CN103119174A - 用于鉴定胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴定用于饲料添加物中的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的方法，所述方法包括：i)提供α淀粉酶；ii)将所述α淀粉酶与玉米基饲料和具有9000U/ml的胃蛋白酶浓度的缓冲溶液在pH 3、40℃、500rpm下混合至少120分钟，并与对照样品相比较分析所述α淀粉酶的α淀粉酶活性；其中所述对照样品的不同之处在于在温育过程中不存在胃蛋白酶；以及iii)选择在测定条件下基本上维持α淀粉酶活性的α淀粉酶；本发明还涉及包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的饲料添加物和饲料以及胃蛋白酶耐受性α淀粉酶在饲料中的用途。

Description

用于鉴定胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的方法
技术领域
本发明涉及胃蛋白酶耐受性α淀粉酶。更具体而言，本发明涉及鉴定用于饲料添加物和饲料中的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的方法、包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的饲料添加物和饲料、它们的用途以及用于饲料添加物和饲料的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶。
背景技术
单胃动物消费的饲料(包括任何饲料添加物)在胃中经受极酸性(pH 2-3)环境以及酶降解。在这种严苛的低pH环境之后是小肠中更中性的环境(pH6-7)以及另外的消化酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶)的降解。
家禽和猪是杂食性的，从而可能通过消费一系列种子、根、无机材料和昆虫来满足它们的营养需求。然而，为了满足消费者对‘素食动物生产’的偏好，以及使与农场动物的工业生产相关的饲料成本降到最低，给予这些动物的饲料对消化系统(尤其是新生儿中)而言很少是最佳的。
例如，一些谷类例如小麦和大麦的非淀粉多糖(NSP)级分可增加肠中的粘度，这可损害营养物的扩散。这种抗营养效应可以通过添加木聚糖酶和/或β-葡聚糖酶来降低，所述木聚糖酶和/或β-葡聚糖酶分别使半纤维素聚合物、木聚糖和β-葡聚糖成为片段。
改善营养物的可利用率的另一个实例是植酸(植物磷酸盐储备)的降解，植酸不容易被动物所产生的酶水解。向饲料添加植酸酶可确保从植酸释放磷酸盐，从而可以部分或全部满足动物对磷酸盐的需要。
因此，在一些情况下，外源酶可以弥补饲料的性质与动物自身的消化酶之间的差距。然而，研究已显示，尽管家禽和猪二者均能够有大量的内源性淀粉酶和蛋白酶合成，但仍可有机会通过使用外源酶增强动物消化且从而改善动物性能的机会。
将在其他添加物中的α淀粉酶加入饲料中以改善饲料的淀粉利用。历史上，添加至饲料的具体淀粉酶的量已使用标准淀粉酶测定例如片剂测定和最近的KoneLab测定进行测定。
WO 2008/006881只涉及牛饲料且公开了细菌淀粉酶的使用。然而，牛胃肠道中的条件与单胃动物的明显不同，用于牛的饲料的组成与用于单胃动物的明显不同。例如，喂给反刍动物的大多数淀粉由通常具有5.0至5.5的pH的瘤胃中的微生物代谢，而在单胃动物中，内源性α淀粉酶将淀粉分解为葡萄糖。此外，负责蛋白质分解的胃蛋白酶首先在牛胃的第四个和最后一个区室中的皱胃中释放。
US 2008-0206401公开了包含热稳定性α淀粉酶的非常特定的干宠物食品。
因此，有需要鉴定用于饲料中的α淀粉酶，其可提供改善的动物性能和/或允许α淀粉酶以减少的量使用，而对动物性能无有害影响。
发明内容
本发明基于本发明人令人惊讶的发现：具有胃蛋白酶耐受性的α淀粉酶在饲料中例如在用于单胃动物的饲料中是特别有用的，因为它们可导致改善的动物性能和/或允许α淀粉酶以减少的量使用。
胃蛋白酶是由动物在消化系统的第一个部分中分泌的消化率蛋白酶。胃蛋白酶可降解蛋白质，这使得蛋白质可用作动物的营养物。外源酶(即添加至饲料中的酶)也是蛋白质，并且如果它们易于受胃蛋白酶降解，则它们会被降解。这在大多数情况下会破坏酶活性。
不希望受任何理论束缚，本发明人假定胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可导致该酶在回肠中具有增加的活性，这使得淀粉代谢产物的摄取改善。此外，胃蛋白酶耐受性酶的活性增加可导致内源性α淀粉酶产生减少，从而增加饲料功效。
根据本发明的广泛方面，提供鉴定用于饲料添加物的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的方法，其包括：
i)提供α淀粉酶；
ii)将所述α淀粉酶与玉米基饲料和胃蛋白酶掺混，在pH 3下温育，并与对照样品相比较分析所述α淀粉酶的α淀粉酶活性；其中所述对照样品的不同之处在于在pH 3下温育过程中不存在胃蛋白酶；并且
iii)选择在测定条件下基本上维持α淀粉酶活性的α淀粉酶。
所谓“基本上维持α淀粉酶活性”，其意指当与在不存在胃蛋白酶的情况下的酶活性相比较时，接受本文详述的胃蛋白酶耐受性测定的α淀粉酶保留至少约75％酶活性，例如约75％-125％酶活性。因此，“基本上维持α淀粉酶活性”的α淀粉酶在玉米基饲料的存在下与至少9000U/ml胃蛋白酶一起在pH 3下温育2小时后，与相同酶与玉米基饲料一起在相同pH(即pH 3)下温育相同时间(即至少2小时)后相比较，保留至少约75％(例如75至125％)活性。
所谓“胃蛋白酶耐受性α淀粉酶”，其意指当接受本文所详述的胃蛋白酶耐受性测定时，保留至少约75％(例如约75至125％)活性的α淀粉酶。
不希望受理论束缚，本发明人已惊讶地发现，α淀粉酶的胃蛋白酶耐受性是获得在经过动物的胃肠道过程中基本上维持活性的α淀粉酶的关键。因此，与常规α淀粉酶相比胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可以更低的剂量使用，并且可以增加饲料的淀粉利用。
在本发明的另一方面，提供制备单胃动物的饲料添加物的方法，其包括将胃蛋白酶耐受性α淀粉酶与至少一种选自如下的生理上可接受的载体掺混：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1，3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。
在本发明的另一个方面，提供单胃动物的饲料添加物，其包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶和至少一种选自如下的生理上可接受的载体：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1，3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。
在本发明的另一方面，提供包含胃蛋白酶耐受性木霉属(Trichoderma)(例如里氏木霉(Trichoderma reesei))α淀粉酶的饲料添加物和/或饲料。
本发明人已惊讶地发现，来自木霉属(例如里氏木霉)的α淀粉酶对于在饲料中使用是特别有效的，并且令人惊讶地是胃蛋白酶耐受性的。
在进一步方面，本发明提供包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的家禽饲料添加物和/或饲料。
根据本发明的另一个方面，提供：1)制备单胃动物的饲料的方法，其包括将本发明的饲料添加物与一种或多种饲料材料混合；和2)通过所述方法制备的饲料。
本发明进一步提供包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的单胃动物饲料，其中所述饲料包含少于3000个单位的α淀粉酶/千克饲料，优选少于2800，或少于2600，或少于2400或少于2200或少于2100或少于2000个单位的α淀粉酶/千克饲料。
应当理解，一淀粉酶单位是在pH 6.5和37℃下每分钟从水不溶性交联淀粉聚合物底物释放1mmol的糖苷键的酶量。
在另一方面，本发明提供用于饲料添加物和/或饲料中的α淀粉酶，其中在100000U/ml胃蛋白酶的存在下温育后，所述α淀粉酶基本上维持α淀粉酶活性。胃蛋白酶单位在下面的文实施例中定义。
本发明进一步提供：用于单胃动物的饲料添加物和/或饲料，其中所述饲料添加物和/或饲料包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶以改善动物性能和/或增加能量吸收/饲料功效；增加家禽和/或猪的增重的方法(其包括给所述家禽和/或猪饲喂养包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的饲料)和胃蛋白酶耐受性α淀粉酶减少动物中的内源性α淀粉酶的表达的用途，以及基本上如本文描述的方法、饲料添加物、饲料和用于饲料中的淀粉酶。
在本发明的另一方面，提供包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的饲料添加物用于改善动物性能和/或增加能量吸收和/或饲料功效和/或用于改善饲料中的原材料消化率(例如营养物消化率，如淀粉消化率)和/或用于改善饲料转化率(FCR)和/或用于改善动物中的增重的用途。
在本发明的又一个方面，提供包含饲料添加物组合物的预混物，其包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶和至少一种矿物质和/或至少一种维生素(或基本上由它们组成或由它们组成)。
具体实施方式
在一个方面，本发明涉及鉴定用于饲料添加物中的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的方法，其包括：
i)提供α淀粉酶；
ii)将所述α淀粉酶与玉米基饲料掺混，在pH 3下温育，并与对照样品相比较分析所述α淀粉酶的α淀粉酶活性；其中所述对照样品的不同之处在于在pH 3下温育过程中不存在胃蛋白酶；并且
iii)选择在测定条件下基本上维持α淀粉酶活性的α淀粉酶。
合适的是，步骤ii)中的胃蛋白酶水平是至少约9000U/ml、至少约10000U/ml、至少10500U/ml、至少11000U/ml、至少12000U/ml、至少13000U/ml、至少14000U/ml、至少15000U/ml、至少16000U/ml、至少17000U/ml、至少18000U/ml、至少19000U/ml、至少20000U/ml、至少21000U/ml、至少22000U/ml或至少23000U/ml胃蛋白酶。
α淀粉酶可以与胃蛋白酶一起温育至少2小时、至少2.5小时、至少3小时或至少3.5小时。优选地，将淀粉酶与胃蛋白酶一起温育少于6小时。
在一个实施方案中，将淀粉酶与胃蛋白酶一起温育约2至约6小时，优选约2至约4小时或约2小时。
合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以保留至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的活性。合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下的活性相比较，α淀粉酶可以具有约80-120％、约85-115％、约90-110％、约95-105％、约96-104％、约97-103％、约98-102％或约99-101％的活性。与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以具有相同活性。
在下文列出的本发明的实施方案中，合适的是α淀粉酶可以是如SEQID NO：1中所示的α淀粉酶。合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，如SEQ ID NO：1中所示的α淀粉酶可以保留至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％活性。合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下的活性相比较，如SEQ ID NO：1中所示的α淀粉酶可以具有约80-120％、约85-115％、约90-110％、约95-105％、约96-104％、约97-103％、约98-102％或约99-101％活性。合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，如SEQ ID NO：1中所示的α淀粉酶可以具有相同活性。
在下文阐述的本发明的进一步实施方案中，α淀粉酶可以适当地是如SEQ ID NO：3中所示的α淀粉酶。合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，SEQ ID NO：3中所示的α淀粉酶可保留至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的活性。合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下的活性相比较，SEQ ID NO：3中所示的α淀粉酶可以具有约80-120％、约85-115％、约90-110％、约95-105％、约96-104％、约97-103％、约98-102％或约99-101％的活性。与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，SEQ ID NO：3中所示的α淀粉酶可具有相同活性。
所谓“不存在胃蛋白酶”，其意指无特别加入的胃蛋白酶(即未将外源胃蛋白酶添加至对照样品中)。然而，将容易理解痕量胃蛋白酶可以存在于所添加的其他组成成分如玉米基饲料中。
饲料添加物可以用于单胃动物，例如家禽、猪、驯养宠物或鱼。在一些方面，单胃动物优选是家禽。
本文所用的术语“饲料添加物”和“饲料添加剂”是可互换的。
本发明提供制备单胃动物的饲料添加物的方法，其包括将胃蛋白酶耐受性α淀粉酶与至少一种选自如下的生理上可接受的载体混合：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1，3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。
在一个实施方案中，根据本发明的饲料添加物可以配制为预混物。仅作为例子，预混物可包含一种或多种饲料组分，例如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。
胃蛋白酶耐受性淀粉酶可以通过使用本发明用于鉴定胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的方法进行鉴定。
优选地，胃蛋白酶耐受性淀粉酶具有如下氨基酸序列：
i)SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
ii)除一个或数个氨基酸添加/插入、缺失或置换外的SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
iii)与SEQ ID No.1具有至少85％(优选至少90％、95％、97％、98％或99％)同一性或与SEQ ID No.3具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列；
iv)由包含SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
vi)由与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4相差一个或数个核苷酸添加/插入、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vii)由与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。
胃蛋白酶耐受性α淀粉酶还可以由在严格或高度严格条件下与SEQ IDNo.2或SEQ ID No.4杂交的核苷酸序列编码。
在与SEQ ID No.1进行缺口比对(gap alignment)时，本发明的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶优选包含选自如下的氨基酸中的任一者或多者：K88；I103；H133；Y175；Y290；F292；R442和H450，其中氨基酸编号方式涉及SEQ ID No.1。
合适的是，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可以包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；和
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)
或可包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％或85％或90％同一性的氨基酸序列。
此外，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；位置85-90
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；位置100-105
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；位置130-135
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；位置172-177
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；位置287-295
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；位置439-444
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)位置447-452
或可以包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％或85％或90％同一性的氨基酸序列，其中氨基酸编号方式涉及SEQ ID No.1。
应当理解，本发明涵盖i)至vii)中的任何组合和/或特别叙述的氨基酸的任何组合。
本发明提供用于单胃动物的饲料添加物，其包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶和至少一种选自如下的生理上可接受的载体：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1，3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。合适的是，可以使用本文公开的任何胃蛋白酶耐受性α淀粉酶。
合适的是，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可以使用本文公开的鉴定胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的方法进行鉴定。
合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以保留至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的活性。合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下的活性相比较，α淀粉酶可以具有约80-120％、约85-115％、约90-110％、约95-105％、约96-104％、约97-103％、约98-102％或约99-101％的活性。与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以具有相同活性。
合适的是，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可以具有如下氨基酸序列：
i)SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列；
ii)除一个或数个氨基酸添加/插入、缺失或置换外的SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列；
iii)与SEQ ID No.1具有至少85％(优选至少90％、95％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列；或
iv)由包含SEQ ID No.2的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.2的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
vi)由与SEQ ID No.2相差一个或数个核苷酸添加/插入、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vii)由与SEQ ID No.2具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。
在与SEQ ID No.1进行缺口比对时，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可包含选自如下的氨基酸中的任一者或多者：K88；I103；H133；Y175；Y290；F292；R442和H450，其中氨基酸编号方式涉及SEQ ID No.1，和/或可以包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；和
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)
或可包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％、85％或90％同一性的氨基酸序列。
此外，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；位置85-90
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；位置100-105
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；位置130-135
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；位置172-177
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；位置287-295
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；位置439-444
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)位置447-452
或可包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％或85％或90％同一性的氨基酸序列，其中氨基酸编号方式涉及SEQ ID No.1。
应当理解，本发明涵盖i)至vii)中的任何组合和/或特别叙述的氨基酸的任何组合。
当单胃动物是家禽时，在消费包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的饲料后，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶基本上维持胃蛋白酶耐受性至少2-4小时是有利的。
当单胃动物是猪时，在消费包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的饲料后，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶基本上维持胃蛋白酶耐受性至少2-6小时是有利的。
本发明还提供制备单胃动物的饲料的方法，其包括将本发明的饲料添加物或通过本发明的方法鉴定的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶与一种或多种饲料材料混合。
合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以保留至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的活性。合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下的活性相比较，α淀粉酶可以具有约80-120％、约85-115％、约90-110％、约95-105％、约96-104％、约97-103％、约98-102％或约99-101％的活性。与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以具有相同活性。
合适的是，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可以具有如下氨基酸序列：
i)SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列；
ii)除一个或数个氨基酸添加/插入、缺失或置换外的SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列；
iii)与SEQ ID No.1具有至少85％(优选至少90％、95％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列；或
iv)由包含SEQ ID No.2的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.2的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
vi)由与SEQ ID No.2相差一个或数个核苷酸添加/插入、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vii)由与SEQ ID No.2具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。
在与SEQ ID No.1进行缺口比对时，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可包含选自如下的氨基酸中的任一者或多者：K88；I103；H133；Y175；Y290；F292；R442和H450，其中氨基酸编号方式涉及SEQ ID No.1，和/或可以包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；和
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)
或可包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％、85％或90％同一性的氨基酸序列。
此外，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；位置85-90
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；位置100-105
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；位置130-135
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；位置172-177
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；位置287-295
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；位置439-444
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)位置447-452
或可包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％或85％或90％同一性的氨基酸序列，其中氨基酸编号方式涉及SEQ ID No.1。
应当理解，本发明涵盖i)至vii)中的任何组合和/或特别叙述的氨基酸的任何组合。
在一些实施方案中，所述饲料添加物/胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可改善动物性能和/或增加能量吸收/饲料功效和/或提供更低的饲料转化率和/或提供动物的增重和/或饲料中的营养物消化率(例如淀粉消化率)和/或饲料中的可消化能量或可代谢能量。
可以使用任何饲料材料。合适的是，可以使用如下饲料材料中的任何一种或多种：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物例如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)得自如下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白质、乳清、干椰肉、芝麻；d)得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素；f)a)至d)中任一者或多者的预混物。
合适的是，如本文提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，所述微量成分为例如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物及其他必需成分。预混物通常是适合于掺和进商业口粮内的组合物。
在优选的实施方案中，饲料可包含少于4000、少于3000、少于2000、少于1900、少于1800、少于1700、少于1600、少于1500、少于1400、少于1300、少于1200、少于1100、少于1000、少于900、少于800、少于700、少于600、少于500或少于约400个单位的α淀粉酶/千克饲料。
本发明还提供通过包括如下步骤的方法制备的单胃动物的饲料：将本发明的饲料添加物或通过本发明的方法鉴定的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶与一种或多种饲料材料混合。
合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以保留至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的活性。合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下的活性相比较，α淀粉酶可以具有约80-120％、约85-115％、约90-110％、约95-105％、约96-104％、约97-103％、约98-102％或约99-101％的活性。与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以具有相同活性。
合适的是，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可以具有如下氨基酸序列：
i)SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列；
ii)除一个或数个氨基酸添加/插入、缺失或置换外的SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列；
iii)与SEQ ID No.1具有至少85％(优选至少90％、95％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列；或
iv)由包含SEQ ID No.2的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.2的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
vi)由与SEQ ID No.2相差一个或数个核苷酸添加/插入、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vii)由与SEQ ID No.2具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。
在与SEQ ID No.1进行缺口比对时，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可包含选自如下的氨基酸中的任一者或多者：K88；I103；H133；Y175；Y290；F292；R442和H450，其中氨基酸编号方式涉及SEQ ID No.1，和/或可以包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；和
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)
或可包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％、85％或90％同一性的氨基酸序列。
此外，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；位置85-90
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；位置100-105
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；位置130-135
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；位置172-177
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；位置287-295
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；位置439-444
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)位置447-452
或可以包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％或85％或90％同一性的氨基酸序列，其中氨基酸编号方式涉及SEQ ID No.1。
应当理解，本发明涵盖i)至vii)中的任何组合和/或特别叙述的氨基酸的任何组合。
在优选的实施方案中，饲料可包含少于4000、少于3000、少于2000、少于1900、少于1800、少于1700、少于1600、少于1500、少于1400、少于1300、少于1200、少于1100、少于1000、少于900、少于800、少于700、少于600、少于500或少于约400个单位的α淀粉酶/千克饲料。
在一些实施方案中，所述饲料添加物可改善动物性能和/或增加能量吸收/饲料功效和/或提供更低的饲料转化率和/或提供动物的增重和/或饲料中的营养物消化率(例如淀粉消化率)和/或饲料中的可消化能量或可代谢能量。
本发明还提供包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的家禽饲料添加物和/或饲料。可以使用任何胃蛋白酶耐受性α淀粉酶，例如任何本文所公开的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶。合适的是，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可以具有如下氨基酸序列：
i)SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列；
ii)除一个或数个氨基酸添加/插入、缺失或置换外的SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列；
iii)与SEQ ID No.1具有至少85％(优选至少90％、95％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列；或
iv)由包含SEQ ID No.2的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.2的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
vi)由与SEQ ID No.2相差一个或数个核苷酸添加/插入、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vii)由与SEQ ID No.2具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。
在与SEQ ID No.1进行缺口比对时，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可包含选自如下的氨基酸中的任一者或多者：K88；I103；H133；Y175；Y290；F292；R442和H450，其中氨基酸编号方式涉及SEQ ID No.1，和/或可以包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；和
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)
或可包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％、85％或90％同一性的氨基酸序列。
此外，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；位置85-90
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；位置100-105
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；位置130-135
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；位置172-177
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；位置287-295
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；位置439-444
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)位置447-452
或可以包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％或85％或90％同一性的氨基酸序列，其中氨基酸编号方式涉及SEQ ID No.1。
应当理解，本发明涵盖i)至vii)中的任何组合和/或特别叙述的氨基酸的任何组合。
不希望受理论束缚，所述氨基酸和上文序列中的一者或多者可在给α淀粉酶赋予胃蛋白酶耐受性中起作用。
在优选的实施方案中，饲料可包含少于4000、少于3000、少于2000、少于1900、少于1800、少于1700、少于1600、少于1500、少于1400、少于1300、少于1200、少于1100、少于1000、少于900、少于800、少于700、少于600、少于500或少于约400个单位的α淀粉酶/千克饲料。
合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以保留至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的活性。合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下的活性相比较，α淀粉酶可以具有约80-120％、约85-115％、约90-110％、约95-105％、约96-104％、约97-103％、约98-102％或约99-101％的活性。与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以具有相同活性。
在一些实施方案中，所述饲料添加物可改善动物性能和/或增加能量吸收/饲料功效和/或提供更低的饲料转化率和/或提供动物的增重和/或饲料中的营养物消化率(例如淀粉消化率)和/或饲料中的可消化能量或可代谢能量。
本发明提供包含木霉属α淀粉酶的饲料添加物和/或饲料。本发明还提供包含胃蛋白酶耐受性木霉属α淀粉酶的饲料添加物和/或饲料。可以使用任何木霉属α淀粉酶。合适的是，α淀粉酶可以来自里氏木霉。
α淀粉酶可具有如下氨基酸序列：
i)SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
ii)除一个或数个氨基酸添加/插入、缺失或置换外的SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID No.3具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列；或
iv)由包含SEQ ID No.4的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.4的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
vi)由与SEQ ID No.4相差一个或数个核苷酸添加/插入、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vii)由与SEQ ID No.4具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，饲料可包含少于4000、少于3000、少于2000、少于1900、少于1800、少于1700、少于1600、少于1500、少于1400、少于1300、少于1200、少于1100、少于1000、少于900、少于800、少于700、少于600、少于500或少于约400个单位的α淀粉酶/千克饲料。
合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以保留至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的活性。合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下的活性相比较，α淀粉酶可以具有约80-120％、约85-115％、约90-110％、约95-105％、约96-104％、约97-103％、约98-102％或约99-101％的活性。与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以具有相同活性。
在一些实施方案中，所述饲料添加物可改善动物性能和/或增加能量吸收/饲料功效和/或提供更低的饲料转化率和/或提供动物的增重和/或饲料中的营养物消化率(例如淀粉消化率)和/或饲料中的可消化能量或可代谢能量。
本发明还提供根据本发明的饲料添加物用于改善动物性能和/或增加能量吸收和/或饲料功效和/或用于改善饲料中的原材料消化率(例如营养物消化率，如淀粉消化率)和/或用于改善饲料转化率(FCR)和/或用于改善动物中的增重的用途。
在本发明的另一个方面，提供包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的用于单胃动物的饲料，其中所述饲料包含少于3000个单位的α淀粉酶/千克饲料。合适的是，饲料可包含少于2500、少于2000、少于1900、少于1800、少于1700、少于1600、少于1500、少于1400、少于1300、少于1200、少于1100、少于1000、少于900、少于800、少于700、少于600、少于500或少于约400个单位的α淀粉酶/千克饲料。
在一些实施方案中，饲料可改善动物性能和/或增加能量吸收/饲料功效和/或提供更低的饲料转化率。
可使用任何胃蛋白酶耐受性α淀粉酶。合适的是，可使用本文公开的或通过本发明方法鉴定的任何胃蛋白酶耐受性α淀粉酶，包括具有如下氨基酸序列的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶：
i)SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
ii)除一个或数个氨基酸添加/插入、缺失或置换外的SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
iii)与SEQ ID No.1具有至少85％(优选至少90％、95％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列；或与SEQ ID No.3具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列；
iv)由包含SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
vi)由与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4相差一个或数个核苷酸添加/插入、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vii)由与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。
合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以保留至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的活性。合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下的活性相比较，α淀粉酶可以具有约80-120％、约85-115％、约90-110％、约95-105％、约96-104％、约97-103％、约98-102％或约99-101％的活性。与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以具有相同活性。
根据本发明的饲料和/或饲料添加物可包含至少一种另外的饲料酶。例如，饲料和/或饲料添加物可包含参与淀粉代谢、纤维降解、脂质代谢的酶类、参与糖原代谢的蛋白质或酶类、乙酰酯酶类、氨肽酶类、淀粉酶类、阿拉伯糖酶类、阿拉伯呋喃糖苷酶类、羧肽酶类、过氧化氢酶类、纤维素酶类、几丁质酶类、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶类、表异构酶类、酯酶类、α-半乳糖苷酶类、β-葡聚糖酶类、葡聚糖裂解酶类、内切葡聚糖酶类、葡糖淀粉酶类、葡萄糖氧化酶类、β-葡糖苷酶类(包括β-葡糖苷酶)、葡糖醛酸酶类、半纤维素酶类、己糖氧化酶类、水解酶类、转化酶类、异构酶类、漆酶类、裂解酶类、甘露糖苷酶类、氧化酶类、氧化还原酶类、果胶酸裂解酶类、果胶乙酰酯酶类、果胶解聚酶类、果胶甲基酯酶类、果胶分解酶类、过氧化物酶类、酚氧化酶类、多聚半乳糖醛酸酶类、蛋白酶类、鼠李糖-半乳糖醛酸酶类、核糖核酸酶类、奇异果甜蛋白、转移酶类、转运蛋白、转谷氨酰胺酶类、木聚糖酶类(包括内切-1，4-β-木聚糖酶(EC3.2.1.8))、己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC 1.1.3.5)、β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、果胶酶、纤维二糖水解酶、酸性磷酸酶类、植酸酶类(包括3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26))、脂解酶类、甘露聚糖酶或它们的组合。这些包括例如可调节饲料的粘度的酶类。
合适的是，本发明的饲料和/或饲料添加物可包含至少一种木聚糖酶和/或至少一种植酸酶和/或至少一种蛋白酶和/或至少一种脂解酶。这些可以来自任何来源。合适的是，木聚糖酶可以来自芽孢杆菌属(Bacillus)或木霉属；植酸酶可以来自大肠杆菌或布丘氏菌属(Buttiauxella)；蛋白酶可以来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，并且脂解酶可以来自曲霉菌属物种(Aspergillus sp)。
术语‘脂解酶’指能够作用于脂肪底物以释放游离脂肪酸分子的酶。优选地，脂解酶是能够水解脂质底物(特别是但非仅仅是甘油三酯、糖脂和/或磷脂)中的酯键以释放游离脂肪酸分子的酶。合适的是，用于本发明中的脂解酶可具有一种或多种选自如下的活性：磷脂酶活性(例如磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)或磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)；糖酯酶活性(E.C.3.1.1.26)、三酰基甘油水解活性(E.C.3.1.1.3)、脂质酰基转移酶活性(通常依照国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会的酶命名法建议(1992年)(EnzymeNomenclature Recommendations(1992)of the Nomenclature Committee of theInternational Union of Biochemistry and Molecular Biology)分类为E.C.2.3.1.x)，以及它们的任何组合。
合适的是，本发明的饲料和/或饲料添加物可包含来自任何来源(例如地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)或里氏木霉)的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶、来自芽孢杆菌属或木霉属的木聚糖酶；来自大肠杆菌或布丘氏菌属的植酸酶；来自枯草芽孢杆菌的蛋白酶和来自曲霉菌属物种的脂解酶。
本发明的任何饲料可包含一种或多种选自如下的饲料材料：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物例如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉(wheat middlings)、小麦次粉(wheat shorts)、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)得自如下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白质、乳清、干椰肉、芝麻；d)得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
合适的是，本发明的任何饲料可包含至少一种低纤维饲料材料和/或所述至少一种低纤维饲料材料的至少一种副产物以提供低纤维饲料，所述低纤维饲料材料选自玉米、小麦、动物副产物粉或大豆。
本发明的任何饲料可含有至少30重量％、至少40重量％、至少50重量％或至少60重量％的玉米和大豆粉或玉米和全脂大豆。
此外或备选地，本发明的任何饲料可包含至少一种高纤维饲料材料和/或所述至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物以提供高纤维饲料。高纤维饲料材料的实例包括：小麦、大麦、裸麦、燕麦，来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣。一些蛋白质来源也可以视为高纤维的：从诸如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花之类的来源获得的蛋白质。
本发明还提供用于饲料添加物和/或饲料中的α淀粉酶，其中在100000U/ml胃蛋白酶的存在下温育后，所述α淀粉酶基本上维持α淀粉酶活性。
合适的是，α淀粉酶可包含如下氨基酸序列：
i)SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列，或
ii)除一个或数个氨基酸添加/插入、缺失或置换外的SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
iii)与SEQ ID No.3具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列；或
iv)由包含SEQ ID No.4的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.4的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vi)由与SEQ ID No.4相差一个或数个核苷酸添加/插入、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vii)由与SEQ ID No.4具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。
合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以保留至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的活性。合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下的活性相比较，α淀粉酶可以具有约80-120％、约85-115％、约90-110％、约95-105％、约96-104％、约97-103％、约98-102％或约99-101％的活性。与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以具有相同活性。
本发明还提供用于单胃动物的饲料，其中所述饲料包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶以改善动物性能和/或增加能量吸收/饲料功效和/或提供更低的饲料转化率和/或提供动物的增重和/或饲料中的营养物消化率(例如淀粉消化率)和/或饲料中的可消化能量或可代谢能量。
本文所用的，“动物性能”可通过饲料功效和/或动物的生长速率和/或通过饲料转化率和/或动物的增重和/或通过饲料中的营养物消化率(例如淀粉消化率)和/或饲料中的可消化能量或可代谢能进行测定。
优选地，“动物性能”通过饲料功效和/或动物的增重和/或饲料转化率进行测定。
所谓“改善的动物性能”，其意指与不包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的饲料相比较，存在着由饲料中使用胃蛋白酶耐受性α淀粉酶所导致的、增加的饲料功效，和/或增加的生长速率和/或减少的饲料转化率和/或增加的动物的增重和/或饲料中的营养物消化率(例如淀粉消化率)和/或饲料中的可消化能量或可代谢能。在优选的实施方案中，当与饲喂不包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的饲料的动物相比较时，在饲喂包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的饲料的动物中，饲料功效和/或生长速率和/或饲料转化率和/或提供动物的增重和/或饲料中的营养物消化率(例如淀粉消化率)和/或饲料中的可消化能量或可代谢能中的至少一者改善至少1％，如1.5％、如2.0％、如2.5％、如3.0％、如4％、如5％。
如本文所用，术语“饲料功效”指当动物饲喂规定量的食物时，动物中出现的增重的量。
所谓“增加的饲料功效”，其意指与饲喂相同量的不存在胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的饲料的动物相比较，在饲料中使用胃蛋白酶耐受性α淀粉酶导致在饲喂动物时增重增加。
如本文所用，术语“饲料转化率”指饲喂给动物以使动物的重量增加规定量的饲料量。
所谓“更低的饲料转化率”，其意指与在饲料不含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶时使动物重量增加规定量所需的饲料量相比较，在饲料中使用胃蛋白酶耐受性α淀粉酶导致饲喂给动物以使动物重量增加相同量所需的饲料量更低。
本文所用的营养物消化率意指从胃肠道或胃肠道的指定区段(例如小肠)消失的营养物的级分。营养物消化率可测量为所施用给受试者的与从受试者粪便中出来的之间的差异，或所施用给受试者的与保留在胃肠道指定区段(例如回肠)的消化物中的之间的差异。
本文所用的营养物消化率可借助于在一段时间中总排泄物的收集，或使用不被动物吸收的惰性标记，通过营养物摄取与排泄的营养物之间的差值进行测量，并且允许研究者计算在整个胃肠道或胃肠道的区段中消失的营养物量。这种惰性标记可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可表示为营养物在饲料中的百分比，或表示为可消化的营养物的质量单位/饲料中的营养物的质量单位。
如本文所用，营养物消化率包含淀粉消化率。
本文所用的能量消化率意指消耗的饲料总能量减去粪便的总能量，或消耗的饲料总能量减去动物胃肠道指定区段(例如回肠)上的剩余消化物的总能量。本文所用的可代谢能量指表观可代谢能量，且意指消耗的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中含有的总能量。能量消化率和可代谢能量可测量为总能量的摄取与粪便中排泄的或胃肠道指定区段中存在的消化物中的总能量之间的差值，其使用与测量营养物的消化率相同的方法，针对氮排泄进行适当校正以计算饲料的可代谢能量。
如本文所用的术语存活率意指仍活着的受试者的数目。术语“改善的存活率”可以是“减少的死亡率”的另一种说法。
本文所用的术语胴体产率意指在商业或实验的屠宰过程后，作为活体重量的比例的胴体量。术语胴体意指已因食物而屠宰的动物身体，其中头、内脏、四肢的部分和羽毛或皮肤被去除。本文所用的术语肉产率意指作为活体重量的比例的食用肉的量，或作为活体重量的比例的切割的指定肉的量。
本发明还提供增加受试者(例如家禽或猪)中的增重的方法，其包括给所述受试者饲喂包含根据本发明的饲料添加剂组合物的饲料。
“增加的增重”指与饲喂不存在饲料添加剂组合物的饲料的动物相比较，在饲喂包含所述饲料添加剂组合物的饲料时动物具有增加的体重。
合适的是，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可以具有如下氨基酸序列：
i)SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列；
ii)除一个或数个氨基酸添加/插入、缺失或置换外的SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列；
iii)与SEQ ID No.1具有至少85％(优选至少90％、95％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列；或
iv)由包含SEQ ID No.2的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.2的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
vi)由与SEQ ID No.2相差一个或数个核苷酸添加/插入、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vii)由与SEQ ID No.2具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。
在与SEQ ID No.1进行缺口比对时，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可包含选自如下的氨基酸中的任一者或多者：K88；I103；H133；Y175；Y290；F292；R442和H450，其中氨基酸编号方式涉及SEQ ID No.1，和/或可以包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；和
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)
或可包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％、85％或90％同一性的氨基酸序列。
此外，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；位置85-90
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；位置100-105
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；位置130-135
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；位置172-177
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；位置287-295
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；位置439-444
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)位置447-452
或可以包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％或85％或90％同一性的氨基酸序列，其中氨基酸编号方式涉及SEQ ID No.1。
应当理解，本发明涵盖i)至vii)中的任何组合和/或特别叙述的氨基酸的任何组合。
在优选的实施方案中，饲料可包含少于4000、少于3000、少于2000、少于1900、少于1800、少于1700、少于1600、少于1500、少于1400、少于1300、少于1200、少于1100、少于1000、少于900、少于800、少于700、少于600、少于500或少于约400个单位的α淀粉酶/千克饲料。
合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以保留至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的活性。合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下的活性相比较，α淀粉酶可以具有约80-120％、约85-115％、约90-110％、约95-105％、约96-104％、约97-103％、约98-102％或约99-101％的活性。与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以具有相同活性。
本发明还提供增加家禽或猪中的增重的方法，其包括给所述家禽或猪饲饲喂包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的饲料。
“增加的增重”指与饲喂不存在胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的饲料的动物相比较，在饲喂包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的饲料时动物具有增加的体重。
合适的是，饲料可导致内源性α淀粉酶mRNA表达减少(优选显著减少(P＜0.05))。因此，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的使用可增加饲料功效和/或降低饲料转化率，因为动物需要较少的能量来利用饲料。
合适的是，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可以具有如下氨基酸序列：
i)SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列；
ii)除一个或数个氨基酸添加/插入、缺失或置换外的SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列；
iii)与SEQ ID No.1具有至少85％(优选至少90％、95％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列；或
iv)由包含SEQ ID No.2的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.2的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
vi)由与SEQ ID No.2相差一个或数个核苷酸添加/插入、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vii)由与SEQ ID No.2具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。
在与SEQ ID No.1进行缺口比对时，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可包含选自如下的氨基酸中的任一者或多者：K88；I103；H133；Y175；Y290；F292；R442和H450，其中氨基酸编号方式涉及SEQ ID No.1，和/或可以包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；和
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)
或可包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％、85％或90％同一性的氨基酸序列。
此外，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；位置85-90
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；位置100-105
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；位置130-135
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；位置172-177
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；位置287-295
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；位置439-444
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)位置447-452
或可包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％或85％或90％同一性的氨基酸序列，其中氨基酸编号方式涉及SEQ ID No.1。
应当理解，本发明涵盖i)至vii)中的任何组合和/或特别叙述的氨基酸的任何组合。
在优选的实施方案中，饲料可包含少于4000、少于3000、少于2000、少于1900、少于1800、少于1700、少于1600、少于1500、少于1400、少于1300、少于1200、少于1100、少于1000、少于900、少于800、少于700、少于600、少于500或少于约400个单位的α淀粉酶/千克饲料。
合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以保留至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的活性。合适的是，与其在不存在胃蛋白酶的情况下的活性相比较，α淀粉酶可以具有约80-120％、约85-115％、约90-110％、约95-105％、约96-104％、约97-103％、约98-102％或约99-101％的活性。与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可以具有相同活性。
本发明还提供包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶和至少一种矿物质和/或至少一种维生素的预混物。
优选地，预混物包含根据本发明的饲料添加物。
本发明还提供胃蛋白酶耐受性α淀粉酶减少动物中的内源性α淀粉酶表达的用途。
应当理解，这将会导致通过编码淀粉酶的基因的转录和翻译产生内源酶所需的能量较少，从而潜在地导致更高的饲料功效和降低的饲料转化率。
应当理解，本文公开的优选特征中的任一者都被认为同等适用于上文所述方面中的任一者，除非另有明确说明。任何优选的特征也被认为与本文公开的任何其他优选特征相组合进行公开。
胃蛋白酶耐受性测定
本发明的α淀粉酶通过胃蛋白酶耐受性测定进行限定。该测定包括如下方案：将α淀粉酶(例如100μl酶溶液)与玉米基饲料(例如100mg)和胃蛋白酶(例如以9000U/ml的浓度，可将其加入900μl的体积中)掺混，并在pH 3下温育(例如至少约120分钟)。此外，在不存在胃蛋白酶的情况下在相同的条件下，将所述α淀粉酶与相同的玉米基饲料掺混作为对照。随后，测定样品和对照的α淀粉酶活性。
不希望受理论束缚，本发明人认为玉米基饲料的存在可影响α淀粉酶的胃蛋白酶耐受性。在胃蛋白酶测定中使用的条件已制定用于模拟单胃动物的胃肠道中使用的条件。
胃蛋白酶水平和温育时间：
在本发明的一个实施方案中，使用的胃蛋白酶水平为约9000U/ml，并且温育时间为约120分钟。在这种条件下基本上维持α淀粉酶活性的淀粉酶可视为根据本发明的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶。然而，应当理解该测定是温育时间和胃蛋白酶水平的平衡。因此，通过增加温育时间，更低的胃蛋白酶水平可以用于鉴定胃蛋白酶耐受性的α淀粉酶。同样，通过减少温育时间，更高的胃蛋白酶水平可以用于鉴定胃蛋白酶耐受性的α淀粉酶。
因此，应当理解本发明可涵盖等价于本文详细描述的规定的温育时间和胃蛋白酶水平的选择标准。
温度：
应当理解可以使用其中胃蛋白酶耐受性α淀粉酶和胃蛋白酶二者都是活性的任何温度。例如，可使用30-50℃，优选40℃的温度。
缓冲液：
在该测定中，可以使用缓冲溶液(例如900μl)。例如，可以使用包含胃蛋白酶的缓冲溶液，不含胃蛋白酶的缓冲溶液可以用于对照。
应当理解可使用提供所需pH的任何合适的缓冲液。这种缓冲液的组成是本领域技术人员的一般常识。
合适的胃蛋白酶温育缓冲液的实例是0.1M甘氨酸-HCl pH 3.0、3mg/mlBSA、2.9mg无水氯化钠/ml、0.73mg氯化钙/ml。对于具有胃蛋白酶的溶液，将温育缓冲液制备为含有至少9000U/ml，优选至少10000U/ml，优选至少10500U/ml，优选至少11000U/ml。合适的是，温育缓冲液可含有9000或9250U/ml。
以实例说明，可制备包含25mg/ml(9250U/ml)的胃蛋白酶的缓冲液(例如西格玛公司(Sigma)P-7000)。
一胃蛋白酶单位定义为在pH 2.0在37℃下每分钟将产生0.001的ΔOD280的酶量，其使用血红蛋白作为底物以TCA可溶性产物测量(如例如美国食品化学法典(Food Chemical Codex)中所述的)。
还可以通过将相同的玉米基饲料和pH 5.6的缓冲溶液掺混来制备阳性对照，其中所述缓冲溶液不含胃蛋白酶且另外包含BSA。
例如，用于阳性对照的合适测定缓冲液可以是具有BSA的淀粉酶测定缓冲液：磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液0,1M，pH 5.6，3mg/ml BSA。
此外，可以制备不添加α淀粉酶的另外的样品，以检查来自所使用的化学物的背景吸收。
合适的是，样品和对照样品二者均可一式两份地制备。
因此，在一个实施方案中，制备样品且如下温育。称取100mg玉米基饲料进每个1,5ml微量离心管(Eppendorf)中。加入不含或含有所需水平的胃蛋白酶(即，至少9000U/ml)的体积900μl的温育缓冲液或900μl测定缓冲液(即，用于阳性对照)，并在Eppendorf恒温混匀器(Thermomixer)5436中以500rpm预温育5分钟。
将体积100μl的酶溶液(或100μl H2O)加入每个管中，盖上盖子，并将管在40℃在Eppendorf恒温混匀器5436中以500rpm温育所需时间长度(即，至少120分钟，例如确切地120分钟)。
然后分析样品的α淀粉酶活性。
当与对照样品(即，不存在胃蛋白酶)中的淀粉酶活性相比较时，如果包含胃蛋白酶的样品中的淀粉酶活性在至少约75％(例如至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)至约125％(或约120％、115％、110％、105％、103％、102％或101％)的范围中，则α淀粉酶视为是“胃蛋白酶耐受性的”或“基本上维持α淀粉酶活性”。
因此，在有用的实施方案中，当与对照样品(即，不存在胃蛋白酶)中的所述淀粉酶活性相比较时，包含胃蛋白酶的样品中SEQ ID NO：1中所示的淀粉酶的活性在至少约75％(例如至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)至约125％(或约120％、115％、110％、105％、103％、102％或101％)的范围中。
在进一步有用的实施方案中，当与对照样品(即，不存在胃蛋白酶)中的所述淀粉酶活性相比较时，包含胃蛋白酶的样品中SEQ ID NO：3中所示的淀粉酶的活性在至少约75％(例如至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％)至约125％(或约120％、115％、110％、105％、103％、102％或101％)的范围中。
本发明可涵盖在至少约75％至约125％之间的上限和下限的任何组合。因此，例如，与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，视为“基本上维持”其活性的“胃蛋白酶耐受性α淀粉酶”或α淀粉酶可具有至少约80-120％、85-115％、90-110％、95-105％、96-104％、97-103％、98-102％或99-101％。因此，在有用的实施方案中，与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，包含胃蛋白酶的样品中SEQ ID NO：1中所示的淀粉酶的活性在75％至约125％之间，例如至少约80-120％、85-115％、90-110％、95-105％、96-104％、97-103％、98-102％或99-101％。因此，在有用的实施方案中，与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，包含胃蛋白酶的样品中SEQ ID NO：3中所示的淀粉酶活性在75％至约125％之间，例如至少约80-120％、85-115％、90-110％、95-105％、96-104％、97-103％、98-102％或99-101％。与其在不存在胃蛋白酶的情况下温育后的活性相比较，α淀粉酶可具有相同活性。
在测定中使用的胃蛋白酶水平是至少9000U/ml。合适的是，所用的胃蛋白酶的水平可以是至少约10000U/ml、至少10500U/ml、至少11000U/ml、至少12000U/ml、至少13000U/ml、至少14000U/ml、至少15000U/ml、至少16000U/ml、至少17000U/ml、至少18000U/ml、至少19000U/ml、至少20000U/ml、至少21000U/ml、至少22000U/ml或至少23000U/ml胃蛋白酶。
α淀粉酶可以与胃蛋白酶一起温育至少约2.5小时、至少约3小时或至少约3.5小时。
对样品中的α淀粉酶活性的分析可通过本领域已知的任何方法进行测定。
在一个实施方案中，α淀粉酶的活性可使用KoneLab测定测量。将管在Eppendorf台式离心机中离心2分钟，抽取100μl并且与900μl测定缓冲液(例如淀粉酶测定缓冲液：磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液0.1M，pH 5.6)混合。立即在KoneLab Arena 20XT(来自美国热电公司(Thermo ElectronCorporation))中分析样品的活性。因此，在该实施方案中，在给定胃蛋白酶浓度时的胃蛋白酶耐受性定义为：相对于如上文方案中所述在pH 3下不含胃蛋白酶时温育至少两个小时后通过KoneLab测定测量的活性所测量的，如上文方案中所述在给定胃蛋白酶浓度在pH 3下温育相同时间后通过KoneLab测定测量的淀粉酶活性。
备选地，α淀粉酶活性可使用下文所述的片剂测定(tablet assay)进行测量。
KONELAB测定
KoneLab测定是使用KoneLab机器人(KoneLab Arena 20XT)用于测定液体和固体产品中的细菌α淀粉酶活性的比色法。
应用和原理
将产物提取物的等分试样与Ceralpha-底物混合物一起在确定条件下温育。通过加入Tris-溶液(Trizma碱)终止反应，并显现黄色。测量在405nm处的吸光度，这与所分析样品中的α淀粉酶水平直接相关。通过将该吸光度测量值与具有充分确定活性的校准酶的吸光度测量值相关联来定量测定样品的酶活性。
底物内的键仅可被α淀粉酶裂解。非封闭的反应产物被过量的葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶(它们为底物混合物的部分)裂解为葡萄糖和游离的对硝基苯基。该反应释放游离的对硝基苯基，并在添加Trizma-碱时显现黄色。
Ceralpha-底物是封闭的对硝基苯基麦芽庚糖苷BPNPG7，其无法在真菌和细菌α淀粉酶之间区分。
由于淀粉葡糖苷酶和α-葡糖苷酶的pH和温度敏感性，该测定仅可在pH-范围5.0-6.0和在40℃或更低温度下使用。
装置
玻璃过滤器，Advantec Toyo GA55，110mm
磁力搅拌器
多种吸管
多种试管
多种容量瓶
试管摇动器
Konelab Arena 20XT机器人
化学品
一水柠檬酸(默克公司(Merck))
磷酸氢二钠(默克公司)
二水氯化钙(默克公司)
无水氯化钠(默克公司)
来自牛血清的白蛋白(BSA，西格玛公司A 7906)
半胱氨酸(默克公司2838)
三(羟甲基)氨基甲烷(默克公司)
试剂
1.稳定试剂
将如下物质溶解于10mL去离子水中：
0.20g来自牛血清的白蛋白(BSA)，
0.05g半胱氨酸，
2.0g无水氯化钠。
保持冷藏或冷冻。贮存期限：冷藏：5+/-3℃下1周，冷冻：-18℃下
1年(在融化后可以再冷冻)。
2.测定缓冲液：柠檬酸-磷酸盐缓冲液，0.1M，pH＝5.60
将如下物质溶解于大约800mL去离子水：
4.41g一水柠檬酸，
10.3g二水磷酸氢二钠，
2.90g无水氯化钠，
0.73g二水氯化钙。
加入1.00mL稳定试剂(1)，同时在磁力搅拌器上搅拌。
当溶解时，将pH调节至5.60(HCl或NaOH)，并将溶液转移至1000mL容量瓶，用蒸馏水调节至1000mL。
3.终止溶液：1％(w/v)TRIS(Trizma碱)
将10g TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)在容量瓶中溶解于去离子水中，并调节至1000mL。
4.底物(来自美格兹密公司(Megazyme)的冻干Ceralpha (BPNPG7))
将褐色瓶的谷类α淀粉酶测定试剂(BPNPG 7)溶解于10.0ml蒸馏水中(2)。
将溶液保持-18℃冷冻于褐色瓶中(10ml批料)
在使用前，将溶液用蒸馏水进一步1∶1稀释。
1瓶Ceralpha含有54.5mg BPNPG7和125U(pH＝6.0)α-葡糖苷酶。
5.对照/标准样品
淀粉酶(LAT)标准：例如485TAU/g(批号102-05208-001)
此外，例如具有7957-8162TAU/g范围的LAT对照样品(批号102-01128-lab)。
程序
淀粉酶标准曲线的制备
对于LAT，将淀粉酶标准(5)稀释至约1.9U/g的浓度。
所有稀释都在测定缓冲液(2)中进行。
进一步的稀释在Konelab中按程序进行：
标准 稀释比 浓度，U/mL
1 1+49.0 0.034
2 1+19.0 0.085
3 1+9.0 0.170
4 1+5.0 0.283
5 1+3.0 0.425
OD范围应在0.2-1.5之间
样品制备
对于每种样品执行2次称重。
液体产品：称取0.5g样品于50ml容量瓶中。将该容量瓶装满测定缓冲液(2)并混合。进一步的稀释也在测定缓冲液(2)中进行。终浓度应是大约0.2U/ml。
固体产品：称取0.5g样品于50ml容量瓶中，并在大约40ml测定缓冲液(2)中稀释。将溶液在磁力搅拌器上混合10分钟，并用缓冲液装满。将溶液滤过沃特曼(whatman)玻璃过滤器，并在测定缓冲液(2)中进一步稀释。终浓度应是约0.2U/ml。
盲样：在每次运行中包括2个盲样(测定缓冲液(2))。
测定中的反应条件
pH＝5.60
温育温度＝37℃+/-0.1℃
波长＝405nm
底物50μl
预温育5分钟
样品10μl
温育15分钟
终止溶液100μl
酶活性的计算
样品的活性根据下式计算：
Figure BDA00002710429900351
OD样品＝酶样品的吸光度
DF＝样品的稀释因子
W样品＝以g表示的样品重量
α＝标准曲线的斜率
β＝标准曲线的截距
质量控制(QC)
如果两次测定所测得的活性具有超过10％的CV％，则必须重新进行测定。
片剂测定
应用和原理
通过测量从天青精交联淀粉酶促释放染色的寡聚物的速率来测定酶活性。通过将该吸光度测量值与具有充分确定活性的校准酶的吸光度测量值相关联来测定样品的酶活性。
装置
玻璃过滤器，Advantec Toyo GA55，110mm
磁力搅拌器
多种吸管
试管
水浴，37℃
秒表
试管摇动器
分光光度计，岛津(Shimadzu)UV-160A，岛津欧洲股份有限公司(Shimadzu Europa GmbH)
试剂
1.底物
Phadebas淀粉酶测试(瑞典隆德的Magle AB公司(Magle AB，Lund，Sweden))。每片片剂含有45mg蓝色淀粉和缓冲剂。
2.测定缓冲液
在容量瓶中的蒸馏水中稀释9.0g无水氯化钠(NaCl)、2.0g牛血清白蛋白和2.2g二水氯化钙(CaCl2，2H2O)，并用蒸馏水填充至1000ml。
3.终止溶液
0.5M NaOH溶液。
将20.0g氢氧化钠溶解于容量瓶中的蒸馏水中，并用蒸馏水填充至1000ml。
对照样品
具有已知活性和方差的对照样品可以在每次运行中作为QC检查进行分析。
样品制备
对于每种样品，一式两份精确称取约1-5g。将样品在100ml测定缓冲液中提取30分钟，伴随磁力搅拌。
将提取物滤过玻璃过滤器。其后，将样品在测定缓冲液中稀释至约0.3U/ml的预期活性(该稀释度要加入下文的式中)。
测定程序
对于每种样品，将200μl提取物和4ml测定缓冲液吸取到试管内。所有样品都一式两份地分析。将溶液在37℃下平衡5分钟，并在t＝0分钟时，加入PhadebasTM片剂[瑞典隆德的Magle生命科学公司(Magle Life Sciences，Lund，Sweden)]，并充分混合10秒。将样品在37℃下温育15分钟，随后通过添加1ml终止溶液来终止反应。用试管摇动器使溶液混合；将管(在桌上)静置5分钟并再次混合，然后以3500rpm离心10分钟。针对试剂空白对照(4.2ml测定缓冲液)测量在620nm处的吸光度。
酶样品的吸光度应在0.3-0.5的范围内。
酶活性的计算
用PhadebasTM片剂制备校准曲线。由该校准曲线读出对应于OD620的活性，随后根据下式计算样品的活性：
其中A为PhadebasTM校准曲线中发现的活性。
质量控制(QC)
如果两次测定所测得的活性具有超过10％的CV％，则重新进行测定。
定量限：100U/kg
碘反应测定
还可以使用Wohlgemuth碘反应方法(Sandstedt，R.M.，Kneen，E.和Blish，M.J.：“A Standardized Wohlgemuth procedure for alpha-amylase activity(《用于α淀粉酶活性的标准化Wohlgemuth程序》)”，Cereal Chem.(《谷物化学》)16，712-723(1939))，以便测量α淀粉酶活性。
该方法是基于在长淀粉链盘绕碘分子时所形成的蓝色。当α淀粉酶将淀粉转化为糊精时，蓝色与活性成比例消失。碘反应方法使用中等反应条件，因此可用于真菌和细菌酶样品。
α淀粉酶
α淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1)构成一组酶，其催化淀粉及其他直链和支链1，4-糖苷寡糖和多糖的水解。
根据本发明的具有淀粉分解活性的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可分离自任何来源，所述淀粉分解活性可用上述测定之一进行测量。合适的是，α淀粉酶可分离自细菌(如芽孢杆菌，例如地衣芽孢杆菌)和/或真菌(如木霉，例如里氏木霉)。
技术人员应当理解，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可作为液体或固体/颗粒状组合物提供。
优选地，当所述酶为液体形式时，所述酶处于在培养包含所述酶的细胞之后所述酶已被分泌至其中的培养基中。优选地，所述培养基是无细胞的(即已从该培养基分离了细胞)。优选地，对所述培养基进行浓缩。应当理解，可将培养基进行制粒以提供固体酶组合物。
应还理解，饲料添加物可以以溶液的形式或作为固体提供，这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
在一个实施方案中，饲料添加物处于适合于消费的液体制剂中，优选这种液体组合物含有缓冲剂、盐、山梨糖醇和/或甘油。
在备选的实施方案中，根据本发明的饲料添加物可以作为一个或多个包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的细胞提供。
在一个实施方案中，将饲料添加物制粒或与其他酶一起制粒。
优选地，饲料添加物还包含至少一种生理上可接受的载体。
至少一种生理上可接受的载体优选选自麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1，3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。
在一个实施方案中，α淀粉酶在生理学可接受的载体上干燥。
在优选的实施方案中，饲料添加物或饲料可包含至少一种另外的酶。在优选的实施方案中，所述至少一种另外的饲料酶选自：参与淀粉代谢、纤维降解、脂质代谢的那些饲料酶、参与糖原代谢的蛋白质或酶、乙酰酯酶类、氨肽酶类、淀粉酶类、阿拉伯糖酶类、阿拉伯呋喃糖苷酶类、羧肽酶类、过氧化氢酶类、纤维素酶类、几丁质酶类、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶类、表异构酶类、酯酶类、α-半乳糖苷酶类、β-葡聚糖酶类、葡聚糖裂解酶类、内切-β葡聚糖酶类、葡糖淀粉酶类、葡萄糖氧化酶类、β-葡糖苷酶类(包括β-葡糖苷酶)、葡糖醛酸酶类、半纤维素酶类、己糖氧化酶类、水解酶类、转化酶类、异构酶类、漆酶类、裂解酶类、脂解酶类、甘露糖苷酶类、氧化酶类、氧化还原酶类、果胶酸裂解酶类、果胶乙酰酯酶类、果胶解聚酶类、果胶甲基酯酶类、果胶分解酶类、过氧化物酶类、酚氧化酶类、多聚半乳糖醛酸酶类、蛋白酶类、鼠李糖-半乳糖醛酸酶类、核糖核酸酶类、奇异果甜蛋白、转移酶类、转运蛋白、转谷氨酰胺酶类、木聚糖酶(包括内切-1，4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8))、己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC 1.1.3.5)、β-葡聚糖酶、果胶酶、纤维二糖水解酶、酸性磷酸酶类、植酸酶类(包括3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26))、甘露聚糖酶类以及它们的组合。这些包括例如可调节饲料的粘度的酶类。
在更优选的实施方案中，饲料添加物或饲料还包含植酸酶、脂解酶、木聚糖酶和/或蛋白酶。在最优选的实施方案中，饲料添加物或饲料还包含植酸酶、脂解酶、木聚糖酶和蛋白酶。
优选地，淀粉酶以约10U/kg饲料至约10000U/kg饲料，更优选约50U/kg饲料至约7500U/kg饲料，甚至更优选约100U/kg饲料至约5000U/kg饲料的范围存在。对于一些方面，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶以少于约4000、少于约3000、少于约2000、少于约1900、少于约1800、少于约1700、少于约1600、少于约1500、少于约1400、少于约1300、少于约1200、少于约1100、少于约1000、少于约900、少于约800、少于约700、少于约600、少于约500、少于约400、少于约300或少于约200单位/kg饲料的量存在。应当理解，一淀粉酶单位是在pH 6.5和37℃下每分钟从水不溶性交联淀粉聚合物底物释放1mmol的糖苷键的酶量。
优选地，淀粉酶以约50至300，更优选100至200单位/kg饲料存在。
优选地，当使用时，木聚糖酶以约100U/kg饲料至约10000U/kg饲料，更优选约250U/kg饲料至约7500U/kg饲料，甚至更优选约500U/kg饲料至约5000U/kg饲料的范围存在。应当理解，一木聚糖酶单位是在pH 5.3和50℃下每分钟从燕麦-斯佩耳特小麦-木聚糖底物释放0.5μmol的还原糖当量(作为木糖，通过DNS[4])还原糖方法)的酶量。(Bailey，M.J.Biely，P.和Poutanen，K.，Journal of Biotechnology(《生物技术杂志》)，第23卷，(3)，1992年5月，257-270)。
优选地，当使用时，植酸酶以约250FTU/kg至约15,000FTU/kg饲料(例如约250至约10,000FTU/kg饲料，约400至约7,500FTU/kg饲料或约500至约5000FTU/kg饲料)的水平存在。
优选地，当使用时，脂解酶以约125LIPU/kg至约45,000LIPU/kg饲料(例如约500至约30,000LIPU/kg，约1000至约20000LIPU/kg以及约3000至约10000LIPU/kg)的水平存在。
优选地，当使用时，蛋白酶以约250U/kg饲料至约15,000U/kg饲料(例如约500至约10,000U/kg饲料，约1,000至约8,000U/kg饲料，约2,000至约7,000U/kg饲料或约3,000至约6,000FTU/kg饲料)的水平存在。应当理解，一蛋白酶单位是在pH 7.5(40mM Na2PO4/乳酸缓冲液)和40℃下每分钟从底物(0.6％酪蛋白溶液)释放一微克的酚类化合物(表示为酪氨酸当量)的酶量。
应当理解，饲料添加物和/或饲料可以用于任何合适的动物。优选地，动物是单胃动物，例如家禽或猪。
对于技术人员显而易见的是，根据本发明的饲料和/或饲料添加物可包含其他组分，例如稳定剂和/或增量剂和/或其他酶。
优选地，本发明的饲料添加物对于最高约70℃；最高约85℃；或最高约95℃的热处理是热稳定的。热处理可以执行最多约1分钟；最多约5分钟；最多约10分钟；最多约30分钟；最多约60分钟。术语“热稳定的”意指在加热到指定温度之前在添加剂中存在/有活性的酶组分有至少约75％在其冷却到室温后仍存在/有活性。优选地，在加热到指定温度之前在添加剂中存在和有活性的酶组分有至少约80％在其冷却到室温后仍存在和有活性。
在特别优选的实施方案中，将饲料添加物均化以产生粉末。
在备选的优选实施方案中，如WO2007/044968(以引用方式并入本文中)中所述，将饲料添加物配制为颗粒(称为TPT颗粒)。
在另一个优选实施方案中，当将饲料添加物配制成颗粒时，颗粒包含涂覆在蛋白质芯上的水合屏蔽盐。这种盐涂层的优点在于使耐热性改善、使保藏稳定性改善和保护免受其他原本会不利影响该酶的饲料添加剂的影响。
优选地，用于盐涂层的盐在20℃下具有大于0.25的水活度或大于60％的恒定湿度。
优选地，盐涂层包含Na2SO4。
制备饲料添加物的方法还可包括将粉末粒化的另外步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可迫使粉末或包含粉末的混合物通过模具，并将所得的料条切成可变长度的合适粒料。
任选地，粒化步骤可包括在粒料形成之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调理机中，例如带蒸汽喷射的混合机。将混合物在调理机中加热至指定的温度，如60-100℃，典型的温度将为70℃、85℃、90℃或95℃。停留时间不定，可从数秒钟到数分钟甚至数小时。例如5秒钟、10秒钟、15秒钟、30秒钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。
应认识到，本发明的饲料添加物适合添加到任何适宜的饲料材料。
本文所用的术语“饲料材料”指待由动物消费的基础饲料材料。还应当理解，这可包含例如至少一种或多种未经加工的谷物，和/或经加工的植物和/或动物材料如大豆粉或骨粉。
在一些实施方案中，饲料材料将包含如下组分中的一种或多种：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物例如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)得自如下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白质、乳清、干椰肉、芝麻；d)得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
本文所用的术语“饲料”指已添加了一种或多种饲料添加物的饲料材料。
技术人员会认识到，不同的动物要求不同的饲料，甚至同一种动物也可能要求不同的饲料，这取决于饲养该动物的目的。还应当理解，取决于初始饲料材料，饲料可以是高纤维饲料或低纤维饲料。
优选地，饲料可包含这样的饲料材料，其包含玉蜀黍或玉米、小麦、大麦、黑小麦、黑麦、大米、木薯、高粱和/或任何副产物，以及富含蛋白质的成分，如大豆粉、油菜籽粉、卡诺拉粉、棉籽粉、葵花籽粉、动物副产物粉和它们的混合物。更优选地，饲料可包含动物脂肪和/或植物油。
任选地，饲料还可含有额外的矿物质(例如钙)和/或额外的维生素。
本文所定义的“低纤维饲料”是包含一种或多种饲料材料的饲料，其含有约25％的水不溶性细胞壁的最大含量，和/或约4％的可溶性非淀粉多糖的最大限度含量。更优选为约22.5％、约20％、约17.5％、约15％、约12.5％的水不溶性细胞壁的最大限度含量；和/或约3％、约2.5％、约2％、约1.75％、约1.5％、约1.25％的可溶性非淀粉多糖的最大限度含量。
在一些实施方案中，将饲料添加物与至少一种低纤维饲料材料(例如玉米、小麦、动物副产物粉或大豆)和/或任何副产物混合，以提供低纤维饲料。
优选地，饲料为玉米大豆粉混合物。
在一个实施方案中，优选地，饲料不是宠物食品。
本文所定义的“高纤维饲料”是包含一种或多种饲料材料的饲料，其含有约25％的水不溶性细胞壁的最低限度含量，和/或约4％的可溶性非淀粉多糖的最低限度含量。更优选为约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约70％的水不溶性细胞壁的最低限度含量；和/或约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％的可溶性非淀粉多糖的最低限度含量。
在一些实施方案中，将饲料添加物与至少一种高纤维饲料材料(优选选自：小麦、大麦、裸麦、燕麦，来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣)和/或任何副产物混合，以提供高纤维饲料。
在另一方面，提供生产饲料的方法。饲料通常在饲料磨机中制备，在磨机中首先将原料研磨成合适的颗粒大小，然后与适宜的添加剂混合。饲料随后可以作为糊料或粒料制备；后者通常涉及这样的方法：将温度升高至靶水平，然后使饲料通过模具以制备出特定大小的粒料。让粒料冷却。随后，可添加液体添加剂如脂肪和酶。饲料的制备还可涉及额外的步骤，其包括在造粒之前的挤出或膨胀-特别是通过可包括至少使用蒸汽的合适技术来进行。
饲料可以是用于单胃动物如家禽(如肉鸡、蛋鸡、肉种鸡、火鸡、鸭、鹅、水禽)、猪(所有年龄类别)、宠物(例如犬、猫)或鱼的饲料，优选饲料用于家禽。
任选地，饲料可包含另外的添加剂。例如，可将钙以任何合适的量添加到饲料中以补充动物的饮食和/或作为增量剂。
饲料可包含至少0.0001重量％的饲料添加物。合适的是，饲料可包含至少0.0005重量％；至少0.0010重量％；至少0.0020重量％；至少0.0025重量％；至少0.0050重量％；至少0.0100重量％的饲料添加物。合适的是，饲料可包含约0.0010重量％至约0.0200重量％；优选约0.005重量％至约0.0100重量％的饲料添加物。
在另一方面，提供用于饲料中的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶用以增加来自饲料材料的可利用代谢能量。
本文所用的术语“增加可利用代谢能”意指与可从单位重量的没有添加淀粉酶或饲料添加物的饲料材料获得的营养物或能量的利用率相比较，消耗单位重量的饲料材料可供动物使用的能量量的增加。
现将参考如下附图描述本发明，其中：
图1示出了来自地衣芽孢杆菌的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的氨基酸序列(SEQ ID No.1)。
图2示出了来自地衣芽孢杆菌的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的核苷酸序列(SEQ ID No.2)。
图3示出了来自里氏木霉的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的氨基酸序列(SEQ ID No.3)。
图4示出了来自里氏木霉的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的核苷酸序列(SEQ ID No.4)。
图5示出了解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α淀粉酶(命名为LTAA)和地衣芽孢杆菌胃蛋白酶耐受性α淀粉酶(命名为LAT)之间的比对。来自LAT内的所关注氨基酸标有下划线。
图6示出了地衣芽孢杆菌α淀粉酶(LAT)、解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶(LTAA)、里氏木霉α-淀粉酶(Tric.amyl.#266)和市售的α-淀粉酶(BAN)的胃蛋白酶耐受性。
图7示出了解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶(LTAA)和地衣芽孢杆菌变体α淀粉酶(FRED)的胃蛋白酶耐受性。
图8示出了地衣芽孢杆菌变体α淀粉酶(FRED)的氨基酸序列。
图9示出了用来自地衣芽孢杆菌的α淀粉酶(LAT)和来自解淀粉芽孢杆菌的α淀粉酶(LTAA)处理的肉仔鸡0-42天的体重增加(4次试验的元分析)。用LAT处理是统计上显著的(P＜0.05)。
图10示出了0-42天的饲料转化率(就重量进行了校正)。这是4次试验的元分析。用LAT处理是统计上显著的(P＜0.05)。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本公开文本所属技术领域普通技术人员通常理解的含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(《微生物学和分子生物学词典》)，第20版，纽约州的约翰威立父子出版公司(John Wiley and Sons，New York)(1994年)，以及Hale&Marham，THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(《哈珀柯林斯生物学辞典》)，纽约州的Harper Perennial出版社，(1991年)为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的一般词典。
本公开文本并不受本文公开的示例性方法和材料的限制，任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于本公开文本的实施方案的实施或试验。数值范围包括限定该范围的数字。除非另有说明，分别地，核酸序列从左至右以5′至3′取向写出；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向写出。
本文提供的标题并非对本公开文本的各个方面或实施方案的限制，这些方面或实施方案可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。相应地，下面就要定义的术语通过将说明书作为一个整体来参考会得到更完全的定义。
氨基酸在本文中用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来指代。
本文所用的术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。
术语“与...等同的氨基酸”、“与...相对应的氨基酸”以及其语法上等价的术语在本文中用于指具有与在具体蛋白质的具体氨基酸序列中指出的相似的位置和作用的蛋白质的氨基酸残基。本领域技术人员将会认识到可比蛋白质中指定残基的等同物。
如本文所用，在多肽的语境中术语“性质”或其语法上等价的术语指多肽的可被选择或检测的任何特征或属性。这些性质包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、温度和/或pH活性谱、饲料加工稳定性和被分泌的能力。
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
氨基酸序列可从合适的来源制备/分离，或者其可通过合成制备或者其可通过利用重组DNA技术制备。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求书中，使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码遵照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission on BiochemicalNomenclature，JCBN)的定义。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一种核苷酸序列编码。
术语“信号序列”或“信号肽”指可参与该蛋白质的成熟形式或前体形式的分泌的核苷酸和/或氨基酸的任何序列。信号序列的这个定义是功能性定义，意在包括所有那些由该蛋白质基因的N末端部分所编码的、参与蛋白质分泌的实现的氨基酸序列。它们往往但并不普遍地结合到蛋白质的N末端部分或者结合到前体蛋白质的N末端部分。
“功能片段”意指多肽保留该多肽的特征性质的片段。在本发明的情形中，植酸酶或脂解酶的功能片段为保留整个蛋白质的植酸酶或脂解酶裂解能力的片段。
术语“分离的”、“回收的”或“纯化的”指从其原始环境中移除出来的材料。术语“基本上纯化的”意指该材料已被纯化至至少相当大的程度。
在一个方面，优选地，核苷酸或氨基酸序列为分离的形式。术语“分离的”意指该序列至少基本上不含与该序列在自然界中天然结合或者在自然界中存在的至少一种其他组分。
术语的其他定义可在整个本说明书中出现。在更详细地描述示例性的实施方案之前，应当理解本公开文本并不限于所描述的具体实施方案，因为这些实施方案当然是可变的。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述具体的实施方案的目的，并不意在具有限制意义，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限定。
在提供数值范围的情况中，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间数值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)也被具体公开。规定的范围中的任何规定值或中间值与该规定的范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围，被涵盖在本公开文本内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中，而且其中任一个、没有一个或两个界限被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本公开文本中，但依据该规定的范围中的任何被具体排除的界限而定。在规定的范围包括界限中的一个或两个的情况中，排除这些被包括的界限中的任一个或两个的范围，也被包括在本公开文本中。
必须指出，本文和所附权利要求书中用到的名词既有单数含义也有复数含义，除非上下文另有清楚规定。因此，例如，提到“基因”则包括多个这种候选物质，而提到“细胞”则包括提到一个或多个细胞以及本领域技术人员知道的它们的等同物，以此类推。
本文述及的出版物只是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供。本文的任何内容都不能被解释为承认这些出版物构成本文所附权利要求的现有技术。
用于本发明的酶可通过固体培养或深层培养来产生，包括分批工艺、补料分批工艺和连续流工艺。培养在培养基中完成，该培养基包含含水矿物盐培养基、有机生长因子、碳和能源物质、分子氧以及当然还有待使用的一种或多种特定微生物物种的起始种菌。
变体/衍生物
本发明还涵盖酶的任何氨基酸序列或编码这种酶的任何核苷酸序列的变体、同源物和衍生物。
变体氨基酸序列可包括可在序列的任何两个氨基酸残基之间插入的合适的间隔基团，这些间隔基团除了氨基酸间隔物如甘氨酸或β-丙氨酸残基外还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。变异的另一种形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为了避免疑惑，“类肽形式”用于指其中α-碳取代基处于残基的氮原子而不是α-碳上的变体氨基酸残基。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ等人，PNAS(《美国国家科学院院刊》)(1992)89(20)，9367-9371，和Horwell DC，Trends Biotechnol.(《生物技术趋势》)(1995)13(4)，132-134。
其他组分
本发明的饲料添加物可与其他的组分或载体组合使用。
用于饲料酶的合适载体包括麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、止泡剂、Na2SO4、滑石粉、PVA、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1，3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。另外，有多种封装技术，包括那些基于脂肪/蜡覆盖、添加植物胶等的技术。
其他组分的实例包括如下中的一种或多种：增稠剂、胶凝剂、乳化剂、粘合剂、结晶改良剂、甜味剂(包括人造甜味料)、流变改性剂、稳定剂、抗氧化剂、染料、酶、载体、溶媒、赋形剂、稀释剂、润滑剂、调味剂、着色物质、助悬剂、崩解剂、制粒粘合剂等。这些其他组分可以是天然的。这些其他组分可通过使用化学和/或酶学技术来制备。
本文所用的术语“增稠剂或胶凝剂”指通过减慢或防止粒子的移动而防止发生分离的产品，所述粒子为不混溶性液体小滴、空气或不溶性固体。
本文所用的术语“稳定剂”定义为防止产品(例如食物产品)随时间推移发生变化的成分或成分组合。
本文所用的术语“乳化剂”指防止乳液发生分离的成分(例如食物产品成分)。
本文所用的术语“粘合剂”指通过物理或化学反应将产品粘合在一起的成分(例如食物成分)。
本文所用的术语“结晶改良剂”指影响脂肪或水的结晶的成分(例如食物成分)。
“载体”或“溶媒”意指适合于化合物施用的材料，包括本领域已知的任何无毒且不会以有害方式与组合物的任何组分发生相互作用的材料，例如任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂等。
营养上可接受的载体的实例包括例如谷物、水、盐溶液、醇、有机硅、蜡、石油凝胶、植物油等。
赋形剂的实例包括如下中的一种或多种：微晶纤维素和其他纤维素、乳糖(lactose)、柠檬酸钠、碳酸钙、二碱式磷酸钙、甘氨酸、淀粉、乳糖(milk sugar)和高分子量聚乙二醇。
崩解剂的实例包括如下中的一种或多种：淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐。
制粒粘合剂的实例包括如下中的一种或多种：聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、麦芽糖、明胶和阿拉伯胶。
润滑剂的实例包括如下中的一种或多种：硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石粉。
稀释剂的实例包括如下中的一种或多种：水、乙醇、丙二醇和丙三醇以及它们的组合。
其他的组分可同时使用(例如当它们混合在一起时或者甚至当它们通过不同的途径递送时)或者依序使用(例如它们可通过不同的途径递送)。
本文所用的术语“适合动物或人消费的组分”意指这样的化合物，其被添加到或可添加到本发明的组合物作为添加物，该添加物可对食用者有营养好处，可以是纤维替代物，或者对消费者具有一般有益的作用。
举个例子，所述组分可以是益生元如藻酸盐、黄原胶、果胶、刺槐豆胶(LBG)、菊粉、瓜尔豆胶、半乳寡聚糖(GOS)、果寡聚糖(FOS)、乳蔗糖、大豆寡糖、帕拉金糖、异麦芽寡聚糖、葡寡聚糖和木寡聚糖。
脂肪酶单位(LIPU)
本文所用的1LIPU(脂肪酶单位)定义为在下文所述的条件下每分钟释放1μmol的H+的酶量。
通过将15.00ml三丁酸甘油酯、50.00ml乳化剂和235ml蒸馏水在匀化器中混合20秒钟，制备5％(v/v)三丁酸甘油酯底物。用0.5M NaOH将底物的pH调节至约5.4。
乳化剂是通过将17.9g NaCl、0.41g KH2PO4、400ml蒸馏水和450ml甘油在2000ml烧杯中混合来制备。在剧烈搅拌下加入6.0g阿拉伯树胶，继续搅拌直到阿拉伯树胶完全溶解。将溶液转移到1000ml容量瓶，用蒸馏水定容至刻度。
对于干燥样品：在容量瓶中溶解经计算能在最终稀释度的一半下得到约3.5LIPU/ml的最终溶液的酶量，并磁力搅拌20分钟。
搅拌后，用蒸馏水调节至最终稀释度。任何进一步的稀释应当用蒸馏水进行。将溶液中的样品直接在蒸馏水中稀释。
将25.00mL的底物调节至30.0℃。
用NaOH/HCl将底物pH调至5.50。
在搅拌的同时，加入2.00ml样品，并立即开动恒PH滴定仪。
6分钟后停止滴定。
计算滴定曲线的斜率。滴定曲线的斜率由3至6分钟之间的数据计算。斜率必须在区间0.1-0.2mL/分钟中。
用如下公式计算该酶的活性(LIPU/g)：
ml/分钟：滴定曲线的斜率
N：NaOH的当量浓度
F：样品的稀释度
A：称重的样品克数
2：ml样品
分离的
在一个方面，优选地，用于本发明中的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶是以分离的形式。术语“分离的”意指胃蛋白酶耐受性α淀粉酶至少基本上不含与该酶在自然界中天然结合或者在自然界中存在的至少一种其他组分。术语“分离的”可意指胃蛋白酶耐受性α淀粉酶至少基本上不含至少一种该酶在其中产生的培养基中的其他组分。本发明的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶可以基本上不含一种或多种污染物的形式提供，所述污染物质可能原本与该酶相关联或该酶可与所述污染物质一起产生。
因而，例如，其可能基本上无细胞或一种或多种潜在污染性多肽和/或核酸分子。可通过在发酵期间或发酵后从肉汤分离出细胞来分离α淀粉酶，从而使得脂解酶保留在肉汤中。可通过经由真空过滤对发酵肉汤实施细胞分离来分离α淀粉酶。
纯化的
在一个方面，优选地，用于本发明中的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶是以纯化的形式。术语“纯化的”意指给定组分以高水平存在。理想的是该组分为组合物中存在的主要组分。优选地，其以至少约60％，或至少约65％，或至少约70％，或至少约75％，或至少约80％的水平存在，所述水平是就所考虑的总组合物以干重/干重计来测定。对于一些实施方案，该量是至少约85％，所述水平是就所考虑的总组合物以干重/干重计来测定。
浓缩物
在一个方面，优选地，用于本发明中的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶作为浓缩物使用。浓缩物可以是该酶已分泌进其中的培养基的浓缩形式。优选地，浓缩物可以是该酶已分泌进其中并且其中已移除细胞的培养基的浓缩形式。
核苷酸序列
本发明的范围涵盖编码具有本文所限定的特定性质的蛋白质的核苷酸序列。
本文所用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。核苷酸序列可为基因组起源的或合成或重组起源的，其可以是双链的或单链的而无论是代表有义链还是反义链。
与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选地，其意指DNA，更优选地，意指编码本发明的cDNA序列。
在优选的实施方案中，当与本发明的范围本身有关以及当由本发明的范围本身所涵盖时，核苷酸序列不包括处于其天然环境中时或其连接至也存在于其/它们的天然环境中的天然结合的序列时的天然的根据本发明的核苷酸序列。为便于说明，我们应将这个优选的实施方案称为“非天然核苷酸序列”。为此，术语“天然核苷酸序列”意指处于它的天然环境中且当与和它天然结合的整个启动子有效连接时的整个核苷酸序列，所述启动子也处于它的天然环境中。然而，由本发明的范围所涵盖的氨基酸序列可在核苷酸序列在其天然生物体中表达后分离和/或纯化。优选地，然而，本发明的范围所涵盖的氨基酸序列可由核苷酸序列在其天然生物体中表达，但其中该核苷酸序列不处于在该生物体中其天然与之相关联的启动子的控制之下。
通常，由本发明的范围所涵盖的核苷酸序列使用重组DNA技术(即重组DNA)制备。然而，在本发明的备选实施方案中，核苷酸序列可用本领域所熟知的化学方法整体或分部分地合成(参见Caruthers MH等人，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser(《核酸研究专题论文系列》)215-23和Horn T等人，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser(《核酸研究专题论文系列》)225-232)。
核苷酸序列的制备
编码具有本文所定义的特定性质的蛋白质或适于修饰的蛋白质的核苷酸序列可从产生所述蛋白质的任何细胞或生物体鉴别和/或分离和/或纯化。多种方法是核苷酸序列鉴别和/或分离和/或纯化领域所熟知的。举个例子，一旦已鉴别和/或分离和/或纯化合适的序列后即可使用PCR扩增技术来制备更多条序列。
举另一个例子，可用来自产生酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该酶的氨基酸序列是已知的话，可合成标记寡核苷酸探针并用于从该由生物体制备的基因组文库鉴别酶编码克隆。作为另外一种选择，可将含有与另一已知酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针用于鉴别酶编码克隆。在后一种情况中，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。
作为另外一种选择，酶编码克隆可通过这样来鉴别：将基因组DNA的片段插入表达载体(如质粒)中，用所得的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将转化细菌接种于含有酶底物(即麦芽糖)的琼脂板上，从而使得表达该酶的克隆能被鉴别。
在再进一步的备选方案中，编码该酶的核苷酸序列可通过确立的标准方法合成制备，例如由Beucage S.L.等人，(1981)Tetrahedron Letters(《四面体通讯》)，22，第1859-1869页描述的亚磷酰胺方法，或由Matthes等人，(1984)EMBO J.(《欧洲分子生物学学会杂志》)，3，第801-805页描述的方法。在亚磷酰胺方法中，寡核苷酸例如在自动DNA合成仪中合成，将其纯化、退火、连接并克隆进适当的载体中。
核苷酸序列可以为混合的基因组和合成起源、混合的合成和cDNA起源或混合的基因组和cDNA起源，根据标准技术通过连接合成、基因组或cDNA起源的片段制备(视情况而定)。每一连接的片段对应整个核苷酸序列的各个部分。DNA序列还可使用特异性引物通过聚合酶链反应(PCR)制备，例如如US 4,683,202或Saiki R K等人(Science(《科学》)(1988)239，第487-491页)中所述。
氨基酸序列
本发明的范围还涵盖具有本文所限定的特定性质的酶的氨基酸序列。
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
氨基酸序列可从合适的来源制备/分离，或者其可通过合成制备或者其可通过利用重组DNA技术制备。
本发明中所涵盖的蛋白质可与其他蛋白质，特别是酶结合使用。因而，本发明还涵盖蛋白质的组合，其中该组合包含本发明的蛋白质/酶和其他蛋白质/酶，所述其他蛋白质/酶可以是根据本发明的其他蛋白质/酶。
优选地，当与本发明的本身范围有关或当由本发明的本身范围所涵盖时，氨基酸序列不是天然的酶。就这一点而言，术语“天然的酶”意指处于其天然环境中并且在其已由其天然核苷酸序列表达时的整个酶。
序列同一性或序列同源性
本发明还涵盖与具有本文所限定的特定性质的多肽的氨基酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列或编码这种多肽的任何核苷酸序列(下文称为“同源序列”)的用途。在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可等同于“同一性”。
该同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应该提供和/或编码保留该酶的功能活性和/或增强该酶的活性的多肽。
在本说明书的语境中，同源序列意指包括这样的氨基酸序列，其可与主题序列有至少75、85或90％同一性、优选至少95或98％同一性。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。
在本说明书的语境中，同源序列意指包括这样的核苷酸序列，其可与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)有至少75、85或90％同一性、优选至少95或98％同一性。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。
同源性比较可通过眼，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可计算两条或更多条序列之间的％同源性。
％同源性可在连续的序列上计算，即将一条序列与另一条序列进行比对，并将一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“不产生缺口的”比对。通常，这种不产生缺口的比对仅在相对较短数目的残基上进行。
尽管这是十分简单和可靠的方法，但其不能考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致％同源性有大的降低。因此，大多数序列比较方法被设计产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会罚掉过多的整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“缺口”以试图使局部同源性最大化来实现。
然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个缺口赋给“缺口罚分”使得，对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少缺口的序列比对(反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多缺口的序列比对更高的分数。通常使用“仿射缺口成本(Affine gap costs)”，其对缺口的存在征收相对较高的成本，对缺口中每一个后续的残基征收较少的罚分。这是最通常使用的缺口打分系统。高的缺口罚分将当然会产生具有较少缺口的最佳比对。大多数比对程序允许修改缺口罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。
最大％同源性的计算因而首先需要在考虑缺口罚分的情况下产生最佳比对。进行这种比对的合适计算机程序是Vector NTI(英杰公司(InvitrogenCorp.))。其他可进行序列比较的软件的例子包括(但不限于)例如BLAST软件包(参见Ausubel等人1999Short Protocols in Molecular Biology(《精编分子生物学方案》)，第4版-第18章)、BLAST 2(参见FEMSMicrobiol Lett(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》)1999174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》)1999177(1)：187-8和tatianancbi.nlm.nih.gov)、FASTA(Altschul等人1990J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)403-410)和AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于离线和在线搜索(参见Ausubel等人，1999，第7-58页至7-60页)。
尽管最终的％同源性也可以同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无的成对比较。相反，通常使用标度化相似性打分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离给每一成对比较赋给分值。通常使用的这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(对于进一步的细节请参见用户手册)。对于一些应用而言，优选的是使用Vector NTI软件包的各默认值。
作为另外一种选择，同源性百分比可使用Vector NTI(英杰公司)中的多重比对功能计算，该功能是基于类似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988)，Gene(《基因》)73(1)，237-244)的算法。
一旦该软件产生了最佳比对，则有可能计算％同源性，优选％序列同一性。作为序列比较的一部分该软件通常进行这些计算，并产生数值结果。
当测定序列同一性时应该使用缺口罚分(Gap Penalty)，然后优选将如下参数用于双序列比对：
对于BLAST
缺口开放(GAP OPEN) 0
缺口延伸(GAP EXTENSION) 0
对于CLUSTAL DNA 蛋白质
字长(WORD SIZE) 2 1 K triple
缺口罚分(GAP PENALTY) 15 10
缺口延伸 6.66 0.1
在一个实施方案中，可使用采用上面限定的缺口罚分和缺口延伸组的CLUSTAL。
合适地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少20个连续核苷酸上，优选在至少30个连续核苷酸上，优选在至少40个连续核苷酸上，优选在50个连续核苷酸上，优选在至少60个连续核苷酸上，优选在至少100个连续核苷酸测定。
合适地，关于核苷酸序列的同一性程度可在整个序列上测定。
变体/同源物/衍生物
本发明还涵盖蛋白质的任何氨基酸序列或编码这种蛋白质的任何核苷酸序列的变体、同源物和衍生物。
在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可等同于“同一性”。
在该语境中，同源序列意欲包括这样的氨基酸序列，其可与主题序列具有至少75、80、85或90％的同一性，优选至少95、96、97、98或99％的同一性。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。
在该语境中，同源序列意欲包括这样的核苷酸序列，其可与编码本发明的酶的核苷酸序列(主题序列)具有至少75、80、85或90％的同一性，优选至少95、96、97、98或99％的同一性。在优选的实施方案中，可用于本发明中的核苷酸序列包括这样的核苷酸序列，其与SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列具有至少75、85或90％的同一性，优选至少95或98％的同一性。此外，可用于本发明中的核苷酸序列包括这样的核苷酸序列，其与SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列具有至少75、85或90％的同一性，优选至少95或98％的同一性。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。
同源性比较可通过眼，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可计算两条或更多条序列之间的％同源性。
％同源性可在连续的序列上计算，即将一条序列与另一条序列进行比对，并将一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“不产生缺口的”比对。通常，这种不产生缺口的比对仅在相对较短数目的残基上进行。
尽管这是十分简单和可靠的方法，但其不能考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致％同源性有大的降低。因此，大多数序列比较方法被设计产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会罚掉过多的整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“缺口”以试图使局部同源性最大化来实现。
然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个缺口赋给“缺口罚分”使得，对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少缺口的序列比对(反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多缺口的序列比对更高的分数。通常使用“仿射缺口成本”，其对缺口的存在征收相对较高的成本，对缺口中每一个后续的残基征收较少的罚分。这是最通常使用的缺口打分系统。高的缺口罚分将当然会产生具有较少缺口的最佳比对。大多数比对程序允许修改缺口罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit程序包时，对于氨基酸序列的默认缺口罚分为：缺口-12，每个缺口延伸-4。
最大％同源性的计算因而首先需要在考虑缺口罚分的情况下产生最佳比对。用于进行这种比对的合适计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(Devereux等人1984Nuc.Acids Research(《核酸研究》)12第387页)。可进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等人，1999 Short Protocols in Molecular Biology(《精编分子生物学方案》)，第4版-第18章)、FASTA(Altschul等人，1990 J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)403-410)和GENEWORKS比较工具套件。BLAST和FASTA二者均可用于离线或在线搜索(参见Ausubel等人，1999，Short Protocols in Molecular Biology(《精编分子生物学方案》)，第7-58至7-60页)。然而，对于某些应用，优选使用GCG Bestfit程序。称为BLAST 2Sequences的新工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》)1999174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett(《欧洲微生物学会联合会微生物学通讯》)1999177(1)：187-8和tatianancbi.nlm.nih.gov)。
尽管最终的％同源性也可以同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无的成对比较。相反，通常使用标度化相似性打分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离给每一成对比较赋给分值。通常使用的这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。GCGWisconsin程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(对于进一步的细节请参见手册)。对于某些应用，优选使用GCG软件包的公用默认值，或者在其他软件的情形中，使用默认矩阵，如BLOSUM62。
作为另一种选择，同源性百分比可使用DNASISTM(日立软件公司(Hitachi Software))中的多重比对功能计算，该功能是基于类似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988)，Gene(《基因》)73(1)，237-244)的算法。
一旦该软件产生了最佳比对，则有可能计算％同源性，优选％序列同一性。作为序列比较的一部分该软件通常进行这些计算，并产生数值结果。
序列还可具有氨基酸残基的插入或置换，该插入或置换产生了沉默改变和导致功能等价的物质。可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性作出有意的氨基酸置换，只要该物质的二级结合活性得以保留。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有类似亲水性值的含不带电的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯基丙氨酸和酪氨酸。
可例如根据下表进行保守置换。第二列同一区组中的氨基酸，优选第三列同一行中的氨基酸可彼此置换：
Figure BDA00002710429900581
本发明还涵盖可能出现的同源置换(在本文中，置换和取代都用来指将现有的氨基酸残基用备选的残基进行交换)，即对等置换，如碱性对碱性，酸性对酸性，极性对极性等。非同源置换也可能出现，即从一类残基置换成另一类残基，或者涉及到加入非自然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。
还可以用非天然氨基酸进行置换，包括：α*和α-二取代*的氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化衍生物(如三氟酪氨酸*、对氯苯丙氨酸*、对溴苯丙氨酸*、对碘苯丙氨酸*)、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、对硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物(如4-甲基-苯丙氨酸*、五甲基-苯丙氨酸*)、L-苯丙氨酸(4-氨基)#、L-酪氨酸(甲基)*、L-苯丙氨酸(4-异丙基)*、L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸#和L-苯丙氨酸(4-苄基)*。为了上文的讨论(与同源或非同源置换有关)的目的已利用记号*指示衍生物的疏水性，而已利用#指示衍生物的亲水性，#*指示两亲特性。
变体氨基酸序列可包括可在序列的任何两个氨基酸残基之间插入的合适的间隔基团，这些间隔基团除了氨基酸间隔物如甘氨酸或β-丙氨酸残基外还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。变异的另一种形式(涉及存在类肽形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为了避免疑惑，“类肽形式”用于指其中α-碳取代基处于残基的氮原子而不是α-碳上的变体氨基酸残基。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ等人，PNAS(《美国国家科学院院刊》)(1992)89(20)，9367-9371，和Horwell DC，Trends Biotechnol.(《生物技术趋势》)(1995)13(4)，132-134。
用于本发明的核苷酸序列可在它们中包括合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3′和/或5′端添加吖啶或多聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解本文所描述的核苷酸序列可通过本领域可用的任何方法修饰。可进行这种修饰以便增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涵盖与本发明给出的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的用途。如果序列与其片段互补，则该序列可用作探针来鉴别其他生物体中的相似编码序列等等。
不与本发明的序列100％同源但属于本发明的范围之内的多核苷酸可以多种方式获得。本文描述的序列的其他变体可例如通过用探针探测(probing)从一系列个体，例如来自不同种群的个体制备的DNA文库来获得。此外，可获得其他同源物并且这种同源物及其片段一般将能够选择性杂交至本文所列序列中所示的序列。这种序列可通过这样获得：从其他动物物种制备cDNA文库或基因组DNA文库，在中等至高严格性条件下用包含随附的序列表中的序列中的任一条的全部或部分的探针，探测这些文库。可应用类似的考虑来获得本发明的多肽或核苷酸序列的种同源物和等位基因变体。
变体和株系/物种同源物还可用简并PCR获得，简并PCR将使用这样一种引物，该引物设计用于靶向变体和同源物内编码本发明序列内的保守氨基酸序列的序列。保守序列可例如通过将来自数种变体/同源物的氨基酸序列进行比对来预测。序列比对可用本领域已知的计算机软件来进行。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。
简并PCR中使用的引物将含有一个或多个简并位置并将在比从已知序列用单序列引物克隆序列所用的严格性条件低的严格性条件下使用。
作为另外一种选择，这种多核苷酸可通过对已表征的序列进行定点诱变来获得。在例如需要沉默密码子序列改变来优化多核苷酸序列在其中表达的特定宿主细胞的密码子偏好的情形中这可能是有用的。其他序列改变可能是期望的以便引入限制性酶识别位点，或以改变多核苷酸编码的多肽的性质或功能。
本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于产生引物(例如PCR引物)、备选的扩增反应的引物、探针(例如用放射性或非放射性标记通过常规手段标记有显示标记的探针)，或者可将该多核苷酸克隆进载体中。这种引物、探针和其他片段将长为至少15个，优选至少20个，例如至少25、30或40个核苷酸，并且也为本文所用的术语本发明的多核苷酸所涵盖。
根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针可重组产生、合成产生或通过本领域技术人员可用的任何手段产生。它们还可以通过标准技术克隆。
通常，引物将通过合成手段产生，涉及所需核酸序列的逐步制备，一次一个核苷酸。利用自动化技术完成该过程的技术是本领域容易获得的。
较长的多核苷酸将通常用重组手段产生，例如用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。引物可被设计为含有合适的限制性酶识别位点使得可将扩增的DNA克隆进合适的克隆载体中。
杂交
本发明还涵盖与本发明的核酸序列互补的序列或能够杂交至本发明的序列或杂交至与之互补的序列的序列。
本文所用的术语“杂交”应包括“一条核酸链与互补链通过碱基配对接合的过程”以及在聚合酶链反应(PCR)技术中所进行的扩增过程。
本发明还涵盖能杂交至与本文给出的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的序列的核苷酸序列的用途。
术语“变体”还涵盖与能够杂交至本文给出的核苷酸序列的序列互补的序列。
优选地，术语“变体”涵盖与这样的序列互补的序列：所述序列能够在严格条件(例如50℃和0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH 7.0})下与本文给出的核苷酸序列杂交。
更优选地，术语“变体”涵盖与这样的序列互补的序列：所述序列能够在高严格条件(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH 7.0})下与本文给出的核苷酸序列杂交。
本发明还涉及可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的核苷酸序列。
本发明还涉及这样的核苷酸序列，该核苷酸序列与可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的核苷酸序列互补。
还包括在本发明范围内的是这样的多核苷酸序列，该多核苷酸序列在中等至最高严格性条件下能够杂交至本文给出的核苷酸序列。
在一个优选的方面，本发明涵盖可在严格条件(例如50℃和0.2xSSC)下，与本发明的核苷酸序列或其互补体杂交的核苷酸序列。
在一个更优选的方面，本发明涵盖可在高严格条件(例如65℃和0.1xSSC)下，与本发明的核苷酸序列或其互补体杂交的核苷酸序列。
分子进化
作为一个非限制性实例，有可能在体内或体外在核苷酸序列中产生多个定点突变或随机突变，并随后通过多种手段针对所编码的多肽的功能性改善进行筛选。
另外，多核苷酸序列的突变或天然变体可与野生型或其他突变或天然变体重组而产生新的变体。也可以针对所编码的多肽的功能性改善对这种新的变体进行筛选。新的优选变体的产生可通过多种本领域十分确立的方法来实现，例如错误阈值诱变(Error Threshold Mutagenesis)(WO 92/18645)、寡核苷酸介导的随机诱变(US 5,723,323)、DNA改组(shuffling)(US 5,605,793)、外切核酸酶介导的基因拼装(exo-mediated gene assembly)(WO00/58517)。这些和类似随机定向分子进化方法的应用使得能在先前对蛋白质结构或功能没有任何了解的情况下鉴别和选择本发明的酶的具有优选的特性的变体，以及使得能产生不可预测的但有利的突变或变体。在本领域中有许多将分子进化应用于优化或改变酶活性的例子，这些例子包括(但不限于)如下中的一种或多种：优化在宿主细胞中或体外的表达和/或活性，增加酶活性，改变底物和/或产物特异性，增加或减少酶或结构稳定性，改变优选环境条件，如温度、pH、底物下的酶活性/特异性。
定点诱变
一旦已分离了蛋白质编码核苷酸序列，或者已鉴别了推定的蛋白质编码核苷酸序列，可能有利的是使该序列突变以便制备本发明的蛋白质。
可用合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有所需突变位点旁侧的核苷酸序列。
合适的方法公开于Morinaga等人(Biotechnology(《生物技术》)(1984)2，第646-649页)中。向酶编码核苷酸序列引入突变的另一种方法在Nelson和Long(Analyical Biochemistry(《分析生物化学》)(1989)，180，第147-151页)中描述。
重组体
在一个方面，用于本发明的序列是重组序列，即用重组DNA技术制备的序列。
这些重组DNA技术是在本发明一般技术人员的能力之内。这种技术在文献中进行了解释，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，第二版，第1-3册，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。
合成
在一个方面，用于本发明的序列是合成序列，即已通过体外化学或酶合成制备的序列。其包括但不限于经制备而具有宿主生物体(例如甲醇营养型酵母毕赤酵母属(Pichia)和汉逊酵母属(Hansenula))的最佳密码子使用的序列。
酶的表达
可将用于本发明的核苷酸序列掺入重组体复制型载体中。该载体可用于在相容宿主细胞中和/或从相容宿主细胞复制和表达核苷酸序列(以蛋白质/酶形式)。
可用控制序列，例如调控序列控制表达。
由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列产生的蛋白质可被分泌或者可包含在细胞内，这取决于所使用的序列和/或载体。编码序列可被设计具有信号序列，该信号序列引导编码该物质的序列穿过特定的原核或真核细胞膜分泌。
表达载体
术语“表达载体”意指能够在体内或体外进行表达的构建体。
优选地，将表达载体掺入合适的宿主生物体的基因组中。术语“掺入”优选涵盖稳定掺入基因组中。
本发明的核苷酸序列可存在于载体中，在该载体中该核苷酸序列有效连接至调控序列，该调控序列能够提供由合适的宿主生物体表达该核苷酸序列。
可将用于本发明的载体转化进如下文所述的合适宿主细胞中以提供本发明的多肽的表达。
载体(例如质粒、粘粒或噬菌体载体)的选择将通常取决于待将其引入的宿主细胞。
用于本发明的载体可含有一种或多种可选标记基因-如赋予抗生素抗性，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。作为另外一种选择，该选择可通过共转化来完成(如WO91/17243中所描述的)。
载体可在体外用于例如产生RNA，或用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。
因而，在进一步的实施方案中，本发明提供通过如下步骤制备本发明的核苷酸序列的方法：将本发明的核苷酸序列引入复制型载体内，将该载体引入相容的宿主细胞内，并在引起该载体复制的条件下培养该宿主细胞。
该载体可另外包含使得该载体能在所考虑的宿主细胞中复制的核苷酸序列。这种序列的实例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起始区。
调控序列
在一些应用中，用于本发明的核苷酸序列有效连接至调控序列，该调控序列能够提供核苷酸序列的表达，例如通过所选择的宿主细胞表达。举个例子，本发明涵盖包含有效连接至这样一种调控序列的本发明核苷酸序列的载体，即该载体是表达载体。
术语“有效连接”是指“邻接”，其中所描述的各组分处于使得它们能以其预期的方式发挥功能的关系。调控序列“有效连接”至编码序列是以使得该编码序列的表达能在与该控制序列相容的条件下实现的方式连接。
术语“调控序列”包括启动子和增强子以及其他表达调节信号。
术语“启动子”是以本领域的标准意义使用，例如RNA聚合酶结合位点。
编码本发明的酶的核苷酸序列的增强表达也可以通过选择异源调控区(例如，启动子、分泌引导区和终止子区)来实现。
优选地，根据本发明的核苷酸序列有效连接至至少一个启动子。
其他启动子还可用于引导本发明的多肽的表达。
适用于引导核苷酸序列在细菌、真菌或酵母宿主中转录的启动子的实例是本领域所熟知的。
启动子可额外包括用于确保或用于增加在合适宿主中的表达的特征物。例如，所述特征物可以是保守区，例如Pribnow盒或TATA盒。
构建体
术语“构建体”(其与诸如“结合物”、“盒”和“杂交体”之类的术语同义)包括直接或间接连接至启动子的用于根据本发明的用途的核苷酸序列。
间接连接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列中间提供合适的间隔基团如内含子序列，例如Sh1-内含子或ADH内含子。与本发明相关的术语“融合的”同样如此，其包括直接或间接连接。在一些情况下，该术语不涵盖这样的编码蛋白质的核苷酸序列的天然组合：其通常与野生型基因启动子相关联并且当它们二者均处于其天然环境中时。
该构建体可甚至还含有或表达标记，该标记使得能对该遗传构建体进行选择。
对于某些应用，优选的是，本发明的构建体至少包含有效连接至启动子的本发明的核苷酸序列。
宿主细胞
与本发明有关的术语“宿主细胞”包括包含所述核苷酸序列或上述表达载体并用于重组产生具有本文所限定的特定性质的蛋白质的任何细胞。
因而，本发明的另一个实施方案提供用表达本发明的蛋白质的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。细胞将选择为与所述载体相容，并且可以例如是原核(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。
合适的细菌宿主生物体的实例是革兰氏阳性或革兰氏阴性菌物种。
取决于编码本发明的多肽的核苷酸序列的性质，和/或对于所表达蛋白质的进一步加工的需要，真核宿主例如酵母或其他真菌可以是优选的。一般而言，酵母细胞优于真菌细胞，因为它们更易于操纵。然而，一些蛋白质或者由酵母细胞弱分泌，或者在一些情况下无法正确加工(例如酵母中的高度糖基化)。在这些情况下，应选择不同的真菌宿主生物体。
合适宿主细胞例如酵母、真菌和植物宿主细胞的使用可提供翻译后修饰(例如豆蔻酰化、糖基化、截短、脂质化以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸的磷酸化)，可能需要这些用于给本发明的重组表达产物赋予最佳的生物学活性。
宿主细胞可以是蛋白酶缺陷型或蛋白酶阴性菌株。这可以例如是命名为“alp”的碱性蛋白酶基因已被缺失的蛋白酶缺陷型菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)JaL 125。这种菌株在WO97/35956中进行了描述。
生物体
与本发明有关的术语“生物体”包括任何生物体，其可包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，和/或其中启动子可允许在存在于该生物体中时根据本发明的核苷酸序列表达。
合适的生物体可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。
与本发明有关的术语“转基因生物体”包括任何生物体，其包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，和/或其中启动子可允许根据本发明的核苷酸序列在该生物体内表达。优选地，所述核苷酸序列掺入生物体的基因组中。
术语“转基因生物体”不涵盖处于其天然环境中且当它们处于它们的天然启动子(也处于其天然环境中)的控制之下时的天然核苷酸编码序列。
因而，本发明的转基因生物体包括包含如下中的任一种或如下的组合的生物体：编码根据本发明的多肽的核苷酸序列、根据本发明的构建体、根据本发明的载体、根据本发明的质粒、根据本发明的细胞、根据本发明的组织或它们的产物。
例如，转基因生物体可还包含处于异源启动子的控制下的编码本发明的多肽的核苷酸序列。
宿主细胞/生物体的转化
如较早指出的，宿主生物体可以是原核或真核生物体。合适的原核宿主的例子包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
有关原核生物宿主的转化的教导在本领域的文献中有充分记载，例如参见Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，第2版，1989，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press))。如果使用原核生物宿主，则该核苷酸序列可能需要适当地进行修饰后再进行转化，例如通过去除内含子来进行修饰。
可用本领域已知的多种方法转化丝状真菌细胞，例如涉及原生质体形成和原生质体转化以及随后的以已知的方式再生细胞壁的方法。使用曲霉菌作为宿主微生物在EP 0238023中进行了描述。
另一种宿主生物体可以是植物。有关用来转化植物的通用技术的一篇综述，可在Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol(《植物生理学与植物分子生物学年鉴》)[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March(《农业食品工业高科技进展》)/1994年4月17-27)的文章中找到。有关植物转化的更多教导可在EP-A-0449375中找到。
有关真菌、酵母和植物的转化的一般教导在以下各节中给出。
转化的真菌
宿主生物体可以是真菌例如霉菌。合适的这种宿主的例子包括属于以下各属的任何成员：嗜热真菌属(Thermomyces)、枝顶孢属(Acremonium)、曲霉菌属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)、链孢霉属(Neurospora)、木霉属等。
在一个实施方案中，宿主生物体可以是丝状真菌。
转化丝状真菌在US-A-5741665中进行了论述，其声称用于转化丝状真菌和培养真菌的标准技术是本领域所熟知的。关于应用于粗糙链孢霉(N.crassa)的技术的详尽综述可见于例如Davis和de Serres，Methods Enzymol(《酶学方法》)(1971)17A：79-143中。
还可用于转化丝状真菌的另外的教导在US-A-5674707中进行了综述。
此外，Punt等人(2002)Trends Biotechnol(《生物技术趋势》)2002年5月；20(5)：200-6，Archer&Peberdy Crit Rev Biotechnol(《生物技术评论》)(1997)17(4)：273-306中教导了基因在丝状真菌中的表达。
本发明涵盖了通过使用这些标准技术制备的根据本发明的转基因丝状真菌的生产。
在一个方面，宿主生物体可以是曲霉菌属，如黑曲霉(Aspergillus niger)。
根据本发明的转基因曲霉菌也可通过例如遵循Turner G.1994(Vectorsfor genetic manipulation.(《用于基因操纵的载体》)，载于：Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(编辑)，Aspergillus：50 years on.Progress in industrialmicrobiology(《曲霉菌属：工业微生物学之50年进展》)，第29卷，阿姆斯特丹爱思唯尔出版社(Elsevier Amsterdam)1994，第641-666页)的教导来制备。
转化的酵母
在另一个实施方案中，转基因生物体可以是酵母。
关于异源基因在酵母中表达的原理的综述在例如如下文献中提供：Methods Mol Biol(《分子生物学方法》)(1995)，49：341-54和Curr OpinBiotechnol(《生物技术当前述评》)(1997)十月；8(5)：554-60。
为此，可将酵母(例如菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisi)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(参见FEMS Microbiol Rev(《欧洲微生物学会联合会微生物学评论》)(200024(1)：45-66))用作用于异源基因表达的媒介物。
E Hinchcliffe E Kenny(1993，“Yeast as a vehicle for the expression ofheterologous genes(《作为用于异源基因表达的媒介物的酵母》)”，Yeasts(《酵母》)，第5卷，Anthony H Rose和J Stuart Harrison(编辑)第2版，科学出版社(Academic Press Ltd.))给出了有关异源基因在酿酒酵母中表达以及基因产物分泌的原理的综述。
为转化酵母，已开发了几种转化方案。例如，可遵循Hinnen等人(1978，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA(《美国国家科学院院刊》)75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature(《自然》)，伦敦(London)，275，104)；和Ito，H等人(1983，J Bacteriology(《细菌学杂志》)153,163-168)的教导制备根据本发明的转基因酵母菌属。
转化的酵母细胞可用多种可选标记(如营养缺陷型标记、显性抗生素抗性标记)来进行选择。
转化的植物/植物细胞
适合于本发明的宿主生物体可以是植物。就这一点而论，构建经遗传修饰的植物的基本原理是在植物基因组中插入遗传学信息，以便获得所插入的遗传材料的稳定维持。关于通用技术的综述可在Potrykus(Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol(《植物生理学与植物分子生物学年鉴》)[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March(《农业食品工业高科技进展》)/1994年4月17-27)的文章中找到。
通过土壤杆菌属(Agrobacterium)直接感染植物组织是简单技术，其已广泛采用，并且在如下文献中描述：Butcher D.N.等人，(1980)，Tissue CultureMethods for Plant Pathologists(《用于植物病理学家的组织培养方法》)，编辑：D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208。
用于转化植物的其他技术包括弹道转化、碳化硅晶须技术(参见FrameBR，Drayton PR，Bagnaall SV，Lewnau CJ，Bullock WP，Wilson HM，DunwellJM，Thompson JA&Wang K(1994)Production of fertile transgenic maize plantsby silicon carbide whisker-mediated transformation(《通过碳化硅晶须介导的转化产生能育转基因玉蜀黍植物》)，The Plant Journal(《植物杂志》)6：941-948)和病毒转化技术(例如参见Meyer P，Heidmann I&Niedenhof I(1992)The use of cassava mosaic virus as a vector system for plants(《木薯花叶病毒作为用于植物的载体系统的用途》)，Gene(《基因》)110：213-217)。
有关植物转化的更多教导可在EP-A-0449375中找到。
植物细胞可以依照熟知的组织培养方法进行培养金额维持，例如通过在补充有必需生长因子例如氨基酸、植物激素、维生素等的合适培养基中培养细胞。
在另一个方面，本发明涉及载体系统，其携带根据本发明的核苷酸序列或构建体，并且能够将所述核苷酸序列或构建体引入生物体如植物的基因组内。载体系统可包含一种载体，但其可包含两种载体。在两种载体的情况下，该载体系统通常被称为二元载体系统。二元载体系统在Gynheung An等人，(1980)，Binary Vectors(《二元载体》)，Plant Molecular Biology Manual(《植物分子生物学手册》)A3，1-19中进一步详细描述。
用于植物细胞转化的一种广泛采用的系统使用来自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒或来自毛根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的Ri质粒(An等人，(1986)，Plant Physiol.(《植物生理学》)81，301-305和Butcher D.N.等人，(1980)，Tissue Culture Methods for PlantPathologists(《用于植物病理学家的组织培养方法》)，编辑：D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208)。在根据本发明的所需启动子或构建体或核苷酸序列每一者引入植物中的方法后，另外的DNA序列的存在和/或插入可能是必需的。例如，对于转化，如果使用植物细胞的Ti-或Ri-质粒，则可以连接Ti-和Ri-质粒T-DNA的至少右边界但通常是右边界和左边界作为引入基因的旁侧区。T-DNA用于转化植物细胞的用途已得到广泛研究，并在如下参考文献中描述：EP-A-120516；Hoekema，于：The Binary Plant Vector System Offet-drukkerij Kanters(《二元植物载体系统》)B.B.，Alblasserdam，1985，第V章；Fraley等人，Crit.Rev.Plant Sci.(《植物科学评论》)，4：1-46；和An等人，EMBOJ(《欧洲分子生物学学会杂志》)(1985)4：277-284。
培养和生产
用本发明的核苷酸序列转化的宿主细胞可在有利于产生所编码的多肽并且有利于从细胞和/或培养基回收所述多肽的条件下培养。
用于培养细胞的培养基可以是适合于培养所考虑的宿主细胞和获得所述多肽的表达的任何常规培养基。
由重组细胞产生的蛋白质可展示在细胞的表面。
蛋白质可从宿主细胞分泌并且可方便地用熟知的工序从培养基回收。
分泌
通常，期望蛋白质从表达宿主分泌进培养基中，从培养基可更容易回收蛋白质。根据本发明，可根据所需的表达宿主选择分泌引导序列。杂交体信号序列也可用于本发明的该方面。
异源分泌引导序列的典型实例是源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-例如来自曲霉菌属的18氨基酸形式和24氨基酸形式二者)、a-因子基因(酵母例如酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和汉逊酵母属)或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属)的那些。
以举例的方式，异源蛋白质在大肠杆菌中的分泌在Methods Enzymol(《酶学方法》)(1990)182：132-43中进行了综述。
检测
多种用于检测和测量氨基酸序列的表达的方案是本领域已知的。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。
很多标签和缀合技术是本领域技术人员已知的并且可用于多种核酸和氨基酸测定。
多个公司如新泽西州皮斯卡特维的法玛西亚生物技术公司(PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)、威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega，Madison，WI)和俄亥俄州克利夫兰的美国生物化学公司(US Biochemical Corp，Cleveland，OH)提供商业试剂盒和用于这些程序的方案。
合适的报告分子或标签包括那些放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或显色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性粒子等等。教导这类标记的用途的专利包括US-A-3,817,837；US-A-3,850,752；US-A-3,939,350；US-A-3,996,345；US-A-4,277,437；US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。
另外，也可如US-A-4,816,567中所示制备重组免疫球蛋白。
另外的关注蛋白(POI)
供根据本发明的用途的序列还可与一种或多种另外的关注蛋白(POI)或关注核苷酸序列(NOI)一起使用。
POI的非限制性实例包括：参与淀粉代谢的蛋白质或酶、参与糖原代谢的蛋白质或酶、乙酰酯酶类、氨肽酶类、淀粉酶类、阿拉伯糖酶类、阿拉伯呋喃糖苷酶类、羧肽酶类、过氧化氢酶类、纤维素酶类、几丁质酶类、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶类、表异构酶类、酯酶类、α-半乳糖苷酶类、β-半乳糖苷酶类、α-葡聚糖酶类、葡聚糖裂解酶类、内切-β-葡聚糖酶类、葡糖淀粉酶类、葡萄糖氧化酶类、α-葡糖苷酶类、β-葡糖苷酶类、葡糖醛酸酶类、半纤维素酶类、己糖氧化酶类、水解酶类、转化酶类、异构酶类、漆酶类、脂解酶类、裂解酶类、甘露糖苷酶类、氧化酶类、氧化还原酶类、果胶酸裂解酶类、果胶乙酰酯酶类、果胶解聚酶类、果胶甲基酯酶类、果胶分解酶类、过氧化物酶类、酚氧化酶类、植酸酶类(包括3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26))、多聚半乳糖醛酸酶类、蛋白酶类、鼠李糖-半乳糖醛酸酶类、核糖核酸酶类、奇异果甜蛋白、转移酶类、转运蛋白、转谷氨酰胺酶类、木聚糖酶类(包括内切-1，4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8))、己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC 1.1.3.5)或它们的组合。NOI可以甚至是那些序列任一种的反义序列。
POI可以甚至是融合蛋白，例如，用以帮助提取和纯化。
POI可甚至融合至分泌序列。
其他序列还可有利于分泌或增加分泌的POI的收率。这种序列可编码伴侣蛋白，作为例如英国专利申请9821198.0中所述的黑曲霉cypB基因的产物。
因为多种原因，可对NOI进行工程改造以便改变它们的活性，包括但不限于可修饰NOI的表达产物的加工和/或表达的改变。举个例子，还可修饰NOI以优化在特定宿主细胞中的表达。其他序列变化可能是所需的以便引入限制性内切酶识别位点。
NOI可在其中包括合成的或经修饰的核苷酸-例如甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链。
可修饰NOI以增加细胞内稳定性和半衰期。可能的修饰包括但不限于：添加分子的5′和/或3′端的旁侧序列或在分子的主链内使用硫代磷酸酯或2′O-甲基而不是磷酸二酯酶键。
现在将仅以举例的方式，参照如下实施例来描述本发明。
实施例1
该实施例设计用于评估单胃动物消化系统中淀粉酶的存活率。动物在体内分泌淀粉酶，这使得难以检查加入的酶的存活率。因此开发了体外测试。实验设置中的条件设计用于模拟单胃动物的胃肠道(GIT)中的条件。测试淀粉酶以察看它们在暴露于这些条件后是否是有活性的。α-淀粉酶LTAA用作参考，因为这种α-淀粉酶已知在动物试验中可改善动物性能。
材料和方法
缓冲液：
胃蛋白酶温育缓冲液：0.1M甘氨酸-HCl，pH 3.0、3mg/ml BSA、2.9mg无水氯化钠/mL、0.73mg氯化钙/mL。对于具有胃蛋白酶的溶液，将温育缓冲液制备为含有25mg/ml(9250U/ml)胃蛋白酶(西格玛公司P-7000)，随后进行三次连续十倍稀释，以分别含有25、2.5、0.25和0.025mg/ml胃蛋白酶的四种溶液结束。一胃蛋白酶单位定义为在pH 2.0、37℃下每分钟将产生0.001的ΔOD280的酶量，其使用血红蛋白作为底物以TCA可溶性产物测量(如美国食品化学法典中所述)。
淀粉酶测定缓冲液：磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液0,1M，pH 5.6。
具有BSA的淀粉酶测定缓冲液：磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液0,1M，pH5.6，3mg/ml BSA。
酶：
●FRED(地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，LAT的变体)，可从杰能科公司(Genencor)获得，并在WO2009/149271中进行了描述。
●LAT(地衣芽孢杆菌α-淀粉酶)，可从杰能科公司获得(Purastar
Figure BDA00002710429900721
)，并在US6211134中进行了描述。
●LTAA或EBA(解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶)是由饲料酶服务公司(feed enzyme service)使用的酶标准，并在US5763385中进行了描述。活性：57492FFI U/g。
●BAN(可从诺维信公司(Novozymes)获得)。
●Tric.Amyl#26(TrAA-里氏木霉α-淀粉酶)，在WO2008/112729中进行了描述。
对渐增的胃蛋白酶浓度的抗性：
所有酶的设置都是相同的：制备具有酶和饲料的六种样品(一式两份)：四种样品具有在缓冲液(pH 3)中的渐增量的胃蛋白酶，一种样品不含胃蛋白酶但在温育缓冲液(pH 3)中，并且一种阳性对照样品具有在含BSA的测定缓冲液中的酶。这一式两份地完成，即对于待测试胃蛋白酶耐受性的每种酶，制备12个eppendorf管。
除了对于待测试的每种酶的2×6个管外，制备不添加酶的2×6份相似样品，以检查来自化学品的背景吸光度。
称取100mg玉米基饲料于每个来自艾本德公司(Eppendorf)的1,5ml微量离心管中。加入不含或含有渐增量的胃蛋白酶的体积900μl的温育缓冲液或900μl测定缓冲液，并在Eppendorf恒温混匀器5436中以500rpm预温育5分钟。将体积100μl的酶溶液(或100μl H2O)加入每个管中，盖上盖子，其后将它们在40℃下在Eppendorf恒温混匀器5436中以500rpm温育。在确切的120分钟温育后，将管(每次6个)在Eppendorf台式离心机中离心2分钟，抽取100μl并与900μl测定缓冲液混合。样品立即在KoneLab Arena20XT(来自美国热电公司)中分析活性。
在给定胃蛋白酶浓度时的胃蛋白酶耐受性定义为：相对于如上文方案中所述在pH 3下不含胃蛋白酶时温育两小时后通过KoneLab测定测得的活性测量的，如上文方案中所述在给定胃蛋白酶浓度在pH 3下温育两小时后通过KoneLab测定测得的淀粉酶活性。
KoneLab测定
化学品：
一水柠檬酸(默克公司)
磷酸氢二钠(默克公司)
二水氯化钙(默克公司)
无水氯化钠(默克公司)
来自牛血清的白蛋白(BSA，西格玛公司A 7906)
半胱氨酸(默克公司2838)
三(羟甲基)氨基甲烷(默克公司)
试剂：
1.稳定试剂
将如下物质溶解于10mL去离子水中：
0.20g来自牛血清的白蛋白(BSA)，
0.05g半胱氨酸，
2.0g无水氯化钠。
2.测定缓冲液：柠檬酸-磷酸盐缓冲液，0.1M，pH＝5.60
将如下物质溶解于大约800mL去离子水中：
4.41g一水柠檬酸，
10.3g二水磷酸氢二钠，
2.90g无水氯化钠，
0.73g二水氯化钙。
加入1.00mL稳定试剂(1)，同时在磁力搅拌器上搅拌。
当溶解时，将pH调节至5.60(HCl或NaOH)，将溶液转移至1000mL容量瓶，并用蒸馏水调节至1000mL。
3.终止溶液：1％(w/v)TRIS(Trizma碱)
将10gTRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)在容量瓶中溶解于去离子水中，并调节至1000mL。
4.底物(来自美格兹密公司的冻干Ceralpha (BPNPG7))
将褐色瓶的谷类α淀粉酶测定试剂(BPNPG 7)溶解于10.0ml蒸馏水(2)中。
在使用前，将溶液用蒸馏水进一步1∶1稀释。
1瓶Ceralpha含有54.5mg BPNPG7和125U(pH＝6.0)α-葡糖苷酶。
5.对照/标准样品
淀粉酶(LAT)标准：485TAU/g(批号102-05208-001)
另外的具有7957-8162TAU/g范围的LAT对照样品(批号102-01128-lab)。
程序
淀粉酶标准曲线的制备：
对于LAT，将淀粉酶标准(5)稀释至大约1.9U/g的浓度。
所有稀释都在测定缓冲液(2)中进行。
进一步的稀释在Konelab中按程序进行：
标准 稀释比 浓度，U/mL
1 1+49.0 0.034
2 1+19.0 0.085
3 1+9.0 0.170
4 1+5.0 0.283
5 1+3.0 0.425
OD范围应在0.2至1.5之间
样品制备：
对于每份样品执行2次称重。
液体产品：称取0.5g样品于50ml容量瓶中。将该容量瓶装满测定缓冲液(2)并混合。进一步的稀释也在测定缓冲液(2)中进行。终浓度应为大约0.2U/ml。
固体产品：称取0.5g样品于50ml容量瓶中，并在大约40ml测定缓冲液(2)中稀释。将溶液在磁力搅拌器上混合10分钟，并用缓冲液填充。将溶液滤过沃特曼玻璃滤器，并在测定缓冲液(2)中进行进一步的稀释。终浓度为大约0.2U/ml。
将样品的重量以4位小数记下用于以后计算。
为了使得稀释程序更容易，所有稀释都使用稀释器(哈美顿公司(Hamilton))进行。
盲样：在每次运行中包括2个盲样(测定缓冲液(2))。
测定中的反应条件：
pH＝5.60
温育温度＝37℃+/-0.1℃
波长＝405nm
底物50μl
预温育5分钟
样品10μl
温育15分钟
终止溶液100μl
酶活性的计算：
样品的活性根据下式进行计算：
Figure BDA00002710429900761
OD样品＝酶样品的吸光度
DF＝样品的稀释倍数
W样品＝以g表示的样品重量
α＝标准曲线的斜率
β＝标准曲线的截距
结果
结果可见于图6和7中。有趣的是，在饲料中使用现有的α淀粉酶-LTAA(杰能科公司)和BAN(诺维信公司)显示在较高的胃蛋白酶浓度下活性降低，而FRED、LAT和TrAA显示在10％饲料的存在下对低pH和胃蛋白酶具有极佳的稳定性。
实验设置中的条件设计用于模拟单胃动物的胃肠道(GIT)中的条件。LTAA作为参照进行测试，因为这种α-淀粉酶已知可改善动物性能。FRED、LAT和TrAA在测定中显示出更佳的稳定性，因此预计它们在GIT中显示出相等或更佳的稳定性。
实施例2
该实施例设计用于比较两种淀粉酶LTAA(目前在饲料中使用的解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶)和LAT(根据本发明的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶)的性能。目的是另外测试在体外完成的这两种淀粉酶的评价/比较是否可以在动物试验中得到验证。根据供应商(丹尼斯克公司(Danisco))推荐将LTAA的剂量定为2000U/kg饲料，而根据实验室试验确定LAT的剂量为性能等价，即100U/kg饲料。
材料和方法(试验1、2、3和4)
性能试验
雄性肉鸡(Ross 308)日龄的小鸡得自商业孵化场，称重并基于体重分配给48个地面围栏：六种处理，每种处理有八个重复围栏。地面围栏位于环境可控的室内。每个围栏布局相同，每个围栏具有一个钟状饮水器和一个喂料斗。在整个研究中饲料以糊料形式无限制地提供并且水可自由获取。成分和计算的饮食组成在表1和2中给出。在第1、21和42天记录体重和饲料摄取。每天记录死亡率。将死亡的任何肉鸡称重，重量用于调整饲料转化率。通过将总饲料摄取除以活的加上死的肉鸡的增重来计算饲料转化率。
统计分析
使用广义线性模型(Proc Mixed；北卡罗来那州凯瑞的SAS软件研究所(SAS Institute，Cary，NC))分析数据，该广义线性模型包括膳食酶的主要效应，以及试验场所和区块x试验场所的随机效应。通过多重t检验完成最小二乘均值差异。显著性以P＜0.05评估。
加入的酶
淀粉酶；2000U/kg饲料的解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶(LTAA)或100U/kg饲料的地衣芽孢杆菌α淀粉酶(LAT)。还向两种饮食中添加2000U/kg的木霉属木聚糖酶。
表1.肉鸡试验。试验1、2、3和4的实验饮食。仔鸡料(0-21天)。
表2.肉鸡试验。试验1、2、3和4的实验饮食。大鸡料(21-42天)。
结果
结果在图9和10中详细描述。与对照淀粉酶LTAA相比，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶(LAT)的使用导致统计上显著的增重(图9)。与对照相比，胃蛋白酶耐受性α淀粉酶(LAT)的使用还导致饲料转化改善(统计上显著)(图10)，其中饲料转化是产生1kg动物所需的饲料量(饲料功效的倒数)。
上面说明书中提及的所有出版物以引用的方式并入本文。对本领域的技术人员将显而易见的是，可在不背离本发明的范围和精神的条件下对所描述的本发明方法和系统作出多种修改和变型。尽管本发明已结合特定的优选实施方案进行了说明，但应该理解受权利要求书保护的本发明不应该不当地受限于这些特定的实施方案。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员明显的用于执行本发明的所述模式的多种修改旨在处于如下权利要求书的范围内。
Figure IDA00002710430300011
Figure IDA00002710430300021
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Figure IDA00002710430300081
Figure IDA00002710430300101

Claims (70)

1.鉴定用于饲料添加物中的胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的方法，所述方法包括：
i)提供α淀粉酶；
ii)将所述α淀粉酶与玉米基饲料和胃蛋白酶混合，在pH 3下温育，并与对照样品相比较分析所述α淀粉酶的α淀粉酶活性；
其中所述对照样品的不同之处在于在pH 3下温育的过程中不存在胃蛋白酶；以及
iii)选择在所述测定条件下基本上维持α淀粉酶活性的α淀粉酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤ii)中的胃蛋白酶水平是至少9000U/ml、至少10500U/ml、至少11000U/ml、至少12000U/ml、至少13000U/ml、至少14000U/ml、至少15000U/ml、至少16000U/ml、至少17000U/ml、至少18000U/ml、至少19000U/ml、至少20000U/ml、至少21000U/ml、至少22000U/ml或至少23000U/ml胃蛋白酶。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中将所述α淀粉酶与胃蛋白酶一起温育至少2小时、至少2.5小时、至少3小时或至少3.5小时。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与所述α淀粉酶在不存在胃蛋白酶的情况下的活性相比较，在所述步骤ii)的测定后，所述α淀粉酶维持至少约80％活性。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述饲料添加物用于单胃动物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述单胃动物选自家禽、猪或鱼。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述饲料添加物用于家禽。
8.制备用于单胃动物的饲料添加物的方法，所述方法包括将胃蛋白酶耐受性α淀粉酶与至少一种选自如下的生理上可接受的载体混合：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1，3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述胃蛋白酶耐受性淀粉酶通过根据权利要求1至7中任一项所述的方法鉴定。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述胃蛋白酶耐受性淀粉酶具有如下氨基酸序列：
i)SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
ii)除一个或数个氨基酸添加/插入、缺失或置换外的SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
iii)与SEQ ID No.1具有至少85％同一性或与SEQ ID No.3具有至少70％同一性的氨基酸序列；
iv)由包含SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
vi)由与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4相差一个或数个核苷酸添加/插入、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vii)由与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4具有至少70％同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的方法，其中在与SEQ ID No.1进行缺口比对时，所述胃蛋白酶耐受性α淀粉酶包含选自如下的氨基酸中的任一者或多者：K88；I103；H133；Y175；Y290；F292；R442和H450，其中所述氨基酸编号方式涉及SEQ ID No.1。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述胃蛋白酶耐受性α淀粉酶包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；和
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)，
或者包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％或至少85％或至少90％同一性的氨基酸序列。
13.用于单胃动物的饲料添加物，所述饲料添加物包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶和至少一种选自如下的生理上可接受的载体：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1，3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。
14.根据权利要求13所述的饲料添加物，其中所述胃蛋白酶耐受性α淀粉酶通过根据权利要求1至7中任一项所述的方法鉴定。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的饲料添加物，其中所述胃蛋白酶耐受性淀粉酶具有如下氨基酸序列：
i)SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
ii)除一个或数个氨基酸添加/插入、缺失或置换外的SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
iii)与SEQ ID No.1具有至少85％同一性；或与SEQ ID No.3具有至少70％同一性的氨基酸序列；
iv)由包含SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
vi)由与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4相差一个或数个核苷酸添加/插入、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vii)由与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4具有至少70％同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。
16.根据权利要求13至权利要求15中任一项所述的饲料添加物，其中在与SEQ ID No.1进行缺口比对时，所述胃蛋白酶耐受性α淀粉酶包含选自如下的氨基酸中的任一者或多者：K88；I103；H133；Y175；Y290；F292；R442和H450，其中所述氨基酸编号方式涉及SEQ IDNo.1。
17.根据权利要求13或权利要求16中任一项所述的饲料添加物，其中所述胃蛋白酶耐受性α淀粉酶包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；和
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)
或者包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％或至少85％或至少90％同一性的氨基酸序列。
18.饲料添加物，所述饲料添加物包含胃蛋白酶耐受性木霉属(Trichoderma)α淀粉酶。
19.根据权利要求18所述的饲料添加物，其中所述α淀粉酶来自里氏木霉(Trichoderma reesei)。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的饲料添加物，其中所述α淀粉酶具有如下氨基酸序列：
i)SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
ii)除一个或数个氨基酸添加/插入、缺失或置换外的SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID No.3具有至少70％同一性的氨基酸序列；或
iv)由包含SEQ ID No.4的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.4的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
vi)由与SEQ ID No.4相差一个或数个核苷酸添加/插入、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vii)由与SEQ ID No.4具有至少70％同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。
21.根据权利要求13至20中任一项所述的饲料添加物，其中所述饲料添加物包含至少一种另外的饲料酶。
22.根据权利要求21所述的饲料添加物，其中所述至少一种另外的饲料酶选自：参与淀粉代谢、纤维降解、脂质代谢的饲料酶、参与糖原代谢的蛋白质或酶、乙酰酯酶类、氨肽酶类、淀粉酶类、阿拉伯糖酶类、阿拉伯呋喃糖苷酶类、羧肽酶类、过氧化氢酶类、纤维素酶类、几丁质酶类、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶类、表异构酶类、酯酶类、α-半乳糖苷酶类、β-葡聚糖酶类、葡聚糖裂解酶类、内切-β葡聚糖酶类、葡糖淀粉酶类、葡萄糖氧化酶类、包括β-葡糖苷酶在内的β-葡糖苷酶类、葡糖醛酸酶类、半纤维素酶类、己糖氧化酶类、水解酶类、转化酶类、异构酶类、漆酶类、裂解酶类、甘露糖苷酶类、氧化酶类、氧化还原酶类、果胶酸裂解酶类、果胶乙酰酯酶类、果胶解聚酶类、果胶甲基酯酶类、果胶分解酶类、过氧化物酶类、酚氧化酶类、多聚半乳糖醛酸酶类、蛋白酶类、鼠李糖-半乳糖醛酸酶类、核糖核酸酶类、奇异果甜蛋白、转移酶类、转运蛋白、转谷氨酰胺酶类、木聚糖酶类、内切-1，4-β-木聚糖酶(EC3.2.1.8)、己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC 1.1.3.5)、β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、果胶酶、纤维二糖水解酶、酸性磷酸酶类、包括3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26)在内的植酸酶类、脂解酶类、甘露聚糖酶以及它们的组合。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的饲料添加物，所述饲料添加物包含至少一种木聚糖酶和/或至少一种植酸酶和/或至少一种蛋白酶和/或至少一种脂解酶。
24.根据权利要求23所述的饲料添加物，其中所述至少一种木聚糖酶来自芽孢杆菌属(Bacillus)或木霉属，和/或所述至少一种植酸酶来自大肠杆菌或布丘氏菌属(Buttiauxella)，和/或所述至少一种蛋白酶来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，和/或所述至少一种脂解酶来自曲霉菌属物种(Aspergillus sp)。
25.家禽饲料添加物，所述家禽饲料添加物包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶。
26.根据权利要求25所述的饲料添加物，其中所述α淀粉酶具有如下氨基酸序列：
i)SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列；
ii)除一个或数个氨基酸添加/插入、缺失或置换外的SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列；
iii)与SEQ ID No.1具有至少85％同一性的氨基酸序列；或
iv)由包含SEQ ID No.2的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.2的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
vi)由与SEQ ID No.2相差一个或数个核苷酸添加/插入、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vii)由与SEQ ID No.2具有至少70％同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的饲料添加物，其中在与SEQID No.1进行缺口比对时，所述胃蛋白酶耐受性α淀粉酶包含选自如下的氨基酸中的任一者或多者：K88；I103；H133；Y175；Y290；F292；R442和H450，其中所述氨基酸编号方式涉及SEQ ID No.1。
28.根据权利要求25或权利要求27中任一项所述的饲料添加物，其中所述胃蛋白酶耐受性α淀粉酶包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；和
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)
或者包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％或至少85％或至少90％同一性的氨基酸序列。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的饲料添加物，其中所述饲料添加物包含至少一种另外的饲料酶。
30.根据权利要求29所述的饲料添加物，其中所述至少一种另外的饲料酶选自：参与淀粉代谢、纤维降解、脂质代谢的饲料酶、参与糖原代谢的蛋白质或酶、乙酰酯酶类、氨肽酶类、淀粉酶类、阿拉伯糖酶类、阿拉伯呋喃糖苷酶类、羧肽酶类、过氧化氢酶类、纤维素酶类、几丁质酶类、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶类、表异构酶类、酯酶类、α-半乳糖苷酶类、β-葡聚糖酶类、葡聚糖裂解酶类、内切-β葡聚糖酶类、葡糖淀粉酶类、葡萄糖氧化酶类、包括β-葡糖苷酶在内的β-葡糖苷酶类、葡糖醛酸酶类、半纤维素酶类、己糖氧化酶类、水解酶类、转化酶类、异构酶类、漆酶类、裂解酶类、甘露糖苷酶类、氧化酶类、氧化还原酶类、果胶酸裂解酶类、果胶乙酰酯酶类、果胶解聚酶类、果胶甲基酯酶类、果胶分解酶类、过氧化物酶类、酚氧化酶类、多聚半乳糖醛酸酶类、蛋白酶类、鼠李糖-半乳糖醛酸酶类、核糖核酸酶类、奇异果甜蛋白、转移酶类、转运蛋白、转谷氨酰胺酶类、木聚糖酶类、内切-1，4-β-木聚糖酶(EC3.2.1.8)、己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC 1.1.3.5)、β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、果胶酶、纤维二糖水解酶、酸性磷酸酶类、包括3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26)在内的植酸酶类、脂解酶类、甘露聚糖酶以及它们的组合。
31.根据权利要求29或权利要求30所述的饲料添加物，所述饲料添加物包含至少一种木聚糖酶和/或至少一种植酸酶和/或至少一种蛋白酶和/或至少一种脂解酶。
32.根据权利要求31所述的饲料添加物，其中所述至少一种木聚糖酶来自芽孢杆菌属或木霉属，和/或所述至少一种植酸酶来自大肠杆菌或布丘氏菌属，和/或所述至少一种蛋白酶来自枯草芽孢杆菌，和/或所述至少一种脂解酶来自曲霉菌属物种。
33.制备用于单胃动物的饲料的方法，所述方法包括将根据权利要求13至24中任一项所述的饲料添加物与一种或多种饲料材料混合。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述一种或多种饲料材料选自：a)谷类，例如小粒谷物(如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)得自诸如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白质、乳清、干椰肉、芝麻之类的来源的蛋白质；d)得自植物和动物来源的油和脂肪；以及e)矿物质和维生素；f)a)至e)中的任一者或多者的预混物。
35.制备用于家禽的饲料的方法，所述方法包括将根据权利要求25至32中任一项所述的饲料添加物与一种或多种饲料材料混合。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述一种或多种饲料材料选自：a)谷类，例如小粒谷物(如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)得自诸如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白质、乳清、干椰肉、芝麻之类的来源的蛋白质；d)得自植物和动物来源的油和脂肪；和e)矿物质和维生素。
37.用于单胃动物的饲料，所述饲料通过根据权利要求33或权利要求34所述的方法制备，或包含根据权利要求13至24中任一项所述的饲料添加物。
38.根据权利要求37所述的饲料，其中所述单胃动物是家禽和/或猪。
39.家禽饲料，所述家禽饲料通过根据权利要求35或权利要求36所述的方法制备，或包含根据权利要求25至32中任一项所述的饲料添加物。
40.根据权利要求37至39中任一项所述的饲料，其中所述饲料包含少于4000单位α淀粉酶/千克饲料。
41.饲料，所述饲料包含胃蛋白酶耐受性木霉属α淀粉酶。
42.根据权利要求41所述的饲料，其中所述α淀粉酶来自里氏木霉。
43.根据权利要求41或权利要求42所述的饲料，其中所述α淀粉酶具有如下氨基酸序列：
i)SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
ii)除一个或数个氨基酸添加/插入、缺失或置换外的SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID No.3具有至少70％同一性的氨基酸序列；或
iv)由包含SEQ ID No.4的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.4的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
vi)由与SEQ ID No.4相差一个或数个核苷酸添加/插入、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vii)由与SEQ ID No.4具有至少70％同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的饲料，所述饲料包含至多4000单位α淀粉酶/千克饲料。
45.包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的用于单胃动物的饲料，其中所述饲料包含少于3000单位的α淀粉酶/千克饲料。
46.根据权利要求45所述的饲料，其中所述α淀粉酶具有如下氨基酸序列：
i)SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
ii)除一个或数个氨基酸添加/插入、缺失或置换外的SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
iii)与SEQ ID No.1具有至少85％同一性；或与SEQ ID No.3具有至少70％同一性的氨基酸序列；
iv)由包含SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
vi)由与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4相差一个或数个核苷酸添加/插入、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vii)由与SEQ ID No.2或SEQ ID No.4具有至少70％同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。
47.根据权利要求46所述的饲料，其中在与SEQ ID No.1进行缺口比对时，所述胃蛋白酶耐受性α淀粉酶包含选自如下的氨基酸中的任一者或多者：K88；I103；H133；Y175；Y290；F292；R442和H450，其中所述氨基酸编号方式涉及SEQ ID No.1。
48.根据权利要求45或权利要求46所述的饲料，其中所述胃蛋白酶耐受性α淀粉酶包含如下氨基酸序列中的一者或多者：
i)SAIKSL(SEQ ID NO：7)；
ii)DVVINH(SEQ ID NO：8)；
iii)SGEHLI(SEQ ID NO：9)；
iv)NRIYKF(SEQ ID NO：10)；
v)PLHYQFHA(SEQ ID NO：11)；
vi)YVGRQN(SEQ ID NO：12)；和
vii)ETWHDI(SEQ ID NO：13)
或者包含与i)至vii)中的任一者具有至少80％或至少85％或至少90％同一性的氨基酸序列。
49.根据权利要求45至48中任一项所述的饲料，其中所述饲料包含至少一种另外的饲料酶。
50.根据权利要求49所述的饲料，其中所述至少一种另外的饲料酶选自：参与淀粉代谢、纤维降解、脂质代谢的饲料酶、参与糖原代谢的蛋白质或酶、乙酰酯酶类、氨肽酶类、淀粉酶类、阿拉伯糖酶类、阿拉伯呋喃糖苷酶类、羧肽酶类、过氧化氢酶类、纤维素酶类、几丁质酶类、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶类、表异构酶类、酯酶类、α-半乳糖苷酶类、β-葡聚糖酶类、葡聚糖裂解酶类、内切-β葡聚糖酶类、葡糖淀粉酶类、葡萄糖氧化酶类、包括β-葡糖苷酶在内的β-葡糖苷酶类、葡糖醛酸酶类、半纤维素酶类、己糖氧化酶类、水解酶类、转化酶类、异构酶类、漆酶类、裂解酶类、甘露糖苷酶类、氧化酶类、氧化还原酶类、果胶酸裂解酶类、果胶乙酰酯酶类、果胶解聚酶类、果胶甲基酯酶类、果胶分解酶类、过氧化物酶类、酚氧化酶类、多聚半乳糖醛酸酶类、蛋白酶类、鼠李糖-半乳糖醛酸酶类、核糖核酸酶类、奇异果甜蛋白、转移酶类、转运蛋白、转谷氨酰胺酶类、包括内切-1，4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)在内的木聚糖酶类、己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC 1.1.3.5)、β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、果胶酶、纤维二糖水解酶、酸性磷酸酶类、包括3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26)在内的植酸酶类、脂解酶类、甘露聚糖酶以及它们的组合。
51.根据权利要求50所述的饲料，所述饲料包含至少一种木聚糖酶和/或至少一种植酸酶和/或至少一种蛋白酶和/或至少一种脂解酶。
52.根据权利要求51所述的饲料，其中所述至少一种木聚糖酶来自芽孢杆菌属或木霉属，和/或所述至少一种植酸酶来自大肠杆菌或布丘氏菌属，和/或所述至少一种蛋白酶来自枯草芽孢杆菌，和/或所述至少一种脂解酶来自曲霉菌属物种。
53.根据权利要求37至52中任一项所述的饲料，所述饲料包含选自如下的一种或多种饲料材料：a)谷类，例如小粒谷物(如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)得自诸如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白质、乳清、干椰肉、芝麻之类的来源的蛋白质；d)得自植物和动物来源的油和脂肪；以及e)矿物质和维生素；f)a)至e)中的任一者或多者的预混物。
54.根据权利要求53所述的饲料，所述饲料包含至少一种低纤维饲料材料和/或所述至少一种低纤维饲料材料的至少一种副产物以提供低纤维饲料，所述低纤维饲料材料选自玉米、小麦、动物副产物粉和大豆。
55.根据权利要求54所述的饲料，所述饲料包含至少一种高纤维饲料材料和/或所述至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物以提供高纤维饲料，所述高纤维饲料材料选自小麦、大麦、裸麦、燕麦，来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣。
56.根据权利要求53至55中任一项所述的饲料，所述饲料包含至少30重量％、至少40重量％、至少50重量％或至少60重量％的玉米和大豆粉或玉米和全脂大豆。
57.用于饲料添加物和/或饲料中的α淀粉酶，其中在100,000U/ml胃蛋白酶的存在下，所述α淀粉酶基本上维持α淀粉酶活性。
58.根据权利要求57所述的淀粉酶，其中所述淀粉酶具有如下氨基酸序列：
i)SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列，或
ii)除一个或数个氨基酸添加/插入、缺失或置换外的SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列；
iii)与SEQ ID No.3具有至少70％同一性的氨基酸序列；或
iv)由包含SEQ ID No.4的序列的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；
v)由由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.4的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vi)由与SEQ ID No.4相差一个或数个核苷酸添加/插入、缺失或置换的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列；或
vii)由与SEQ ID No.4具有至少70％同一性的核苷酸序列表达而产生的氨基酸序列。
59.用于单胃动物的饲料添加物，其中所述饲料包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶以改善动物性能。
60.增加家禽或猪的增重的方法，所述方法包括给所述家禽或猪饲喂包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的饲料。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述饲料导致内源性α淀粉酶mRNA的表达减少。
62.胃蛋白酶耐受性α淀粉酶用于减少动物中的内源性α淀粉酶表达的用途。
63.包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶的饲料添加物用于改善动物性能和/或增加能量吸收和/或饲料功效和/或用于改善饲料中的原材料消化率(例如营养物消化率，如淀粉消化率)和/或用于改善饲料转化率(FCR)和/或用于改善动物的增重的用途。
64.根据权利要求63所述的用途，其中所述饲料添加物包含根据权利要求13至32中任一项所述的饲料添加物。
65.预混物，所述预混物包含胃蛋白酶耐受性α淀粉酶和至少一种矿物质和/或至少一种维生素。
66.根据权利要求65所述的预混物，所述预混物包含根据权利要求13至32中任一项所述的饲料添加物。
67.方法，所述方法基本上如本文所述。
68.饲料添加物，所述饲料添加物基本上如本文所述。
69.饲料，所述饲料基本上如本文所述。
70.淀粉酶，其用于基本上如本文所述的饲料中。
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