JP3464810B2 - 超耐熱性アミノペプチダーゼ遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、食品、タンパク質工学
等の分野で有用な超耐熱性アミノペプチダーゼをコード
する遺伝子、及び該酵素の遺伝子工学的製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】食品加工、ペプチド合成等の工業的プロ
セスに利用されるプロテアーゼには高い熱安定性が要求
される。これまで種々の耐熱性プロテアーゼが探索され
てきたが、その多くはエンド型の酵素であり、ペプチド
結合を末端から切断するエキソ型の酵素としてはサーマ
ス アクアティカス（Thermus aquaticus)由来のアミノ
ペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼが知られている
程度である〔アグリカルチュラル アンド バイオロジ
カル ケミストリー（Agric. Biol. Chem.) 、第５２
巻、第１７５５〜１７６３頁（１９８８）、同、第５４
巻、第２３８５〜２３９２頁（１９９０）、バイオサイ
エンス バイオテクノロジー アンド バイオケミスト
リー（Biosci. Biotech. Biochem.)、第５６巻、第１８
３９〜１８４４頁（１９９２）〕。しかしこれらの酵素
は９０℃以上の高温で使用することは困難である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ピロコッカス フリオ
サス（Pyrococcus furiosus)に代表される超耐熱菌は、
極めて高い耐熱性を持った酵素の給源として期待される
が、酵素の取得には高温での微生物の培養を要するた
め、工業的な製造方法としては問題を有していた。本発
明はこの問題を解決するために、超耐熱性アミノペプチ
ダーゼ遺伝子を単離し、該遺伝子を用いた超耐熱性アミ
ノペプチダーゼの工業的製造方法を提供するものであ
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、１００℃、１０分間の熱処理に耐
性の超耐熱性アミノペプチダーゼに関し、配列表の配列
番号２で表されるアミノ酸配列、あるいは該配列に１〜
数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加の少なくとも
一つを有するアミノ酸配列を含んでいることを特徴とす
る。また、本発明の第２の発明は超耐熱性アミノペプチ
ダーゼ遺伝子に関し、第１の発明の超耐熱性アミノペプ
チダーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする。
更に、本発明の第３の発明は、第２の発明の超耐熱性ア
ミノペプチダーゼ遺伝子に関し、配列表の配列番号１で
表される塩基配列を含んでいることを特徴とする。また
更に、本発明の第４の発明は超耐熱性アミノペプチダー
ゼ遺伝子に関し、第３の発明の超耐熱性アミノペプチダ
ーゼ遺伝子にストリンジェントな条件でハイブリダイズ
可能な、１００℃、１０分間の熱処理に耐性の超耐熱性
アミノペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコード
する遺伝子であることを特徴とする。更にまた、本発明
の第５の発明は超耐熱性アミノペプチダーゼの製造方法
に関し、第２〜第４の発明のいずれか１つの発明の超耐
熱性アミノペプチダーゼ遺伝子を含有させた組換体プラ
スミドを導入させた形質転換体を培養し、該培養物から
１００℃、１０分間の熱処理に耐性の超耐熱性アミノペ
プチダーゼを採取することを特徴とする。

【０００５】本発明に係る超耐熱性アミノペプチダーゼ
遺伝子は超耐熱菌の遺伝子ライブラリーのスクリーニン
グにより得ることができる。超耐熱菌としてはピロコッ
カス属に属する細菌が使用でき、例えばピロコッカス
フリオサスのゲノムのコスミドライブラリーより目的の
遺伝子をスクリーニングし、得ることができる。ピロコ
ッカス フリオサスとしてはピロコッカス フリオサス
ＤＭＳ３６３８が使用でき、該菌株は、ドイッチェ
ザムルンク フォン ミクロオルガニスメンウント ツ
ェルクルチュウレンＧｍｂＨ（Deutsch Sammlung von M
ikroorganismen und Zellkulturen GmbH）より入手可能
な菌株である。

【０００６】ピロコッカス フリオサス ゲノムのコス
ミドライブラリーはピロコッカスフリオサス ゲノムＤ
ＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）で部分消化
して得られたＤＮＡフラグメントとトリプルヘリックス
コスミドベクター（ストラタジーン社製）をライゲーシ
ョンした後、イン ビトロ パッケージング法によって
ラムダファージ粒子中にパッケージングし、適当な大腸
菌、例えば大腸菌ＤＨ５αＭＣＲ（ＢＲＬ社製）を形質
転換することによって得ることができる。次にライブラ
リー中の形質転換体を培養した後、熱処理（１００℃、
１０分間）、超音波処理、再熱処理（１００℃、１０分
間）し、得られたライゼート中のＬ−ロイシン−ｐ−ニ
トロアニリドを基質としたアミノペプチダーゼ活性をス
クリーニングすることができる。これにより、１００
℃、２０分間の熱処理に耐性のアミノペプチダーゼを発
現する、超耐熱性アミノペプチダーゼ遺伝子を含むコス
ミドクローンをいくつか得ることができる。このように
して得られたコスミドクローンの１つから調製したコス
ミドをＸｂａＩ（宝酒造社製）消化し、得られたＤＮＡ
断片をプラスミドベクターｐＵＣ１１８（宝酒造社製）
のＸｂａＩサイトに導入した組換えプラスミドを得るこ
とができる。次に、この組換えプラスミドを導入した大
腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）を培養した後、前述のコ
スミドの場合と同様にして培養物処理物中の超耐熱性ア
ミノペプチダーゼ活性を測定することにより、発現した
アミノペプチダーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドを得
ることができる。該プラスミドはプラスミドｐＡＭ２と
命名された。図２にプラスミドｐＡＭ２の制限酵素地図
を示す。図中太実線がプラスミドベクターｐＵＣ１１８
への挿入ＤＮＡ断片である。

【０００７】更にこの組換えプラスミドについて数種類
の制限酵素を用いて種々の長さのＤＮＡ断片を調製し、
各断片を含む組換えプラスミドを作製することができ
る。次に、該プラスミドを導入した大腸菌ＪＭ１０９を
培養した後、培養物中の超耐熱性アミノペプチダーゼ活
性を測定することにより、目的のアミノペプチダーゼ遺
伝子を含む組換えプラスミドを得ることができる。すな
わち、前記のプラスミドｐＡＭ２をＸｂａＩ（宝酒造社
製）、ＮｏｔＩ（宝酒造社製）消化して得られる約４kb
のＤＮＡ断片を、あらかじめＨｉｎｃIIサイトにＮｏｔ
Ｉリンカー（linker) （宝酒造社製）を導入したｐＵＣ
１９（宝酒造社製）のＸｂａＩ、ＮｏｔＩサイトに導入
することができる。該プラスミドはプラスミドｐＡＭ３
と命名され、これを導入された大腸菌ＪＭ１０９を培養
して得られる培養物のライゼートは超耐熱性アミノペプ
チダーゼ活性を示す。図３にプラスミドｐＡＭ３の制限
酵素地図を示す。図中、太実線がプラスミドベクターｐ
ＵＣ１９への挿入ＤＮＡ断片である。

【０００８】更に前記プラスミドｐＡＭ３より超耐熱性
アミノペプチダーゼ遺伝子を含む約１．８kbのＤＮＡ断
片を得ることができる。すなわち、前記プラスミドｐＡ
Ｍ３をＮｄｅＩ（宝酒造社製）消化した後、末端を平滑
化し、更にＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）消化して得られる
約１．８kbのＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＵＣ１
８（宝酒造社製）のＨｉｎｃII、ＥｃｏＲＩサイトに導
入することができる。該プラスミドはプラスミドｐＡＭ
７と命名され、該プラスミドで形質転換された大腸菌Ｊ
Ｍ１０９は Escherichia coli JM109/pAM7と命名されて
いる。また Escherichia coli JM109/pAM7は超耐熱性ア
ミノペプチダーゼ活性を示す。図４にプラスミドｐＡＭ
７の制限酵素地図を示す。図中、太実線がプラスミドベ
クターｐＵＣ１８への挿入ＤＮＡ断片である。

【０００９】更に前記プラスミドｐＡＭ７より超耐熱性
アミノペプチダーゼ遺伝子を含まない約０．３kbのＤＮ
Ａ断片を次のように除くことができる。すなわち、前記
プラスミドｐＡＭ７をＰｓｔＩ（宝酒造社製）、Ｈｉｎ
ｄIII （宝酒造社製）消化して得られる約０．５kbのＰ
ｓｔＩ−ＨｉｎｄIII 断片、及び約１．０kbのＨｉｎｄ
III −ＨｉｎｄIII 断片を単離した後、まず約０．５kb
のＰｓｔＩ−ＨｉｎｄIII 断片をプラスミドベクターｐ
ＵＣ１８のＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIII サイトに導入した組
換えプラスミドを作製する。該プラスミドはプラスミド
ｐＡＭ１８と命名され、図５にその制限酵素地図を示
す。図中、太実線がプラスミドベクターｐＵＣ１８への
挿入ＤＮＡ断片である。

【００１０】次に前述の約１．０kbのＨｉｎｄIII −Ｈ
ｉｎｄIII 断片を前記プラスミドｐＡＭ１８のＨｉｎｄ
III サイトに導入した後、大腸菌ＪＭ１０９に導入す
る。得られたコロニーの超耐熱性アミノペプチダーゼ活
性を測定し、活性を示したコロニーよりプラスミドを調
製する。該プラスミドはプラスミドｐＡＭ１９と命名さ
れ、該プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は
Escherichia coli JM109/pAM19 と命名、表示され、工
業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３
６０６として寄託されている。図６にプラスミドｐＡＭ
１９の制限酵素地図を示す。図中、太実線がプラスミド
ベクターｐＵＣ１８への挿入ＤＮＡ断片である。

【００１１】図１にプラスミドｐＡＭ１９に挿入された
ピロコッカス フリオサス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地
図を示す。すなわち図１は本発明により得られる超耐熱
性アミノペプチダーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片の１
例の制限酵素地図である。配列表の配列番号１に図１に
示されるＤＮＡ断片の塩基配列を示す。すなわち配列表
の配列番号１は本発明によって得られる超耐熱性アミノ
ペプチダーゼ遺伝子の１例の塩基配列である。配列表の
配列番号２に、配列番号１に示される塩基配列より推定
される遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。すなわち配列
表の配列番号２は本発明によって得られる超耐熱性アミ
ノペプチダーゼ遺伝子を用いて生産される酵素タンパク
のアミノ酸配列である。

【００１２】超耐熱性アミノペプチダーゼ遺伝子を含有
させた組換えプラスミドを導入した形質転換体、例えば
Escherichia coli JM109/pAM7、 Escherichia coli JM
109/pAM19 はそれぞれ通常の培養条件、例えば１００μ
ｇ／mlのアンピシリンを含む２×ＴＹ培地（トリプトン
１６ｇ／リットル、酵母エキス１０ｇ／リットル、Ｎａ
Ｃｌの５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）中、３７℃で培養
することにより、培養物中に超耐熱性アミノペプチダー
ゼを発現させることができる。培養終了後、培養菌体を
集菌し、得られた菌体の超音波処理後の遠心上清を粗酵
素液とし、該酵素液の１００℃、１０分間の熱処理によ
る夾雑タンパク質の変性処理、除核酸処理、硫安塩析処
理、透析処理、イオン交換クロマトグラフィー等を行う
ことにより、精製酵素標品を得ることができる。

【００１３】本発明の超耐熱性アミノペプチダーゼ遺伝
子を含有させた組換体プラスミドを導入した形質転換
体、例えば Escherichia coli JM109/pAM7が生産する超
耐熱性アミノペプチダーゼの酵素化学的、及び理化学的
性質は次のとおりである。

【００１４】（１）作 用 本発明の酵素はＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ
−アラニン−ｐ−ニトロアニリド、及びＬ−メチオニン
−ｐ−ニトロアニリドを加水分解し、黄色物質（ｐ−ニ
トロアニリン）を生成する。また、ロイシン−エンケフ
ァリンを加水分解し、遊離のアミノ酸を生成する。

【００１５】（２）酵素活性測定方法 酵素活性の測定はＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドを
基質とし、酵素による加水分解反応によって生成するｐ
−ニトロアリニンを分光光学的に測定することにより行
った。すなわち、酵素活性を測定しようとする酵素標品
を適度に希釈し、その試料溶液１０μｌに５mM Ｌ−ロ
イシン−ｐ−ニトロアニリド溶液（５０mM酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ６．０）４０μｌを加え、９５℃で３０分間反
応させた。氷冷して反応を停止した後、４１０nmにおけ
る吸光度を測定し、ｐ−ニトロアニリンの生成量を求め
た。酵素１単位は９５℃において１分間に１μmoleのｐ
−ニトロアニリンを生成する酵素量とした。本発明で得
られる酵素は測定されたｐＨ６．０、９５℃においてＬ
−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド分解活性を有してい
た。

【００１６】また、Ｌ−アラニン−ｐ−ニトロアニリ
ド、及びＬ−メチオニン−ｐ−ニトロアニリドを基質と
してその分解活性を測定した。すなわち１ミリ単位の酵
素を含む試料１０μｌに５mM Ｌ−アラニン−ｐ−ニト
ロアニリド溶液（５０mM酢酸ナトリウム、ｐＨ６．
０）、あるいは５mM Ｌ−メチオニン−ｐ−ニトロアニ
リド溶液（５０mM酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０）４０μ
ｌを加えて、９５℃で３０分間反応させた。氷冷して反
応を停止した後、４１０nmにおける吸光度を測定し、ｐ
−ニトロアニリンの生成量を求めた。本発明により得ら
れる酵素は測定されたｐＨ６．０、９５℃においてＬ−
アラニン−ｐ−ニトロアニリド分解活性、及びＬ−メチ
オニン−ｐ−ニトロアニリド分解活性を有していた。

【００１７】更にまた、ロイシン−エンケファリンを基
質としてその分解活性を測定した。すなわち６nmole の
ロイシン−エンケファリンを含む５mM酢酸ナトリウム、
ｐＨ６．０、２０μＭ ＣｏＣｌ₂ 溶液５４μｌに５０
ミリ単位の酵素を含む試料６μｌを加え、９５℃で３時
間反応させた。氷冷して反応を停止した後、反応液の一
部をアミノ酸分析に供し、遊離したアミノ酸を分析し
た。本発明により得られる酵素は測定されたｐＨ６．
０、９５℃においてロイシン−エンケファリン分解活性
を有していた。なお、以下（３）〜（７）において示す
酵素活性はＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドを基質と
する上記の活性測定方法で測定したものである。

【００１８】（３）至適温度 測定には１ミリ単位の酵素標品を用い、種々の温度で反
応を行った。試験した酵素は図７に示すごとく測定され
たｐＨ６．０において６０℃〜１００℃の範囲で活性が
あり、その至適温度は８０℃〜１００℃であった。すな
わち図７は本発明により得られる酵素の至適温度を示す
図であり、縦軸は相対活性（％）、横軸は温度（℃）を
示す。

【００１９】（４）至適ｐＨ 測定には１ミリ単位の酵素標品を用い、Ｌ−ロイシン−
ｐ−ニトロアニリド溶液をｐＨ３．５〜６．０において
は５０mM酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０において
は５０mMリン酸カリウム、またｐＨ８．５〜９．５にお
いては５０mMホウ酸ナトリウムを用いて調製し、使用し
た。試験した酵素は図８に示すごとくｐＨ６．０で最大
活性を示した。すなわち図８は本発明により得られる酵
素の至適ｐＨを示す図であり、縦軸は相対活性、横軸は
ｐＨを示す。図中白四角は５０mM酢酸ナトリウム、図中
＋字は５０mMリン酸カリウム、図中白丸は５０mMホウ酸
ナトリウムを用いて測定した結果を示す。

【００２０】（５）熱安定性 １ミリ単位の酵素を含む５０mM酢酸ナトリウム、ｐＨ
５．５溶液１０μｌを６０℃及び９５℃で種々の時間処
理した後、残存する酵素活性を測定した。図９に示すご
とく６０℃、１８０分間処理しても活性の低下は全く見
られず、また、９５℃、１８０分間の処理後も９０％以
上の活性を保持していた。すなわち図９は本発明により
得られる酵素の熱安定性を示す図であり、縦軸に残存活
性（％）、横軸に熱処理時間（時）を示す。図中白四角
は６０℃、＋字は９５℃での測定の結果を示す。

【００２１】（６）ｐＨ安定性 ５ミリ単位の酵素を含む２０mMの各ｐＨの緩衝液５０μ
ｌを９５℃で６０分間処理した後、そのうちの１０μｌ
を用いて残存する酵素活性を測定した。なお、緩衝液と
してｐＨ４．０〜６．０においては酢酸ナトリウム、ｐ
Ｈ６．０〜８．０においてはリン酸カリウム、ｐＨ８．
５〜９．５においてはホウ酸ナトリウムをそれぞれ用い
た。図１０に示すごとくｐＨ５．５〜７．０の間では９
５℃、６０分間の処理後も８０％以上の活性を保持して
いた。すなわち図１０は本発明により得られる酵素のｐ
Ｈ安定性を示す図であり、縦軸に残存活性、横軸にｐＨ
を示す。図中白四角は２０mM酢酸ナトリウム、図中＋字
は２０mMリン酸カリウム、図中白丸は２０mMホウ酸ナト
リウムを用いて測定した結果を示す。

【００２２】（７）各種試薬の影響 １ミリ単位の酵素を用い、各種試薬の存在下で酵素活性
の測定を行った。終濃度０．１mMのＥＤＴＡを加えた場
合、ＥＤＴＡではほとんど活性が見られなかった。ま
た、終濃度０．００５〜１mMのＣｏＣｌ₂ を添加した場
合には酵素活性の上昇が見られた。

【００２３】以上、詳細に説明したように、本発明によ
り超耐熱性アミノペプチダーゼをコードする遺伝子が提
供され、該遺伝子を用いた超耐熱性アミノペプチダーゼ
の工業的製造方法が提供される。該酵素は高度の耐熱性
を有する新規酵素であり、高温下での食品加工やタンパ
ク質工学処理において特に有用である。また、本発明に
より単離された遺伝子を用いることにより、該遺伝子に
ハイブリダイズ可能な超耐熱性アミノペプチダーゼ遺伝
子を簡便にクローニングすることができる。

【００２４】

【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明が以
下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。な
お、実施例中の％は重量％を意味する。

【００２５】実施例１ （ピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡの調製）ピ
ロコッカス フリオサス ＤＳＭ３６３８の培養は以下
のとおりに行った。トリプトン１％、酵母エキス０．５
％、可溶性デンプン１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジ
ャマリンラボラトリー）３．５％、ジャマリンＳ・リキ
ッド（ジャマリンラボラトリー）０．５％、ＭｇＳＯ₄
０．００３％、ＮａＣｌの０．００１％、ＦｅＳＯ₄ ・
７Ｈ₂ Ｏ ０．０００１％、ＣｏＳＯ₄ ０．０００１
％、ＣａＣｌ₂ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．０００１％、ＺｎＳＯ
₄ ０．０００１％、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂ Ｏ ０．１ppm
、ＫＡｌ（ＳＯ₄ ）₂ ０．１ppm 、Ｈ₃ ＢＯ₃ ０．１p
pm 、Ｎａ₂ ＭｏＯ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ ０．１ppm 、ＮｉＣ
ｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ ０．２５ppm の組成の培地２リットル
を２リットル容のメディウムボトルに入れ、１２０℃、
２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹込み溶存酸素を除去
した後、これに上記菌株を接種して９５℃、１６時間静
置培養した。培養後、遠心分離によって菌体を集めた。
次に集菌体を２５％スクロースを含む０．０５Ｍトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４mlに懸濁し、この懸濁液に
０．８mlのリゾチーム〔５mg／ml、０．２５Ｍトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕、２mlの０．２Ｍ ＥＤＴＡを
加えて、２０℃で１時間保温した後、２４mlのＳＥＴ溶
液〔１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、２０mMトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕を加え、更に５％ＳＤＳ４
ml、プロティナーゼＫ（１０mg／ml）４００μｌを加
え、３７℃、１時間反応させた。反応終了後、フェノー
ル−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、
約３．２mgのゲノムＤＮＡを調製した。

【００２６】（コスミドプロテインライブラリーの作
製）ピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡ４００μ
ｇをＳａｕ３ＡＩで部分消化し、密度勾配超遠心法によ
り、３５〜５０kbにサイズ分画した。次に、トリプルヘ
リックスコスミドベクター１μｇをＢａｍＨＩ消化し、
上記分画された３５〜５０kbのＤＮＡ１４０μｇと混合
したライゲーションを行い、ガイガーパックゴールド
（ストラタジーン社製）を用いたイン ビトロ パッケ
ージング法によってピロコッカス フリオサス ゲノム
ＤＮＡのフラグメントをラムダファージ粒子中にパッケ
ージングした。得られたファージ溶液の一部を用いて大
腸菌ＤＨ５αＭＣＲを形質転換し、ライブラリーを調製
した。得られたコロニーのうち数個を選んでコスミドを
調製し、適当な大きさの挿入断片があることを確認した
のち、調製した５００個のコロニーから個別に形質転換
体を１００μｇ／mlのアンピシリンを含む１５０mlのＬ
Ｂ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ
／リットル、ＮａＣｌの５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）
中で培養した。該培養物を遠心し、回収した菌体を２０
mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０ １mlに懸濁し、１００
℃で１０分間熱処理した。続いて超音波処理を行い、更
にもう一度１００℃、１０分間熱処理した。遠心後の上
清として得られるライゼートをコスミドプロテインライ
ブラリーとした。

【００２７】（超耐熱性アミノペプチダーゼ遺伝子を含
むコスミドの選択）アミノペプチダーゼ活性は、Ｌ−ロ
イシン−ｐ−ニトロアニリド加水分解活性を、加水分解
で生成するｐ−ニトロアニリンを分光学的に追跡するこ
とにより測定した。すなわち、上記コスミドプロテイン
ライブラリーからライゼート２０μｌずつをとり、５mM
Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド溶液（５０mMトリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）、８０μｌを加え、９５℃で
１２０分間反応させた。氷冷して反応を停止した後４１
０nmにおける吸光度を測定しｐ−ニトロアニリンの生成
量を求めた。コスミドプロテインライブラリーよりアミ
ノペプチダーゼ活性を持つ２つのコスミドクローンを得
た。

【００２８】（超耐熱性アミノペプチダーゼ遺伝子を含
むプラスミドｐＡＭ２の調製）アミノペプチダーゼ活性
を持つ２つのコスミドクローンの一方についてコスミド
を調製し、ＸｂａＩ消化した後、プラスミドベクターｐ
ＵＣ１１８のＸｂａＩサイトにライゲーションした。こ
の組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入した後、
１００μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢプレート上に
まき、出現したコロニーについて１００μｇ／mlのアン
ピシリンを含む５mlのＬＢ培地中で培養を行った。該培
養物を遠心して回収した菌体を５０mMトリス−ＨＣｌ・
ｐＨ７．５ １００μｌに懸濁し、１００℃、１０分間
熱処理を行った後、超音波処理によって菌体を破砕し
た。更にもう一度、１００℃、１０分間の熱処理を行
い、遠心してライゼートを得た。

【００２９】このライゼートについてアミノペプチダー
ゼ活性を測定した。すなわち１０μｌのライゼートに５
mM Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド溶液（５０mMト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）４０μｌを加え、９５℃で
１２０分間反応させた。氷冷して反応を停止した後、４
１０nmにおける吸光度を測定しｐ−ニトロアニリンの生
成量を求めた。アミノペプチダーゼ活性を有するコロニ
ーよりプラスミドを調製し、これをプラスミドｐＡＭ２
と命名した。

【００３０】（超耐熱性アミノペプチダーゼ遺伝子を含
むプラスミドｐＡＭ３の調製）上記プラスミドｐＡＭ２
についてＸｂａＩ、ＮｏｔＩの切断位置を調べ、図２に
示す制限酵素地図を得た。この制限酵素地図を基に約４
kbのＸｂａＩ、ＮｏｔＩ断片をあらかじめＨｉｎｃIIサ
イトにＮｏｔＩリンカーを導入したプラスミドベクター
ｐＵＣ１９にＸｂａＩ、ＮｏｔＩサイトを利用して挿入
した。この組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入
し、出現したコロニーについて前述の方法でアミノペプ
チダーゼ活性を調べた。超耐熱性アミノペプチダーゼ活
性が認められたコロニーよりプラスミドを調製し、これ
をプラスミドｐＡＭ３と命名した。図３にプラスミドｐ
ＡＭ３の制限酵素地図を示す。

【００３１】（超耐熱性アミノペプチダーゼ遺伝子を含
むプラスミドｐＡＭ７の調製）上記プラスミドｐＡＭ３
をＮｄｅＩ消化した後、ＤＮＡブランティングキット
（宝酒造社製）を用いてＤＮＡ末端を平滑化し、更にＥ
ｃｏＲＩ消化してアガロースゲル電気泳動を行い、約
１．８kbのＤＮＡ断片をアガロースゲルより回収した。
このＤＮＡ断片とＨｉｎｃII、ＥｃｏＲＩで消化したプ
ラスミドベクターｐＵＣ１８とをライゲーションして大
腸菌ＪＭ１０９に導入し、前述の方法により出現したコ
ロニーのアミノペプチダーゼ活性を調べた。超耐熱性ア
ミノペプチダーゼ活性が認められたコロニーよりプラス
ミドを調製し、これをプラスミドｐＡＭ７と命名した。
次に該プラスミドを保有する大腸菌ＪＭ１０９を Esche
richia coli JM109/pAM7と命名した。図４にプラスミド
ｐＡＭ７の制限酵素地図を示す。

【００３２】（超耐熱性アミノペプチダーゼ遺伝子を含
むプラスミドｐＡＭ１９の調製）上記プラスミドｐＡＭ
７をＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIII で消化後アガロースゲル電
気泳動を行い、分離された約０．５kb、約１kb、約３kb
のＤＮＡ断片のうち、約０．５kb、約１kbの２つのＤＮ
Ａ断片を回収した。約０．５kbのＤＮＡ断片をＰｓｔ
Ｉ、ＨｉｎｄIII 消化したプラスミドベクターｐＵＣ１
８とライゲーションして大腸菌ＪＭ１０９に導入し、出
現したコロニーに保持されているプラスミドを調べ、上
記約０．５kb断片１分子だけが挿入されたものを選びこ
れをｐＡＭ１８と命名した。図５にプラスミドｐＡＭ１
８の制限酵素地図を示す。次に、上記プラスミドｐＡＭ
１８をＨｉｎｄIII 消化した後アルカリホスファターゼ
（宝酒造社製）を用いて脱リン酸化し、前述の約１kbＤ
ＮＡ断片と混合してライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ
１０９に導入した。出現したコロニーのアミノペプチダ
ーゼ活性を前述の方法により調べ、超耐熱性アミノペプ
チダーゼ活性が認められたコロニーよりプラスミドを調
製し、該プラスミドをプラスミドｐＡＭ１９と命名し
た。次に該プラスミドを保有する大腸菌ＪＭ１０９を E
scherichia coli JM109/pAM19 と命名した。図６にプラ
スミドｐＡＭ１９の制限酵素地図を示す。また、図１に
本発明により得られた、プラスミドｐＡＭ１９に挿入さ
れた約１．５kbのピロコッカス フリオサス由来超耐熱
性アミノペプチダーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片の制
限酵素地図を示す。

【００３３】実施例２ （超耐熱性アミノペプチダーゼ遺伝子の塩基配列の決
定）上記プラスミドｐＡＭ１９に挿入された超耐熱性ア
ミノペプチダーゼ遺伝子を含む約１．５kbのＤＮＡ断片
を種々の制限酵素で適当なサイズに断片化し、該断片を
プラスミドベクターｐＵＣ１１８にサブクローニングし
た後、各断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定は
ＢｃａＢＥＳＴジデオキシシークエンシングキット（宝
酒造社製）を用いたジデオキシ法により行った。配列表
の配列番号１にプラスミドｐＡＭ１９に挿入された超耐
熱性アミノペプチダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基
配列を示す。上記塩基配列より超耐熱性アミノペプチダ
ーゼは配列表の配列番号１に示す塩基配列の３６２番目
のＡより始まる開始コドンＡＴＧから、１４００番目の
Ｔより始まる終止コドンＴＧＡまでコードされているこ
とが示された。配列表の配列番号２に該塩基配列から推
定される超耐熱性アミノペプチダーゼのアミノ酸配列を
示す。

【００３４】実施例３ （酵素標品の調製）実施例１で得られた Escherichia c
oli JM109/pAM7を１００μｇ／mlのアンピシリンを含む
２×ＴＹ培地（トリプトン１６ｇ／リットル、酵母エキ
ス１０ｇ／リットル、ＮａＣｌの５ｇ／リットル、ｐＨ
７．２）５ml中で３７℃、９時間振とう培養した。２リ
ットル容の三角フラスコ２本に同様の培地６００mlずつ
を準備し、それぞれに前述の培養液１mlずつを接種し、
３７℃で１２時間振とう培養した。培養液を遠心分離し
て得られた湿重量４．１ｇの菌体を５０mlの２０mMトリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に懸濁した後、超音波処理にて
菌体を破砕し、遠心分離して得た上清を粗抽出液とし
た。この粗抽出液を１００℃、１０分間熱処理した後、
遠心分離によって変性したタンパクを除去し、得られた
上清に終濃度１％となるように硫酸ストレプトマイシン
を加えた。この試料を再び遠心分離して得た上清に７５
％飽和となるよう硫酸アンモニウムを加え、沈殿物を遠
心分離によって回収した。得られた沈殿物を８mlの２０
mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に溶解し、同緩衝液に対
して一夜透析した。次に透析内液をあらかじめ２０mMト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で平衡化した１５mlのＤＥＡ
Ｅ−トヨパール（東ソー）カラムに通し、吸着した画分
を０〜０．８ＭのＫＣｌ直線濃度勾配により溶出した。
この溶出液についてアミノペプチダーゼ活性を調べ、活
性が認められた画分のみを集めてこれを精製酵素標品と
した。

【００３５】同様に、 Escherichia coli JM109/pAM19
を上記と同様に培養し、培養物中より超耐熱性アミノペ
プチダーゼ活性画分を精製し、超耐熱性アミノペプチダ
ーゼ標品を得た。

【００３６】

【発明の効果】本発明により極めて高い耐熱性を有する
アミノペプチダーゼをコードする遺伝子が得られた。該
遺伝子を用い、超耐熱性アミノペプチダーゼが高純度で
大量に供給できる。

【００３７】

【配列表】

【００３８】配列番号：1 配列の長さ：1481 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA アンチセンス：NO 配列： ATATATGCAT ATTCTTCATA CTCAACATTC ATTTTCTTCT TTATGCTATG ATGATACGGA 60 TGTCTTCTGT GATAATCCAT TATTCATCCC CCCTCTTTTT ATAGTAGAGG AGTTTAATAC 120 TTTTATCATT TGGTATACTC TTTGTTCTAA TAAGTTGTAC ATTGTACCAT TTTTATTTTC 180 CTCTTTTGAA AAGTTCTTGT TTGTAGAAAG GGTCCAGTTA AAGAAGAGAA TTAGACAAAC 240 CTTTTGCTTT TTGGTATCTT AGCTCTCTTT CTCTTTTTGA TAAAGTCAAG TATTTTAGGC 300 AAGCAAAGTA TTTAAATATC TTTATTTGCA CTGAGAAATA GATCTTAATG GAGGTGAAAG 360 GATGGTAGAT TGGGAACTAA TGAAAAAAAT AATAGAATCT CCAGGAGTTT CTGGGTATGA 420 ACACCTGGGA ATTAGAGACC TTGTGGTAGA TATTCTTAAA GATGTTGCGG ATGAAGTAAA 480 AATTGATAAG CTTGGGAATG TGATTGCCCA CTTTAAGGGC TCTGCTCCCA AGGTAATGGT 540 TGCTGCTCAC ATGGATAAGA TAGGACTCAT GGTAAATCAT ATTGACAAAG ATGGCTATCT 600 ACGTGTTGTC CCAATTGGTG GGGTTTTGCC TGAAACCTTA ATAGCTCAGA AGATAAGATT 660 CTTCACAGAA AAAGGGGAGA GATATGGTGT TGTAGGAGTT TTGCCTCCTC ACTTGAGAAG 720 GGAAGCCAAG GATCAAGGTG GTAAGATAGA TTGGGATAGC ATTATAGTGG ATGTTGGAGC 780 TTCTAGCAGG GAAGAAGCTG AAGAGATGGG ATTCAGAATT GGGACAATTG GAGAGTTTGC 840 ACCAAACTTC ACAAGGCTTA GCGAGCACAG GTTTGCCACC CCCTATTTGG ATGATAGGAT 900 ATGCCTATAT GCGATGATTG AAGCTGCTAG ACAATTAGGA GAGCATGAAG CAGATATATA 960 CATTGTAGCG TCTGTGCAGG AGGAGATTGG GCTCAGAGGA GCGAGGGTCG CGAGCTTTGC 1020 TATAGACCCA GAAGTTGGAA TTGCTATGGA TGTCACCTTT GCAAAGCAAC CAAATGACAA 1080 AGGAAAGATA GTTCCAGAGT TGGGTAAGGG TCCCGTTATG GATGTTGGGC CAAATATTAA 1140 TCCAAAACTA AGGCAGTTTG CTGACGAGGT TGCAAAGAAA TATGAGATCC CATTACAAGT 1200 TGAACCAAGT CCAAGGCCTA CTGGAACTGA TGCAAATGTA ATGCAGATAA ACAGAGAAGG 1260 TGTTGCGACG GCAGTTCTCA GTATACCAAT CAGATATATG CATTCCCAGG TTGAATTAGC 1320 TGATGCTAGA GATGTTGACA ATACAATAAA ACTTGCTAAG GCGTTACTTG AGGAGCTAAA 1380 GCCAATGGAC TTTACACCGT GAGGGATATG ATAATAGTAG TCCCAATTGG TGAAGTTCCT 1440 AGCGATGTTC TTTCTTTTCT TTCTGAAAAT ATTGAAAGCT T 1481

【００３９】配列番号：2 配列の長さ：346 配列の型： アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Val Asp Trp Glu Leu Met Lys Lys Ile Ile Glu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Val Ser Gly Tyr Glu His Leu Gly Ile Arg Asp Leu Val Val Asp 20 25 30 Ile Leu Lys Asp Val Ala Asp Glu Val Lys Ile Asp Lys Leu Gly 35 40 45 Asn Val Ile Ala His Phe Lys Gly Ser Ala Pro Lys Val Met Val 50 55 60 Ala Ala His Met Asp Lys Ile Gly Leu Met Val Asn His Ile Asp 65 70 75 Lys Asp Gly Tyr Leu Arg Val Val Pro Ile Gly Gly Val Leu Pro 80 85 90 Glu Thr Leu Ile Ala Gln Lys Ile Arg Phe Phe Thr Glu Lys Gly 95 100 105 Glu Arg Tyr Gly Val Val Gly Val Leu Pro Pro His Leu Arg Arg 110 115 120 Glu Ala Lys Asp Gln Gly Gly Lys Ile Asp Trp Asp Ser Ile Ile 125 130 135 Val Asp Val Gly Ala Ser Ser Arg Glu Glu Ala Glu Glu Met Gly 140 145 150 Phe Arg Ile Gly Thr Ile Gly Glu Phe Ala Pro Asn Phe Thr Arg 155 160 165 Leu Ser Glu His Arg Phe Ala Thr Pro Tyr Leu Asp Asp Arg Ile 170 175 180 Cys Leu Tyr Ala Met Ile Glu Ala Ala Arg Gln Leu Gly Glu His 185 190 195 Glu Ala Asp Ile Tyr Ile Val Ala Ser Val Gln Glu Glu Ile Gly 200 205 210 Leu Arg Gly Ala Arg Val Ala Ser Phe Ala Ile Asp Pro Glu Val 215 220 225 Gly Ile Ala Met Asp Val Thr Phe Ala Lys Gln Pro Asn Asp Lys 230 235 240 Gly Lys Ile Val Pro Glu Leu Gly Lys Gly Pro Val Met Asp Val 245 250 255 Gly Pro Asn Ile Asn Pro Lys Leu Arg Gln Phe Ala Asp Glu Val 260 265 270 Ala Lys Lys Tyr Glu Ile Pro Leu Gln Val Glu Pro Ser Pro Arg 275 280 285 Pro Thr Gly Thr Asp Ala Asn Val Met Gln Ile Asn Arg Glu Gly 290 295 300 Val Ala Thr Ala Val Leu Ser Ile Pro Ile Arg Tyr Met His Ser 305 310 315 Gln Val Glu Leu Ala Asp Ala Arg Asp Val Asp Asn Thr Ile Lys 320 325 330 Leu Ala Lys Ala Leu Leu Glu Glu Leu Lys Pro Met Asp Phe Thr 335 340 345 Pro

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の超耐熱性アミノペプチダーゼ遺伝子の
１例の制限酵素地図を示す図である。

【図２】プラスミドｐＡＭ２の制限酵素地図を示す図で
ある。

【図３】プラスミドｐＡＭ３の制限酵素地図を示す図で
ある。

【図４】プラスミドｐＡＭ７の制限酵素地図を示す図で
ある。

【図５】プラスミドｐＡＭ１８の制限酵素地図を示す図
である。

【図６】プラスミドｐＡＭ１９の制限酵素地図を示す図
である。

【図７】本発明の超耐熱性アミノペプチダーゼの１例の
至適温度を示す図である。

【図８】本発明の超耐熱性アミノペプチダーゼの１例の
至適ｐＨを示す図である。

【図９】本発明の超耐熱性アミノペプチダーゼの１例の
熱安定性を示す図である。

【図１０】本発明の超耐熱性アミノペプチダーゼの１例
のｐＨ安定性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三田 正範 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 浅田 起代蔵 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＰｕｂＭｅｄ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号２で表されるアミノ酸
   配列、あるいは該配列に１〜数個のアミノ酸の欠失、置
   換、挿入、付加の少なくとも一つを有するアミノ酸配列
   を含んでいることを特徴とする１００℃、１０分間の熱
   処理に耐性の超耐熱性アミノペプチダーゼ。
2. 【請求項２】 請求項１記載の超耐熱性アミノペプチダ
   ーゼをコードする遺伝子。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１で表される塩基配列
   を含んでいることを特徴とする請求項２記載の遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項３記載の遺伝子にストリンジェン
   トな条件でハイブリダイズ可能な、１００℃、１０分間
   の熱処理に耐性の超耐熱性アミノペプチダーゼ活性を有
   するポリペプチドをコードする遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項２〜４のいずれか１項に記載の遺
   伝子を含有させた組換体プラスミドを導入させた形質転
   換体を培養し、該培養物から１００℃、１０分間の熱処
   理に耐性の超耐熱性アミノペプチダーゼを採取すること
   を特徴とする超耐熱性アミノペプチダーゼの製造方法。