JP3478410B2 - 超耐熱性プロテアソーム - Google Patents
超耐熱性プロテアソームInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は超耐熱性プロテアソーム
及び該酵素をコードする遺伝子に関する。
及び該酵素をコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】プロテアーゼは、洗剤への添加、ウール
の処理、Ｘ線フィルムからの銀の回収等の目的に広く使
われている。通常の酵素は高温にすると不安定になるの
で利用分野が限られている。耐熱性プロテアーゼとして
はバチルス サーモプロテオリティカス（Bacillus the
rmoproteolyticus) 由来のサーモリシン、サーマス ア
クアティカス（Thermus aquaticus)由来のアクアリシン
等が知られているが、熱安定性は高々８０℃である。プ
ロテアソームは分子量７０万前後の高分子量細胞内プロ
テアーゼである。プロテアソームはほとんどすべての真
核生物で発見されているためにそのアミノ酸配列と遺伝
子のＤＮＡ塩基配列は進化系統学上重要な意味を持って
いるが真核生物以外の生物由来のプロテアソームとして
は中等度好熱性古細菌サーモプラズマアシドフィラム
（Thermoplasma acidophilum) の生産するものが知られ
ているだけである。近年１００℃付近で最もよく生育す
る超好熱性古細菌が多数発見され、これらが超耐熱性酵
素源として注目を浴びている。その一種のピロコッカス
フリオサス（Pyrococcus furiosus)はプロテアーゼで
あるピロリシン（Pyrolysin)を生産することがエッゲン
ら〔フェムス マイクロバイオロジー レターズ（FEMS
Microbiology Letters)、第７１巻、第１７〜２０頁
（１９９０）〕により報告されている。また、ピロコッ
カス フリオサスの菌体抽出液（cell-free-extract)か
ら、ＳＤＳ耐性を有する数種のプロテアーゼの混合物が
発見されている〔アプライド エンバイロンメンタル
マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.)、
第５６巻、第１９９２〜９８頁（１９９０）〕が、これ
らの酵素タンパクは実用可能な程度まで精製されておら
ず、またその遺伝子をクローニングされていない。ま
た、超好熱性微生物からプロテアソーム又はプロテアソ
ーム遺伝子は発見されていない。
の処理、Ｘ線フィルムからの銀の回収等の目的に広く使
われている。通常の酵素は高温にすると不安定になるの
で利用分野が限られている。耐熱性プロテアーゼとして
はバチルス サーモプロテオリティカス（Bacillus the
rmoproteolyticus) 由来のサーモリシン、サーマス ア
クアティカス（Thermus aquaticus)由来のアクアリシン
等が知られているが、熱安定性は高々８０℃である。プ
ロテアソームは分子量７０万前後の高分子量細胞内プロ
テアーゼである。プロテアソームはほとんどすべての真
核生物で発見されているためにそのアミノ酸配列と遺伝
子のＤＮＡ塩基配列は進化系統学上重要な意味を持って
いるが真核生物以外の生物由来のプロテアソームとして
は中等度好熱性古細菌サーモプラズマアシドフィラム
（Thermoplasma acidophilum) の生産するものが知られ
ているだけである。近年１００℃付近で最もよく生育す
る超好熱性古細菌が多数発見され、これらが超耐熱性酵
素源として注目を浴びている。その一種のピロコッカス
フリオサス（Pyrococcus furiosus)はプロテアーゼで
あるピロリシン（Pyrolysin)を生産することがエッゲン
ら〔フェムス マイクロバイオロジー レターズ（FEMS
Microbiology Letters)、第７１巻、第１７〜２０頁
（１９９０）〕により報告されている。また、ピロコッ
カス フリオサスの菌体抽出液（cell-free-extract)か
ら、ＳＤＳ耐性を有する数種のプロテアーゼの混合物が
発見されている〔アプライド エンバイロンメンタル
マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.)、
第５６巻、第１９９２〜９８頁（１９９０）〕が、これ
らの酵素タンパクは実用可能な程度まで精製されておら
ず、またその遺伝子をクローニングされていない。ま
た、超好熱性微生物からプロテアソーム又はプロテアソ
ーム遺伝子は発見されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、工業的に有
用な超耐熱性のタンパク質分解酵素及び該酵素の遺伝子
を提供することを目的とし、詳しくは従来の耐熱性プロ
テアーゼよりも、より耐熱性の高い超耐熱性タンパク質
及び該タンパク質をコードする遺伝子を提供することを
目的とする。
用な超耐熱性のタンパク質分解酵素及び該酵素の遺伝子
を提供することを目的とし、詳しくは従来の耐熱性プロ
テアーゼよりも、より耐熱性の高い超耐熱性タンパク質
及び該タンパク質をコードする遺伝子を提供することを
目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、配列表の配列番号１で表されるア
ミノ酸配列、あるいは該配列中に１〜数個のアミノ酸の
置換、欠失、挿入、付加の少なくとも１つがされたアミ
ノ酸配列からなるタンパク質、並びに配列表の配列番号
２で表されるアミノ酸配列、あるいは該配列中に１〜数
個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加の少なくとも１
つがされたアミノ酸配列からなるタンパク質で構成さ
れ、かつ下記の酵素学的特徴を有することを特徴とする
超耐熱性プロテアソームに関する。 （１）作用及び基質特異性 サクシニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル
−Ｌ−チロシン ４−メチル−クマリル−７−アミド
（以下、ＬＬＶＹ−ＭＣＡと略す。ペプチド研究社製）
を加水分解して蛍光物質を生成する。また、ゼラチンを
加水分解して低分子化する。可溶性還元リゾチームを加
水分解して短鎖ペプチドを生成する。 （２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ 至適ｐＨは６．０から９．０であり、安定ｐＨは１００
℃、１０分間処理において５．０から１０．０である。 （３）熱安定性 ２％ＳＤＳ中で１００℃３０分間処理しても約８０％の
ＬＬＶＹ−ＭＣＡ解活性を有している。また、本発明の
第２の発明は配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配
列からなるタンパク質をコードする遺伝子に関する。更
に、本発明の第３の発明は配列表の配列番号２で表され
るアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
に関する。そして、本発明の第４の発明は、上記第２の
又は第３の発明における、他方の配列表の配列番号で表
されるアミノ酸配列からなるタンパク質と会合して前記
酵素学的特徴を有する超耐熱性プロテアソームを構成す
ることのできるタンパク質をコードする遺伝子であっ
て、上記第２の又は第３の発明の遺伝子に厳密な条件に
おいてハイブリダイズすることを特徴とする遺伝子に関
する。
発明の第１の発明は、配列表の配列番号１で表されるア
ミノ酸配列、あるいは該配列中に１〜数個のアミノ酸の
置換、欠失、挿入、付加の少なくとも１つがされたアミ
ノ酸配列からなるタンパク質、並びに配列表の配列番号
２で表されるアミノ酸配列、あるいは該配列中に１〜数
個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加の少なくとも１
つがされたアミノ酸配列からなるタンパク質で構成さ
れ、かつ下記の酵素学的特徴を有することを特徴とする
超耐熱性プロテアソームに関する。 （１）作用及び基質特異性 サクシニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル
−Ｌ−チロシン ４−メチル−クマリル−７−アミド
（以下、ＬＬＶＹ−ＭＣＡと略す。ペプチド研究社製）
を加水分解して蛍光物質を生成する。また、ゼラチンを
加水分解して低分子化する。可溶性還元リゾチームを加
水分解して短鎖ペプチドを生成する。 （２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ 至適ｐＨは６．０から９．０であり、安定ｐＨは１００
℃、１０分間処理において５．０から１０．０である。 （３）熱安定性 ２％ＳＤＳ中で１００℃３０分間処理しても約８０％の
ＬＬＶＹ−ＭＣＡ解活性を有している。また、本発明の
第２の発明は配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配
列からなるタンパク質をコードする遺伝子に関する。更
に、本発明の第３の発明は配列表の配列番号２で表され
るアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
に関する。そして、本発明の第４の発明は、上記第２の
又は第３の発明における、他方の配列表の配列番号で表
されるアミノ酸配列からなるタンパク質と会合して前記
酵素学的特徴を有する超耐熱性プロテアソームを構成す
ることのできるタンパク質をコードする遺伝子であっ
て、上記第２の又は第３の発明の遺伝子に厳密な条件に
おいてハイブリダイズすることを特徴とする遺伝子に関
する。
【０００５】本発明者らは超耐熱性プロテアーゼを探索
するために鋭意研究を重ねた結果、超好熱性古細菌が超
耐熱性プロテアソームを生産することを見いだした。更
に該酵素を精製し、該酵素がα、βの２種類のサブユニ
ットからなることを見いだした。αサブユニットをコー
ドする遺伝子にハイブリダイズするプローブをポリメラ
ーゼ連鎖反応によって合成した。一方βサブユニットの
部分アミノ酸配列を決定し、その配列の一部をコードす
るＤＮＡを合成し、プローブとした。そして前記両プロ
ーブを用いて両サブユニットをコードする遺伝子をクロ
ーニングし、該遺伝子のＤＮＡ塩基配列を決定して本発
明を完成した。
するために鋭意研究を重ねた結果、超好熱性古細菌が超
耐熱性プロテアソームを生産することを見いだした。更
に該酵素を精製し、該酵素がα、βの２種類のサブユニ
ットからなることを見いだした。αサブユニットをコー
ドする遺伝子にハイブリダイズするプローブをポリメラ
ーゼ連鎖反応によって合成した。一方βサブユニットの
部分アミノ酸配列を決定し、その配列の一部をコードす
るＤＮＡを合成し、プローブとした。そして前記両プロ
ーブを用いて両サブユニットをコードする遺伝子をクロ
ーニングし、該遺伝子のＤＮＡ塩基配列を決定して本発
明を完成した。
【０００６】以下、本発明を更に詳細に説明する。本発
明に用いられる微生物は超耐熱性プロテアソームを産生
する微生物であれば特に限定されないが、例えば超好熱
性古細菌であるピロコッカス属に属する菌株を用いるこ
とができ、例えばピロコッカス フリオサスＤＳＭ３６
３８やピロコッカス ボウゼイ（Pyrococcus woesei)Ｄ
ＳＭ３７７３を用いることができる。なお、該両菌株
は、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニ
スメンウント ツェルクルチュウレンＧｍｂＨ（Deutsh
e Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gm
bH）より入手可能な菌株である。
明に用いられる微生物は超耐熱性プロテアソームを産生
する微生物であれば特に限定されないが、例えば超好熱
性古細菌であるピロコッカス属に属する菌株を用いるこ
とができ、例えばピロコッカス フリオサスＤＳＭ３６
３８やピロコッカス ボウゼイ（Pyrococcus woesei)Ｄ
ＳＭ３７７３を用いることができる。なお、該両菌株
は、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニ
スメンウント ツェルクルチュウレンＧｍｂＨ（Deutsh
e Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gm
bH）より入手可能な菌株である。
【０００７】これらの菌株より超耐熱性プロテアソーム
を調製する方法としては菌体を破砕し、粗抽出物から適
当なカラムクロマトグラフィーの組合せで超耐熱性プロ
テアソームを精製する方法が有効である。例えば、ピロ
コッカス フリオサスを培養し、菌体を超音波破砕し、
細胞粗抽出液をカラムクロマトグラフィーの組合せ、例
えば陰イオン交換カラムであるモノ（Mono) Ｑ（ファル
マシア社製）とゲルろ過カラムであるセファクリル（Se
phacryl)Ｓ−３００（ファルマシア社製）を用いること
ができる。精製の指標となる酵素活性の測定方法として
は例えば基質として２０μＭのＬＬＶＹ−ＭＣＡを用
い、２０mMトリス（Tris) −ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１
mMＥＤＴＡ、１mM ＤＤＴ（以下、ＴＥＤと略す）中で
０．１Ｍ ＣａＣｌ2 存在下７０℃で３０分間反応させ
た後、反応液の１／３量の２５％酢酸を加えて反応を停
止させ、励起波長３５５nmで４６０nmの蛍光を測定する
方法が有効である。モノＱカラムの展開溶媒は例えばＴ
ＥＤに０から１ＭのＮａＣｌ濃度勾配をかければよく、
セファクリルＳ−３００の展開溶媒はＴＥＤに０．５Ｍ
のＮａＣｌを加えたものが使用できる。
を調製する方法としては菌体を破砕し、粗抽出物から適
当なカラムクロマトグラフィーの組合せで超耐熱性プロ
テアソームを精製する方法が有効である。例えば、ピロ
コッカス フリオサスを培養し、菌体を超音波破砕し、
細胞粗抽出液をカラムクロマトグラフィーの組合せ、例
えば陰イオン交換カラムであるモノ（Mono) Ｑ（ファル
マシア社製）とゲルろ過カラムであるセファクリル（Se
phacryl)Ｓ−３００（ファルマシア社製）を用いること
ができる。精製の指標となる酵素活性の測定方法として
は例えば基質として２０μＭのＬＬＶＹ−ＭＣＡを用
い、２０mMトリス（Tris) −ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１
mMＥＤＴＡ、１mM ＤＤＴ（以下、ＴＥＤと略す）中で
０．１Ｍ ＣａＣｌ2 存在下７０℃で３０分間反応させ
た後、反応液の１／３量の２５％酢酸を加えて反応を停
止させ、励起波長３５５nmで４６０nmの蛍光を測定する
方法が有効である。モノＱカラムの展開溶媒は例えばＴ
ＥＤに０から１ＭのＮａＣｌ濃度勾配をかければよく、
セファクリルＳ−３００の展開溶媒はＴＥＤに０．５Ｍ
のＮａＣｌを加えたものが使用できる。
【０００８】こうして精製したプロテアソームの酵素化
学的性質及び理化学的性質は以下の通りである。 （１）作用 本発明のプロテアソームはＬＬＶＹ−ＭＣＡを加水分解
して蛍光物質を生成する。また、ゼラチンを加水分解し
て低分子化する。可溶性還元リゾチーム（生化学工業社
製）を加水分解して短鎖ペプチドを生成する。 （２）酵素活性測定方法 本酵素の活性はＬＬＶＹ−ＭＣＡを加水分解して生成す
る７−アミノ−４−メチルクマリン（以下、ＡＭＣと略
す）を蛍光光度計で定量することにより測定した。すな
わち酵素活性を測定しようとする酵素標品を希釈し、そ
の試料溶液１０μｌにＴＥＤに溶解した２０μＭ ＬＬ
ＶＹ−ＭＣＡ、０．１Ｍ ＣａＣｌ2 １４０μｌを加
え、７０℃で反応させる。２５％酢酸５０μｌを加えて
反応を停止させた後、励起波長３５５nmで４６０nmの蛍
光を測定して生成したＡＭＣ量を求めた。ゼラチン分解
活性は以下のようにして測定した。０．２％ゼラチン、
０．１ＭＣａＣｌ2 を含むＴＥＤに酵素標品を加え、７
５℃で３０分間反応させ、この反応液をＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略
す）で分析した。また、１０nmolの可溶性還元リゾチー
ムを酵素と０．１Ｍ ＣａＣｌ2 を含むＴＥＤ中で反応
させ、その反応液をデルタパックＣ18逆相カラム（ウォ
ーターズ社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーで
分析した。本発明により得られるプロテアソームはｐＨ
８、７０℃においてゼラチン及び可溶性還元リゾチーム
を加水分解した。
学的性質及び理化学的性質は以下の通りである。 （１）作用 本発明のプロテアソームはＬＬＶＹ−ＭＣＡを加水分解
して蛍光物質を生成する。また、ゼラチンを加水分解し
て低分子化する。可溶性還元リゾチーム（生化学工業社
製）を加水分解して短鎖ペプチドを生成する。 （２）酵素活性測定方法 本酵素の活性はＬＬＶＹ−ＭＣＡを加水分解して生成す
る７−アミノ−４−メチルクマリン（以下、ＡＭＣと略
す）を蛍光光度計で定量することにより測定した。すな
わち酵素活性を測定しようとする酵素標品を希釈し、そ
の試料溶液１０μｌにＴＥＤに溶解した２０μＭ ＬＬ
ＶＹ−ＭＣＡ、０．１Ｍ ＣａＣｌ2 １４０μｌを加
え、７０℃で反応させる。２５％酢酸５０μｌを加えて
反応を停止させた後、励起波長３５５nmで４６０nmの蛍
光を測定して生成したＡＭＣ量を求めた。ゼラチン分解
活性は以下のようにして測定した。０．２％ゼラチン、
０．１ＭＣａＣｌ2 を含むＴＥＤに酵素標品を加え、７
５℃で３０分間反応させ、この反応液をＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略
す）で分析した。また、１０nmolの可溶性還元リゾチー
ムを酵素と０．１Ｍ ＣａＣｌ2 を含むＴＥＤ中で反応
させ、その反応液をデルタパックＣ18逆相カラム（ウォ
ーターズ社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーで
分析した。本発明により得られるプロテアソームはｐＨ
８、７０℃においてゼラチン及び可溶性還元リゾチーム
を加水分解した。
【０００９】以下（３）〜（８）に示す酵素活性は特に
示さない限り上記のＬＬＶＹ−ＭＣＡを基質とする活性
測定方法で測定したものである。 （３）至適温度 様々な温度でＬＬＶＹ−ＭＣＡの分解活性を測定した。
本発明のプロテアソームは図１に示すようにｐＨ８にお
いて４０℃から９０℃の間で活性を持ち、その至適温度
は７０℃から９０℃であった。図１は本発明により得ら
れる酵素の至適温度を示す図であり、縦軸は相対活性
（％）、横軸は温度（℃）を示す。 （４）至適ｐＨ ０．１Ｍ ＣａＣｌ2 、１mM ＤＴＴを含む２０mM緩衝
液中で２０μＭ ＬＬＶＹ−ＭＣＡの加水分解活性を測
定した。用いた緩衝液はｐＨ３．０〜４．０においてク
エン酸ナトリウム、ｐＨ４．０〜６．０において酢酸ナ
トリウム、ｐＨ７．０〜８．０においてＰＩＰＥＳ−Ｎ
ａ、ｐＨ９においてトリス−ＨＣｌ、ｐＨ１０．０〜１
１．０においてアラニン−Ｎａ、ｐＨ１１．０〜１２．
０においてホウ酸ナトリウムである。本酵素は図２に示
すようにｐＨ７で最も高い活性を持つ。図２は本酵素の
至適ｐＨを示す図であり、縦軸に相対活性（％）、横軸
にｐＨを示す。 （５）熱及び界面活性剤に対する安定性 １％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下本酵素を
１００℃で熱処理した後、活性を測定した。その結果、
本酵素は２％ＳＤＳ中で３０分熱処理しても約８０％の
活性を有していた。図３は本酵素のＳＤＳ中での熱安定
性を示すものであり、縦軸に相対残存活性（％）、横軸
に熱処理時間（分）を示す。 （６）ｐＨ安定性 １mM ＤＴＴを含む２０mM緩衝液中で本酵素を１００
℃、１０分間加熱し、その一部を酵素標品として活性を
測定した。用いた緩衝液はｐＨ３．０〜４．０において
クエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０〜６．０において酢酸
ナトリウム、ｐＨ７．０〜８．０においてＰＩＰＥＳ−
Ｎａ、ｐＨ９においてトリス−ＨＣｌ、ｐＨ１０．０〜
１１．０においてアラニン−Ｎａ、ｐＨ１１．０〜１
２．０においてホウ酸ナトリウムである。図４に示すよ
うに本酵素はｐＨ５．０〜１０．０で１００℃、１０分
間処理しても活性の低下はみられない。図４は本酵素の
ｐＨ安定性を示す図であり、縦軸に相対残存活性
（％）、横軸に熱処理時のｐＨを示す。 （７）塩の影響 様々な濃度のＣａＣｌ2 を含むＴＥＤ中で本酵素のＬＬ
ＶＹ−ＭＣＡ加水分解活性を測定した。図５に示すよう
に５０〜５００mM ＣａＣｌ2 存在下高い活性を示し
た。図５において縦軸は相対活性（％）、横軸はＣａＣ
ｌ2 濃度（mM）を示す。また、０．１Ｍ ＣａＣｌ2 を
含むＴＥＤに様々な濃度のＮａＣｌを加えて本酵素のＬ
ＬＶＹ−ＭＣＡ加水分解活性を測定した。図６に示すよ
うに１００〜２００mM ＮａＣｌによってわずかに活性
化された。図６において縦軸は相対活性（％）、横軸は
ＮａＣｌ濃度（Ｍ）を示す。 （８）変性剤の影響 ０．１Ｍ ＣａＣｌ2 を含むＴＥＤに様々な濃度の尿素
を加えて活性を測定した。図７に示すように尿素濃度を
高くすると活性は直線的に低下し、８Ｍ尿素存在下では
約５％まで低下した。図７において縦軸は相対活性
（％）、横軸は尿素濃度（Ｍ）を示す。５mM ＣａＣｌ
2 を含むＴＥＤに様々な濃度のＳＤＳを加えて活性を測
定した。図８に示すように０．３％以下のＳＤＳでは活
性は低下しなかった。図８において縦軸は相対活性
（％）、横軸はＳＤＳ濃度（％）を示す。
示さない限り上記のＬＬＶＹ−ＭＣＡを基質とする活性
測定方法で測定したものである。 （３）至適温度 様々な温度でＬＬＶＹ−ＭＣＡの分解活性を測定した。
本発明のプロテアソームは図１に示すようにｐＨ８にお
いて４０℃から９０℃の間で活性を持ち、その至適温度
は７０℃から９０℃であった。図１は本発明により得ら
れる酵素の至適温度を示す図であり、縦軸は相対活性
（％）、横軸は温度（℃）を示す。 （４）至適ｐＨ ０．１Ｍ ＣａＣｌ2 、１mM ＤＴＴを含む２０mM緩衝
液中で２０μＭ ＬＬＶＹ−ＭＣＡの加水分解活性を測
定した。用いた緩衝液はｐＨ３．０〜４．０においてク
エン酸ナトリウム、ｐＨ４．０〜６．０において酢酸ナ
トリウム、ｐＨ７．０〜８．０においてＰＩＰＥＳ−Ｎ
ａ、ｐＨ９においてトリス−ＨＣｌ、ｐＨ１０．０〜１
１．０においてアラニン−Ｎａ、ｐＨ１１．０〜１２．
０においてホウ酸ナトリウムである。本酵素は図２に示
すようにｐＨ７で最も高い活性を持つ。図２は本酵素の
至適ｐＨを示す図であり、縦軸に相対活性（％）、横軸
にｐＨを示す。 （５）熱及び界面活性剤に対する安定性 １％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下本酵素を
１００℃で熱処理した後、活性を測定した。その結果、
本酵素は２％ＳＤＳ中で３０分熱処理しても約８０％の
活性を有していた。図３は本酵素のＳＤＳ中での熱安定
性を示すものであり、縦軸に相対残存活性（％）、横軸
に熱処理時間（分）を示す。 （６）ｐＨ安定性 １mM ＤＴＴを含む２０mM緩衝液中で本酵素を１００
℃、１０分間加熱し、その一部を酵素標品として活性を
測定した。用いた緩衝液はｐＨ３．０〜４．０において
クエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０〜６．０において酢酸
ナトリウム、ｐＨ７．０〜８．０においてＰＩＰＥＳ−
Ｎａ、ｐＨ９においてトリス−ＨＣｌ、ｐＨ１０．０〜
１１．０においてアラニン−Ｎａ、ｐＨ１１．０〜１
２．０においてホウ酸ナトリウムである。図４に示すよ
うに本酵素はｐＨ５．０〜１０．０で１００℃、１０分
間処理しても活性の低下はみられない。図４は本酵素の
ｐＨ安定性を示す図であり、縦軸に相対残存活性
（％）、横軸に熱処理時のｐＨを示す。 （７）塩の影響 様々な濃度のＣａＣｌ2 を含むＴＥＤ中で本酵素のＬＬ
ＶＹ−ＭＣＡ加水分解活性を測定した。図５に示すよう
に５０〜５００mM ＣａＣｌ2 存在下高い活性を示し
た。図５において縦軸は相対活性（％）、横軸はＣａＣ
ｌ2 濃度（mM）を示す。また、０．１Ｍ ＣａＣｌ2 を
含むＴＥＤに様々な濃度のＮａＣｌを加えて本酵素のＬ
ＬＶＹ−ＭＣＡ加水分解活性を測定した。図６に示すよ
うに１００〜２００mM ＮａＣｌによってわずかに活性
化された。図６において縦軸は相対活性（％）、横軸は
ＮａＣｌ濃度（Ｍ）を示す。 （８）変性剤の影響 ０．１Ｍ ＣａＣｌ2 を含むＴＥＤに様々な濃度の尿素
を加えて活性を測定した。図７に示すように尿素濃度を
高くすると活性は直線的に低下し、８Ｍ尿素存在下では
約５％まで低下した。図７において縦軸は相対活性
（％）、横軸は尿素濃度（Ｍ）を示す。５mM ＣａＣｌ
2 を含むＴＥＤに様々な濃度のＳＤＳを加えて活性を測
定した。図８に示すように０．３％以下のＳＤＳでは活
性は低下しなかった。図８において縦軸は相対活性
（％）、横軸はＳＤＳ濃度（％）を示す。
【００１０】（９）分子量
スーパーロース６カラム（ファルマシア社製）を用いて
スマートシステム（ファルマシア社製）でゲルろ過を行
った。チログロブリン（分子量６６9,０００）、フェリ
チン（分子量４４0,０００）、カタラーゼ（分子量２３
2,０００）、及びアルドラーゼ（分子量１５8,０００）
を分子量マーカーとして用いた。この結果本酵素の分子
量は６５0,０００であった。
スマートシステム（ファルマシア社製）でゲルろ過を行
った。チログロブリン（分子量６６9,０００）、フェリ
チン（分子量４４0,０００）、カタラーゼ（分子量２３
2,０００）、及びアルドラーゼ（分子量１５8,０００）
を分子量マーカーとして用いた。この結果本酵素の分子
量は６５0,０００であった。
【００１１】２％ＳＤＳ中で５分間煮沸した後にＳＤＳ
−ＰＡＧＥを行うと本酵素は分子量２０0,０００のミオ
シンよりも更に高分子側の挙動を示す。しかし、酵素液
に終濃度０．５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え
て室温で１０分放置した後に中和してＳＤＳ−ＰＡＧＥ
を行うと分子量３2,０００と２5,０００の２種類のタン
パクが観察される。この結果から本酵素は分子量３2,０
００のαサブユニットと２5,０００のβサブユニットの
２種類のサブユニットが強固に会合した高分子タンパク
質であるといえる。こうして精製した超耐熱性プロテア
ソームのα，β両サブユニットの部分アミノ酸配列は例
えば次のようにして決定できる。以下、βサブユニット
について説明するが、αサブユニットに関しても後述す
る方法の組合せで部分アミノ酸配列が決定可能である。
−ＰＡＧＥを行うと本酵素は分子量２０0,０００のミオ
シンよりも更に高分子側の挙動を示す。しかし、酵素液
に終濃度０．５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え
て室温で１０分放置した後に中和してＳＤＳ−ＰＡＧＥ
を行うと分子量３2,０００と２5,０００の２種類のタン
パクが観察される。この結果から本酵素は分子量３2,０
００のαサブユニットと２5,０００のβサブユニットの
２種類のサブユニットが強固に会合した高分子タンパク
質であるといえる。こうして精製した超耐熱性プロテア
ソームのα，β両サブユニットの部分アミノ酸配列は例
えば次のようにして決定できる。以下、βサブユニット
について説明するが、αサブユニットに関しても後述す
る方法の組合せで部分アミノ酸配列が決定可能である。
【００１２】精製超耐熱性プロテアソーム溶液に終濃度
０．５％となるようにＴＦＡを加えて室温で１０分間放
置した後、ＮａＯＨで中和してレムリらの方法に従って
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。このゲル内のタンパクをポリ
ビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写
し、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（ＣＢＢ）
で染色される部分を切り出して自動アミノ酸シークエン
サーにかけると配列表の配列番号３に示すＮ末端アミノ
酸配列が決定できる。Ｎ末端がアセチル基やピログルタ
ミル基等でブロックされていてＮ末端アミノ酸配列が設
定できない場合はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク
質をエバーソルド（マイクロシークエンスのための微量
タンパク質精製法ｐ７１〜８６、マツダイラ編、中村ら
訳、１９９２年羊土社）の方法に従ってニトロセルロー
ス膜上で例えばリシルエンドペプチダーゼ、トリプシ
ン、Ｖ８プロテアーゼ、アスパラギニルエンドペプチダ
ーゼのように特異的なアミノ酸残基を認識して切断する
プロテアーゼのどれか一種類でニトロセルロース膜に結
合したタンパク質を限定分解し、分解されて膜から溶出
されてきたペプチド断片を逆相高速液体クロマトグラフ
ィーで精製して自動アミノ酸シークエンサーにかければ
Ｎ末端以外の部分のアミノ酸配列が決定できる。
０．５％となるようにＴＦＡを加えて室温で１０分間放
置した後、ＮａＯＨで中和してレムリらの方法に従って
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。このゲル内のタンパクをポリ
ビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写
し、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（ＣＢＢ）
で染色される部分を切り出して自動アミノ酸シークエン
サーにかけると配列表の配列番号３に示すＮ末端アミノ
酸配列が決定できる。Ｎ末端がアセチル基やピログルタ
ミル基等でブロックされていてＮ末端アミノ酸配列が設
定できない場合はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク
質をエバーソルド（マイクロシークエンスのための微量
タンパク質精製法ｐ７１〜８６、マツダイラ編、中村ら
訳、１９９２年羊土社）の方法に従ってニトロセルロー
ス膜上で例えばリシルエンドペプチダーゼ、トリプシ
ン、Ｖ８プロテアーゼ、アスパラギニルエンドペプチダ
ーゼのように特異的なアミノ酸残基を認識して切断する
プロテアーゼのどれか一種類でニトロセルロース膜に結
合したタンパク質を限定分解し、分解されて膜から溶出
されてきたペプチド断片を逆相高速液体クロマトグラフ
ィーで精製して自動アミノ酸シークエンサーにかければ
Ｎ末端以外の部分のアミノ酸配列が決定できる。
【００１３】こうして決定した部分アミノ酸配列を基
に、例えば次のようにしてプロテアソームα又はβサブ
ユニットの遺伝子をクローン化できる。以下にはβサブ
ユニット遺伝子のクローン化に関して説明するが、αサ
ブユニットに関しても同様である。部分アミノ酸配列を
決定したプロテアソームを生産する微生物を培養し、例
えばＳＤＳとプロテイナーゼＫで溶菌させてフェノール
を用いる通常の方法で菌体から染色体ＤＮＡを調製す
る。この調製方法は染色体ＤＮＡのライブラリーを作成
するのに適当なＤＮＡを得られる方法ならば他の方法で
もよい。制限酵素又は超音波等を用いて切断した染色体
ＤＮＡと直鎖化したベクターをＤＮＡリガーゼ等によっ
て連結し、この組換体ＤＮＡが複製可能な宿主に導入し
てライブラリーを作製する。クローニングに必要なライ
ブラリーのクローン数を少なくするために生産菌の染色
体ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションを行って目的
の遺伝子を含むＤＮＡ断片の分子量を決定し、アガロー
スゲル電気泳動でその断片を濃縮することも有効であ
る。染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＨｉｎｄII
I 、ＢａｍＨＩ、及びＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩで消化
し、アガロースゲル電気泳動で分離し、このＤＮＡ断片
を常法に従いニトロセルロース膜又はナイロン膜に転写
し、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼー
ションに用いるプローブとしては、βサブユニットの
部分アミノ酸配列の全てのコドンを含む混合合成ＤＮ
Ａ、プロテアソーム生産菌のコドン使用頻度を基にし
た、より少ない組合せの混合合成ＤＮＡ、２カ 所以上
のアミノ酸配列を基に混合プライマーを合成してポリメ
ラーゼ連鎖反応を行って得られるより長鎖のＤＮＡ、等
が挙げられるが、プロテアソームβサブユニット遺伝子
に特異的にハイブリダイズするものならばどのようなも
のでもよい。プローブの標識方法は32Ｐ、蛍光基、ビオ
チン等を５′又は３′末端、あるいはプローブＤＮＡの
内部に取り込ませる方法が挙げられるが、βサブユニッ
ト遺伝子とプローブのハイブリダイゼーションを検出で
きる方法ならばどれでもよい。配列表の配列番号４に示
される上記のプローブの５′末端を32Ｐで標識してサ
ザンハイブリダイゼーションを行うとプロテアソームβ
サブユニット遺伝子を含む制限酵素断片の分子量はＨｉ
ｎｄIII 消化した場合５．６kb、ＢａｍＨＩ消化した場
合１．９kb、ＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩで二重消化した
場合１．７kbと決定されるので目的の断片の両端は一方
がＨｉｎｄIII 部位、他方がＢａｍＨＩ部位であること
がわかる。ＢａｍＨＩで消化したピロコッカス フリオ
サスＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分離し、目的の
１．９kbＤＮＡ断片を含むゲル断片を切り出し、常法に
よってＤＮＡを回収し、そのＤＮＡを更にＨｉｎｄIII
で消化したのちアガロースゲル電気泳動で分離し、１．
７kbＤＮＡ断片を含むゲル片からＤＮＡを抽出すると目
的の１．７kb ＨｉｎｄIII ＋ＢａｍＨＩ断片が高度に
濃縮される。このＤＮＡ混合物を用いてライブラリーを
作製すると全ＤＮＡでライブラリーを作製する場合に比
べてより少数のクローンをスクリーニングすればよい。
に、例えば次のようにしてプロテアソームα又はβサブ
ユニットの遺伝子をクローン化できる。以下にはβサブ
ユニット遺伝子のクローン化に関して説明するが、αサ
ブユニットに関しても同様である。部分アミノ酸配列を
決定したプロテアソームを生産する微生物を培養し、例
えばＳＤＳとプロテイナーゼＫで溶菌させてフェノール
を用いる通常の方法で菌体から染色体ＤＮＡを調製す
る。この調製方法は染色体ＤＮＡのライブラリーを作成
するのに適当なＤＮＡを得られる方法ならば他の方法で
もよい。制限酵素又は超音波等を用いて切断した染色体
ＤＮＡと直鎖化したベクターをＤＮＡリガーゼ等によっ
て連結し、この組換体ＤＮＡが複製可能な宿主に導入し
てライブラリーを作製する。クローニングに必要なライ
ブラリーのクローン数を少なくするために生産菌の染色
体ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションを行って目的
の遺伝子を含むＤＮＡ断片の分子量を決定し、アガロー
スゲル電気泳動でその断片を濃縮することも有効であ
る。染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＨｉｎｄII
I 、ＢａｍＨＩ、及びＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩで消化
し、アガロースゲル電気泳動で分離し、このＤＮＡ断片
を常法に従いニトロセルロース膜又はナイロン膜に転写
し、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼー
ションに用いるプローブとしては、βサブユニットの
部分アミノ酸配列の全てのコドンを含む混合合成ＤＮ
Ａ、プロテアソーム生産菌のコドン使用頻度を基にし
た、より少ない組合せの混合合成ＤＮＡ、２カ 所以上
のアミノ酸配列を基に混合プライマーを合成してポリメ
ラーゼ連鎖反応を行って得られるより長鎖のＤＮＡ、等
が挙げられるが、プロテアソームβサブユニット遺伝子
に特異的にハイブリダイズするものならばどのようなも
のでもよい。プローブの標識方法は32Ｐ、蛍光基、ビオ
チン等を５′又は３′末端、あるいはプローブＤＮＡの
内部に取り込ませる方法が挙げられるが、βサブユニッ
ト遺伝子とプローブのハイブリダイゼーションを検出で
きる方法ならばどれでもよい。配列表の配列番号４に示
される上記のプローブの５′末端を32Ｐで標識してサ
ザンハイブリダイゼーションを行うとプロテアソームβ
サブユニット遺伝子を含む制限酵素断片の分子量はＨｉ
ｎｄIII 消化した場合５．６kb、ＢａｍＨＩ消化した場
合１．９kb、ＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩで二重消化した
場合１．７kbと決定されるので目的の断片の両端は一方
がＨｉｎｄIII 部位、他方がＢａｍＨＩ部位であること
がわかる。ＢａｍＨＩで消化したピロコッカス フリオ
サスＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分離し、目的の
１．９kbＤＮＡ断片を含むゲル断片を切り出し、常法に
よってＤＮＡを回収し、そのＤＮＡを更にＨｉｎｄIII
で消化したのちアガロースゲル電気泳動で分離し、１．
７kbＤＮＡ断片を含むゲル片からＤＮＡを抽出すると目
的の１．７kb ＨｉｎｄIII ＋ＢａｍＨＩ断片が高度に
濃縮される。このＤＮＡ混合物を用いてライブラリーを
作製すると全ＤＮＡでライブラリーを作製する場合に比
べてより少数のクローンをスクリーニングすればよい。
【００１４】作製したライブラリーをサザンハイブリダ
イゼーションに使用できるプローブの内のどれかを用い
てコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブ
リダイゼーションによってスクリーニングしてプロテア
ソームβサブユニット遺伝子の少なくとも一部を含むＤ
ＮＡ断片を得る。例えば上記ＤＮＡ混合物をＨｉｎｄII
I とＢａｍＨＩで二重消化したｐＵＣ１１９と連結し、
大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換したのちサザンハイブリ
ダイゼーションで用いたプローブによるコロニーハイブ
リダイゼーションでスクリーニングすればプロテアソー
ムβサブユニットをコードするＤＮＡ断片を挿入断片と
して持つプラスミドｐＰＲＯβＢＨが得られる。ｐＰＲ
ＯβＢＨの制限酵素地図を図９に示す。もしこうして得
られた断片が目的の遺伝子の一部しか含まない場合はこ
の断片をプローブにして別の制限酵素で作製したライブ
ラリーをスクリーニングすることにより全長をコードす
るＤＮＡ断片が得られる。
イゼーションに使用できるプローブの内のどれかを用い
てコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブ
リダイゼーションによってスクリーニングしてプロテア
ソームβサブユニット遺伝子の少なくとも一部を含むＤ
ＮＡ断片を得る。例えば上記ＤＮＡ混合物をＨｉｎｄII
I とＢａｍＨＩで二重消化したｐＵＣ１１９と連結し、
大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換したのちサザンハイブリ
ダイゼーションで用いたプローブによるコロニーハイブ
リダイゼーションでスクリーニングすればプロテアソー
ムβサブユニットをコードするＤＮＡ断片を挿入断片と
して持つプラスミドｐＰＲＯβＢＨが得られる。ｐＰＲ
ＯβＢＨの制限酵素地図を図９に示す。もしこうして得
られた断片が目的の遺伝子の一部しか含まない場合はこ
の断片をプローブにして別の制限酵素で作製したライブ
ラリーをスクリーニングすることにより全長をコードす
るＤＮＡ断片が得られる。
【００１５】プラスミドｐＰＲＯβＢＨにより形質転換
された大腸菌ＪＭ１０９株はEscherichia coli JM109／
pPROβBHと命名、表示され、工業技術院生命工学工業技
術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３９８７として寄託されて
いる。
された大腸菌ＪＭ１０９株はEscherichia coli JM109／
pPROβBHと命名、表示され、工業技術院生命工学工業技
術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３９８７として寄託されて
いる。
【００１６】こうしてクローン化できたプロテアソーム
βサブユニット遺伝子のＤＮＡ塩基配列は例えばジデオ
キシ法又はマクサム・ギムバート法によって決定でき
る。１．７kb ＤＮＡ断片を種々の制限酵素で断片化し
てサブクローニングし、内部配列の決定を容易にする、
決定された部分配列を元に新たに配列決定用のプライマ
ーを合成して端から順番に配列を決定する、適当な制限
酵素で配列決定に都合のよい欠失プラスミドを構築す
る、等の方法を組合せれば１．７kb断片のＤＮＡ塩基配
列を決定できる。本断片には１９６アミノ酸残基からな
るオープンリーディングフレームが認められ、Ｎ末端か
ら７番目のスレオニン残基以下がプロテアソームβサブ
ユニットのＮ末端配列と完全に一致する。プロテアソー
ムβサブユニットをコードする領域のＤＮＡ塩基配列を
配列表の配列番号５に示す。すなわち配列表の配列番号
５は本発明により得られるプロテアソームβサブユニッ
ト遺伝子のＤＮＡ塩基配列の一例である。該ＤＮＡ塩基
配列から推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号２
に示す。
βサブユニット遺伝子のＤＮＡ塩基配列は例えばジデオ
キシ法又はマクサム・ギムバート法によって決定でき
る。１．７kb ＤＮＡ断片を種々の制限酵素で断片化し
てサブクローニングし、内部配列の決定を容易にする、
決定された部分配列を元に新たに配列決定用のプライマ
ーを合成して端から順番に配列を決定する、適当な制限
酵素で配列決定に都合のよい欠失プラスミドを構築す
る、等の方法を組合せれば１．７kb断片のＤＮＡ塩基配
列を決定できる。本断片には１９６アミノ酸残基からな
るオープンリーディングフレームが認められ、Ｎ末端か
ら７番目のスレオニン残基以下がプロテアソームβサブ
ユニットのＮ末端配列と完全に一致する。プロテアソー
ムβサブユニットをコードする領域のＤＮＡ塩基配列を
配列表の配列番号５に示す。すなわち配列表の配列番号
５は本発明により得られるプロテアソームβサブユニッ
ト遺伝子のＤＮＡ塩基配列の一例である。該ＤＮＡ塩基
配列から推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号２
に示す。
【００１７】また、プロテアソームαサブユニットをコ
ードする遺伝子についても同様にクローニングを行うこ
とができるが、特に本発明者らは、中等度好熱性古細菌
であるサーモプラズマ アシドフィラムのプロテアソー
ムβサブユニット遺伝子〔ズウィックル（Zwickl) ら、
フェブス レターズ（FEBS Letters) 第２７８巻、第２
１７〜２２１頁（１９９１）〕が報告されているのに着
目し該遺伝子情報を基に超好熱性古細菌であるピロコッ
カス フリオサスのプロテアソーム遺伝子をスクリーニ
ングする方法を検討した。中等度好熱性古細菌の遺伝子
により超好熱性古細菌の遺伝子が単離された例はない。
ードする遺伝子についても同様にクローニングを行うこ
とができるが、特に本発明者らは、中等度好熱性古細菌
であるサーモプラズマ アシドフィラムのプロテアソー
ムβサブユニット遺伝子〔ズウィックル（Zwickl) ら、
フェブス レターズ（FEBS Letters) 第２７８巻、第２
１７〜２２１頁（１９９１）〕が報告されているのに着
目し該遺伝子情報を基に超好熱性古細菌であるピロコッ
カス フリオサスのプロテアソーム遺伝子をスクリーニ
ングする方法を検討した。中等度好熱性古細菌の遺伝子
により超好熱性古細菌の遺伝子が単離された例はない。
【００１８】サーモプラズマ アシドフィラムのゲノム
遺伝子を鋳型としてＰＣＲ反応により合成したプローブ
を用いてピロコッカス フリオサスのゲノムＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングしたところ、驚くべきことに
ピロコッカス フリオサスのプロテアソームαサブユニ
ット遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることが可能であっ
た。
遺伝子を鋳型としてＰＣＲ反応により合成したプローブ
を用いてピロコッカス フリオサスのゲノムＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングしたところ、驚くべきことに
ピロコッカス フリオサスのプロテアソームαサブユニ
ット遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることが可能であっ
た。
【００１９】プロテアソームαサブユニットをコードす
る領域のＤＮＡ塩基配列を配列表の配列番号６に示す。
すなわち配列表の配列番号６は本発明により得られるプ
ロテアソームαサブユニット遺伝子のＤＮＡ塩基配列の
一例である。該ＤＮＡ塩基配列から推定されるアミノ酸
配列を配列表の配列番号１に示す。
る領域のＤＮＡ塩基配列を配列表の配列番号６に示す。
すなわち配列表の配列番号６は本発明により得られるプ
ロテアソームαサブユニット遺伝子のＤＮＡ塩基配列の
一例である。該ＤＮＡ塩基配列から推定されるアミノ酸
配列を配列表の配列番号１に示す。
【００２０】本発明により単離された遺伝子を適当な宿
主−ベクター系に組込むことにより超耐熱性プロテアソ
ームの遺伝子工学的生産が可能である。遺伝子工学的生
産方法の主なものとしてはα、β両サブユニット遺伝
子を同一の宿主細胞に導入し、細胞内でプロテアソーム
を構成させる方法、α、β両サブユニットを別々に発
現させて試験管内で混合してプロテアソームを構成させ
る方法、が挙げられる。例えば、プロテアソームαサブ
ユニットをコードする遺伝子を用いて適当な発現用プラ
スミドを構築し、適当な宿主を形質転換して該形質転換
体を培養し、αサブユニットを生産させることができ
る。図１０に発現用プラスミドｐＰＲＯＮ０．７の制限
酵素地図を示す。ｐＰＲＯＮ０．７により形質転換され
た大腸菌ＪＭ１０９株はEscherichia cili JM109／pPRO
N 0.7 と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術
研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３９８６として寄託されてい
る。
主−ベクター系に組込むことにより超耐熱性プロテアソ
ームの遺伝子工学的生産が可能である。遺伝子工学的生
産方法の主なものとしてはα、β両サブユニット遺伝
子を同一の宿主細胞に導入し、細胞内でプロテアソーム
を構成させる方法、α、β両サブユニットを別々に発
現させて試験管内で混合してプロテアソームを構成させ
る方法、が挙げられる。例えば、プロテアソームαサブ
ユニットをコードする遺伝子を用いて適当な発現用プラ
スミドを構築し、適当な宿主を形質転換して該形質転換
体を培養し、αサブユニットを生産させることができ
る。図１０に発現用プラスミドｐＰＲＯＮ０．７の制限
酵素地図を示す。ｐＰＲＯＮ０．７により形質転換され
た大腸菌ＪＭ１０９株はEscherichia cili JM109／pPRO
N 0.7 と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術
研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３９８６として寄託されてい
る。
【００２１】以上詳細に説明したように本発明により超
耐熱性プロテアソーム及び該酵素のサブユニットをコー
ドする遺伝子が提供される。該酵素は高度の耐熱性を持
つ新規酵素であり、高温下での食品加工、タンパク質工
学処理、化学工業等に特に有用である。
耐熱性プロテアソーム及び該酵素のサブユニットをコー
ドする遺伝子が提供される。該酵素は高度の耐熱性を持
つ新規酵素であり、高温下での食品加工、タンパク質工
学処理、化学工業等に特に有用である。
【００２２】
【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明が以
下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
【００２３】実施例１
（超耐熱性プロテアソームの精製）ピロコッカス フリ
オサスＤＳＭ３６３８の培養は以下のようにして行っ
た。トリプトン１％、イーストエキス０．５％、可溶性
でんぷん１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジャマリンラ
ボラトリー社製）３．５％、ジャマリンＳ・リキッド
（ジャマリンラボラトリー社製）０．５％、ＭｇＳＯ4
０．００３％、ＮａＣｌ ０．００１％、ＦｅＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏ ０．０００１％、ＣｏＳＯ4 ０．０００１
％、ＣａＣｌ2 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０００１％、ＺｎＳＯ
4 ０．０００１％、ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．１ppm
、ＫＡｌ（ＳＯ4 ）2 ０．１ppm 、Ｈ3 ＢＯ3 ０．１p
pm 、Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ０．１ppm 、ＮｉＣ
ｌ2 ・６Ｈ2Ｏ ０．２５ppm の組成の培地２リットル
を２リットル容のメディウムボトルに入れ、１２０℃、
２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み溶存酸素を除
去した後、これに上記菌株を接種して９５℃、１６時間
静置培養した。培養後、遠心分離によって菌株を集め、
３０mlのＴＥＤ（２０mMトリス−ＨＣｌ ｐＨ８、１mM
ＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴ）に懸濁したあと超音波処理を
行って菌体を破砕した。超音波破砕物を２0,０００×
ｇ、１５分間遠心し、その上清を更に１０0,０００×
ｇ、１．５時間遠心して上清を得、これを粗抽出液とし
た。該粗抽出液の陰イオン交換クロマトグラフィーをモ
ノＱＨＲ１６／１０カラム（ファルマシア社製）を用い
て行った。カラムを吸着した菌体成分はＴＥＤと１Ｍ
ＮａＣｌを含むＴＥＤの直線濃度勾配によって溶出し
た。ＬＬＶＹ−ＭＣＡを基質として各画分の酵素活性を
測定し、約０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出される活性画分を
硫安沈殿して少量のＴＥＤに溶解し、０．５Ｍ ＮａＣ
ｌを含むＴＥＤで平衡化したセファクリルＳ−３００で
ゲルろ過を行った。ＬＬＶＹ−ＭＣＡ加水分解活性のあ
る画分を集め、酵素標品とした。 （Ｎ末端アミノ酸配列の決定）以上のようにして得られ
た酵素標品に最終濃度０．５％となるようにＴＦＡを加
え、室温で１０分間放置した。これをＮａＯＨで中和し
た後ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜に電気的に転
写した。この膜をＣＢＢで染色したところ分子量３2,０
００と２5,０００のタンパクがみられ、前者をαサブユ
ニット、後者をβサブユニットと命名した。これらの染
色バンドを切り抜いてアミノ酸自動シークエンサーでＮ
末端アミノ酸配列を分析した結果、αサブユニットはＮ
末端がブロックされていたために配列が読めなかったβ
サブユニットのＮ末端アミノ酸配列は配列表の配列番号
３の通りであった。
オサスＤＳＭ３６３８の培養は以下のようにして行っ
た。トリプトン１％、イーストエキス０．５％、可溶性
でんぷん１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジャマリンラ
ボラトリー社製）３．５％、ジャマリンＳ・リキッド
（ジャマリンラボラトリー社製）０．５％、ＭｇＳＯ4
０．００３％、ＮａＣｌ ０．００１％、ＦｅＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏ ０．０００１％、ＣｏＳＯ4 ０．０００１
％、ＣａＣｌ2 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０００１％、ＺｎＳＯ
4 ０．０００１％、ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ ０．１ppm
、ＫＡｌ（ＳＯ4 ）2 ０．１ppm 、Ｈ3 ＢＯ3 ０．１p
pm 、Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ ０．１ppm 、ＮｉＣ
ｌ2 ・６Ｈ2Ｏ ０．２５ppm の組成の培地２リットル
を２リットル容のメディウムボトルに入れ、１２０℃、
２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み溶存酸素を除
去した後、これに上記菌株を接種して９５℃、１６時間
静置培養した。培養後、遠心分離によって菌株を集め、
３０mlのＴＥＤ（２０mMトリス−ＨＣｌ ｐＨ８、１mM
ＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴ）に懸濁したあと超音波処理を
行って菌体を破砕した。超音波破砕物を２0,０００×
ｇ、１５分間遠心し、その上清を更に１０0,０００×
ｇ、１．５時間遠心して上清を得、これを粗抽出液とし
た。該粗抽出液の陰イオン交換クロマトグラフィーをモ
ノＱＨＲ１６／１０カラム（ファルマシア社製）を用い
て行った。カラムを吸着した菌体成分はＴＥＤと１Ｍ
ＮａＣｌを含むＴＥＤの直線濃度勾配によって溶出し
た。ＬＬＶＹ−ＭＣＡを基質として各画分の酵素活性を
測定し、約０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出される活性画分を
硫安沈殿して少量のＴＥＤに溶解し、０．５Ｍ ＮａＣ
ｌを含むＴＥＤで平衡化したセファクリルＳ−３００で
ゲルろ過を行った。ＬＬＶＹ−ＭＣＡ加水分解活性のあ
る画分を集め、酵素標品とした。 （Ｎ末端アミノ酸配列の決定）以上のようにして得られ
た酵素標品に最終濃度０．５％となるようにＴＦＡを加
え、室温で１０分間放置した。これをＮａＯＨで中和し
た後ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜に電気的に転
写した。この膜をＣＢＢで染色したところ分子量３2,０
００と２5,０００のタンパクがみられ、前者をαサブユ
ニット、後者をβサブユニットと命名した。これらの染
色バンドを切り抜いてアミノ酸自動シークエンサーでＮ
末端アミノ酸配列を分析した結果、αサブユニットはＮ
末端がブロックされていたために配列が読めなかったβ
サブユニットのＮ末端アミノ酸配列は配列表の配列番号
３の通りであった。
【００２４】実施例２
（ピロコッカス フリオサスゲノムＤＮＡの調製）実施
例１に示した方法でピロコッカス フリオサスを培養し
て得た菌体を２５％スクロースを含む０．０５Ｍトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４mlに懸濁し、この懸濁液に
０．２Ｍ ＥＤＴＡ２mlとＳＥＴ溶液〔１５０mM Ｎａ
Ｃｌ、１mMＥＤＴＡ、２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）〕２４mlを加え、更に５％ＳＤＳ４mlと１０mg／ml
プロテイナーゼＫ４００μｌを加えて３７℃、１時間反
応させた。反応終了後フェノール−クロロホルム抽出、
続いてエタノール沈殿を行い、約３．２mgのゲノムＤＮ
Ａを調製した。
例１に示した方法でピロコッカス フリオサスを培養し
て得た菌体を２５％スクロースを含む０．０５Ｍトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４mlに懸濁し、この懸濁液に
０．２Ｍ ＥＤＴＡ２mlとＳＥＴ溶液〔１５０mM Ｎａ
Ｃｌ、１mMＥＤＴＡ、２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）〕２４mlを加え、更に５％ＳＤＳ４mlと１０mg／ml
プロテイナーゼＫ４００μｌを加えて３７℃、１時間反
応させた。反応終了後フェノール−クロロホルム抽出、
続いてエタノール沈殿を行い、約３．２mgのゲノムＤＮ
Ａを調製した。
【００２５】（αサブユニット遺伝子のクローニング）
サーモプラズマ アシドフィラムゲノムＤＮＡを鋳型、
配列表の配列番号７と配列表の配列番号８に示すＤＮＡ
をプライマーとしてＰＣＲ反応を行ったところ３４７bp
のＤＮＡ断片が増幅した。この断片をアガロースゲル電
気泳動とイージートラップ（EASYTRAPTM、宝酒造社製）
で精製し、ランダムプライマーＤＮＡラベリングキット
（宝酒造社製）によって〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ（アマシ
ャム社製）で標識した。ピロコッカス フリオサスゲノ
ムＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化し、アガロースゲル電気泳動
によって分離した後ゲル中のＤＮＡをサムブルックら
〔コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発
行、Ｔ．マニアティス（T. Maniatis)ほか著、モレキュ
ラー クローニング、ア ラボラトリー マニュアル
（Molecular Cloning,Ａ Laboratory Manual) 、第２
版、第９．３８〜９．４０頁（１９８９）〕の方法によ
りナイロン膜に転写した。上記標識ＤＮＡをプローブと
してサムブルックら〔コールド スプリング ハーバー
ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティスほか著、モレキ
ュラー クローニング、ア ラボラトリー マニュア
ル、第２版、第９．５２〜９．５５頁（１９８９）〕の
方法により上記ナイロン膜上のＤＮＡと５０℃で一晩ハ
イブリダイズさせ、０．２×ＳＳＣ中、室温で洗ったあ
とオートラジオグラフィーを行った。その結果、１．７
kbの断片がプローブとハイブリダイズすることが明らか
となった。
サーモプラズマ アシドフィラムゲノムＤＮＡを鋳型、
配列表の配列番号７と配列表の配列番号８に示すＤＮＡ
をプライマーとしてＰＣＲ反応を行ったところ３４７bp
のＤＮＡ断片が増幅した。この断片をアガロースゲル電
気泳動とイージートラップ（EASYTRAPTM、宝酒造社製）
で精製し、ランダムプライマーＤＮＡラベリングキット
（宝酒造社製）によって〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ（アマシ
ャム社製）で標識した。ピロコッカス フリオサスゲノ
ムＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化し、アガロースゲル電気泳動
によって分離した後ゲル中のＤＮＡをサムブルックら
〔コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発
行、Ｔ．マニアティス（T. Maniatis)ほか著、モレキュ
ラー クローニング、ア ラボラトリー マニュアル
（Molecular Cloning,Ａ Laboratory Manual) 、第２
版、第９．３８〜９．４０頁（１９８９）〕の方法によ
りナイロン膜に転写した。上記標識ＤＮＡをプローブと
してサムブルックら〔コールド スプリング ハーバー
ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティスほか著、モレキ
ュラー クローニング、ア ラボラトリー マニュア
ル、第２版、第９．５２〜９．５５頁（１９８９）〕の
方法により上記ナイロン膜上のＤＮＡと５０℃で一晩ハ
イブリダイズさせ、０．２×ＳＳＣ中、室温で洗ったあ
とオートラジオグラフィーを行った。その結果、１．７
kbの断片がプローブとハイブリダイズすることが明らか
となった。
【００２６】ピロコッカス フリオサスゲノムＤＮＡ１
００μｇをＥｃｏＲＩ消化し、アガロースゲル電気泳動
を行い、１．７kbのＤＮＡを含むゲル断片を切り出し、
イージーラップでＤＮＡを抽出した。このＤＮＡをλｇ
ｔ１０ ＥｃｏＲＩアーム（ストラタジーン社製）に連
結し、ギガパック ゴールド（GIGAPACK GOLD)（ストラ
タジーン社製）にパッケージングした。こうして作製し
たライブラリーをサザンハイブリダイゼーションに用い
たプローブでスクリーニングして陽性クローンλｐｒｏ
２を得、λｐｒｏ２の挿入断片をｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒
造社製）にサブクローニングしてｐＰＲＯ１．７を得
た。ｐＰＲＯ１．７中に挿入されているＤＮＡ断片につ
いて、ジデオキシ法によりＤＮＡ塩基配列を決定した。
配列表の配列番号６に該配列の一部を示す。すなわち配
列表の配列番号６は本発明により得られるプロテアソー
ムαサブユニットの遺伝子のＤＮＡ塩基配列の１例であ
る。該配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号１示
す。
００μｇをＥｃｏＲＩ消化し、アガロースゲル電気泳動
を行い、１．７kbのＤＮＡを含むゲル断片を切り出し、
イージーラップでＤＮＡを抽出した。このＤＮＡをλｇ
ｔ１０ ＥｃｏＲＩアーム（ストラタジーン社製）に連
結し、ギガパック ゴールド（GIGAPACK GOLD)（ストラ
タジーン社製）にパッケージングした。こうして作製し
たライブラリーをサザンハイブリダイゼーションに用い
たプローブでスクリーニングして陽性クローンλｐｒｏ
２を得、λｐｒｏ２の挿入断片をｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒
造社製）にサブクローニングしてｐＰＲＯ１．７を得
た。ｐＰＲＯ１．７中に挿入されているＤＮＡ断片につ
いて、ジデオキシ法によりＤＮＡ塩基配列を決定した。
配列表の配列番号６に該配列の一部を示す。すなわち配
列表の配列番号６は本発明により得られるプロテアソー
ムαサブユニットの遺伝子のＤＮＡ塩基配列の１例であ
る。該配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号１示
す。
【００２７】（βサブユニット遺伝子のクローニング）
ピロコッカス フリオサスゲノムＤＮＡをＨｉｎｄIII
、ＢａｍＨＩ、及びＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩの３種
類の方法で消化し、アガロースゲル電気泳動によって分
離した後ゲル中のＤＮＡをサムブルックら〔コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マニア
ティスほか著、モレキュラー クローニング、ア ラボ
ラトリー マニュアル、第２版、第９．３８〜９．４０
頁（１９８９）〕の方法によりナイロン膜に転写した。
一方βサブユニットのＮ末端アミノ酸配列をもとに配列
表の配列番号４に示す混合ＤＮＡを合成し、メガラベル
(MEGALABELTM、寳酒造社製）と〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ（ア
マシャム社製）でこのＤＮＡを標識した。この標識ＤＮ
Ａをプローブとしてサムブルックら〔コールド スプリ
ング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス
ほか著、モレキュラー クローニング、ア ラボラトリ
ー マニュアル、第２版、第９．５２〜９．５５頁（１
９８９）〕の方法により上記ナイロン膜上のＤＮＡと５
０℃で一晩ハイブリダイズさせ、０．２×ＳＳＣ中、室
温で洗ったあとオートラジオグラフィーを行った。その
結果、ＨｉｎｄIII 消化した場合５．６kb、ＢａｍＨＩ
消化した場合１．９kb、ＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩで二
重消化した場合１．７kbの断片がプローブとハイブリダ
イズすることが明らかとなった。
ピロコッカス フリオサスゲノムＤＮＡをＨｉｎｄIII
、ＢａｍＨＩ、及びＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩの３種
類の方法で消化し、アガロースゲル電気泳動によって分
離した後ゲル中のＤＮＡをサムブルックら〔コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マニア
ティスほか著、モレキュラー クローニング、ア ラボ
ラトリー マニュアル、第２版、第９．３８〜９．４０
頁（１９８９）〕の方法によりナイロン膜に転写した。
一方βサブユニットのＮ末端アミノ酸配列をもとに配列
表の配列番号４に示す混合ＤＮＡを合成し、メガラベル
(MEGALABELTM、寳酒造社製）と〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ（ア
マシャム社製）でこのＤＮＡを標識した。この標識ＤＮ
Ａをプローブとしてサムブルックら〔コールド スプリ
ング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス
ほか著、モレキュラー クローニング、ア ラボラトリ
ー マニュアル、第２版、第９．５２〜９．５５頁（１
９８９）〕の方法により上記ナイロン膜上のＤＮＡと５
０℃で一晩ハイブリダイズさせ、０．２×ＳＳＣ中、室
温で洗ったあとオートラジオグラフィーを行った。その
結果、ＨｉｎｄIII 消化した場合５．６kb、ＢａｍＨＩ
消化した場合１．９kb、ＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩで二
重消化した場合１．７kbの断片がプローブとハイブリダ
イズすることが明らかとなった。
【００２８】ＢａｍＨＩで消化したピロコッカス フリ
オサスゲノムＤＮＡ１００μｇをアガロースゲル電気泳
動によって分離し、１．９kbのＤＮＡを含むゲル片を切
り出してイージートラップ（宝酒造社製）を用いてゲル
片からＤＮＡを抽出した。このＤＮＡをＨｉｎｄIII で
消化し、同様にアガロースゲル電気泳動を行って１．７
kbのＤＮＡ断片を抽出した。こうして得られたＤＮＡを
ＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＵＣ
１１９にＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）で
連結し、このＤＮＡ溶液で形質転換した大腸菌ＪＭ１０
９をサザンハイブリダイゼーションのプローブでコロニ
ーハイブリダイゼーションによってスクリーニングする
ことによりプラスミドｐＰＲＯβＢＨを得た。図９にプ
ラスミドｐＰＲＯβＢＨの制限酵素地図を示す。
オサスゲノムＤＮＡ１００μｇをアガロースゲル電気泳
動によって分離し、１．９kbのＤＮＡを含むゲル片を切
り出してイージートラップ（宝酒造社製）を用いてゲル
片からＤＮＡを抽出した。このＤＮＡをＨｉｎｄIII で
消化し、同様にアガロースゲル電気泳動を行って１．７
kbのＤＮＡ断片を抽出した。こうして得られたＤＮＡを
ＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＵＣ
１１９にＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）で
連結し、このＤＮＡ溶液で形質転換した大腸菌ＪＭ１０
９をサザンハイブリダイゼーションのプローブでコロニ
ーハイブリダイゼーションによってスクリーニングする
ことによりプラスミドｐＰＲＯβＢＨを得た。図９にプ
ラスミドｐＰＲＯβＢＨの制限酵素地図を示す。
【００２９】プラスミドｐＰＲＯβＢＨにより形質転換
された大腸菌ＪＭ１０９株はEscherichia coli JM109／
pPROβBHと命名、表示され、工業技術院生命工学工業技
術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３９８７として寄託されて
いる。
された大腸菌ＪＭ１０９株はEscherichia coli JM109／
pPROβBHと命名、表示され、工業技術院生命工学工業技
術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３９８７として寄託されて
いる。
【００３０】プラスミドｐＰＲＯβＢＨにつき、様々な
欠失プラスミドを構築し、ジデオキシ法により挿入断片
のＤＮＡ塩基配列を決定した。配列表の配列番号５に該
配列を示す。すなわち配列表の配列番号５は本発明によ
り得られるプロテアソームβサブユニット遺伝子のＤＮ
Ａ塩基配列の１例である。該ＤＮＡ塩基配列から推定さ
れるアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。
欠失プラスミドを構築し、ジデオキシ法により挿入断片
のＤＮＡ塩基配列を決定した。配列表の配列番号５に該
配列を示す。すなわち配列表の配列番号５は本発明によ
り得られるプロテアソームβサブユニット遺伝子のＤＮ
Ａ塩基配列の１例である。該ＤＮＡ塩基配列から推定さ
れるアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。
【００３１】（αサブユニット遺伝子の発現）配列表の
配列番号９に示すＤＮＡを合成し、メガラベルとＡＴＰ
で５′末端をリン酸化した。このＤＮＡをプライマー、
ｐＰＲＯ１．７を鋳型としてミュータン（Mutan)TM−Ｋ
（宝酒造社製）でαサブユニット遺伝子の開始コドンの
位置にＮｃｏＩ部位を導入した。こうして得られたプラ
スミドｐＰＲＯＮ１．７をＮｃｏＩ消化し、再び環化さ
せることによってベクター由来のｌａｃプロモーターと
翻訳開始点のすぐ下流にαサブユニットのコード域を持
つプラスミドｐＰＲＯＮ１．２を構築した。ｐＰＲＯＮ
１．２をＦｏｋＩで消化し、クレノウフラグメント（宝
酒造社製）を用いて末端を平滑化した後、アガロースゲ
ル電気泳動とイージートラップにより約２．３kbのＤＮ
Ａ断片を精製した。該断片をＮｃｏＩで消化し、これを
ＮｃｏＩ及びＨｉｎｃIIにより二重消化したプラスミド
ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）と連結し、得られたプラ
スミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換
体からプラスミドを調製し、約０．７kbの挿入断片を持
つプラスミドｐＰＲＯＮ０．７を得た。図１０にｐＰＲ
ＯＮ０．７の制限酵素地図を示す。ｐＰＲＯＮ０．７に
より形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は Escherichia
coli JM109/pPRON0.7と命名、表示され、工業技術院生
命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３９８６とし
て寄託されている。Escherichia coli JM109/pPRON0.7
を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドと
アンピシリンを加えたＬ−ブロス培地で培養すると、タ
ンパク質の発現がみられた。該タンパク質を精製してＮ
末端のアミノ酸配列を解析したところ、配列表の配列番
号１のＮ末端のメチオニンが除去され、Ｎ末端から２番
目のアラニンから始まる配列を有していた。
配列番号９に示すＤＮＡを合成し、メガラベルとＡＴＰ
で５′末端をリン酸化した。このＤＮＡをプライマー、
ｐＰＲＯ１．７を鋳型としてミュータン（Mutan)TM−Ｋ
（宝酒造社製）でαサブユニット遺伝子の開始コドンの
位置にＮｃｏＩ部位を導入した。こうして得られたプラ
スミドｐＰＲＯＮ１．７をＮｃｏＩ消化し、再び環化さ
せることによってベクター由来のｌａｃプロモーターと
翻訳開始点のすぐ下流にαサブユニットのコード域を持
つプラスミドｐＰＲＯＮ１．２を構築した。ｐＰＲＯＮ
１．２をＦｏｋＩで消化し、クレノウフラグメント（宝
酒造社製）を用いて末端を平滑化した後、アガロースゲ
ル電気泳動とイージートラップにより約２．３kbのＤＮ
Ａ断片を精製した。該断片をＮｃｏＩで消化し、これを
ＮｃｏＩ及びＨｉｎｃIIにより二重消化したプラスミド
ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）と連結し、得られたプラ
スミドで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換
体からプラスミドを調製し、約０．７kbの挿入断片を持
つプラスミドｐＰＲＯＮ０．７を得た。図１０にｐＰＲ
ＯＮ０．７の制限酵素地図を示す。ｐＰＲＯＮ０．７に
より形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は Escherichia
coli JM109/pPRON0.7と命名、表示され、工業技術院生
命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３９８６とし
て寄託されている。Escherichia coli JM109/pPRON0.7
を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドと
アンピシリンを加えたＬ−ブロス培地で培養すると、タ
ンパク質の発現がみられた。該タンパク質を精製してＮ
末端のアミノ酸配列を解析したところ、配列表の配列番
号１のＮ末端のメチオニンが除去され、Ｎ末端から２番
目のアラニンから始まる配列を有していた。
【００３２】
【発明の効果】本発明により、工業的に有用な超耐熱性
プロテアソーム及び該プロテアソームのα，βサブユニ
ットの遺伝子が提供される。
プロテアソーム及び該プロテアソームのα，βサブユニ
ットの遺伝子が提供される。
【００３３】
【００３４】配列番号：1
配列の長さ：194
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ヒ゜ロコッカス フリオサス（Pyrococcus furiosus ）
配列：
Met Ala Phe Val Pro Pro Gln Ala Gly Tyr Asp Arg Ala Ile Thr
5 10 15
Val Phe Ser Pro Asp Gly Arg Leu Phe Gln Val Asn Tyr Ala Arg
20 25 30
Glu Ala Val Lys Arg Gly Ala Thr Ala Val Gly Val Lys Cys Gly
35 40 45
Glu Gly Val Val Leu Ala Val Glu Lys Arg Ile Thr Ser Arg Leu
50 55 60
Ile Glu Pro Asp Ser Tyr Glu Lys Ile Phe Gln Ile Asp Asp His
65 70 75
Ile Ala Ala Ala Ser Ser Gly Ile Ile Ala Asp Ala Arg Val Leu
80 85 90
Val Asn Arg Ala Arg Leu Glu Ala Gln Ile Tyr Arg Leu Thr Tyr
95 100 105
Gly Glu Pro Ala Pro Val Ser Val Ile Val Lys Lys Ile Cys Asp
110 115 120
Leu Lys Gln Met His Thr Gln Tyr Gly Gly Val Arg Pro Phe Gly
125 130 135
Ala Ala Leu Leu Met Ala Gly Ile Asn Asp Arg Pro Glu Leu Tyr
140 145 150
Glu Thr Asp Pro Ser Gly Ala Tyr Phe Ala Trp Lys Ala Val Ala
155 160 165
Ile Gly Ser Gly Arg Asn Thr Ala Met Ala Ile Phe Glu Glu Lys
170 175 180
Tyr Arg Asp Asp Met Asn Leu Glu Asp Ala Ile Ser Trp Leu
185 190
【００３５】配列番号：2
配列の長さ：190
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ヒ゜ロコッカス フリオサス（Pyrococcus furiosus ）
配列：
Thr Thr Thr Val Gly Ile Lys Val Lys Asp Gly Val Val Leu Ala
5 10 15
Ala Asp Thr Gln Ala Ser Leu Asp His Met Val Glu Thr Leu Asn
20 25 30
Ile Lys Lys Ile Ile Pro Ile Thr Asp Arg Ile Ala Ile Thr Thr
35 40 45
Ala Gly Ser Val Gly Asp Val Gln Met Leu Ala Arg Tyr Leu Glu
50 55 60
Ala Glu Ala Arg Tyr Tyr Tyr Phe Thr Trp Gly Arg Pro Met Thr
65 70 75
Thr Lys Ala Met Ala Asn Leu Leu Ser Asn Ile Leu Asn Glu Asn
80 85 90
Arg Trp Phe Pro Tyr Leu Val Gln Ile Ile Ile Gly Gly Tyr Val
95 100 105
Asp Glu Pro Thr Ile Ala Asn Leu Asp Pro Phe Gly Gly Leu Ile
110 115 120
Phe Asp Asp Tyr Thr Ala Thr Gly Ser Gly Thr Pro Phe Ala Ile
125 130 135
Ala Val Leu Glu Glu Gly Tyr Arg Glu Asp Leu Thr Ile Glu Glu
140 145 150
Ala Lys Glu Leu Ala Ile Arg Ala Val Arg Ala Ala Gly Arg Arg
155 160 165
Asp Val Tyr Thr Gly Ser Lys Lys Val Gln Val Val Thr Ile Thr
170 175 180
Lys Asp Gly Met Lys Glu Glu Phe Val Val
185 190
【００３６】配列番号：3
配列の長さ：20
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
起源
生物名：ヒ゜ロコッカス フリオサス (Pyrococcus furiosus)
配列
Thr Thr Thr Val Gly Ile Lys Val Lys Asp Gly Val Val Leu Ala
1 5 10 15
Ala Asp Thr Gln Ala
20
【００３７】配列番号：4
配列の長さ：19
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA ）
配列
AARGTNAARG AYGGNGTNG 19
【００３８】配列番号：5
配列の長さ：570
配列の型：核酸
トポロジー：核酸
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：ヒ゜ロコッカス フリオサス (Pyrococcus furiosus)
配列：
ACGACTACGG TAGGTATTAA GGTAAAAGAC GGCGTTGTGC TTGCTGCTGA CACTCAAGCC 60
TCCCTTGATC ACATGGTTGA GACACTTAAC ATAAAGAAGA TCATCCCAAT CACAGATAGA 120
ATAGCAATAA CGACTGCTGG TAGCGTTGGA GATGTTCAAA TGCTTGCTAG ATACCTAGAG 180
GCTGAAGCAA GATACTACTA CTTCACCTGG GGTAGACCAA TGACTACAAA GGCCATGGCG 240
AACCTCTTGA GCAACATACT GAACGAAAAC AGATGGTTCC CATATTTGGT TCAGATAATC 300
ATTGGAGGAT ACGTGGATGA ACCAACAATA GCAAACCTAG ATCCCTTTGG AGGCTTAATA 360
TTTGATGACT ACACAGCAAC AGGTTCCGGA ACCCCCTTTG CAATTGCAGT TTTAGAAGAG 420
GGATATAGAG AGGACTTAAC TATAGAGGAG GCAAAAGAAC TTGCAATTAG AGCGGTAAGA 480
GCAGCTGGGA GAAGAGACGT CTACACCGGA AGCAAGAAGG TTCAAGTGGT CACAATAACT 540
AAGGACGGCA TGAAGGAAGA GTTTGTAGTA 570
【００３９】配列番号：6
配列の長さ：582
配列の型：核酸
トポロジー：核酸
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：ヒ゜ロコッカス フリオサス (Pyrococcus furiosus)
配列：
ATGGCATTTG TTCCACCTCA GGCTGGGTAC GACAGAGCAA TTACAGTTTT TAGTCCAGAT 60
GGAAGATTAT TCCAAGTAAA TTATGCAAGG GAAGCAGTAA AAAGAGGAGC TACAGCTGTG 120
GGAGTTAAGT GTGGCGAGGG TGTTGTCTTA GCTGTTGAGA AAAGGATAAC GAGCAGGTTA 180
ATTGAACCTG ACAGTTATGA GAAGATCTTT CAAATTGATG ATCACATCGC TGCAGCTTCA 240
AGTGGTATTA TAGCCGATGC GAGAGTTCTA GTTAACAGAG CAAGATTAGA AGCTCAAATT 300
TATAGACTAA CATATGGTGA ACCAGCACCA GTTTCAGTTA TAGTCAAAAA AATCTGTGAC 360
CTTAAGCAGA TGCATACTCA GTATGGAGGC GTAAGGCCAT TTGGAGCAGC GCTTTTAATG 420
GCGGGTATAA ATGACAGACC AGAGCTTTAT GAGACAGATC CAAGTGGTGC ATATTTTGCT 480
TGGAAAGCTG TAGCTATAGG AAGTGGAAGG AACACAGCAA TGGCAATTTT CGAAGAAAAA 540
TATAGAGATG ACATGAATTT AGAAGATGCA ATAAGCTGGC TT 582
【００４０】配列番号：7
配列の長さ：20
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA ）
配列
CTTTTCCAGG TAGAGTATGC 20
【００４１】配列番号：8
配列の長さ：20
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA ）
配列
AGCGATACAC CGTATGGCCT 20
【００４２】配列番号：9
配列の長さ：22
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成DNA ）
配列
GAGGTGAACG CCATGGCATT TG 22
【図１】本発明のプロテアソームの至適温度を示す図で
ある。
ある。
【図２】本発明のプロテアソームの至適ｐＨを示す図で
ある。
ある。
【図３】ＳＤＳ存在下のプロテアソームの熱安定性を示
す図である。
す図である。
【図４】本発明のプロテアソームのｐＨ安定性を示す図
である。
である。
【図５】ＣａＣｌ2 が本発明のプロテアソーム活性に及
ぼす影響を示す図である。
ぼす影響を示す図である。
【図６】ＮａＣｌが本発明のプロテアソーム活性に及ぼ
す影響を示す図である。
す影響を示す図である。
【図７】尿素が本発明のプロテアソーム活性に及ぼす影
響を示す図である。
響を示す図である。
【図８】ＳＤＳが本発明のプロテアソーム活性に及ぼす
影響を示す図である。
影響を示す図である。
【図９】プラスミドｐＰＲＯβＢＨの制限酵素地図を示
す図である。
す図である。
【図１０】プラスミドｐＰＲＯＮ０．７の制限酵素地図
を示す図である。
を示す図である。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:01）
(72)発明者 加藤 郁之進
滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒
造株式会社中央研究所内
(56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，1992年,
Ｖｏｌ．31， Ｎｏ．４，ｐ．964−972
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，1991年，Ｖｏ
ｌ．278， Ｎｏ．２，ｐ．217−221
Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，1990年,
Ｖｏｌ．172， Ｎｏ．７，ｐ．3654−
3660
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90 ZNA
C12N 9/00 - 9/99
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
配列、あるいは該配列中に１〜数個のアミノ酸の置換、
欠失、挿入、付加の少なくとも１つがされたアミノ酸配
列からなるタンパク質、並びに配列表の配列番号２で表
されるアミノ酸配列、あるいは該配列中に１〜数個のア
ミノ酸の置換、欠失、挿入、付加の少なくとも１つがさ
れたアミノ酸配列からなるタンパク質で構成され、かつ
下記の酵素学的特徴を有することを特徴とする超耐熱性
プロテアソーム。 （１）作用及び基質特異性 サクシニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル
−Ｌ−チロシン ４−メチル−クマリル−７−アミドを
加水分解して蛍光物質を生成する。また、ゼラチンを加
水分解して低分子化する。可溶性還元リゾチームを加水
分解して短鎖ペプチドを生成する。 （２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ 至適ｐＨは６．０から９．０であり、安定ｐＨは１００
℃、１０分間処理において５．０から１０．０である。 （３）熱安定性 ２％ＳＤＳ中で１００℃３０分間処理しても約８０％の
サクシニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル
−Ｌ−チロシン ４−メチル−クマリル−７−アミド分
解活性を有している。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。 - 【請求項３】 配列表の配列番号２で表されるアミノ酸
配列からなるタンパク質と会合して下記酵素学的特徴を
有する超耐熱性プロテアソームを構成することのできる
タンパク質をコードする遺伝子であって、請求項２に記
載の遺伝子に厳密な条件においてハイブリダイズするこ
とを特徴とする遺伝子。 （１）作用及び基質特異性 サクシニル− Ｌ− ロイシル− Ｌ− ロイシル− Ｌ− バリル
− Ｌ− チロシン ４−メチル−クマリル−７−アミドを
加水分解して蛍光物質を生成する。また、ゼラチンを加
水分解して低分子化する。可溶性還元リゾチームを加水
分解して短鎖ペ プチドを生成する。 （２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ 至適ｐＨは６．０から９．０であり、安定ｐＨは１００
℃、１０分間処理において５０から１０．０である。 （３）熱安定性 ２％ＳＤＳ中で１００℃、３０分間処理しても約８０％
のサクシニル− Ｌ− ロイシル− Ｌ− ロイシル− Ｌ− バリ
ル− Ｌ− チロシン ４−メチル−クマリル−７−アミド
分解活性を有している。 - 【請求項４】 配列表の配列番号２で表されるアミノ酸
配列からなるタンパク質をコードする遺伝子。 - 【請求項５】 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
配列からなるタンパク質と会合して下記酵素学的特徴を
有する超耐熱性プロテアソームを構成することのできる
タンパク質をコードする遺伝子であって、請求項４に記
載の遺伝子に厳密な条件においてハイブリダイズするこ
とを特徴とする遺伝子。 （１）作用及び基質特異性 サクシニル− Ｌ− ロイシル− Ｌ− ロイシル− Ｌ− バリル
− Ｌ− チロシン ４−メチル−クマリル−７−アミドを
加水分解して蛍光物質を生成する。また、ゼラチンを加
水分解して低分子化する。可溶性還元リゾチームを加水
分解して短鎖ペプチドを生成する。 （２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ 至適ｐＨは６．０から９．０であり、安定ｐＨは１００
℃、１０分間処理において５．０から１０．０である。 （３）熱安定性 ２％ＳＤＳ中で１００℃、３０分間処理しても約８０％
のサクシニル− Ｌ− ロイシル− Ｌ− ロイシル− Ｌ− バリ
ル− Ｌ− チロシン ４−メチル−クマリル−７−アミド
分解活性を有している。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34922993A JP3478410B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 超耐熱性プロテアソーム |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34922993A JP3478410B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 超耐熱性プロテアソーム |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07184660A JPH07184660A (ja) | 1995-07-25 |
| JP3478410B2 true JP3478410B2 (ja) | 2003-12-15 |
Family
ID=18402359
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34922993A Expired - Fee Related JP3478410B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | 超耐熱性プロテアソーム |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3478410B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE205257T1 (de) | 1995-12-12 | 2001-09-15 | Takara Shuzo Co | Gene kodierend für ultrathermostabile proteasen |
| WO2000061711A1 (fr) * | 1999-04-07 | 2000-10-19 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Composition de decomposition de proteines |
-
1993
- 1993-12-28 JP JP34922993A patent/JP3478410B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２年，Ｖｏｌ．３１， Ｎｏ．４，ｐ．９６４−９７２ |
| ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９１年，Ｖｏｌ．２７８， Ｎｏ．２，ｐ．２１７−２２１ |
| Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９０年，Ｖｏｌ．１７２， Ｎｏ．７，ｐ．３６５４−３６６０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07184660A (ja) | 1995-07-25 |
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