JPH07143880A - 超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ピロコッカス フリオサスの超耐熱性α−ア
ミラーゼをコードする遺伝子を単離して提供する。 【構成】 配列表の配列番号１で表される塩基配列（ピ
ロコッカス フリオサスから得られ、配列の長さ１３０
５）を含有する超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子。及びそ
れに厳密な条件下でハイブリダイズ可能な当該遺伝子。
前記遺伝子の例には、配列表の配列番号２又は３で表さ
れる塩基配列（配列の長さ１６７０、及び２１３４）を
持つものがあり、例えばｐＨ５．５において７０〜１０
０℃の至適温度、また８０℃，６時間でも活性維持、９
５℃，６時間で７０％以上の活性を保持する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、工業用酵素として有用
な超耐熱性α−アミラーゼをコードする遺伝子に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】α−アミラーゼは食品工業のみならずア
ルコール製造、繊維産業など多数の重要な工業的プロセ
スに利用されている。α−アミラーゼの代表的な用途は
グルコース製造プロセスにおけるデンプンの液化であ
り、生産されたグルコースはそのまま甘味料や栄養剤に
加工されるほか、異性化糖の原料として利用されてい
る。また、液化デンプンはサイクロデキストリンやカッ
プリングシュガーの製造原料としても重要である。α−
アミラーゼによるデンプンの液化は、デンプンが水に溶
けにくく酵素の作用を受けにくいために、通常、１００
℃前後の高温で糊化させたデンプンにα−アミラーゼを
作用させるという方法がとられる。液化反応中のｐＨは
副生成物の生成を抑えるために酸性域に調整される。特
に、連続的に糖化プロセスに移行する場合には糖化に使
用するグルコアミラーゼの作用に適した酸性条件におい
て液化を行うことが望まれる。以上のようにデンプンの
液化に用いられるα−アミラーゼには極めて高い温度、
及び酸性域において高い活性を示すことが要求される。
デンプンの液化にはバチルス リケニホルミス（Bacill
us licheniformis) 由来α−アミラーゼ（商品名 ター
マミル、ノボ・ノルディスク社製）、バチルスズブチリ
ス（Bacillus subtilis)由来α−アミラーゼ（商品名
スピターゼ、長瀬産業製）等が用いられている。これら
は常温菌を起源とする酵素でありながら比較的高い耐熱
性を有している。一方、高温環境に適応した超好熱菌で
は更に耐熱性に優れ、液化に適したα−アミラーゼが生
産されていることが期待される。超好熱菌ピロコッカス
フリオサス（Pyrococcus furiosus)及びピロコッカス
ボウゼイ（Pyrococcus woesei)がα−アミラーゼを生産
することが知られている〔アプライド アンド エンバ
イロンメンタル マイクロバイオロジー（Appl. Enviro
n. Microbiol.)、第５６巻、第１９８５〜１９９１頁
（１９９０）、アーカイブス オブ マイクロバイオロ
ジー（Arch. Microbiol.) 、第１５５巻、第６号、第５
７２〜５７８頁（１９９１）、エフイーエムエス マイ
クロバイオロジー レターズ（ＦＥＭＳ Microbiol. Le
tt.)、第７１巻、第１〜２号、第２１〜２６頁（１９９
０）、特表平４−５０３７５７号公報〕。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】これらピロコッカス属
の細菌由来のα−アミラーゼは、高い耐熱性を持つこと
からデンプンの液化等への利用が期待されるが、上記の
文献においては酵素の生産量が低い上に、酵素の取得に
高温での微生物の培養を要するため、工業的な製造方法
としては問題を有していた。また、上記の文献において
はα−アミラーゼは精製されておらず、純化された酵素
は提供されていない。上記の課題にかんがみ、これらの
α−アミラーゼの遺伝子工学的製造方法の開発が望まれ
ている。本発明の目的は、上記の課題を解決するため
に、ピロコッカス フリオサスのα−アミラーゼをコー
ドする遺伝子を単離して提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子に関
し、配列表の配列番号１で表される塩基配列を含有する
ことを特徴とする。また、本発明の第２の発明は超耐熱
性α−アミラーゼ遺伝子に関し、第１の発明の超耐熱性
α−アミラーゼ遺伝子に厳密な条件下でハイブリダイズ
可能であることを特徴とする。更に、本発明の第３の発
明は超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子に関し、配列表の配
列番号２、又は３で表される第１の発明の超耐熱性α−
アミラーゼ遺伝子であることを特徴とする。

【０００５】本明細書において、「厳密な条件下」と
は、以下の条件下のことをいう。すなわち、（１）ＤＮ
Ａを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは
塩化ナトリウム８．６７ｇ、クエン酸ナトリウム４．４
１ｇを水１リットルに溶解したもの）、１％ラウリル硫
酸ナトリウム、１００μｇ／mlのサケ精子ＤＮＡ、５×
デンハルツ（Denhardt^' s)（ウシ血清アルブミン、ポリ
ビニルピロリドン、フィコールをそれぞれ０．１％の濃
度で含む）を含む溶液中で、６５℃にて２０時間、プロ
ーブと接触させること。また、洗浄時は、（２）ナイロ
ン膜を３７℃から出発して３℃ずつ高い温度の２×ＳＳ
Ｃ（０．１％ＳＤＳを含む）で、ナイロン膜に固定化さ
れたＤＮＡに由来するシグナルが、バックグラウンドと
区別できるようになるまで、又は、ＳＳＣ濃度を２×Ｓ
ＳＣから出発して、０．２ずつ濃度を減少させたＳＳＣ
（０．１％ＳＤＳを含む）、３７℃で、ナイロン膜に固
定化されたＤＮＡに由来するシグナルが、バックグラウ
ンドと区別できるようになるまで洗浄すること。

【０００６】本発明者らは、該α−アミラーゼ遺伝子を
取得するため、独自にピロコッカスフリオサス ＤＳＭ
３６３８よりα−アミラーゼを精製し、酵素タンパクの
部分アミノ酸配列を決定することを試みた。しかし該酵
素の精製は困難であり、部分アミノ酸配列を決定し得る
純度の酵素標品を得ることはできなかった。

【０００７】目的とする酵素の一次構造に関する情報な
しに酵素遺伝子をクローニングする方法としては発現ク
ローニング法があり、例えばピロコッカス ボウゼイ由
来のプルラナーゼ遺伝子（国際公開 ９２／０２６１４
号）はこの方法により取得された。一般に発現クローニ
ング法にはプラスミドベクターが使用されるが、この場
合には目的遺伝子がその内部で切断されることなく、か
つプラスミドベクターに挿入可能な程度の比較的小さな
ＤＮＡ断片に切断されるような制限酵素を用いなければ
ならず、必ずしもすべての酵素遺伝子のクローニングに
適用可能ではない。更に、数多くのクローンについて酵
素活性の発現を調べる必要があり、操作が繁雑である。

【０００８】本発明者らはプラスミドベクターに代え
て、より大きなＤＮＡ断片（３５〜５０kb) を保持でき
るコスミドベクターを用いてピロコッカス フリオサス
ゲノムのコスミドライブラリーを作製し、該ライブラ
リー中にα−アミラーゼ活性を発現するコスミドクロー
ンを検索することにより、α−アミラーゼ遺伝子を単離
することを試みた。コスミドベクターを用いることによ
り、酵素遺伝子内部が切断されるおそれが減ると共に、
スクリーニングする形質転換体の数を減らすことができ
る。その半面、コスミドベクターはプラスミドベクター
ほど宿主内でのコピー数が高くないため、酵素の発現量
が低く、活性を検出できない可能性がある。

【０００９】本発明者らは目的とする酵素が高い耐熱性
を有する点に着目し、コスミドライブラリー中の形質転
換体を個別に培養し、得られた菌体から耐熱性のタンパ
クのみを含むライゼートを調製する工程を組合せた。こ
の一群のライゼートは、コスミドプロテインライブラリ
ーと命名され、該コスミドプロテインライブラリーを酵
素活性の検出に用いることにより、形質転換体のコロニ
ーを用いる方法よりも検出感度が上がると共に、宿主由
来のタンパク等によるバックグラウンドや酵素活性の阻
害といった悪影響を除去することができる。

【００１０】本発明者らは、ピロコッカス フリオサス
由来のコスミドプロテインライブラリーを検索し、α−
アミラーゼ活性を示す数個のコスミドクローンを取得し
た。更に本発明者らはこのクローン中に含まれる挿入Ｄ
ＮＡ断片より、種々の遺伝子工学的手法を駆使して超耐
熱性α−アミラーゼ遺伝子の単離を行った。なお、この
コスミドプロテインライブラリーを利用した発現クロー
ニング法は必ずしもあらゆる耐熱性酵素に応用できるわ
けではなく、目的とする遺伝子によりその成否は左右さ
れる。例えば、本発明者らは該方法を用いてピロコッカ
スフリオサス由来のプロテアーゼ〔アプライド アンド
エンバイロンメンタルマイクロバイオロジー、第５６
巻、第１９９２〜１９９８頁（１９９０）〕についても
該プロテアーゼをコードする遺伝子の単離を試みたが、
該遺伝子の単離には至っていない。

【００１１】これまでに遺伝子解析のなされたα−アミ
ラーゼのほとんどは前駆体として酵素タンパクが合成さ
れ、その後にシグナルペプチドが切断されて成熟型の酵
素に変換されることが知られている〔アプライド マイ
クロバイオロジー アンドバイオテクノロジー（Appl.
Microbiol. Biotechnol.) 、第２３巻、第３５５〜３６
０頁（１９８６）〕。そこで本発明者らは得られた超耐
熱性α−アミラーゼ遺伝子の塩基配列を決定し、これと
既知のα−アミラーゼ遺伝子との比較から成熟型α−ア
ミラーゼをコードする領域を推定した上、更に微生物に
おいてこの成熟型α−アミラーゼを発現する組換えプラ
スミドの構築を行い、該プラスミドにより形質転換した
微生物を用いて、該α−アミラーゼを生産させることに
成功し、本発明を完成した。

【００１２】本発明に係る超耐熱性α−アミラーゼ遺伝
子は超好熱菌の遺伝子ライブラリーのスクリーニングに
より得ることができる。超好熱菌としては、ピロコッカ
ス属に属する細菌が使用でき、例えばピロコッカス フ
リオサスのゲノムのコスミドライブラリーより目的の遺
伝子をスクリーニングし、得ることができる。ピロコッ
カス フリオサスとしてはピロコッカス フリオサス
ＤＳＭ３６３８が使用でき、該菌株は、ドイッチェ ザ
ムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツ
ェルクルチュウレンＧｍｂＨ（Deutsch Sammlung von M
ikroorganismenund Zellkulturen GmbH）より入手可能
な菌株である。

【００１３】ピロコッカス フリオサス ゲノムのコス
ミドライブラリーはピロコッカスフリオサス ゲノムＤ
ＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）で部分消化
して得られたＤＮＡ断片とトリプルヘリックスコスミド
ベクター（ストラタジーン社製）とをライゲーションし
た後、イン ビトロ パッケージング法によってラムダ
ファージ粒子中にパッケージングし、適当な大腸菌、例
えば大腸菌ＤＨ５αＭＣＲ（ＢＲＬ社製）を形質転換す
ることによって得ることができる。次にライブラリー中
の形質転換体を培養した後、熱処理（１００℃、１０分
間）、超音波処理、再熱処理（１００℃、１０分間）し
て、コスミドプロテインライブラリーとして、得られた
ライゼート中のα−アミラーゼ活性の有無をデンプンを
基質としてスクリーニングすることができる。これによ
り、上記の熱処理に耐性のα−アミラーゼを発現する、
超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子を含むコスミドクローン
をいくつか得ることができる。

【００１４】更に、このようにして得られたコスミドク
ローンより調製したコスミドを適当な制限酵素で断片化
し、各断片を含む組換えプラスミドを作製することがで
きる。次に該プラスミドを適当な微生物に導入して得ら
れる形質転換体の生産するα−アミラーゼ活性を調べる
ことにより、目的とする超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子
を含む組換えプラスミドを得ることができる。

【００１５】すなわち、前記のコスミドクローンの１つ
から調製したコスミドをHind III（宝酒造社製）消化
し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＵＣ１
１９（宝酒造社製）のHind IIIサイトに導入した組換え
プラスミドを得ることができる。次にこの組換えプラス
ミドを大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）に導入して得ら
れた形質転換体をニトロセルロース メンブラン上に生
育させ、クロロホルム蒸気で溶菌させる。このメンブラ
ンをデンプンを含むアガロースゲル上にのせてインキュ
ベートした後、ヨウ素−デンプン反応を利用してデンプ
ンの分解を調べて形質転換体のα−アミラーゼ活性を検
出することにより、発現したα−アミラーゼ遺伝子を含
む組換えプラスミドを得ることができる。

【００１６】該プラスミドはプラスミドｐＨＩ８６と命
名され、該プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０
９はEscherichia coli JM109／H-86と命名、表示され、
工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−
４７６３として寄託されている。図１にプラスミドｐＨ
Ｉ８６の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す。

【００１７】プラスミドｐＨＩ８６を種々の制限酵素で
切断したＤＮＡ断片を調製し、その断片を適当なプラス
ミドベクターに挿入した組換えプラスミドを作製する。
該プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、これら
の形質転換体についてα−アミラーゼ活性を測定するこ
とにより、前記プラスミドｐＨＩ８６より超耐熱性α−
アミラーゼ遺伝子を含まない部分のＤＮＡ断片を除くこ
とができる。すなわち、前記プラスミドｐＨＩ８６をHi
nd III及びＳｐｈＩ（宝酒造社製）で消化した後、約
２．４kbのＤＮＡ断片を単離してプラスミドベクターｐ
ＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）のHind III、ＳｐｈＩサイ
トにライゲーションし、得られた組換えプラスミドを大
腸菌ＪＭ１０９に挿入する。こうして得られたコロニー
について前述のコスミドプロテインライブラリーのスク
リーニングに用いた方法でα−アミラーゼ活性を調べ、
活性の認められたコロニーよりプラスミドを調製する。
該組換えプラスミドはｐＳＨ２４と命名され、該プラス
ミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９はEscherichia
coli JM109／pSH24 と命名されている。図２にプラスミ
ドｐＳＨ２４の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す。

【００１８】前記プラスミドｐＳＨ２４は通常用いられ
る方法、例えばジデオキシ法を用いることにより、その
塩基配列を決定することができる。すなわち、プラスミ
ドｐＳＨ２４について、その挿入ＤＮＡ断片の一部を欠
失した種々のデレーションミュータントを作製し、その
うち適当なものを鋳型としてジデオキシ法により塩基配
列を決定することができる。更に、各デレーションミュ
ータントについて決定された塩基配列を比較、解析する
ことにより、プラスミドｐＳＨ２４に挿入された超耐熱
性α−アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を
決定することができる。

【００１９】こうして得られたプラスミドｐＳＨ２４の
挿入ＤＮＡ断片の塩基配列のうちEaeI−Hind IIIの部分
の配列を配列表の配列番号３に示す。すなわち配列表の
配列番号３は本発明によって得られる超耐熱性α−アミ
ラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片の塩基配列の１例で
ある。また、上記塩基配列から推定される超耐熱性α−
アミラーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号４に示
す。

【００２０】上記アミノ酸配列を基に成熟型の超耐熱性
α−アミラーゼを大腸菌内で発現する組換えプラスミド
を作製することができる。すなわち、上記アミノ酸配列
を既知の種々のα−アミラーゼのアミノ酸配列〔アプラ
イド マイクロバイオロジーアンド バイオテクノロジ
ー、第２３巻、第３５５〜３６０頁（１９８６）〕と比
較することにより、成熟型α−アミラーゼのＮ末端アミ
ノ酸の位置を推定することができる。

【００２１】次に、プラスミドｐＳＨ２４上のこのＮ末
端アミノ酸をコードするコドンの直前に、開始コドン
（ＡＴＧ）及びＮｃｏＩサイト（ＣＣＡＴＧＧ）を導入
できるような配列表の配列番号５に示される、オリゴヌ
クレオチドＡＭＦＮ（図３に示す）、及びプラスミドｐ
ＳＨ２４上のＳｐｅＩサイトを含む領域に相補的な配列
表の配列番号６に示されるオリゴヌクレオチドＡＭＲＳ
（図４に示す）を合成し、この２つをプライマーとし、
プラスミドｐＳＨ２４を鋳型としてＰＣＲを行うことに
より、この２つのオリゴヌクレオチドを両端に持ち、超
耐熱性α−アミラーゼ遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を
合成することができる。該ＤＮＡ断片をＮｃｏＩ（宝酒
造社製）、ＳｐｅＩ（宝酒造社製）消化し、これをプラ
スミドｐＳＨ２４をＮｃｏＩ、ＳｐｅＩ消化して得られ
る約４．６kbのＤＮＡ断片とライゲーションして大腸菌
ＪＭ１０９に導入することができる。こうして得られた
コロニーをＩＰＴＧ存在下で培養し、前述のコスミドブ
ロテインライブラリーに用いた方法でα−アミラーゼ活
性を調べ、活性が認められたコロニーからプラスミドを
調製する。

【００２２】該プラスミドはｐＮＨ１７と命名され、該
プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９はEscher
ichia coli JM109／pNH17 と命名、表示され、工業技術
院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４７６４
として寄託されている。

【００２３】図５にプラスミドｐＮＨ１７の挿入ＤＮＡ
断片の制限酵素地図を示す。図中、黒矢印が超耐熱性α
−アミラーゼタンパクをコードする領域である。また、
配列表の配列番号２にプラスミドｐＮＨ１７の挿入ＤＮ
Ａ断片の塩基配列を示す。すなわち、配列表の配列番号
２は、本発明により得られる超耐熱性α−アミラーゼ遺
伝子を含有するＤＮＡ断片の塩基配列の１例である。

【００２４】更に、図５に図中、超耐熱性α−アミラー
ゼタンパクをコードする領域である黒矢印の部分の塩基
配列を配列表の配列番号１に示す。すなわち、配列表の
配列番号１は、本発明により得られる超耐熱性α−アミ
ラーゼ遺伝子である。また、上記塩基配列から推定され
る成熟型の超耐熱性α−アミラーゼのアミノ酸配列を配
列表の配列番号７に示す。

【００２５】Escherichia coli JM109／pNH17 を通常の
培養条件、例えば５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ
Ｂ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ
／リットル、ＮａＣｌの５ｇ／リットル、ｐＨ７．０）
中、３７℃で培養し、培養中の適当な時期にＩＰＴＧを
添加することにより、培養菌体中に超耐熱性α−アミラ
ーゼを発現させることができる。培養終了後、培養菌体
を集菌し、得られた菌体の超音波処理後の遠心上清を粗
酵素液とし、該酵素液の９５℃、１０分間の熱処理によ
る夾雑タンパク質の変性処理、除核酸処理、硫安塩析処
理、透析処理等を行うことによって、粗精製超耐熱性α
−アミラーゼ標品を得ることができる。

【００２６】Escherichia coli JM109／pNH17 が生産す
る粗精製超耐熱性α−アミラーゼの酵素化学的、及び理
化学的性質は次のとおりである。

【００２７】（１）作 用 デンプンを加水分解し、ヨウ素−デンプン反応に基づく
呈色を減少させる。また、糊状のデンプンを加水分解
し、液化する。

【００２８】（２）活性測定方法 酵素活性の測定は可溶性デンプンを基質とし、酵素によ
る加水分解反応後のヨウ素−デンプン反応の呈色の減少
を分光光学的に追跡することにより行った。すなわち、
測定しようとする酵素標品を適度に希釈し、その試料溶
液５０μｌを０．５％の可溶性デンプン（メルク社製）
を含む５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）２
００μｌに加え、９５℃で１５分間反応させた。氷冷し
て反応を停止した後、５００μｌの０．０１Ｎ ヨウ素
液（１％ヨウ化カリウムを含む）を加えて混合し、更
に、このうち５０μｌをとって蒸留水で１０倍希釈した
上、６００nmにおける吸光度を測定した。酵素１単位は
９５℃において６００nmにおける吸光度を１分間に１％
減少させる酵素量とした。本発明で得られる超耐熱性α
−アミラーゼ標品は、測定されたｐＨ５．５、９５℃に
おいてデンプン加水分解活性を有していた。

【００２９】また、トウモロコシデンプンを基質として
液化活性を測定した。すなわち、２０％のトウモロコシ
デンプン（ナカライテスク社製）を含む５０mMリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１．５mlに５０単位の酵
素を含む５０mMリン酸ナトリウム緩衝液１．５mlを加え
て混合し、沸騰水浴上で糊化させた後、更に９５℃で６
０分間保温した。反応物の粘度は酵素を加えなかった対
照に比べて著しく低下した。本発明で得られる超耐熱性
α−アミラーゼ標品は測定されたｐＨ５．５、９５℃に
おいてデンプン液化活性を有していた。なお、以下
（３）〜（５）において示す酵素活性はヨウ素−デンプ
ン反応を利用する上記の活性測定方法で測定したもので
ある。

【００３０】（３）至適ｐＨ 活性測定に用いる基質溶液をｐＨ３．５〜６．０におい
ては５０mM酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０〜８．０
においては５０mMリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．５〜
９．５においては５０mMホウ酸ナトリウム緩衝液を用い
てそれぞれ調製し、至適ｐＨを調べた。図６は本発明に
より得られる超耐熱性α−アミラーゼ標品の活性とｐＨ
の関係を示す図であり、縦軸は相対活性（％）、横軸は
ｐＨを示す。また、図中白丸印は５０mM酢酸ナトリウム
緩衝液、図中×印は５０mMリン酸カリウム緩衝液、図中
白四角印は５０mMホウ酸ナトリウム緩衝液を用いて測定
した結果を示す。図６に示すように、超耐熱性α−アミ
ラーゼ標品はｐＨ４．５〜６．５の間で活性を示し、ｐ
Ｈ５．５で最大の活性を示した。

【００３１】（４）至適温度 酵素活性を種々の温度で測定し、至適温度を調べた。図
７は本発明により得られる超耐熱性α−アミラーゼ標品
の活性と温度の関係を示す図であり、縦軸は相対活性
（％）、横軸は温度（℃）を示す。超耐熱性α−アミラ
ーゼ標品は、図７に示すように測定されたｐＨ５．５に
おいて７０〜１００℃の広い範囲で高い活性を示した。

【００３２】（５）耐熱性 酵素溶液を８０℃及び９５℃で種々の時間保温した後、
残存する酵素活性を測定し、酵素の耐熱性を調べた。図
８は本発明により得られる超耐熱性α−アミラーゼ標品
の耐熱性を示す図であり、縦軸は残存活性（％）、横軸
は時間（ｈｒ）を示す。超耐熱性α−アミラーゼ標品は
図８に示すように８０℃、６時間保温した後も酵素活性
の低下は見られず、９５℃、６時間処理後でも７０％以
上の活性を保持していた。

【００３３】以上、詳細に説明したように、本発明によ
り超耐熱性α−アミラーゼをコードする遺伝子が提供さ
れる。また、該遺伝子を用いて超耐熱性α−アミラーゼ
を工業的に製造することも可能となる。該酵素は高度の
耐熱性を有する酵素であり、グルコースの製造に代表さ
れる高温下でのデンプンの分解について特に有用であ
る。更に、本発明により得られた遺伝子、又は遺伝子を
含むＤＮＡ、更には本発明の超耐熱性α−アミラーゼを
コードする遺伝子の一部の塩基配列をプローブとして、
厳密な条件下でハイブリダイゼーションを行えば、本酵
素と配列は少し異なるが、同様の酵素活性を持つと期待
されるすべての本酵素類似の遺伝子を得ることが期待で
きる。また、本発明により得られた遺伝子、又は遺伝子
を含むＤＮＡ、更には本発明の超耐熱性α−アミラーゼ
をコードする遺伝子の一部の塩基配列をプライマーとし
て用い、遺伝子増幅を行えば、本酵素と配列は少し異な
るが、同様の酵素活性を持つと期待されるすべての本酵
素類似の遺伝子を得ることが期待できる。また、本発明
により得られる超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子に適当な
修飾を施して、該α−アミラーゼの機能を更に改善する
ことができる。

【００３４】

【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明が以
下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。な
お、実施例中の％は重量％を意味する。

【００３５】実施例１ （ピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡの調製）ピ
ロコッカス フリオサス ＤＳＭ３６３８の培養を以下
のとおりに行った。トリプトン１％、酵母エキス０．５
％、可溶性デンプン１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジ
ャマリンラボラトリー）３．５％、ジャマリンＳ・リキ
ッド（ジャマリンラボラトリー）０．５％、ＭｇＳＯ₄
０．００３％、ＮａＣｌの０．００１％、ＦｅＳＯ₄ ・
７Ｈ₂ Ｏ ０．０００１％、ＣｏＳＯ₄ ０．０００１
％、ＣａＣｌ₂ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．０００１％、ＺｎＳＯ
₄ ０．０００１％、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂ Ｏ ０．１ppm
、ＫＡｌ（ＳＯ₄ ）₂ ０．１ppm 、Ｈ₃ ＢＯ₃ ０．１p
pm 、Ｎａ₂ ＭｏＯ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ ０．１ppm 、ＮｉＣ
ｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ ０．２５ppm の組成の培地２リットル
を２リットル容のメディウムボトルに入れ、１２０℃、
２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹込み溶存酸素を除去
した後、これに上記菌株を接種して９５℃、１６時間静
置培養した。培養後、遠心分離によって菌体を集めた。
次に集菌体を２５％スクロースを含む０．０５Ｍトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４mlに懸濁し、この懸濁液に
０．８mlのリゾチーム〔５mg／ml、０．２５Ｍトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕、２mlの０．２Ｍ ＥＤＴＡを
加えて、２０℃で１時間保温した後、２４mlのＳＥＴ溶
液〔１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、２０mMトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕を加え、更に５％ＳＤＳ４
ml、プロティナーゼＫ（１０mg／ml）４００μｌを加
え、３７℃、１時間反応させた。反応終了後、フェノー
ル−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、
約３．２mgのゲノムＤＮＡを調製した。

【００３６】（コスミドプロテインライブラリーの作
製）ピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡ４００μ
ｇをＳａｕ３ＡＩで部分消化し、密度勾配超遠心法によ
り、３５〜５０kbにサイズ分画した。次に、トリプルヘ
リックスコスミドベクター１μｇをＢａｍＨＩ消化し、
上記分画された３５〜５０kbのＤＮＡ１４０μｇと混合
したライゲーションを行い、ガイガーパックゴールド
（ストラタジーン社製）を用いたイン ビトロ パッケ
ージング法によってピロコッカス フリオサス ゲノム
ＤＮＡのフラグメントをラムダファージ粒子中にパッケ
ージングした。得られたファージ溶液の一部を用いて大
腸菌ＤＨ５αＭＣＲを形質転換し、ライブラリーを調製
した。得られたコロニーのうち数個を選んでコスミドを
調製し、適当な大きさの挿入断片があることを確認した
のち、改めて、上記ライブラリー中から５００個のコロ
ニーを選び、それぞれ個別に形質転換体を１００μｇ／
mlのアンピシリンを含む１５０mlのＬＢ培地（トリプト
ン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、Ｎａ
Ｃｌの５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）中で培養した。該
培養物を遠心し、回収した菌体を２０mMトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．０ １mlに懸濁し、１００℃で１０分間熱
処理した。続いて超音波処理を行い、更にもう一度１０
０℃、１０分間熱処理した。遠心後の上清として得られ
るライゼートをコスミドプロテインライブラリーとし
た。

【００３７】（超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子を含むコ
スミドの選択）α−アミラーゼ活性は、デンプンの加水
分解を、加水分解によって減少するヨウ素−デンプン反
応の呈色を分光光学的に追跡することにより、測定し
た。すなわち、上記コスミドプロテインライブラリーか
らライゼート２０μｌずつをとり、０．０４％可溶性デ
ンプンを含む０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５．５）５０μｌを加えて９５℃で３０分間保温し、５
０μｌの０．０１Ｎヨウ素液（１％ヨウ化カリウムを含
む）、及び１５０μｌの蒸留水を加えた後、６３０nmに
おける吸光度を測定し、対照と比較した。コスミドプロ
テインライブラリーよりα−アミラーゼ活性を持つ９つ
のコスミドクローンを得た。

【００３８】（プラスミドｐＨＩ８６の調製）α−アミ
ラーゼ活性を持つ９つのコスミドクローンのうち、最も
高い活性を示した１クローンについてコスミドを調製
し、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Hind III、ＰｓｔＩでそ
れぞれ消化した後、プラスミドベクターｐＵＣ１１９の
マルチクローニングサイトに、ライゲーションした。こ
の組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入した後、
５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢプレート上にま
き、出現したコロニーについてα−アミラーゼ活性を調
べた。すなわち、出現したコロニーを５０μｇ／mlのア
ンピシリンを含むＬＢプレート上にのせたニトロセルロ
ースメンブラン上に移して３７℃で一晩培養した後、該
メンブランをクロロホルム蒸気に１５分間さらしてコロ
ニーを溶菌させた後、風乾し、１％可溶性デンプン、５
０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含むアガ
ロースプレート上に、コロニー面を下にしてのせた。７
０℃で一晩保温した後、メンブランを取り除いたプレー
トに０．０１Ｎヨウ素液（１％ヨウ化カリウムを含む）
を加えてデンプンを染色した。デンプンが加水分解され
たためにヨウ素液で染色されなかった部分の位置からα
−アミラーゼ活性を示すコロニーを選択した。ＢａｍＨ
Ｉを除く３種の制限酵素で作製された形質転換体のコロ
ニーの中にはα−アミラーゼ活性を示すものが認めら
れ、それぞれのコロニーからプラスミドを調製した。こ
れらのプラスミドに含まれる挿入ＤＮＡ断片の大きさを
調べた結果、ＥｃｏＲＩ、Hind III、ＰｓｔＩを用いて
作製された組換えプラスミド中にはそれぞれ約６．５k
b、約３．８kb、約８kbのＤＮＡ断片が含まれていた。
このうち最も小さな挿入ＤＮＡ断片を含む、Hind IIIに
よって作製された組換えプラスミドをｐＨＩ８６と命名
した。該プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９
はEscherichia coli JM109／H-86と命名、表示され、工
業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４
７６３として寄託されている。図１にプラスミドｐＨＩ
８６の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す。

【００３９】（プラスミドｐＳＨ２４の調製）上記プラ
スミドｐＨＩ８６をHind III、ＳｐｈＩで消化後、アガ
ロースゲル電気泳動を行い、約２．４kbのＤＮＡ断片を
アガロースゲルより回収した。このＤＮＡ断片をプラス
ミドベクターｐＴＶ１１８ＮのHind III、ＳｐｈＩサイ
トにライゲーションして大腸菌ＪＭ１０９に導入し、出
現したコロニーについてコスミドプロテインライブラリ
ーのスクリーニングに用いた方法でα−アミラーゼ活性
を調べた。活性が認められたコロニーよりプラスミドを
調製し、これをプラスミドｐＳＨ２４と命名した。次に
該プラスミドｐＳＨ２４で形質転換された大腸菌ＪＭ１
０９をEscherichia coli JM109／pSH24 と命名した。図
２にプラスミドｐＳＨ２４の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素
地図を示す。

【００４０】実施例２ （超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子の塩基配列の決定）超
耐熱性α−アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配
列を決定するために、プラスミドｐＳＨ２４に含まれる
挿入ＤＮＡ断片を種々の長さ欠失させたデレーションミ
ュータントを作製した。デレーションミュータントの作
製にはキロシークエンス用デレーションキット（宝酒造
社製）を用いた。これらのうち適当な長さの欠失が起こ
ったものをいくつか選び、ＢｃａＢＥＳＴジデオキシシ
ークエンシングキット（宝酒造社製）を用いたジデオキ
シ法によりそれぞれの挿入ＤＮＡ断片部分の塩基配列を
解読した上、これらの結果を総合してプラスミドｐＳＨ
２４に含まれる挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
配列表の配列番号３にプラスミドｐＳＨ２４に挿入され
た超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片のう
ち、ＥａｅＩサイトからHind IIIサイトまでの２１３４
bpの塩基配列を示す。上記塩基配列中３３７番目から３
７３番目にかけて古細菌のプロモーター類似の配列〔ヌ
クレイック アシッズ リサーチ（Nucleic Acids Rese
arch) 第１４巻、第２４５９〜２４７９頁（１９８
６）、同第１６巻、第１〜１９頁（１９８８）〕が見ら
れること、及び３８０番目から３８８番目にかけてＳＤ
様配列が存在することから、超耐熱性α−アミラーゼは
上記配列中３９５番目のＧより始まるＧＴＧを開始コド
ンとしてコードされていることがわかる。また終止コド
ンは上記配列中１７７５番目のＴから始まるＴＧＡであ
る。以上から推定される超耐熱性α−アミラーゼのアミ
ノ酸配列を配列表の配列番号４に示す。

【００４１】上記アミノ酸配列中には、既知のα−アミ
ラーゼに保存されている相同性の高い４つの領域〔アプ
ライド マイクロバイオロジー アンド バイオテクノ
ロジー、第２３巻、第３５５〜３６０頁（１９８６）〕
がすべて存在していた。またＮ末端近傍の比較から上記
アミノ酸配列中１番目のメチオニンから２５番目のアラ
ニンまでの２５アミノ酸はシグナルペプチドであり、成
熟型α−アミラーゼのＮ末端は２６番目のアラニンであ
る。

【００４２】（プラスミドｐＮＨ１７の調製）上記の結
果を基に、大腸菌内で成熟型の超耐熱性α−アミラーゼ
を発現する組換えプラスミドをＰＣＲを利用した部位特
異的変異導入法により構築した。まず図３に示すよう
に、超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子中の成熟型α−アミ
ラーゼのＮ末端をコードする領域の直前にＮｃｏＩサイ
トと開始コドンとを導入できるように設計したオリゴヌ
クレオチドＡＭＦＮ（配列番号５）と、図４に示すよう
に超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子中のＳｐｅＩサイトを
含む領域と相補的なオリゴヌクレオチド ＡＭＲＳ（配
列番号６）とを化学的に合成した。この２つのオリゴヌ
クレオチドをプライマー、プラスミドｐＳＨ２４を鋳型
としたＰＣＲにより、これらのオリゴヌクレオチドの配
列を両端に持つ約３００bpの２本鎖ＤＮＡを合成した
後、これをＮｃｏＩ、ＳｐｅＩで消化した。一方、プラ
スミドｐＳＨ２４をＮｃｏＩ、ＳｐｅＩ消化した後、ア
ガロースゲル電気泳動によって約４．６kbのＤＮＡ断片
を単離し、これと前述の制限酵素消化したＰＣＲ産物と
をライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９に導入し
た。得られたコロニーをＩＰＴＧ存在下で培養し、コス
ミドプロテインライブラリーのスクリーニングに用いた
方法でα−アミラーゼ活性を調べ、活性が認められたコ
ロニーよりプラスミドを調製し、これをプラスミドｐＮ
Ｈ１７と命名した。プラスミドｐＮＨ１７で形質転換さ
れた大腸菌ＪＭ１０９はEscherichia coli JM109／pNH1
7 と命名、表示され、工業技術院生命工学工業技術研究
所にＦＥＲＭＢＰ−４７６４として寄託されている。図
５にプラスミドｐＮＨ１７に含まれる挿入ＤＮＡ断片の
制限酵素地図を示す。また、この挿入ＤＮＡ断片の塩基
配列を配列表の配列番号２に示す。更に、図中、超耐熱
性α−アミラーゼタンパクをコードする領域を黒矢印で
示し、その黒矢印の部分の塩基配列を配列表の配列番号
１に示す。また、上記塩基配列から推定される成熟型の
超耐熱性α−アミラーゼのアミノ酸配列を配列表の配列
番号７に示す。

【００４３】実施例３ （超耐熱性α−アミラーゼ標品の調製）実施例２で得ら
れたEscherichia coli JM109／pNH17 を、５０μｇ／ml
のアンピシリンを含む５mlのＬＢ培地（トリプトン１０
ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌの
５ｇ／リットル、ｐＨ７．０）中、３７℃で一夜振とう
培養した。２リットル容の三角フラスコに同様の培地５
００mlを準備し、前述の培養液５mlを接種し、３７℃で
振とう培養した。培養液の６６０nmにおける吸光度が
０．５に達したところで終濃度２mMとなるようにＩＰＴ
Ｇ溶液を加え、更に３７℃で１２時間培養した。培養終
了後、遠心分離して得られた菌体を５mlの５０mMリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に懸濁し、超音波処理
によって菌体を破砕した後、遠心分離して得た上清を粗
抽出液とした。この粗抽出液を９５℃、３０分間熱処理
した後、遠心分離によって変性したタンパクを除去し、
得られた上清に終濃度１％となるように硫酸ストレプト
マイシンを加えた。この試料を再び遠心分離して得られ
た上清に８０％飽和となるよう硫酸アンモニウムを加
え、沈殿物を遠心分離によって回収した。得られた沈殿
物を１mlの５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．
５）に溶解し、同緩衝液に対して一晩透析した。この透
析内液を粗精製酵素標品とした。

【００４４】

【発明の効果】本発明により、極めて高い耐熱性を有す
るα−アミラーゼをコードする遺伝子が得られた。該遺
伝子を用い、超耐熱性α−アミラーゼが高純度で大量に
供給できる。

【００４５】

【配列表】

【００４６】配列番号：1 配列の長さ：1305 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：ピロコッカス フリオサス(Pyrococcus furios
us) 配列： GCAAAATACT TGGAGCTTGA AGAGGGAGGA GTTATAATGC AAGCATTCTA TTGGGATGTT 60 CCAGGGGGAG GAATTTGGTG GGATCATATA AGATCGAAGA TTCCTGAATG GTATGAAGCT 120 GGAATCTCTG CAATATGGCT ACCTCCACCA AGCAAGGGGA TGAGTGGAGG ATATTCAATG 180 GGCTACGATC CCTATGATTA CTTTGATCTC GGCGAGTACT ACCAGAAGGG AACTGTAGAG 240 ACGCGTTTTG GATCAAAAGA AGAACTAGTG AGATTGATAC AAACTGCCCA TGCCTATGGA 300 ATAAAGGTAA TCGCCGATGT AGTTATAAAC CACAGGGCTG GTGGTGACCT AGAATGGAAC 360 CCCTTCGTTG GAGATTACAC ATGGACAGAC TTTTCTAAAG TTGCCTCAGG GAAATATACA 420 GCTAACTATC TGGACTTCCA TCCAAACGAG CTTCATTGTT GTGACGAAGG AACCTTTGGA 480 GGATTTCCAG ATATATGTCA TCACAAAGAG TGGGATCAGT ACTGGCTATG GAAGAGCAAT 540 GAGAGTTATG CTGCTTATTT AAGAAGCATA GGATTTGATG GTTGGAGATT TGACTATGTT 600 AAGGGCTATG GAGCTTGGGT TGTCAGAGAC TGGCTTAATT GGTGGGGAGG TTGGGCAGTT 660 GGAGAGTACT GGGACACAAA TGTAGATGCA CTACTAAGCT GGGCATATGA GAGTGGTGCA 720 AAGGTCTTTG ACTTCCCGCT CTACTATAAA ATGGATGAAG CATTTGACAA TAACAACATT 780 CCAGCATTAG TCTATGCCCT ACAAAACGGA CAAACTGTAG TTTCGAGAGA TCCATTTAAG 840 GCAGTAACTT TCGTTGCCAA TCATGACACA GATATAATAT GGAACAAGTA TCCAGCATAT 900 GCGTTCATAT TGACATATGA GGGACAGCCA GTAATATTCT ACAGGGACTT TGAGGAATGG 960 CTGAACAAGG ATAAGCTAAT TAACCTCATT TGGATCCATG ATCATTTGGC AGGAGGAAGC 1020 ACAACAATTG TCTACTACGA CAACGATGAG CTCATATTTG TGAGAAATGG AGATTCTAGA 1080 AGGCCTGGGC TTATAACTTA CATTAACTTG AGCCCTAACT GGGTTGGTAG GTGGGTATAC 1140 GTTCCAAAGT TTGCAGGGGC TTGTATTCAT GAATACACTG GAAACCTAGG AGGATGGGTA 1200 GATAAAAGAG TAGATAGTAG CGGATGGGTA TACCTAGAGG CACCACCTCA CGATCCAGCT 1260 AACGGCTACT ATGGGTACTC CGTATGGAGT TATTGTGGTG TTGGG 1305

【００４７】配列番号：2 配列の長さ：1670 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：ピロコッカス フリオサス(Pyrococcus furios
us) 配列： CCATGGCAAA ATACTTGGAG CTTGAAGAGG GAGGAGTTAT AATGCAAGCA TTCTATTGGG 60 ATGTTCCAGG GGGAGGAATT TGGTGGGATC ATATAAGATC GAAGATTCCT GAATGGTATG 120 AAGCTGGAAT CTCTGCAATA TGGCTACCTC CACCAAGCAA GGGGATGAGT GGAGGATATT 180 CAATGGGCTA CGATCCCTAT GATTACTTTG ATCTCGGCGA GTACTACCAG AAGGGAACTG 240 TAGAGACGCG TTTTGGATCA AAAGAAGAAC TAGTGAGATT GATACAAACT GCCCATGCCT 300 ATGGAATAAA GGTAATCGCC GATGTAGTTA TAAACCACAG GGCTGGTGGT GACCTAGAAT 360 GGAACCCCTT CGTTGGAGAT TACACATGGA CAGACTTTTC TAAAGTTGCC TCAGGGAAAT 420 ATACAGCTAA CTATCTGGAC TTCCATCCAA ACGAGCTTCA TTGTTGTGAC GAAGGAACCT 480 TTGGAGGATT TCCAGATATA TGTCATCACA AAGAGTGGGA TCAGTACTGG CTATGGAAGA 540 GCAATGAGAG TTATGCTGCT TATTTAAGAA GCATAGGATT TGATGGTTGG AGATTTGACT 600 ATGTTAAGGG CTATGGAGCT TGGGTTGTCA GAGACTGGCT TAATTGGTGG GGAGGTTGGG 660 CAGTTGGAGA GTACTGGGAC ACAAATGTAG ATGCACTACT AAGCTGGGCA TATGAGAGTG 720 GTGCAAAGGT CTTTGACTTC CCGCTCTACT ATAAAATGGA TGAAGCATTT GACAATAACA 780 ACATTCCAGC ATTAGTCTAT GCCCTACAAA ACGGACAAAC TGTAGTTTCG AGAGATCCAT 840 TTAAGGCAGT AACTTTCGTT GCCAATCATG ACACAGATAT AATATGGAAC AAGTATCCAG 900 CATATGCGTT CATATTGACA TATGAGGGAC AGCCAGTAAT ATTCTACAGG GACTTTGAGG 960 AATGGCTGAA CAAGGATAAG CTAATTAACC TCATTTGGAT CCATGATCAT TTGGCAGGAG 1020 GAAGCACAAC AATTGTCTAC TACGACAACG ATGAGCTCAT ATTTGTGAGA AATGGAGATT 1080 CTAGAAGGCC TGGGCTTATA ACTTACATTA ACTTGAGCCC TAACTGGGTT GGTAGGTGGG 1140 TATACGTTCC AAAGTTTGCA GGGGCTTGTA TTCATGAATA CACTGGAAAC CTAGGAGGAT 1200 GGGTAGATAA AAGAGTAGAT AGTAGCGGAT GGGTATACCT AGAGGCACCA CCTCACGATC 1260 CAGCTAACGG CTACTATGGG TACTCCGTAT GGAGTTATTG TGGTGTTGGG TGACTTTTTC 1320 TTTTTTCTTT TTAACAATGG GAGAAGTGCA AATACTGCGA CAATTCCTGG GCCGCATACA 1380 GGAGTTTCTG GAGCGGCTTC ATTCAATATT ACTGTTTTAT TTCCAATTCC ATACAACGTG 1440 ACATTTGTTG GTTGGAGAGG TTCCCAGGGA AGTCCCTTAT ATAGTTGAAC TGTAAAAGTT 1500 TTGTTTCTGG GGAGGGGAAC CACGGCAAAG TAGTGTCCCG TTGGAGATTT CAAGAGGGGT 1560 CTCGGCTCTG AGAGTTCTGG TATGTTCCCC TTGACCCAAA GGTAACCAGT GTAGTTTCCT 1620 TGTAGGACTA TTAGTGCTGG GATATCATTG CTAGAATAGT ACCTAAGCTT 1670

【００４８】配列番号：3 配列の長さ：2134 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：ピロコッカス フリオサス(Pyrococcus furios
us) 配列： CGGCCACCAT TGTAACGTCA TCGTGAGTTG GCCCGAGGCC TCCCGAAATA ATAAGAACAT 60 CGGGTTTTCT GTTAAGGGAT TCTAAAATTA CAGACCTTAT ATCCTCCACG TCATCGCCAA 120 CAGTAGTTAT TCTCTTAACG AGGTATCCTC TCTCCGTTAA TTTCTTCGCT ATGTGTGCTG 180 AGTTGCTGTT TACAGTATTC CCTGTTAAAA GTTCATCACC TACGGTAATT ATTTCCGCGA 240 ACATTGGTTC TCCCCAGGAA TTGTTTTTAT CAAGAGTTTA TTAGATTTTG ACGTGCGTTG 300 ATGAACATTT ATGTTCACAT GATCATAACA GAAAAATTTA TATGTATCAT CACCAGTGAT 360 ACATTATGAG ACTTTGGTGT ATGGAGGTGA TCACGTGAAC ATAAAGAAAT TAACACCCCT 420 CCTAACTCTA TTACTGTTTT TTATAGTACT AGCAAGTCCA GTAAGTGCAG CAAAATACTT 480 GGAGCTTGAA GAGGGAGGAG TTATAATGCA AGCATTCTAT TGGGATGTTC CAGGGGGAGG 540 AATTTGGTGG GATCATATAA GATCGAAGAT TCCTGAATGG TATGAAGCTG GAATCTCTGC 600 AATATGGCTA CCTCCACCAA GCAAGGGGAT GAGTGGAGGA TATTCAATGG GCTACGATCC 660 CTATGATTAC TTTGATCTCG GCGAGTACTA CCAGAAGGGA ACTGTAGAGA CGCGTTTTGG 720 ATCAAAAGAA GAACTAGTGA GATTGATACA AACTGCCCAT GCCTATGGAA TAAAGGTAAT 780 CGCCGATGTA GTTATAAACC ACAGGGCTGG TGGTGACCTA GAATGGAACC CCTTCGTTGG 840 AGATTACACA TGGACAGACT TTTCTAAAGT TGCCTCAGGG AAATATACAG CTAACTATCT 900 GGACTTCCAT CCAAACGAGC TTCATTGTTG TGACGAAGGA ACCTTTGGAG GATTTCCAGA 960 TATATGTCAT CACAAAGAGT GGGATCAGTA CTGGCTATGG AAGAGCAATG AGAGTTATGC 1020 TGCTTATTTA AGAAGCATAG GATTTGATGG TTGGAGATTT GACTATGTTA AGGGCTATGG 1080 AGCTTGGGTT GTCAGAGACT GGCTTAATTG GTGGGGAGGT TGGGCAGTTG GAGAGTACTG 1140 GGACACAAAT GTAGATGCAC TACTAAGCTG GGCATATGAG AGTGGTGCAA AGGTCTTTGA 1200 CTTCCCGCTC TACTATAAAA TGGATGAAGC ATTTGACAAT AACAACATTC CAGCATTAGT 1260 CTATGCCCTA CAAAACGGAC AAACTGTAGT TTCGAGAGAT CCATTTAAGG CAGTAACTTT 1320 CGTTGCCAAT CATGACACAG ATATAATATG GAACAAGTAT CCAGCATATG CGTTCATATT 1380 GACATATGAG GGACAGCCAG TAATATTCTA CAGGGACTTT GAGGAATGGC TGAACAAGGA 1440 TAAGCTAATT AACCTCATTT GGATCCATGA TCATTTGGCA GGAGGAAGCA CAACAATTGT 1500 CTACTACGAC AACGATGAGC TCATATTTGT GAGAAATGGA GATTCTAGAA GGCCTGGGCT 1560 TATAACTTAC ATTAACTTGA GCCCTAACTG GGTTGGTAGG TGGGTATACG TTCCAAAGTT 1620 TGCAGGGGCT TGTATTCATG AATACACTGG AAACCTAGGA GGATGGGTAG ATAAAAGAGT 1680 AGATAGTAGC GGATGGGTAT ACCTAGAGGC ACCACCTCAC GATCCAGCTA ACGGCTACTA 1740 TGGGTACTCC GTATGGAGTT ATTGTGGTGT TGGGTGACTT TTTCTTTTTT CTTTTTAACA 1800 ATGGGAGAAG TGCAAATACT GCGACAATTC CTGGGCCGCA TACAGGAGTT TCTGGAGCGG 1860 CTTCATTCAA TATTACTGTT TTATTTCCAA TTCCATACAA CGTGACATTT GTTGGTTGGA 1920 GAGGTTCCCA GGGAAGTCCC TTATATAGTT GAACTGTAAA AGTTTTGTTT CTGGGGAGGG 1980 GAACCACGGC AAAGTAGTGT CCCGTTGGAG ATTTCAAGAG GGGTCTCGGC TCTGAGAGTT 2040 CTGGTATGTT CCCCTTGACC CAAAGGTAAC CAGTGTAGTT TCCTTGTAGG ACTATTAGTG 2100 CTGGGATATC ATTGCTAGAA TAGTACCTAA GCTT 2134

【００４９】配列番号：4 配列の長さ：460 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：ピロコッカス フリオサス(Pyrococcus furios
us) 配列： Met Asn Ile Lys Lys Leu Thr Pro Leu Leu Thr Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Phe Ile Val Leu Ala Ser Pro Val Ser Ala Ala Lys Tyr Leu Glu 20 25 30 Leu Glu Glu Gly Gly Val Ile Met Gln Ala Phe Tyr Trp Asp Val 35 40 45 Pro Gly Gly Gly Ile Trp Trp Asp His Ile Arg Ser Lys Ile Pro 50 55 60 Glu Trp Tyr Glu Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Leu Pro Pro Pro 65 70 75 Ser Lys Gly Met Ser Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr 80 85 90 Asp Tyr Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Lys Gly Thr Val Glu 95 100 105 Thr Arg Phe Gly Ser Lys Glu Glu Leu Val Arg Leu Ile Gln Thr 110 115 120 Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Val Ile Ala Asp Val Val Ile Asn 125 130 135 His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Val Gly Asp 140 145 150 Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Val Ala Ser Gly Lys Tyr Thr 155 160 165 Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Cys Cys Asp 170 175 180 Glu Gly Thr Phe Gly Gly Phe Pro Asp Ile Cys His His Lys Glu 185 190 195 Trp Asp Gln Tyr Trp Leu Trp Lys Ser Asn Glu Ser Tyr Ala Ala 200 205 210 Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Phe Asp Gly Trp Arg Phe Asp Tyr Val 215 220 225 Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Val Val Arg Asp Trp Leu Asn Trp Trp 230 235 240 Gly Gly Trp Ala Val Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Val Asp Ala 245 250 255 Leu Leu Ser Trp Ala Tyr Glu Ser Gly Ala Lys Val Phe Asp Phe 260 265 270 Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Asn Asn Ile 275 280 285 Pro Ala Leu Val Tyr Ala Leu Gln Asn Gly Gln Thr Val Val Ser 290 295 300 Arg Asp Pro Phe Lys Ala Val Thr Phe Val Ala Asn His Asp Thr 305 310 315 Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr 320 325 330 Tyr Glu Gly Gln Pro Val Ile Phe Tyr Arg Asp Phe Glu Glu Trp 335 340 345 Leu Asn Lys Asp Lys Leu Ile Asn Leu Ile Trp Ile His Asp His 350 355 360 Leu Ala Gly Gly Ser Thr Thr Ile Val Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu 365 370 375 Leu Ile Phe Val Arg Asn Gly Asp Ser Arg Arg Pro Gly Leu Ile 380 385 390 Thr Tyr Ile Asn Leu Ser Pro Asn Trp Val Gly Arg Trp Val Tyr 395 400 405 Val Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn 410 415 420 Leu Gly Gly Trp Val Asp Lys Arg Val Asp Ser Ser Gly Trp Val 425 430 435 Tyr Leu Glu Ala Pro Pro His Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Tyr Gly 440 445 450 Tyr Ser Val Trp Ser Tyr Cys Gly Val Gly 455 460

【００５０】配列番号：5 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CAGTAAGTGC CATGGCAAAA TACTT 25

【００５１】配列番号：6 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTGTATCAAT CTCACTAGTT CTTCT 25

【００５２】配列番号：7 配列の長さ：435 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：ピロコッカス フリオサス(Pyrococcus furios
us) 配列： Ala Lys Tyr Leu Glu Leu Glu Glu Gly Gly Val Ile Met Gln Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Trp Asp Val Pro Gly Gly Gly Ile Trp Trp Asp His Ile 20 25 30 Arg Ser Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Glu Ala Gly Ile Ser Ala Ile 35 40 45 Trp Leu Pro Pro Pro Ser Lys Gly Met Ser Gly Gly Tyr Ser Met 50 55 60 Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Tyr Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln 65 70 75 Lys Gly Thr Val Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Glu Glu Leu Val 80 85 90 Arg Leu Ile Gln Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Val Ile Ala 95 100 105 Asp Val Val Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn 110 115 120 Pro Phe Val Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Val Ala 125 130 135 Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu 140 145 150 Leu His Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe Gly Gly Phe Pro Asp Ile 155 160 165 Cys His His Lys Glu Trp Asp Gln Tyr Trp Leu Trp Lys Ser Asn 170 175 180 Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Phe Asp Gly Trp 185 190 195 Arg Phe Asp Tyr Val Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Val Val Arg Asp 200 205 210 Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Val Gly Glu Tyr Trp Asp 215 220 225 Thr Asn Val Asp Ala Leu Leu Ser Trp Ala Tyr Glu Ser Gly Ala 230 235 240 Lys Val Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe 245 250 255 Asp Asn Asn Asn Ile Pro Ala Leu Val Tyr Ala Leu Gln Asn Gly 260 265 270 Gln Thr Val Val Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Val Thr Phe Val 275 280 285 Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr 290 295 300 Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gln Pro Val Ile Phe Tyr Arg 305 310 315 Asp Phe Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Ile Asn Leu Ile 320 325 330 Trp Ile His Asp His Leu Ala Gly Gly Ser Thr Thr Ile Val Tyr 335 340 345 Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Val Arg Asn Gly Asp Ser Arg 350 355 360 Arg Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Ser Pro Asn Trp Val 365 370 375 Gly Arg Trp Val Tyr Val Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His 380 385 390 Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Val Asp Lys Arg Val Asp 395 400 405 Ser Ser Gly Trp Val Tyr Leu Glu Ala Pro Pro His Asp Pro Ala 410 415 420 Asn Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ser Val Trp Ser Tyr Cys Gly Val Gly 425 430 435

【図面の簡単な説明】

【図１】超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子を含有する約
３．８ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図であ
る。

【図２】超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子を含有する約
２．４ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図であ
る。

【図３】オリゴヌクレオチドＡＭＦＮの配列を示す図で
ある。

【図４】オリゴヌクレオチドＡＭＲＳの配列を示す図で
ある。

【図５】超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子を含有する約
１．７ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図であ
る。

【図６】本発明により得られる超耐熱性α−アミラーゼ
の１例の活性とｐＨとの関係を示す図である。

【図７】本発明により得られる超耐熱性α−アミラーゼ
の１例の活性と温度との関係を示す図である。

【図８】本発明により得られる超耐熱性α−アミラーゼ
の１例の耐熱性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 小山 信人 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 山本 克彦 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 浅田 起代蔵 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１で表される塩基配列
   を含有することを特徴とする超耐熱性α−アミラーゼ遺
   伝子。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の超耐熱性α−アミラー
   ゼ遺伝子に厳密な条件下でハイブリダイズ可能な超耐熱
   性α−アミラーゼ遺伝子。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号２、又は３で表される
   請求項１に記載の超耐熱性α−アミラーゼ遺伝子。