KR100380804B1 - 내열성을 갖는 포스포리파제 ａ1의 돌연변이체 및 그의제조방법 - Google Patents

내열성을 갖는 포스포리파제 ａ1의 돌연변이체 및 그의제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인지질 분해/합성 효소인 포스포리파제 A1의 돌연변이체로서 내열성을 가지는 포스포리파제 TA3 및 TA13, 그를 암호화하는 유전자, 전기 돌연변이체의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 미생물 및 그로부터 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 돌연변이체는 돌연변이 유발형 중합효소연쇄반응(mutagenic PCR)에 의하여 유발된 포스포리파제 A1의 돌연변이체의 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 대장균주를 배양한 후, 이로부터 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조할 수 있다. 본 발명의 포스포리파제 A1의 돌연변이체는 야생형의 포스포리파제 A1에 비하여 열에 대한 안정성이 향상되었을 뿐만 아니라, 고온에서의 효소활성 자체도 증가하였으므로, 생물공정, 의약, 화장품 및 식품 등에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

내열성을 갖는 포스포리파제 Ａ1의 돌연변이체 및 그의 제조방법{Thermostable Phospholipase A1 Mutants and Process for Preparing the Same}
본 발명은 포스포리파제 A1의 돌연변이체 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 인지질 분해/합성 효소인 포스포리파제 A1의 돌연변이체로서 내열성을 가지는 포스포리파제 TA3 및 TA13, 그를 암호화하는 유전자, 전기 돌연변이체의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 미생물 및 그로부터 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
라이소포스포리피드(lysophospholipid)는 혈소판 응집에서 작용기의 역할을 할 뿐만 아니라 신호전달 등 여러 가지 생리적 활성을 매개하거나(참조: Durieux and Lynch, Trends Pharmacol. Sci., 14:249, 1993), 식물 호르몬으로서 식물이나 과일의 과숙성을 방지하는 역할을 한다고 알려졌다(참조: 미합중국 특허 제 5,126,155). 특히, 전기 라이소포스포리피드는 물에 대한 용해도가 높고, 다양한 수소이온농도 및 온도에서도 안정한 유제(emulsion)를 형성시킬 수 있으며, 마그네슘이나 칼슘 이온 존재하에서도 안정성을 가지므로, 유화제(emulsifier)로서 의약, 화장품 및 식품 산업에 다양하게 활용되고 있다.
상술한 라이소포스포리피드는 생화학적인 경로에서 인지질 가수분해 효소인 포스포리파제 A1에 의하여 포스포리피드로부터 생성될 수 있으며, 전기 과정은 포스포리파제 A1가 포스포리피드의 1-아실기를 가수분해하여 라이소포스포리피드와 지방산을 생성됨으로써 일어난다. 이러한 포스포리파제 A1은 DHA 또는 EPA 등의 다가불포화 지방산(PUFA)과 같은 유용 지방산을 함유하는 인지질의 합성 공정에 필수적인 효소이다. 아울러, 포스포리파제 A1은 생리학적 측면에서 라이소좀(lysosome)내에 인지질이 축적되는 인지질증(phospholipidosis)에도 중요하게 작용하는데, 이는 인지질증의 원인이 인간의 라이소좀에서 양이온성 양성친화성 약물(cationic amphiphilic drug, CAD)에 의한 포스포리파제의 활성의 억제에 기인하기 때문이다(참조: Reasor et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 212:297-304, 1996). 이와 같은 포스포리파제 A1은 다양한 포유동물, 뱀이나 벌 종류의 독 성분, 세라시아 속(Serratia sp., 참조: Kim et al. J. Industrial Microbiol., 16:171-174, 1996)과 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 등의 미생물로부터 분리되었으나, 효소의 안정성이 낮으므로 포스포리파제 A1을 생물공정에서 활용되지 못한 단점이 있었다.
한편, 효소를 생물 촉매로 이용하여 유용한 물질을 생산하는 생물공정에 있어서 가장 중요한 것은 효소의 안정성이다. 특히, 고온에서 이루어지는 생물촉매 반응이 저온에서 이루어지는 효소반응에 비하여 상대적으로 생산수율이 높은 것으로 알려져 있으므로, 생물공정에서 효소의 열안정성은 상당히 중요한 문제이다. 게다가, 고온의 효소 반응은 상온이나 저온에서의 반응에 비하여 효소의 기질 용해도가 높고, 미생물 오염이 감소되며, 용액의 점성(viscosity)이 감소하는 등의 장점이 있기 때문에, 열안정성이 높은 효소의 개발은 생물공정 및 이를 응용한 산업에 매우 유용하다. 이 외에도, 열에 대한 안정성이 증가된 내열성 효소는 상온에서의 구조적 안정성, 유기용매에 대한 안정성, 극단의 수소 이온 농도에 대한 안정성 및 단백질 변성제에 대한 안정성 등이 향상될 수 있다고 알려져 있다.
상술한 관점에서 볼 때, 인지질의 일종인 라이소포스포리피드를 생산하기 위하여 포스포리파제 A1를 수득하는데 있어서, 효소의 활성을 높이기 위하여 열안정성이 향상된 포스포리파제 A1을 제조하는 것이 상당히 중요한 문제임을 알 수 있다. 그러나, 현재까지 유용한 효소단백질의 변이체를 합성하기 위하여 제시되어 온 방법들 즉, 이황화결합(disulfide bond), 화학적 가교(cross-link), 염다리(salt bridge) 또는 금속이온 결합 부위(metal binding site)를 도입시킴으로써 효소의 3차원 구조를 변화시키는 방법은 전기 포스포리파제 A1의 활성을 높이기 위한 변이체를 제조하는데 있어서 적절하지 못하다. 왜냐하면, 전기 방법들은 효소의 3차원적인 구조가 결정되어야만 가능한 방법들이므로, 아직까지 3차원 구조와 결정이 밝혀지지 않은 포스포리파제 A1에 대하여 상술한 방법을 적용할 수 없기 때문이다.
따라서, 포스포리파제 A1을 생물공정에 적극적으로 활용하기 위하여, 포스포리파제 A1의 열안정성을 향상시키는 것이 시급히 요구되었으나, 열에 대한 안정성과 효소활성이 증가된 포스포리파제 A1의 변이체를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 생물공정에 다양하게 응용할 수 있는 열안정성이 향상된 포스포리파제 A1의 변이체를 제조하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 세라시아 속(Serratia sp.)으로부터 유래된 포스포리파제 A1의 유전자를 포함하는 벡터를 주형으로 하여 돌연변이 유발형 중합효소연쇄반응(mutagenic PCR)을 통하여 무작위적인 돌연변이를 유발시킨 후, 이를 대장균에 도입함으로써 열안정성이 야생형에 비해 획기적으로 향상된 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 첫번째 목적은 세라시아 속(Serratia sp. strain MK1)으로부터 유래된 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 목적은 전기 돌연변이체를 암호화하는 유전자를 제공하는것이다.
본 발명의 세번째 목적은 전기 돌연변이체의 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 네번째 목적은 전기 발현벡터로 형질전환된 대장균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다섯번째 목적은 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 내열성을 갖는 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 제조하는 과정을 개략적으로 도시한 그림이다.
도 2a는 본 발명의 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA3의 유전자를 함유하는 발현벡터인 pTA3를 나타내는 그림이다.
도 2b는 본 발명의 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA13의 유전자를 함유하는 발현벡터인 pTA13을 나타내는 그림이다.
도 3은 본 발명의 내열성을 갖는 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA3 또는 TA13의 열안정성을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 내열성을 갖는 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA3 또는 TA13의 효소활성을 고온에서 측정한 그래프이다.
본 발명의 포스포리파제 A1의 돌연변이체는 세라시아 속(Serratia sp.)의 포스포리파제 A1의 돌연변이체의 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 대장균주를 배양한 후, 이로부터 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된다.
이하, 본 발명의 포스포리파제 A1의 돌연변이체 및 이를 제조하는 방법을 좀 더 상세히 설명하고자 한다.
우선, 포스포리파제 A1의 돌연변이체의 유전자를 포함하는 벡터를 수득하기 위하여, 세라시아 속(Serratia sp.)으로부터 유래된 963bp의 포스포리파제 A1 유전자(서열번호 1)를 포함하는 벡터를 제조한 후에, 이를 주형으로 하여 돌연변이 유발형 중합효소연쇄반응에 의하여, 야생형의 포스포리파제 A1의 유전자에 무작위적인 돌연변이들을 유발시킴으로써 포스포리파제 A1 돌연변이체의 DNA를 수득하였다. 그런 다음, 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 발현시키기 적합한 벡터에 접합시킨 후, 이를 대장균에 형질전환시켜 돌연변이 라이브러리를 작제하였다.
이어, 세라시아 속(Serratia sp.) 유래의 포스포리파제 A1의 돌연변이체의 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 대장균주를 70 내지 90℃에서 고온열처리함으로써 내열성의 포스포리파제를 분리하는 멤브레인 결합형 활성탐색 방법(filter-based visual screening)에 의하여 내열성을 갖는 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 생산하는 대장균주를 선별하였다.
전기 내열성을 갖는 포스포리파제 A1의 돌연변이체 유전자의 염기서열은 공지된 방법에 의하여 결정되었으며, 이로부터 유래된 내열성 포스포리파제 A1의 돌연변이체는 야생형의 포스포리파제 A1의 아미노산 서열과 비교할 경우, 각각 6개와 7개의 아미노산이 변환된 새로운 아미노산 배열을 갖는 단백질인 것으로 확인되어,이를 '포스포리파제 TA3' 또는 '포스포리파제 TA13'으로 명명하였다. 즉, 포스포리파제 TA3의 경우, 32번째, 39번째, 65번째, 105번째, 153번째, 158번째 및 303번째 아미노산 서열이 각각 P, A, L, V, I, I 및 E로 치환된 돌연변이체임을 확인할 수 있었고, 포스포리파제 TA13의 경우, 36번째, 102번째, 154번째, 158번째, 281번째 및 291번째 아미노산 서열이 각각 Q, N, K, W, Q 및 N으로 치환된 돌연변이체임을 확인할 수 있었다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 포스포리파제 A1의 돌연변이체 유전자를 포함하는 발현벡터 pTA3 또는 pTA13을 작제하고, 전기 발현벡터를 각각 대장균 E. coli XL-Blue에 도입하여 최종적으로 형질전환된 대장균들을 수득하였고, 전기 형질전환체를 "Escherichia coliXL-Blue/pTA3"와 "Escherichia coliXL-Blue/pTA13"로 명명하였으며, 전기 형질전환체들을 2000년 8월 10일자로 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재한 대전광역시 생명공학연구소(KRIBB) 유전자원센터의 유전자은행에 기탁번호 KCTC-18037P(Escherichia coliXL-Blue/pTA3) 및 KCTC-18038P(Escherichia coliXL-Blue/pTA13)로 기탁하였다. 아울러, 본 발명의 내열성을 갖는 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 제조하는 바람직한 실시예를 도 1에 개략적으로 도시하였다.
한편, 고온 안정성 증가로 인하여 효소활성의 감소가 일어날 수 있으므로, 정제된 내열성 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 포스포리파제 TA3 또는 TA13에 대하여 고온에서 인지질 가수분해 반응을 실시한 결과, 기존의 야생형 포스포리파제 A1에 비해서 최적활성온도가 증가하였고, 그 최적활성온도에서의 효소활성도 야생형에 비하여 증가함을 확인하였는 바, 본 발명의 내열성 포스포리파제 A1은 열에 대한 안정성이 향상되었을 뿐만 아니라, 고온에서의 효소활성 자체도 증가한 것을 재차 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 포스포리파제 A1의 돌연변이체는 생물공정 및 그를 이용한 의약, 화장품 및 식품 산업에 유용하게 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명의 실시예를 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 돌연변이 포스포리파제 A1 라이브러리의 제조
포스포리파제 A1 유전자에 돌연변이 유발형 중합효소연쇄반응(mutagenic PCR)을 이용하여 그 유전자에 무작위적인 돌연변이들을 유발시킴으로써 다양한 포스포리파제 A1 돌연변이체를 다음과 같이 제조하였다. 우선, 세라시아 속(Serratia sp. strain MK1; 참조: Song, J.K., et al., J. Biotechnol., 72:103-114, 1999)으로부터 유래된 963bp의 포스포리파제 A1 유전자(서열번호 1)를 pUC19 벡터에 연결한 재조합 플라스미드 pMJ1를 작제하여 이를 돌연변이 유발형 중합효소연쇄반응의 주형으로 준비하였다. 돌연변이 유발형 중합효소연쇄반응에 사용될 프라이머는 다음과 같이 N-말단 프라이머와 C-말단 프라이머를 사용하였으며, 이는 세라시아 속으로부터 유래된 포스포리파제 A1유전자의 염기배열에 근거하여 합성하였다.
N-프라이머(서열번호 2) : 5' - CGGAATTCTTTGAGTTTTACCTCTGCGATCG - 3'
C-프라이머(서열번호 3) : 5' - GCGGATCCCATCAGGCATTGGCCATCGCCTCC - 3'
PCR 반응액은 각각 0.1 μM의 상기 N 말단 프라이머 및 C 말단 프라이머, 주형으로서는 재조합 플라스미드 pMJ1 5ng, 10mM 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.3), 50mM KCl, 7mM MgCl2, 0.1mM MnCl2, 0.2mM dATP, 0.2mM dGTP, 1mM dCTP, 1mM dTTP, 및 Taq 중합효소 5 효소단위(unit)를 포함하도록 100㎕를 조제하였다. 이어, 전기 반응액을 94℃에서 1분(첫번째 사이클에서는 10분), 60℃에서 1분, 72℃에서 1분(마지막 사이클에서는 10분)의 조건으로 돌연변이 유발형 PCR을 25회 수행하였다. 이후, 반복되는 돌연변이 유발형 PCR(secondary mutagenic PCR)은 주형으로서 이전 단계에서 분리된 내열성 돌연변이 유전자들을 모아서 상기한 조건과 동일하게 실시하였다.
상기와 같이 증폭된 PCR 산물들은 한천 겔 전기영동법을 통해 분리하였고, 증폭 분리된 DNA 단편을 제한효소 EcoRI과 BamHI으로 절단한 후에, 포스포리파제 A1(PLA1)의 돌연변이체의 발현에 효율적이라고 평가된 벡터인 pSTV28(Takara Shuzo, Japan)에 접합시켜, 재조합 플라스미드를 작제하였다. 전기 작제된 돌연변이 유전자들을 함유하는 벡터들을 대장균 XL1-Blue(recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1[F'proAB lacI q Z△15Tn10(Tetr)], Stratagene, U.S.A.)에 도입하여 포스포리파제 A1의 돌연변이체 라이브러리를 제조하였다.
실시예 2: 포스포리파제 A1의 돌연변이체의 탐색
실시예 1에서 제조된 포스포리파제 A1 돌연변이체의 라이브러리는 0.5% 박토 트립톤, 1% 효모 추출물, 1% NaCl, 1.5% 아가를 포함하는 LB 평판배지에 도말하였다. 이어, 멤브레인 결합형 활성 탐색 방법에 의하여 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 탐색하기 위하여, 전기 라이브러리를 나일론 멤브레인에 옮겨서 다시 LB 배지에 올려두고, 대장균 숙주 세포가 성장하도록 함으로써 나일론 멤브레인 위에 라이브러리가 구축되도록 하였다. 그런 다음, 3종류의 세포용해 용액에 각각 적신 페이퍼 필터 위에 멤브레인을 올려두는 식으로 3단계의 세포용해 과정을 수행하였다. 각 용액의 조성과 반응시간은 다음과 같다.
(ⅰ) 25mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mg/ml lysozyme 1mM EDTA(pH 8.0), 15분
(ⅱ) 10mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.1% Triton X-100, 30분
(ⅲ) 50mM Tris-HCl(pH 8.0, 30분)
내열성 돌연변이체 포스포리파제 A1을 탐색하기 위하여, 상기 과정을 거친 멤브레인을 70℃ 이상의 고온에서 2시간 동안 방치함으로써 첫번째 열처리 과정을 수행하였고, 두번째 열처리 과정은 80℃에서 3시간 동안 방치하여 수행하였다.
고온 열처리가 끝난 멤브레인 상의 돌연변이체 라이브러리로부터 효소활성을 탐색하기 위하여, 1% 아가로스(agarose), 0.8% 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 20mM CaCl2, 0.4% 타우로콜린산(taurocholic acid), 50mM Tris-HCl(pH 8.0)의 조성을 포함하는 포스포리파제 활성탐색 젤(PCY plate)에서 42℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 투명원형지대(halo)를 나타내지 않는 야생형 포스포리파제 A1로부터 투명원형지대를 나타내는 효소활성이 유지된 돌연변이체를 선별하였다.
전기 탐색과정을 거쳐 열 안정성 및 고온에서의 효소활성이 증가된 내열성 포스포리파제 유전자를 포함하는 두 종류의 클론을 분리하였다.
전기 실시예 1 및 2에 기술한, 내열성을 갖는 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 제조하는 과정을 도 1에 개략적으로 도시하였다.
실시예 3: 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 암호화하는 유전자의 염기서열 결정
포스포리파제 A1의 돌연변이체의 유전자의 서열은 ABI PRISM BioDye Primer cycle sequencing kit 및 AmpliTaq DNA polymerase(Perkin-Elmer, U.S.A.)를 사용하여 결정하였으며, 각각의 염기서열은 서열번호 4(포스포리파제 TA3) 및 서열번호 5(포스포리파제 TA13)로 확인되었는 바, 서열번호 4를 갖는 포스포리파제를 TA3로, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 포스포리파제를 TA13으로 명명하였다. 아울러, 전기 TA3 또는 TA13을 포함하고 있는 플라스미드 지도를 도 2a및 도 2b에 각각 나타내었다.
전기 pTA3에 포함된 내열성 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA3 유전자의 염기배열로부터 TA3의 아미노산 배열을 추정하여, 이를 서열번호 6에 나타내었으며, pTA13에 포함된 내열성 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA13 유전자의 염기배열로부터 아미노산 배열을 추정하여 이를 서열번호 7에 나타내었다. 본 발명의 내열성 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA3과 TA13를 야생형의 포스포리파제 A1의 아미노산 서열과 비교하였을 경우, 각각 6개와 7개의 아미노산이 변환된 새로운 아미노산 배열을 갖는 단백질임을 확인할 수 있었다. 즉, 포스포리파제 TA3의 경우, 32번째, 39번째, 65번째, 105번째, 153번째, 158번째 및 303번째 아미노산 서열이 각각 P, A, L, V, I, I 및 E로 치환된 돌연변이체임을 확인할 수 있었고, 포스포리파제 TA13의 경우, 36번째, 102번째, 154번째, 158번째, 281번째 및 291번째 아미노산 서열이 각각 Q, N, K, W, Q 및 N으로 치환된 돌연변이체로 신규한 포스포리파제임을 알 수 있었다.
상술한 아미노산 서열 및 멤브레인 결합형 활성 탐색 방법에 의하여, 본 발명의 TA3과 TA13은 아미노산 배열이 기존의 포스포리파제A1과 상이할 뿐만 아니라고온에서 안정성을 갖는 신규한 포스포리파제 A1으로 판단할 수 있었다.
실시예 4: 재조합 포스포리파제 돌연변이체의 생산과 정제
pTA3과 pTA13은 내열성 포스포리파제 A1에 Histidine-tag을 가지도록 고안되었으며 지속적인 내열성 단백질 발현이 가능하도록 작제되었는 바, 이를 이용하여 대장균(Escherichia coli) XL1-Blue을 형질전환시켰다. Histidine-tag은 내열성 단백질의 정제를 용이하게 하기 위함이었으며, 니켈-니트로트리아세트산 아가로스 수지(nickel-nitrotriacetic acid agarose resin)을 이용하였을때 한번에 단백질 정제가 가능하였다. 각각의 재조합 대장균 XL1-Blue/pTA3 과 XL1-Blue/pTA13을 클로람페니콜을 100mg/ℓ농도로 첨가한 TYSPN 배지(2% 박토 트립톤, 1% 효모 추출물, 0.5% Na2HPO4, 1% KNO3, 0.5% NaCl)에 접종하고, 30℃에서 200rpm으로 진탕배양하였다. 이어, 균체 농도가 약 OD600= 3.0에 이르렀을 때까지 계속 배양하여 내열성 포스포리파제 A1의 돌연변이체가 지속적으로 발현되게 한 후, 7000rpm으로 10분동안 원심분리하여 균체를 회수하였다.
전기 회수된 재조합 대장균 균체를 pH 8.0의 50mM 인산염 나트륨 완충액(sodium phosphate buffer), 300mM NaCl, 10mM 이미다졸(imidazole), 0.05% Triton X-100, 10% 글리세롤이 포함된 세포용해완충액(cell lysis buffer)으로 현탁시켜 초음파 파쇄한 후, 이를 원심분리하여 수득한 상등액을 니켈-니트로트리아세트산 아가로스 수지에 흡착시켰다. 그런 다음, 수회에 걸쳐 세척완충액(washing buffer)으로 세척한 후, 250mM의 이미다졸이 포함된 용액으로 내열성 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 용출시켰다. 전기 용출된 효소액을 다시 Sephacryl S-200 수지에 통과시켜 순수한 내열성 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 수득하였으며, 정제된 효소를 SDS-PAGE로 분석한 결과, 최종적인 효소액에는 99% 이상의 순수한 내열성 포스포리파제 A1의 돌연변이체만이 함유되어 있었으며, 이들은 모두 가용성이며 포스포리파제의 활성이 유지된 상태로 제조됨을 확인할 수 있었다.
따라서, 내열성 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA3 또는 TA13을 포함하는 벡터로 형질전환된 대장균으로부터 포스포리파제 활성이 유지된 내열성의 TA3 또는 TA13를 용이하게 제조할 수 있음을 알 수 있었는 바, 본 발명자들은 전기 형질전환체들을 2000년 8월 10일자로 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재한 대전광역시 생명공학연구소(KRIBB) 유전자원센터의 유전자은행에 기탁번호 KCTC-18037P(Escherichia coliXL-Blue/pTA3) 및 KCTC-18038P(Escherichia coliXL-Blue/pTA13)로 기탁하였다.
실시예 5: 포스포리파제 A1의 돌연변이체의 고온에서의 안정성 및 효소활성 평가
포스포리파제 A1 효소활성은 효소에 의해 유리된 지방산을 pH stat 적정법에 의하여, 자동적정기(autotitrator)와 자동분주기(autoburette)가 장착된 pH stat(Radiometer Copenhagen, France)을 이용하여 37℃에서 효소반응을 수행함으로써 측정되었다. 즉, 3.4mM 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 10mM CaCl2, 2.6mM 데옥시콜린산(deoxycholic acid)이 포함된 효소반응액을 기질로 하여, 초음파로 에멀젼화한 다음, 포스포리파제 A1 효소액을 첨가하여 포스파티딜콜린의 지방산이 유리된 양을 측정하였다. 이때, 포스포리파제 A1의 효소활성은 1분당 1μmole의 포스파티딜콜린이 생성될 때의 효소활성을 1단위활성(unit)으로 정의하였다.
고온에서의 안정성은 실시예 4에서 분리한 내열성 포스포리파제를 이용하여 측정하였다. 정제된 효소를 각각 50mM 인산염 완충액(sodium phosphate buffer, pH 8.0)에 동일한 농도로 희석한 후, 50℃에서 95℃까지 매 5℃ 간격의 지시된 온도에서 20분간 방치하였다.
도 3은 본 발명의 내열성을 갖는 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA3 또는 TA13의 열안정성을 효소활성(%)으로 나타낸 그래프이다: 이때, ■는 기존의 야생형 포스포리파제 A1의 효소활성을, ▼는 신규한 내열성 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA3의 효소활성을, ▲는 신규한 내열성 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA13의 효소활성을 나타낸다. 도 3에서 보듯이, 최초 활성의 50%가 감소할 때의 온도인 Tm을 보면 TA3은 7℃, TA13은 11℃만큼 증가하였다. 따라서, 인위적 분자진화에 의해 얻어낸 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA3과 TA13은 야생형의 포스포리파제A1에 비해 열에 대해 훨씬 더 안정적인 특성을 가지고 있음이 확인되었다.
포스포리파제의 종류에 따른 효소의 반응속도 매개변수(kinetic parameter)의 값*
포스포리파제의 종류 Km(μM) Kcat(S-1) Kcat/Km(S-1μM)
야생형(PLA1) 114.5 11.23 0.098
TA3 105.1 10.92 0.104
TA13 120.4 13.67 0.114
*전기 효소의 반응속도 매개변수의 값은 pH 8.0 및 37℃에서 측정한 값으로, 2회 실시한 실험값의 평균을 나타내었다.
한편, 효소의 고온 안정성 증가로 인한 효소활성의 감소가 일어날 수 있으므로, 정제된 내열성 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 이용하여 지시된 각각의 온도에서 인지질 가수분해 반응을 실시하였다. 도 4는 본 발명의 내열성을 갖는 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA3 또는 TA13의 효소활성을 고온에서 측정한 그래프이다: 이때, ■는 기존의 야생형 포스포리파제 A1의 효소활성을, ▼는 신규한 내열성 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA3의 효소활성을, ▲는 신규한 내열성 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA13의 효소활성을 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 야생형 포스포리파제 A1에 비해서 최적활성온도가 10℃ 증가하였으며, 그 최적활성온도에서의 효소활성도 1.6배 가량 증가하였다. 따라서, 본 발명의 내열성 포스포리파제A1은 열에 대한 안정성이 증가하였을 뿐만 아니라, 고온에서의 효소활성 자체도 증가한 것을 재차 확인할 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 인지질 분해/합성 효소인 포스포리파제 A1의 돌연변이체로서 내열성을 가지는 포스포리파제 TA3 및 TA13, 그를 암호화하는 유전자, 전기 돌연변이체의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 미생물 및 그로부터 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 포스포리파제 A1의 돌연변이체는 세라시아 속의 포스포리파제 A1의 돌연변이체의 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 대장균주를 배양한 후, 이로부터 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된다. 본 발명의 포스포리파제 A1의 돌연변이체는 내열성을 가지며 야생형의 포스포리파제 A1에 비하여 효소의 안정성과 활성이 증가하였으므로, 생물공정 뿐만 아니라, 의약, 화장품 및 식품 산업에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Claims (15)

  1. 세라시아 속(Serratia sp. strain MK1)으로부터 유래된 포스포리파제 A1의 돌연변이체로서 내열성을 갖는 포스포리파제 TA3(phospholipase TA3)를 암호화하며, 서열번호 4로 나타내어지는 유전자.
  2. 세라시아 속(Serratia sp. strain MK1)으로부터 유래된 포스포리파제 A1의 돌연변이체로서 내열성을 갖는 포스포리파제 TA13(phospholipase TA13)을 암호화하며, 서열번호 5로 나타내어지는 유전자.
  3. 제 1항의 유전자로부터 유래되는 포스포리파제 A1의 돌연변이체로서 내열성을 가지며, 서열번호 6의 아미노산으로 나타내어지는 TA3.
  4. 제 2항의 유전자로부터 유래되는 포스포리파제 A1의 돌연변이체로서 내열성을 가지며, 서열번호 7의 아미노산으로 나타내어지는 TA13.
  5. 세라시아 속(Serratia sp.) 유래의 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 포스포리파제 TA3의 유전자를 포함하는 벡터.
  6. 세라시아 속(Serratia sp.) 유래의 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 포스포리파제 TA13의 유전자를 포함하는 벡터.
  7. 세라시아 속(Serratia sp. strain MK1)으로부터 유래된 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 포스포리파제 TA3의 유전자를 포함하는 발현벡터 pTA3.
  8. 세라시아 속(Serratia sp. strain MK1)으로부터 유래된 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 포스포리파제 TA13의 유전자를 포함하는 발현벡터 pTA13.
  9. 세라시아 속(Serratia sp. strain MK1) 유래의 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA3의 유전자를 포함하는 발현벡터 pTA3로 형질전환된 대장균주(Escherichia coliXL-Blue/pTA3, KCTC-18037P).
  10. 세라시아 속(Serratia sp. strain MK1) 유래의 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA13의 유전자를 포함하는 발현벡터 pTA13으로 형질전환된 대장균주(Escherichia coliXL-Blue/pTA13, KCTC-18038P).
  11. 세라시아 속(Serratia sp.) 유래의 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 포스포리파제 TA3 또는 TA13의 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 대장균주를 배양한 후, 이로부터 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 제조하는 방법.
  12. 삭제
  13. 제 11항에 있어서,
    세라시아 속(Serratia sp.) 유래의 포스포리파제 A1의 돌연변이체의
    유전자를 포함하는 벡터는 pTA3 또는 pTA13인 것을 특징으로 하는
    포스포리파제 A1의 돌연변이체를 제조하는 방법.
  14. 제 11항에 있어서,
    형질전환된 대장균주는Escherichia coliXL-Blue/pTA3(KCTC-18037P),
    Escherichia coliXL-Blue/pTA13(KCTC-18038P) 또는
    이들의 혼합균주인 것을 특징으로 하는
    포스포리파제 A1의 돌연변이체를 제조하는 방법.
  15. 제 11항에 있어서,
    세라시아 속(Serratia sp.) 유래의 포스포리파제 A1의 돌연변이체인 TA3 또는 TA13의 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 대장균주를 70 내지 90℃에서 고온열처리함으로써 내열성의 포스포리파제를 분리하는 멤브레인 결합형 활성탐색 방법(filter-based visual screening)에 의 하여 내열성을 갖는 포스포리파제 A1의 돌연변이체를 생산하는 대장균 을 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는
    포스포리파제 A1의 돌연변이체를 제조하는 방법.
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