JP6391601B2 - ペプシン耐性αアミラーゼおよびその使用 - Google Patents

ペプシン耐性αアミラーゼおよびその使用 Download PDF

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Description

本発明は、ペプシン耐性αアミラーゼに関する。より具体的には、本発明は、飼料補助剤及び飼料材料に使用されるペプシン耐性αアミラーゼを同定する方法、ペプシン耐性αアミラーゼを含む飼料補助剤及び飼料材料、その使用並びに飼料補助剤及び飼料材料に使用されるペプシン耐性αアミラーゼに関する。
任意の飼料補助剤を含めた、単胃動物によって摂取される飼料は、胃の中で酵素分解を伴う極めて酸性（ｐＨ２〜３）の環境にさらされる。この厳しい低ｐＨ環境の後には、小腸でのより中性の環境（ｐＨ６〜７）及びさらなる消化酵素（トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ）による分解が続く。
家禽及びブタは雑食性であり、機会があれば様々な種子、根、無機物及び昆虫を摂取することでその栄養要求を満たし得る。しかしながら、「菜食主義的な動物生産」に対する消費者の好みに応え、且つ家畜の工業生産に関連する飼料費を最小限に抑えるために、これらの動物に提供される飼料が、特に新生仔において、消化器系に最適なものであることはほとんどない。
例えば、小麦及び大麦などの一部の穀類の非デンプン性多糖（ＮＳＰ）画分は腸内で粘度が増し、栄養分が拡散しにくくなる。この抗栄養作用は、それぞれヘミセルロース重合体のキシラン及びβ−グルカンを断片化するキシラナーゼ及び／又はβ−グルカナーゼを添加することで低減され得る。
栄養分の利用率を改善する別の例は、植物のリン酸貯蔵物質であるフィチン酸の分解であり、フィチン酸は、動物が産生する酵素による加水分解を受けにくい。飼料にフィターゼを添加することによりフィチン酸からリン酸が確実に遊離し、それにより動物のリン酸要求を部分的又は全面的に賄うことができる。
従って、ある場合には外因性酵素が、飼料の性質と動物自身の消化酵素の相補性との隔たりを埋めることができる。しかしながら、研究からは、家禽及びブタの双方とも高い内因性アミラーゼ及びプロテアーゼ合成能力を有するものの、外因性酵素を使用して動物の消化を増強し、それにより畜産能力（ａｎｉｍａｌ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）を改善する機会がいまだあり得ることが示されている。
数ある補助剤の中でもα−アミラーゼは、飼料のデンプン利用の向上のため飼料に添加される。歴史的に、飼料に添加する特定のアミラーゼの量は、標準的なアミラーゼアッセイ、例えばタブレットアッセイ及び最近ではＫｏｎｅＬａｂアッセイを用いて決定されている。
特許文献１は、もっぱらウシ飼料に関し、細菌アミラーゼの使用を開示する。しかしながら、ウシの胃腸管内の条件は単胃動物のものと著しく異なり、及びウシ用飼料の組成は単胃動物用のものと著しく異なる。例えば、反芻動物に与えられるデンプンの大部分は、典型的なｐＨが５．０〜５．５である瘤胃内の微生物により代謝されるが、単胃動物では、内因性αアミラーゼがデンプンをグルコースに分解する。さらに、タンパク質の分解に関与するペプシンが、初めにウシ胃の四番目且つ最後の区画における皺胃に放出される。
特許文献２は、耐熱性α−アミラーゼを含む極めて特殊な乾燥ペットフードを開示する
。
国際公開第２００８／００６８８１号パンフレット 米国特許出願公開第２００８−０２０６４０１号明細書
従って、飼料材料に使用されるα−アミラーゼであって、畜産能力の向上を提供し、及び／又は畜産能力に有害な作用を及ぼすことなしにαアミラーゼの使用量の低減を可能にするα−アミラーゼを同定することが必要とされている。
本発明は、ペプシン耐性を有するαアミラーゼが、畜産能力の向上をもたらし、及び／又はαアミラーゼの使用量の低減を可能にするため、飼料、例えば単胃動物用飼料において特に有用であるという本発明者の意外な発見に基づく。
ペプシンは、動物により消化器系の最初の部分で排出される消化性プロテアーゼである。ペプシンはタンパク質を分解し、それによりそのタンパク質が栄養分として動物に利用可能になる。外因性酵素、すなわち飼料に添加される酵素もまたタンパク質であり、ペプシンによる分解を受けやすい場合には分解される。ほとんどの場合に、これが酵素活性を破壊する。
いかなる理論による拘束も望むものではないが、本発明者は、ペプシン耐性αアミラーゼ酵素により、回腸で高い活性を有してデンプン代謝物の取り込みの向上を可能にする酵素がもたらされ得るという仮説を立てる。さらに、ペプシン耐性酵素の活性が高まることにより、内因性αアミラーゼの産生が低下し、従って飼料効率が高まり得る。
本発明の広義の態様によれば、飼料補助剤に使用されるペプシン耐性αアミラーゼ酵素の同定方法であって、
ｉ）αアミラーゼ酵素を提供するステップと、
ｉｉ）前記αアミラーゼをトウモロコシベースの飼料及びペプシンと混合し、ｐＨ３でインキュベートし、及び対照試料と比較した前記αアミラーゼのαアミラーゼ活性を分析するステップであって；前記対照試料はｐＨ３でのインキュベーション中にペプシンが存在しない点が異なる、ステップと、
ｉｉｉ）アッセイ条件下で実質的にαアミラーゼ活性を維持するαアミラーゼ酵素を選択するステップと、
を含む方法が提供される。
「実質的にαアミラーゼ活性を維持する」とは、本明細書に詳述されるペプシン耐性アッセイに供されるαアミラーゼが、ペプシンの非存在下における酵素の活性と比較したとき、少なくとも約７５％の酵素活性、例えば約７５％〜１２５％の酵素活性を保つことを意味する。従って、「実質的にαアミラーゼ活性を維持する」αアミラーゼは、少なくとも９０００Ｕ／ｍｌのペプシンと共にトウモロコシベースの飼料の存在下に少なくとも２時間ｐＨ３でインキュベートすると、トウモロコシベースの飼料と共に同じ時間（すなわち少なくとも２時間）且つ同じｐＨ（すなわちｐＨ３）でインキュベートしたときの同じ酵素と比較して、少なくとも約７５％（例えば７５〜１２５％）の活性を保つ。
「ペプシン耐性αアミラーゼ」とは、本明細書に詳述されるとおりのペプシン耐性アッ
セイに供されたとき、少なくとも約７５％（例えば約７５％〜１２５％）の活性を保つαアミラーゼを意味する。
理論による拘束を望むものではないが、本発明者は、意外にも、α−アミラーゼのペプシン耐性が、動物の胃腸管を通過する間に実質的に活性を維持するαアミラーゼの実現における鍵であることを見出した。従って、ペプシン耐性α−アミラーゼは従来のα−アミラーゼと比較して低用量で使用することができ、飼料のデンプン利用が向上し得る。
本発明の別の態様において、単胃動物用の飼料補助剤の調製方法であって、ペプシン耐性αアミラーゼを、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギ又はコムギ成分、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、安息香酸塩、ソルビエート（ｓｏｒｂｉａｔｅ）、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、グルコース、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩及びそれらの混合物の少なくとも１つから選択される少なくとも１つの生理学的に許容可能な担体と混合するステップを含む方法が提供される。
本発明のさらなる態様において、ペプシン耐性αアミラーゼと、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギ又はコムギ成分、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、安息香酸塩、ソルビエート（ｓｏｒｂｉａｔｅ）、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、グルコース、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩及びそれらの混合物の少なくとも１つから選択される少なくとも１つの生理学的に許容可能な担体とを含む単胃動物用の飼料補助剤が提供される。
本発明の別の態様において、ペプシン耐性トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えばトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ））αアミラーゼを含む飼料補助剤及び／又は飼料材料が提供される。
本発明者は、意外にも、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えばトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ））由来のα−アミラーゼが、飼料に使用するのに特に有効であり、且つ意外にもペプシン耐性であることを見出した。
さらなる態様において、本発明は、ペプシン耐性αアミラーゼを含む家禽用飼料補助剤及び／又は飼料材料を提供する。
本発明の別の態様によれば、１）本発明の飼料補助剤を１つ以上の飼料原料と混合するステップを含む単胃動物用の飼料材料の調製方法；及び２）前記方法により調製される飼料材料が提供される。
本発明はさらに、ペプシン耐性αアミラーゼを含む単胃動物用の飼料材料であって、飼料１キログラム当たり３０００単位未満のαアミラーゼ、好ましくは飼料１キログラム当たり２８００単位未満、又は２６００単位未満、又は２４００単位未満又は２２００単位未満又は２１００単位未満又は２０００単位未満のαアミラーゼを含む飼料材料を提供する。
１アミラーゼＵが、ｐＨ６．５及び３７℃で水不溶性架橋デンプン高分子基質から毎分１ｍｍｏｌのグルコシド結合を解離する酵素の量であることは理解されるであろう。
別の態様において、本発明は、飼料補助剤及び／又は飼料材料に使用されるαアミラーゼであって、１０００００Ｕ／ｍｌのペプシンの存在下でインキュベートした後に実質的にαアミラーゼ活性を維持するαアミラーゼを提供する。ペプシン単位は以下の実施例に定義する。
本発明はさらに、単胃動物用の飼料補助剤及び／又は飼料材料であって、畜産能力を改善し、及び／又はエネルギー吸収／飼料効率を高めるためペプシン耐性αアミラーゼを含む飼料補助剤及び／又は飼料材料；家禽及び／又はブタの体重増加を増進する方法であって、前記家禽及び／又はブタにペプシン耐性αアミラーゼを含む飼料材料を与えるステップを含む方法、及び動物における内因性αアミラーゼの発現を低下させるためのペプシン耐性αアミラーゼの使用、並びに実質的に本明細書に記載されるとおりの方法、飼料補助剤、飼料材料及び飼料材料に使用されるアミラーゼを提供する。
本発明の別の態様において、畜産能力を改善し、及び／又はエネルギー吸収及び／又は飼料効率を高めるための、及び／又は飼料中の原材料の消化率（例えばデンプン消化率などの栄養分消化率）を改善するための、及び／又は飼料転換率（ＦＣＲ）を改善するための、及び／又は動物の体重増加を改善するための、ペプシン耐性αアミラーゼを含む飼料補助剤の使用が提供される。
本発明のさらに別の態様において、ペプシン耐性αアミラーゼを含む（又はそれから本質的になる、又はそれからなる）飼料補助組成物と、少なくとも１つのミネラル及び／又は少なくとも１つのビタミンとを含むプレミックスが提供される。
一態様において、本発明は、飼料補助剤に使用されるペプシン耐性αアミラーゼ酵素の同定方法であって、
ｉ）αアミラーゼ酵素を提供するステップと、
ｉｉ）前記αアミラーゼをトウモロコシベースの飼料と混合し、ｐＨ３でインキュベートし、及び対照試料と比較した前記αアミラーゼのαアミラーゼ活性を分析するステップであって、前記対照試料はｐＨ３でのインキュベーション中にペプシンが存在しない点が異なる、ステップと、
ｉｉｉ）アッセイ条件下で実質的にαアミラーゼ活性を維持するαアミラーゼ酵素を選択するステップと、
を含む方法に関する。
好適には、ステップｉｉ）におけるペプシンのレベルは、少なくとも約９０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも約１００００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１０５００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１１０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１２０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１３０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１４０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１５０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１６０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１７０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１８０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１９０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも２００００Ｕ／ｍｌ、少なくとも２１０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも２２０００Ｕ／ｍｌ又は少なくとも２３０００Ｕ／ｍｌのペプシンである。
αアミラーゼは、ペプシンと共に少なくとも２時間、少なくとも２．５時間、少なくとも３時間又は少なくとも３．５時間インキュベートされ得る。好ましくは、アミラーゼはペプシンと共に６時間未満インキュベートされる。
一実施形態において、αアミラーゼはペプシンと共に約２〜約６時間、好ましくは約２〜約４時間又は約２時間インキュベートされる。
好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と
比較して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の活性を保ち得る。好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でのその活性と比較して、約８０〜１２０％、約８５〜１１５％、約９０〜１１０％、約９５〜１０５％、約９６〜１０４％、約９７〜１０３％、約９８〜１０２％、又は約９９〜１０１％を有し得る。αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、同じ活性を有し得る。
以下に記載する本発明の実施形態において、αアミラーゼは、好適には、配列番号１に示すとおりのαアミラーゼであり得る。好適には、配列番号１に示すとおりのαアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の活性を保ち得る。好適には、配列番号１に示すとおりのαアミラーゼは、ペプシンの非存在下でのその活性と比較して、約８０〜１２０％、約８５〜１１５％、約９０〜１１０％、約９５〜１０５％、約９６〜１０４％、約９７〜１０３％、約９８〜１０２％、又は約９９〜１０１％を有し得る。配列番号１に示すとおりのαアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、同じ活性を有し得る。
以下に記載する本発明のさらなる実施形態において、αアミラーゼは、好適には、配列番号３に示すとおりのαアミラーゼであり得る。好適には、配列番号３に示すとおりのαアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の活性を保ち得る。好適には、配列番号３に示すとおりのαアミラーゼは、ペプシンの非存在下でのその活性と比較して、約８０〜１２０％、約８５〜１１５％、約９０〜１１０％、約９５〜１０５％、約９６〜１０４％、約９７〜１０３％、約９８〜１０２％、又は約９９〜１０１％を有し得る。配列番号３に示すとおりのαアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、同じ活性を有し得る。
「ペプシンの非存在」とは、特別に添加されたペプシンがない（すなわち対照試料には外因性ペプシンが添加されない）ことを意味する。しかしながら、例えばトウモロコシベースの飼料中など、添加される他の構成成分中に痕跡量のペプシンが存在し得ることは容易に理解されるであろう。
飼料補助剤は、単胃動物用、例えば、家禽、ブタ、家庭用ペット又は魚類用であり得る。いくつかの態様において、単胃動物は好ましくは家禽である。
用語「飼料補助剤」及び「飼料添加剤」は、本明細書で使用されるとき、同義である。
本発明は、単胃動物用の飼料補助剤の調製方法であって、ペプシン耐性αアミラーゼを、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギ又はコムギ成分、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、安息香酸塩、ソルビエート（ｓｏｒｂｉａｔｅ）、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、グルコース、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩及びそれらの混合物の少なくとも１つから選択される少なくとも１つの生理学的に許容可能な担体と混合するステップを含む方法を提供する。
一実施形態において、本発明に係る飼料補助剤はプレミックスとして配合され得る。単
に例として、プレミックスは１つ以上の飼料成分、例えば１つ以上のミネラル及び／又は１つ以上のビタミンを含み得る。
ペプシン耐性アミラーゼは、本発明のペプシン耐性αアミラーゼ酵素の同定方法を用いて同定され得る。
好ましくは、ペプシン耐性アミラーゼは、
ｉ）配列番号１又は配列番号３に示されるとおりであるか；
ｉｉ）１つ又はいくつかのアミノ酸付加／挿入、欠失又は置換を除いては配列番号１又は配列番号３に示されるとおりであるか；
ｉｉｉ）配列番号１と少なくとも８５％（好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性又は配列番号３と少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するか；
ｉｖ）配列番号２又は配列番号４の配列を含むヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖ）遺伝子コードの縮重に起因して配列番号２又は配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖｉ）１つ又はいくつかのヌクレオチド付加／挿入、欠失又は置換だけ配列番号２又は配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；又は
ｖｉｉ）配列番号２又は配列番号４と少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列の発現により産生される
アミノ酸配列を有する。
ペプシン耐性αアミラーゼはまた、ストリンジェントな条件又は高度にストリンジェントな条件下で配列番号２又は配列番号４とハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
配列番号１とのギャップアラインメントで、本発明のペプシン耐性αアミラーゼは、好ましくは、Ｋ８８；Ｉ１０３；Ｈ１３３；Ｙ１７５；Ｙ２９０；Ｆ２９２；Ｒ４４２及びＨ４５０からなる群から選択されるアミノ酸のうちの任意の１つ以上を含み、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関する。
好適には、ペプシン耐性αアミラーゼは、以下のアミノ酸配列、すなわち、
ｉ）ＳＡＩＫＳＬ（配列番号７）；
ｉｉ）ＤＶＶＩＮＨ（配列番号８）；
ｉｉｉ）ＳＧＥＨＬＩ（配列番号９）；
ｉｖ）ＮＲＩＹＫＦ（配列番号１０）；
ｖ）ＰＬＨＹＱＦＨＡ（配列番号１１）；
ｖｉ）ＹＶＧＲＱＮ（配列番号１２）；及び
ｖｉｉ）ＥＴＷＨＤＩ（配列番号１３）
のうちの１つ以上を含んでもよく、又はｉ）〜ｖｉｉ）のいずれかと少なくとも８０％又は８５％又は９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
さらに、ペプシン耐性αアミラーゼは、以下のアミノ酸配列、すなわち、
ｉ）ＳＡＩＫＳＬ（配列番号７）；位置８５〜９０位
ｉｉ）ＤＶＶＩＮＨ（配列番号８）；位置１００〜１０５位
ｉｉｉ）ＳＧＥＨＬＩ（配列番号９）；位置１３０〜１３５位
ｉｖ）ＮＲＩＹＫＦ（配列番号１０）；位置１７２〜１７７位
ｖ）ＰＬＨＹＱＦＨＡ（配列番号１１）；位置２８７〜２９５位
ｖｉ）ＹＶＧＲＱＮ（配列番号１２）；位置４３９〜４４４位
ｖｉｉ）ＥＴＷＨＤＩ（配列番号１３）位置４４７〜４５２位
のうちの１つ以上を含んでもよく、又はｉ）〜ｖｉｉ）のいずれかと少なくとも８０％又は８５％又は９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関する。
ｉ）〜ｖｉｉ）の任意の組み合わせ及び／又は具体的に記載されるアミノ酸の任意の組み合わせが、本明細書に包含されることは理解されるであろう。
本発明は、ペプシン耐性αアミラーゼと、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギ又はコムギ成分、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、安息香酸塩、ソルビエート（ｓｏｒｂｉａｔｅ）、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、グルコース、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩及びそれらの混合物の少なくとも１つから選択される少なくとも１つの生理学的に許容可能な担体とを含む単胃動物用の飼料補助剤を提供し、それもまた提供される。好適には、本明細書に開示される任意のペプシン耐性αアミラーゼが用いられ得る。
好適には、ペプシン耐性αアミラーゼは、本明細書に開示されるペプシン耐性αアミラーゼ酵素の同定方法を用いて同定され得る。
好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の活性を保ち得る。好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でのその活性と比較して、約８０〜１２０％、約８５〜１１５％、約９０〜１１０％、約９５〜１０５％、約９６〜１０４％、約９７〜１０３％、約９８〜１０２％、又は約９９〜１０１％を有し得る。αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、同じ活性を有し得る。
好適には、ペプシン耐性αアミラーゼは、
ｉ）配列番号１に示されるとおりであるか；
ｉｉ）１つ又はいくつかのアミノ酸付加／挿入、欠失又は置換を除いては配列番号１に示されるとおりであるか；
ｉｉｉ）配列番号１と少なくとも８５％（好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するか；又は
ｉｖ）配列番号２の配列を含むヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖ）遺伝子コードの縮重に起因して配列番号２と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖｉ）１つ又はいくつかのヌクレオチド付加／挿入、欠失又は置換だけ配列番号２と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；若しくは
ｖｉｉ）配列番号２と少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列の発現により産生される
アミノ酸配列を有し得る。
配列番号１とのギャップアラインメントでのペプシン耐性αアミラーゼは、Ｋ８８；Ｉ１０３；Ｈ１３３；Ｙ１７５；Ｙ２９０；Ｆ２９２；Ｒ４４２及びＨ４５０からなる群か
ら選択されるアミノ酸のうちの任意の１つ以上を含んでもよく、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関し、及び／又は以下のアミノ酸配列、すなわち、
ｉ）ＳＡＩＫＳＬ（配列番号７）；
ｉｉ）ＤＶＶＩＮＨ（配列番号８）；
ｉｉｉ）ＳＧＥＨＬＩ（配列番号９）；
ｉｖ）ＮＲＩＹＫＦ（配列番号１０）；
ｖ）ＰＬＨＹＱＦＨＡ（配列番号１１）；
ｖｉ）ＹＶＧＲＱＮ（配列番号１２）；及び
ｖｉｉ）ＥＴＷＨＤＩ（配列番号１３）
のうちの１つ以上を含んでもよく、又はｉ）〜ｖｉｉ）のいずれかと少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
さらに、ペプシン耐性αアミラーゼは、以下のアミノ酸配列、すなわち、
ｉ）ＳＡＩＫＳＬ（配列番号７）；位置８５〜９０位
ｉｉ）ＤＶＶＩＮＨ（配列番号８）；位置１００〜１０５位
ｉｉｉ）ＳＧＥＨＬＩ（配列番号９）；位置１３０〜１３５位
ｉｖ）ＮＲＩＹＫＦ（配列番号１０）；位置１７２〜１７７位
ｖ）ＰＬＨＹＱＦＨＡ（配列番号１１）；位置２８７〜２９５位
ｖｉ）ＹＶＧＲＱＮ（配列番号１２）；位置４３９〜４４４位
ｖｉｉ）ＥＴＷＨＤＩ（配列番号１３）位置４４７〜４５２位
のうちの１つ以上を含んでもよく、又はｉ）〜ｖｉｉ）のいずれかと少なくとも８０％又は８５％又は９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関する。
ｉ）〜ｖｉｉ）の任意の組み合わせ及び／又は具体的に記載されるアミノ酸の任意の組み合わせが、本明細書に包含されることは理解されるであろう。
単胃動物が家禽である場合、ペプシン耐性αアミラーゼを含む飼料が摂取された後、ペプシン耐性αアミラーゼがペプシン耐性を少なくとも２〜４時間にわたり実質的に維持することが有利である。
単胃動物がブタである場合、ペプシン耐性αアミラーゼを含む飼料が摂取された後、ペプシン耐性αアミラーゼがペプシン耐性を少なくとも２〜６時間にわたり実質的に維持することが有利である。
本発明はまた、単胃動物用の飼料材料の調製方法であって、本発明の飼料補助剤又は本発明の方法により同定されるペプシン耐性αアミラーゼを１つ以上の飼料原料と混合するステップを含む方法も提供する。
好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の活性を保ち得る。好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でのその活性と比較して、約８０〜１２０％、約８５〜１１５％、約９０〜１１０％、約９５〜１０５％、約９６〜１０４％、約９７〜１０３％、約９８〜１０２％、又は約９９〜１０１％を有し得る。αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、同じ活性を有し得る。
好適には、ペプシン耐性αアミラーゼは、
ｉ）配列番号１に示されるとおりであるか；
ｉｉ）１つ又はいくつかのアミノ酸付加／挿入、欠失又は置換を除いては配列番号１に示されるとおりであるか；
ｉｉｉ）配列番号１と少なくとも８５％（好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するか；又は
ｉｖ）配列番号２の配列を含むヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖ）遺伝子コードの縮重に起因して配列番号２と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖｉ）１つ又はいくつかのヌクレオチド付加／挿入、欠失又は置換だけ配列番号２と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；若しくは
ｖｉｉ）配列番号２と少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列の発現により産生される
アミノ酸配列を有し得る。
配列番号１とのギャップアラインメントでのペプシン耐性αアミラーゼは、Ｋ８８；Ｉ１０３；Ｈ１３３；Ｙ１７５；Ｙ２９０；Ｆ２９２；Ｒ４４２及びＨ４５０からなる群から選択されるアミノ酸のうちの任意の１つ以上を含んでもよく、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関し、及び／又は以下のアミノ酸配列、すなわち、
ｉ）ＳＡＩＫＳＬ（配列番号７）；
ｉｉ）ＤＶＶＩＮＨ（配列番号８）；
ｉｉｉ）ＳＧＥＨＬＩ（配列番号９）；
ｉｖ）ＮＲＩＹＫＦ（配列番号１０）；
ｖ）ＰＬＨＹＱＦＨＡ（配列番号１１）；
ｖｉ）ＹＶＧＲＱＮ（配列番号１２）；及び
ｖｉｉ）ＥＴＷＨＤＩ（配列番号１３）
のうちの１つ以上を含んでもよく、又はｉ）〜ｖｉｉ）のいずれかと少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
さらに、ペプシン耐性αアミラーゼは、以下のアミノ酸配列、すなわち、
ｉ）ＳＡＩＫＳＬ（配列番号７）；位置８５〜９０位
ｉｉ）ＤＶＶＩＮＨ（配列番号８）；位置１００〜１０５位
ｉｉｉ）ＳＧＥＨＬＩ（配列番号９）；位置１３０〜１３５位
ｉｖ）ＮＲＩＹＫＦ（配列番号１０）；位置１７２〜１７７位
ｖ）ＰＬＨＹＱＦＨＡ（配列番号１１）；位置２８７〜２９５位
ｖｉ）ＹＶＧＲＱＮ（配列番号１２）；位置４３９〜４４４位
ｖｉｉ）ＥＴＷＨＤＩ（配列番号１３）位置４４７〜４５２位
のうちの１つ以上を含んでもよく、又はｉ）〜ｖｉｉ）のいずれかと少なくとも８０％又は８５％又は９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関する。
ｉ）〜ｖｉｉ）の任意の組み合わせ及び／又は具体的に記載されるアミノ酸の任意の組み合わせが、本明細書に包含されることは理解されるであろう。
いくつかの実施形態において、前記飼料補助剤／ペプシン耐性αアミラーゼは、畜産能力を改善し、及び／又はエネルギー吸収／飼料効率を高め、及び／又はより低い飼料転換率及び／又は動物の体重増加を提供し、及び／又は飼料中の栄養分の消化率（例えばデンプン消化率）及び／又は飼料における可消化エネルギー若しくは代謝エネルギーによる。
任意の飼料原料が用いられ得る。好適には、以下の飼料原料の任意の１つ以上を用いることができる、すなわち、ａ）穀類、例えば、小粒穀類（例えば、小麦、大麦、ライ麦、
オート麦及びそれらの組み合わせ）及び／又はトウモロコシ若しくはソルガムなどの大粒穀類；ｂ）穀類の副産物、例えば、コーングルテンミール、乾燥醸造粕（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ Ｄｒｉｅｄ Ｇｒａｉｎ Ｓｏｌｕｂｌｅｓ：ＤＤＧＳ）、小麦ふすま、小麦ミドリング粉、小麦ショーツ、米糠、米の籾殻、オート麦の籾殻、パーム核油、及び柑橘パルプ；ｃ）ソーヤ、ヒマワリ、ピーナッツ、ルピナス、エンドウ豆、ソラ豆、綿、キャノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉骨粉、ジャガイモタンパク質、乳清、コプラ、ゴマなどの原料から得られるタンパク質；ｄ）植物源及び動物源から得られる油及び脂肪；ｅ）ミネラル及びビタミン ｆ）ａ）〜ｄ）の任意の１つ以上のプレミックス。
好適には、本明細書において参照されるとおりのプレミックスは、ビタミン、ミネラル、化学防腐剤、抗生物質、発酵産物、及び他の必須成分などの微成分から構成される組成物であり得る。プレミックスは、通常、ブレンドして商業的な規定飼料にするのに好適な組成物である。
好ましい実施形態において、飼料材料は、飼料１キログラム当たり４０００単位未満、３０００単位未満、２０００単位未満、１９００単位未満、１８００単位未満、１７００単位未満、１６００単位未満、１５００単位未満、１４００単位未満、１３００単位未満、１２００単位未満、１１００単位未満、１０００単位未満、９００単位未満、８００単位未満、７００単位未満、６００単位未満、５００単位未満、又は約４００単位未満のαアミラーゼを含み得る。
本発明はさらに、本発明の飼料補助剤又は本発明の方法によって同定されるペプシン耐性αアミラーゼを１つ以上の飼料原料と混合するステップを含む方法により調製される単胃動物用の飼料材料を提供する。
好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の活性を保ち得る。好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でのその活性と比較して、約８０〜１２０％、約８５〜１１５％、約９０〜１１０％、約９５〜１０５％、約９６〜１０４％、約９７〜１０３％、約９８〜１０２％、又は約９９〜１０１％を有し得る。αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、同じ活性を有し得る。
好適には、ペプシン耐性αアミラーゼは、
ｉ）配列番号１に示されるとおりであるか；
ｉｉ）１つ又はいくつかのアミノ酸付加／挿入、欠失又は置換を除いては配列番号１に示されるとおりであるか；
ｉｉｉ）配列番号１と少なくとも８５％（好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するか；又は
ｉｖ）配列番号２の配列を含むヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖ）遺伝子コードの縮重に起因して配列番号２と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖｉ）１つ又はいくつかのヌクレオチド付加／挿入、欠失又は置換だけ配列番号２と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；若しくは
ｖｉｉ）配列番号２と少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列の発現により産生される
アミノ酸配列を有し得る。
配列番号１とのギャップアラインメントでのペプシン耐性αアミラーゼは、Ｋ８８；Ｉ１０３；Ｈ１３３；Ｙ１７５；Ｙ２９０；Ｆ２９２；Ｒ４４２及びＨ４５０からなる群から選択されるアミノ酸のうちの任意の１つ以上を含んでもよく、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関し、及び／又は以下のアミノ酸配列
ｉ）ＳＡＩＫＳＬ（配列番号７）；
ｉｉ）ＤＶＶＩＮＨ（配列番号８）；
ｉｉｉ）ＳＧＥＨＬＩ（配列番号９）；
ｉｖ）ＮＲＩＹＫＦ（配列番号１０）；
ｖ）ＰＬＨＹＱＦＨＡ（配列番号１１）；
ｖｉ）ＹＶＧＲＱＮ（配列番号１２）；及び
ｖｉｉ）ＥＴＷＨＤＩ（配列番号１３）
のうちの１つ以上を含んでもよく、又はｉ）〜ｖｉｉ）のいずれかと少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
さらに、ペプシン耐性αアミラーゼは、以下のアミノ酸配列
ｉ）ＳＡＩＫＳＬ（配列番号７）；位置８５〜９０位
ｉｉ）ＤＶＶＩＮＨ（配列番号８）；位置１００〜１０５位
ｉｉｉ）ＳＧＥＨＬＩ（配列番号９）；位置１３０〜１３５位
ｉｖ）ＮＲＩＹＫＦ（配列番号１０）；位置１７２〜１７７位
ｖ）ＰＬＨＹＱＦＨＡ（配列番号１１）；位置２８７〜２９５位
ｖｉ）ＹＶＧＲＱＮ（配列番号１２）；位置４３９〜４４４位
ｖｉｉ）ＥＴＷＨＤＩ（配列番号１３）位置４４７〜４５２位
のうちの１つ以上を含んでもよく、又はｉ）〜ｖｉｉ）のいずれかと少なくとも８０％又は８５％又は９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関する。
ｉ）〜ｖｉｉ）の任意の組み合わせ及び／又は具体的に記載されるアミノ酸の任意の組み合わせが、本明細書に包含されることは理解されるであろう。
好ましい実施形態において、飼料材料は、飼料１キログラム当たり４０００単位未満、３０００単位未満、２０００単位未満、１９００単位未満、１８００単位未満、１７００単位未満、１６００単位未満、１５００単位未満、１４００単位未満、１３００単位未満、１２００単位未満、１１００単位未満、１０００単位未満、９００単位未満、８００単位未満、７００単位未満、６００単位未満、５００単位未満、又は約４００単位未満のαアミラーゼを含み得る。
いくつかの実施形態において前記飼料補助剤は、畜産能力を改善し、及び／又はエネルギー吸収／飼料効率を高め、及び／又はより低い飼料転換率及び／又は動物の体重増加を提供し、及び／又は飼料中の栄養分の消化率（例えばデンプン消化率）及び／又は飼料における可消化エネルギー若しくは代謝エネルギーによる。
本発明はまた、ペプシン耐性αアミラーゼを含む家禽用飼料補助剤及び／又は飼料材料も提供する。本明細書に開示される任意のペプシン耐性αアミラーゼなど、任意のペプシン耐性αアミラーゼを用い得る。好適には、ペプシン耐性αアミラーゼは、
ｉ）配列番号１に示されるとおりであるか；
ｉｉ）１つ又はいくつかのアミノ酸付加／挿入、欠失又は置換を除いては配列番号１に示されるとおりであるか；
ｉｉｉ）配列番号１と少なくとも８５％（好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するか；又は
ｉｖ）配列番号２の配列を含むヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖ）遺伝子コードの縮重に起因して配列番号２と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖｉ）１つ又はいくつかのヌクレオチド付加／挿入、欠失又は置換だけ配列番号２と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；若しくは
ｖｉｉ）配列番号２と少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列の発現により産生される
アミノ酸配列を有し得る。
配列番号１とのギャップアラインメントでのペプシン耐性αアミラーゼは、Ｋ８８；Ｉ１０３；Ｈ１３３；Ｙ１７５；Ｙ２９０；Ｆ２９２；Ｒ４４２及びＨ４５０からなる群から選択されるアミノ酸のうちの任意の１つ以上を含んでもよく、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関し、及び／又は以下のアミノ酸配列
ｉ）ＳＡＩＫＳＬ（配列番号７）；
ｉｉ）ＤＶＶＩＮＨ（配列番号８）；
ｉｉｉ）ＳＧＥＨＬＩ（配列番号９）；
ｉｖ）ＮＲＩＹＫＦ（配列番号１０）；
ｖ）ＰＬＨＹＱＦＨＡ（配列番号１１）；
ｖｉ）ＹＶＧＲＱＮ（配列番号１２）；及び
ｖｉｉ）ＥＴＷＨＤＩ（配列番号１３）
のうちの１つ以上を含んでもよく、又はｉ）〜ｖｉｉ）のいずれかと少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
さらに、ペプシン耐性αアミラーゼは、以下のアミノ酸配列
ｉ）ＳＡＩＫＳＬ（配列番号７）；位置８５〜９０位
ｉｉ）ＤＶＶＩＮＨ（配列番号８）；位置１００〜１０５位
ｉｉｉ）ＳＧＥＨＬＩ（配列番号９）；位置１３０〜１３５位
ｉｖ）ＮＲＩＹＫＦ（配列番号１０）；位置１７２〜１７７位
ｖ）ＰＬＨＹＱＦＨＡ（配列番号１１）；位置２８７〜２９５位
ｖｉ）ＹＶＧＲＱＮ（配列番号１２）；位置４３９〜４４４位
ｖｉｉ）ＥＴＷＨＤＩ（配列番号１３）位置４４７〜４５２位
のうちの１つ以上を含んでもよく、又はｉ）〜ｖｉｉ）のいずれかと少なくとも８０％又は８５％又は９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関する。
ｉ）〜ｖｉｉ）の任意の組み合わせ及び／又は具体的に記載されるアミノ酸の任意の組み合わせが、本明細書に包含されることは理解されるであろう。
理論による拘束を望むものではないが、上記の記載されるアミノ酸及び配列の１つ以上が、αアミラーゼ酵素にペプシン耐性を付与する役割を果たし得る。
好ましい実施形態において、飼料材料は、飼料１キログラム当たり４０００単位未満、３０００単位未満、２０００単位未満、１９００単位未満、１８００単位未満、１７００単位未満、１６００単位未満、１５００単位未満、１４００単位未満、１３００単位未満、１２００単位未満、１１００単位未満、１０００単位未満、９００単位未満、８００単位未満、７００単位未満、６００単位未満、５００単位未満、又は約４００単位未満のαアミラーゼを含み得る。
好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも
約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の活性を保ち得る。好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でのその活性と比較して、約８０〜１２０％、約８５〜１１５％、約９０〜１１０％、約９５〜１０５％、約９６〜１０４％、約９７〜１０３％、約９８〜１０２％、又は約９９〜１０１％を有し得る。αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、同じ活性を有し得る。
いくつかの実施形態において前記飼料補助剤は、畜産能力を改善し、及び／又はエネルギー吸収／飼料効率を高め、及び／又はより低い飼料転換率及び／又は動物の体重増加を提供し、及び／又は飼料中の栄養分の消化率（例えばデンプン消化率）及び／又は飼料における可消化エネルギー若しくは代謝エネルギーによる。
本発明は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）αアミラーゼを含む飼料補助剤及び／又は飼料材料を提供する。本発明はまた、ペプシン耐性トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）αアミラーゼを含む飼料補助剤及び／又は飼料材料も提供する。任意のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）αアミラーゼを用い得る。好適には、αアミラーゼはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来であり得る。
αアミラーゼは、
ｉ）配列番号３に示されるとおりであるか；
ｉｉ）１つ又はいくつかのアミノ酸付加／挿入、欠失又は置換を除いては配列番号３に示されるとおりであるか；
ｉｉ）配列番号３と少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するか；又は
ｉｖ）配列番号４の配列を含むヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖ）遺伝子コードの縮重に起因して配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖｉ）１つ又はいくつかのヌクレオチド付加／挿入、欠失又は置換だけ配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；若しくは
ｖｉｉ）配列番号４と少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列の発現により産生される
アミノ酸配列を有し得る。
好ましい実施形態において、飼料材料は、飼料１キログラム当たり４０００単位未満、３０００単位未満、２０００単位未満、１９００単位未満、１８００単位未満、１７００単位未満、１６００単位未満、１５００単位未満、１４００単位未満、１３００単位未満、１２００単位未満、１１００単位未満、１０００単位未満、９００単位未満、８００単位未満、７００単位未満、６００単位未満、５００単位未満、又は約４００単位未満のαアミラーゼを含み得る。
好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の活性を保ち得る。好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でのその活性と比較して、約８０〜１２０％、約８５〜１１５％、約９０〜１１０％、約９５〜１０５％、約９６〜１０４％、約９７〜１０３％、約９８〜１０２％、又は約９９〜１０１％を有し得る。αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、同じ活性を有し得る。
いくつかの実施形態において前記飼料補助剤は、畜産能力を改善し、及び／又はエネルギー吸収／飼料効率を高め、及び／又はより低い飼料転換率及び／又は動物の体重増加を提供し、及び／又は飼料中の栄養分の消化率（例えばデンプン消化率）及び／又は飼料における可消化エネルギー若しくは代謝エネルギーによる。
本発明はさらに、畜産能力を改善し、及び／又はエネルギー吸収及び／又は飼料効率を高めるための、及び／又は飼料中の原材料の消化率（例えばデンプン消化率などの栄養分消化率）を改善するための、及び／又は飼料転換率（ＦＣＲ）を改善するための、及び／又は動物の体重増加を改善するための、本発明に係る飼料補助剤の使用を提供する。
本発明の別の態様において、ペプシン耐性αアミラーゼを含む単胃動物用の飼料材料であって、飼料１キログラム当たり３０００単位未満のαアミラーゼを含む飼料材料が提供される。好適には、飼料材料は、飼料１キログラム当たり２５００単位未満、２０００単位未満、１９００単位未満、１８００単位未満、１７００単位未満、１６００単位未満、１５００単位未満、１４００単位未満、１３００単位未満、１２００単位未満、１１００単位未満、１０００単位未満、９００単位未満、８００単位未満、７００単位未満、６００単位未満、５００単位未満、又は約４００単位未満のαアミラーゼを含み得る。
いくつかの実施形態において飼料材料は、畜産能力を改善し、及び／又はエネルギー吸収／飼料効率を高め、及び／又はより低い飼料転換率を提供する。
任意のペプシン耐性αアミラーゼが用いられ得る。好適には、
ｉ）配列番号１又は配列番号３に示されるとおりであるか；
ｉｉ）１つ又はいくつかのアミノ酸付加／挿入、欠失又は置換を除いては配列番号１又は配列番号３に示されるとおりであるか；
ｉｉｉ）配列番号１と少なくとも８５％（好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性；若しくは配列番号３と少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するか；
ｉｖ）配列番号２又は配列番号４の配列を含むヌクレオチド配列の発現により産生されるか
ｖ）遺伝子コードの縮重に起因して配列番号２又は配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖｉ）１つ又はいくつかのヌクレオチド付加／挿入、欠失又は置換だけ配列番号２又は配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；又は
ｖｉｉ）配列番号２又は配列番号４と少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列の発現により産生される
アミノ酸配列を有するペプシン耐性αアミラーゼを含めた、本明細書に開示される又は本発明の方法により同定される任意のペプシン耐性αアミラーゼを用いることができる。
好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の活性を保ち得る。好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でのその活性と比較して、約８０〜１２０％、約８５〜１１５％、約９０〜１１０％、約９５〜１０５％、約９６〜１０４％、約９７〜１０３％、約９８〜１０２％、又は約９９〜１０１％を有し得る。αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、同じ活性を有し得る。
本発明に係る飼料材料及び／又は飼料補助剤は、少なくとも１つのさらなる飼料酵素を含み得る。例えば、飼料材料及び／又は飼料補助剤は、デンプン代謝、繊維分解、脂質代謝に関わる酵素、グリコーゲン代謝に関わるタンパク質又は酵素、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−グルカナーゼ、グルカンリサーゼ（ｇｌｕｃａｎ ｌｙｓａｓｅ）、エンドグルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−グルコシダーゼを含むβ−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８）を含むキシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ２−オキシドレダクターゼ、ＥＣ １．１．３．５） β−グルカナーゼ、α−アミラーゼ、ペクチナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、酸性ホスファターゼ、３−フィターゼ（ＥＣ ３．１．３．８）又は６−フィターゼ（ＥＣ ３．１．３．２６）を含むフィターゼ、脂肪分解酵素、マンナナーゼ又はそれらの組み合わせを含み得る。これらには、例えば飼料の粘度を調節する酵素が含まれる。
好適には、本発明の飼料材料及び／又は飼料補助剤は、少なくとも１つのキシラナーゼ及び／又は少なくとも１つのフィターゼ及び／又は少なくとも１つのプロテアーゼ及び／又は少なくとも１つの脂肪分解酵素を含み得る。これらは任意の供給源由来であってよい。好適には、キシラナーゼはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来であってもよく；フィターゼは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はブティアウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）由来であってもよく；プロテアーゼはＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来であってもよく、及び脂肪分解酵素はアスペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）由来であってもよい。
用語「脂肪分解酵素」は、脂質基質に作用して遊離脂肪酸分子を遊離させる能力を有する酵素を指す。好ましくは、脂肪分解酵素は、脂質基質（特に、限定的ではないが、トリグリセリド、糖脂質及び／又はリン脂質）におけるエステル結合を加水分解して遊離脂肪酸分子を遊離させる能力を有する酵素である。好適には、本発明に使用される脂肪分解酵素は、ホスホリパーゼ活性（ホスホリパーゼＡ１活性（Ｅ．Ｃ． ３．１．１．３２）又はホスホリパーゼＡ２活性（Ｅ．Ｃ． ３．１．１．４）など；グリコリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ． ３．１．１．２６）、トリアシルグリセロール加水分解活性（Ｅ．Ｃ． ３．１．１．３）、脂質アシルトランスフェラーゼ活性（一般に、国際生化学分子生物学連合命名法委員会の１９９２年度勧告による酵素命名法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ（１９９２）ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ
ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）に従いＥ．Ｃ． ２．３．１．ｘに分類される）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される活性の１つ以上を有し得る。
好適には、本発明の飼料材料及び／又は飼料補助剤は、任意の供給源（Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）又はＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）など）由来のペプシン耐性αアミラーゼ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）又はトリコデルマ
属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来のキシラナーゼ；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はブティアウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）由来のフィターゼ；Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプロテアーゼ及びアスペルギルス・エスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）由来の脂肪分解酵素を含み得る。
本発明の任意の飼料材料は、ａ）穀類、例えば、小粒穀類（例えば、小麦、大麦、ライ麦、オート麦及びそれらの組み合わせ）及び／又はトウモロコシ若しくはソルガムなどの大粒穀類；ｂ）穀類の副産物、例えば、コーングルテンミール、乾燥醸造粕（ＤＤＧＳ）、小麦ふすま、小麦ミドリング粉、小麦ショーツ、米糠、米の籾殻、オート麦の籾殻、パーム核油、及び柑橘パルプ；ｃ）ソーヤ、ヒマワリ、ピーナッツ、ルピナス、エンドウ豆、ソラ豆、綿、キャノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉骨粉、ジャガイモタンパク質、乳清、コプラ、ゴマなどの原料から得られるタンパク質；ｄ）植物源及び動物源から得られる油及び脂肪；ｅ）ミネラル及びビタミンを含む群から選択される１つ以上の飼料原料を含み得る。
好適には、本発明の任意の飼料材料は、トウモロコシ、小麦、畜産副産物ミール又は大豆からなる群から選択される少なくとも１つの低繊維飼料原料及び／又は少なくとも１つの低繊維飼料原料の少なくとも１つの副産物を含むことにより、低繊維飼料材料を提供し得る。
本発明の任意の飼料材料は、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％又は少なくとも６０重量％のトウモロコシ及び大豆粕又はトウモロコシ及び高脂肪大豆を含み得る。
それに加えて又は代えて、本発明の任意の飼料材料は、少なくとも１つの高繊維飼料原料及び／又は少なくとも１つの高繊維飼料原料の少なくとも１つの副産物を含むことにより、高繊維飼料材料を提供し得る。高繊維飼料原料の例としては、小麦、大麦、ライ麦、オート麦、穀類の副産物、例えば、コーングルテンミール、乾燥醸造粕（ＤＤＧＳ）、小麦ふすま、小麦ミドリング粉、小麦ショーツ、米糠、米の籾殻、オート麦の籾殻、パーム核油、及び柑橘パルプが挙げられる。一部のタンパク質源、すなわち、ヒマワリ、ルピナス、ソラ豆及び綿などの原料から得られるタンパク質もまた、高繊維と見なされ得る。
本発明はさらに、飼料補助剤及び／又は飼料材料に使用されるαアミラーゼであって、１０００００Ｕ／ｍｌのペプシンの存在下でインキュベートした後に実質的にαアミラーゼ活性を維持するαアミラーゼを提供する。
好適にはαアミラーゼは、
ｉ）配列番号３に示されるとおりであるか、若しくは
ｉｉ）１つ又はいくつかのアミノ酸付加／挿入、欠失又は置換を除いては配列番号３に示されるとおりであるか；
ｉｉｉ）配列番号３と少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するか；又は
ｉｖ）配列番号４の配列を含むヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖ）遺伝子コードの縮重に起因して配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；若しくは
ｖｉ）１つ又はいくつかのヌクレオチド付加／挿入、欠失又は置換だけ配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；若しくは
ｖｉｉ）配列番号４と少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列の発現により産生される
アミノ酸配列を含み得る。
好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の活性を保ち得る。好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でのその活性と比較して、約８０〜１２０％、約８５〜１１５％、約９０〜１１０％、約９５〜１０５％、約９６〜１０４％、約９７〜１０３％、約９８〜１０２％、又は約９９〜１０１％を有し得る。αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、同じ活性を有し得る。
本発明はまた、単胃動物用の飼料材料であって、ペプシン耐性αアミラーゼを含むことにより畜産能力を改善し、及び／又はエネルギー吸収／飼料効率を高め、及び／又はより低い飼料転換率及び／又は動物の体重増加を提供する、及び／又は飼料中の栄養分の消化率（例えばデンプン消化率）及び／又は飼料における可消化エネルギー若しくは代謝エネルギーによる飼料材料も提供する。
本明細書で使用されるとき、「畜産能力」は、飼料効率及び／又は動物の成長率により、及び／又は飼料転換率及び／又は動物の体重増加により、及び／又は飼料中の栄養分の消化率（例えばデンプン消化率）及び／又は飼料における可消化エネルギー若しくは代謝エネルギーにより決定され得る。
好ましくは「畜産能力」は、飼料効率及び／又は動物の体重増加により、及び／又は飼料転換率により決定される。
「畜産能力の改善」とは、ペプシン耐性αアミラーゼを含まない飼料と比較して、飼料にペプシン耐性αアミラーゼを使用することによってもたらされる飼料効率の上昇、及び／又は成長率の上昇及び／又は飼料転換率の低下及び／又は動物の体重増加及び／又は飼料中の栄養分の消化率（例えばデンプン消化率）及び／又は飼料における可消化エネルギー若しくは代謝エネルギーによるものがあることを意味する。好ましい実施形態では、飼料効率、及び／又は成長率及び／又は飼料転換率及び／又は動物の体重増加及び／又は飼料中の栄養分の消化率（例えばデンプン消化率）及び／又は飼料における可消化エネルギー若しくは代謝エネルギーによるものの少なくとも１つが、ペプシン耐性αアミラーゼを含む飼料を与えられた動物において、ペプシン耐性αアミラーゼを含まない飼料を与えられた動物と比較したとき、少なくとも１％、例えば１．５％、例えば２．０％、例えば２．５％、例えば３．０％、例えば４％、例えば５％だけ改善される。
本明細書で使用されるとき、用語「飼料効率」は、動物が一定量の飼料を与えられたときに起こる動物の体重増加の大きさを指す。
「飼料効率の上昇」とは、飼料にペプシン耐性αアミラーゼを使用することにより、ペプシン耐性αアミラーゼが存在しない同量の飼料を与えた動物と比較して、動物への給餌時の体重増加が増進することを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「飼料転換率」は、動物の体重を一定量だけ増加させるために動物に与えられる飼料量を指す。
「より低い飼料転換率」とは、飼料にペプシン耐性αアミラーゼを使用することにより、動物の体重を一定の大きさだけ増加させるために動物に与える必要のある飼料量が、飼料がペプシン耐性αアミラーゼを含まない場合に動物の体重を同じ大きさだけ増加させる
ために必要な飼料量と比較して、少なくなることを意味する。
栄養分消化率は、本明細書で使用されるとき、胃腸管又は胃腸管の特定の部分、例えば小腸から消失する栄養分の割合を意味する。栄養分消化率は、対象に投与されるものと、対象の糞便中に出てくるものとの差、又は対象に投与されるものと、胃腸管の特定の部分、例えば回腸の消化管内容物中に残るものとの差として計測され得る。
栄養分消化率は、本明細書で使用されるとき、所定期間における栄養分の摂取量と、排泄物の全回収量を用いることによる排泄された栄養分との差により；又は動物によって吸収されず、且つ研究者による全胃腸管又は胃腸管の一部で消失した栄養分の量の計算を可能にする不活性マーカーを使用することで、計測されてもよい。かかる不活性マーカーは二酸化チタン、酸化クロム又は酸不溶性灰分であってもよい。消化率は、飼料中の栄養分の百分率として、又は飼料中の栄養分の質量単位当たりの可消化栄養分の質量単位として表現され得る。
栄養分消化率は、本明細書で使用されるとき、デンプン消化率を包含する。
エネルギー消化率は、本明細書で使用されるとき、摂取された飼料の総エネルギーから糞便の総エネルギーを引いたもの、又は摂取された飼料の総エネルギーから、動物の胃腸管の特定の部分、例えば回腸に残る消化管内容物の総エネルギーを引いたものを意味する。代謝エネルギーは、本明細書で使用されるとき、見かけの代謝エネルギーを指し、摂取された飼料の総エネルギーから、糞便、尿、及びガス状消化産物の中に含まれる総エネルギーを引いたものを意味する。エネルギー消化率及び代謝エネルギーは、総エネルギーの摂取量と、糞便中又は胃腸管の特定の部分に存在する消化管内容物中に排泄される総エネルギーとの差として、栄養分の消化率の計測と同じ方法を用いて計測され、ここで飼料の代謝エネルギーの計算には、窒素排泄物が適切に補正される。
用語の生存は、本明細書で使用されるとき、生存し続ける対象の数を意味する。用語「生存の改善」は、「死亡率の低減」の別の言い方であり得る。
用語の屠体収量は、本明細書で使用されるとき、商業的又は実験的な屠殺処理後における生体重の割合としての屠体の量を意味する。用語の屠体は、頭部、臓腑、肢の一部、及び羽毛又は皮膚が取り除かれた、食肉用に屠殺された動物の体を意味する。用語の肉収量は、本明細書で使用されるとき、生体重の割合としての食肉の量、又は生体重の割合としての特定のカット肉の量を意味する。
本発明はさらに、対象、例えば家禽又はブタの体重増加を増進する方法であって、前記対象に本発明に係る飼料添加組成物を含む飼料材料を与えるステップを含む方法を提供する。
「体重増加の増進」は、飼料添加組成物を含む飼料を与えたときに、前記飼料添加組成物が存在しない飼料を与えられた動物と比較して体重の増加を伴う動物を指す。
好適には、ペプシン耐性αアミラーゼは、
ｉ）配列番号１に示されるとおりであるか；
ｉｉ）１つ又はいくつかのアミノ酸付加／挿入、欠失又は置換を除いては配列番号１に示されるとおりであるか；
ｉｉｉ）配列番号１と少なくとも８５％（好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するか；又は
ｉｖ）配列番号２の配列を含むヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖ）遺伝子コードの縮重に起因して配列番号２と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖｉ）１つ又はいくつかのヌクレオチド付加／挿入、欠失又は置換だけ配列番号２と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；若しくは
ｖｉｉ）配列番号２と少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列の発現により産生される
アミノ酸配列を有し得る。
配列番号１とのギャップアラインメントでのペプシン耐性αアミラーゼは、Ｋ８８；Ｉ１０３；Ｈ１３３；Ｙ１７５；Ｙ２９０；Ｆ２９２；Ｒ４４２及びＨ４５０からなる群から選択されるアミノ酸のうちの任意の１つ以上を含んでもよく、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関し、及び／又は以下のアミノ酸配列、すなわち、
ｉ）ＳＡＩＫＳＬ（配列番号７）；
ｉｉ）ＤＶＶＩＮＨ（配列番号８）；
ｉｉｉ）ＳＧＥＨＬＩ（配列番号９）；
ｉｖ）ＮＲＩＹＫＦ（配列番号１０）；
ｖ）ＰＬＨＹＱＦＨＡ（配列番号１１）；
ｖｉ）ＹＶＧＲＱＮ（配列番号１２）；及び
ｖｉｉ）ＥＴＷＨＤＩ（配列番号１３）
のうちの１つ以上を含んでもよく、又はｉ）〜ｖｉｉ）のいずれかと少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
さらに、ペプシン耐性αアミラーゼは、以下のアミノ酸配列、すなわち、
ｉ）ＳＡＩＫＳＬ（配列番号７）；位置８５〜９０位
ｉｉ）ＤＶＶＩＮＨ（配列番号８）；位置１００〜１０５位
ｉｉｉ）ＳＧＥＨＬＩ（配列番号９）；位置１３０〜１３５位
ｉｖ）ＮＲＩＹＫＦ（配列番号１０）；位置１７２〜１７７位
ｖ）ＰＬＨＹＱＦＨＡ（配列番号１１）；位置２８７〜２９５位
ｖｉ）ＹＶＧＲＱＮ（配列番号１２）；位置４３９〜４４４位
ｖｉｉ）ＥＴＷＨＤＩ（配列番号１３）位置４４７〜４５２位
のうちの１つ以上を含んでもよく、又はｉ）〜ｖｉｉ）のいずれかと少なくとも８０％又は８５％又は９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関する。
ｉ）〜ｖｉｉ）の任意の組み合わせ及び／又は具体的に記載されるアミノ酸の任意の組み合わせが、本明細書に包含されることは理解されるであろう。
好ましい実施形態において、飼料材料は、飼料１キログラム当たり４０００単位未満、３０００単位未満、２０００単位未満、１９００単位未満、１８００単位未満、１７００単位未満、１６００単位未満、１５００単位未満、１４００単位未満、１３００単位未満、１２００単位未満、１１００単位未満、１０００単位未満、９００単位未満、８００単位未満、７００単位未満、６００単位未満、５００単位未満、又は約４００単位未満のαアミラーゼを含み得る。
好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の活性を保ち得る。好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でのその活性と比較して、約８０〜１２０％、約８５〜１１５％、約９０〜１１０％、約９５〜１０５％、約９６〜１０４
％、約９７〜１０３％、約９８〜１０２％、又は約９９〜１０１％を有し得る。αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、同じ活性を有し得る。
本発明はさらに、家禽又はブタの体重増加を増進する方法であって、ペプシン耐性αアミラーゼを含む飼料材料を前記家禽又はブタに与えるステップを含む方法を提供する。
「体重増加の増進」は、ペプシン耐性αアミラーゼを含む飼料を与えたときに、ペプシン耐性αアミラーゼが存在しない飼料を与えられた動物と比較して体重の増加を伴う動物を指す。
好適には、飼料材料は、内因性αアミラーゼｍＲＮＡの発現の低下（好ましくは有意な低下（Ｐ＜０．０５））をもたらし得る。従って、ペプシン耐性α−アミラーゼを使用することにより、動物が飼料を利用するのに必要なエネルギーが少なくなるため、飼料効率が高まり、及び／又は飼料転換率が低下し得る。
好適には、ペプシン耐性αアミラーゼは、
ｉ）配列番号１に示されるとおりであるか；
ｉｉ）１つ又はいくつかのアミノ酸付加／挿入、欠失又は置換を除いては配列番号１に示されるとおりであるか；
ｉｉｉ）配列番号１と少なくとも８５％（好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するか；又は
ｉｖ）配列番号２の配列を含むヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖ）遺伝子コードの縮重に起因して配列番号２と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；
ｖｉ）１つ又はいくつかのヌクレオチド付加／挿入、欠失又は置換だけ配列番号２と異なるヌクレオチド配列の発現により産生されるか；若しくは
ｖｉｉ）配列番号２と少なくとも７０％（好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するヌクレオチド配列の発現により産生される
アミノ酸配列を有し得る。
配列番号１とのギャップアラインメントでのペプシン耐性αアミラーゼは、Ｋ８８；Ｉ１０３；Ｈ１３３；Ｙ１７５；Ｙ２９０；Ｆ２９２；Ｒ４４２及びＨ４５０からなる群から選択されるアミノ酸のうちの任意の１つ以上を含んでもよく、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関し、及び／又は以下のアミノ酸配列、すなわち、
ｉ）ＳＡＩＫＳＬ（配列番号７）；
ｉｉ）ＤＶＶＩＮＨ（配列番号８）；
ｉｉｉ）ＳＧＥＨＬＩ（配列番号９）；
ｉｖ）ＮＲＩＹＫＦ（配列番号１０）；
ｖ）ＰＬＨＹＱＦＨＡ（配列番号１１）；
ｖｉ）ＹＶＧＲＱＮ（配列番号１２）；及び
ｖｉｉ）ＥＴＷＨＤＩ（配列番号１３）
の１つ以上を含んでもよく、又はｉ）〜ｖｉｉ）のいずれかと少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
さらに、ペプシン耐性αアミラーゼは、以下のアミノ酸配列、すなわち、
ｉ）ＳＡＩＫＳＬ（配列番号７）；位置８５〜９０位
ｉｉ）ＤＶＶＩＮＨ（配列番号８）；位置１００〜１０５位
ｉｉｉ）ＳＧＥＨＬＩ（配列番号９）；位置１３０〜１３５位
ｉｖ）ＮＲＩＹＫＦ（配列番号１０）；位置１７２〜１７７位
ｖ）ＰＬＨＹＱＦＨＡ（配列番号１１）；位置２８７〜２９５位
ｖｉ）ＹＶＧＲＱＮ（配列番号１２）；位置４３９〜４４４位
ｖｉｉ）ＥＴＷＨＤＩ（配列番号１３）位置４４７〜４５２位
のうちの１つ以上を含んでもよく、又はｉ）〜ｖｉｉ）のいずれかと少なくとも８０％又は８５％又は９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関する。
ｉ）〜ｖｉｉ）の任意の組み合わせ及び／又は具体的に記載されるアミノ酸の任意の組み合わせが、本明細書に包含されることは理解されるであろう。
好ましい実施形態において、飼料材料は、飼料１キログラム当たり４０００単位未満、３０００単位未満、２０００単位未満、１９００単位未満、１８００単位未満、１７００単位未満、１６００単位未満、１５００単位未満、１４００単位未満、１３００単位未満、１２００単位未満、１１００単位未満、１０００単位未満、９００単位未満、８００単位未満、７００単位未満、６００単位未満、５００単位未満、又は約４００単位未満のαアミラーゼを含み得る。
好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の活性を保ち得る。好適には、αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でのその活性と比較して、約８０〜１２０％、約８５〜１１５％、約９０〜１１０％、約９５〜１０５％、約９６〜１０４％、約９７〜１０３％、約９８〜１０２％、又は約９９〜１０１％を有し得る。αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、同じ活性を有し得る。
本発明はまた、ペプシン耐性αアミラーゼと、少なくとも１つのミネラル及び／又は少なくとも１つのビタミンとを含むプレミックスも提供する。
好ましくは、プレミックスは、本発明に係る飼料補助剤を含む。
本発明はさらに、動物における内因性αアミラーゼの発現を低下させるためのペプシン耐性αアミラーゼの使用を提供する。
これにより、アミラーゼをコードする遺伝子の転写及び翻訳による内因性酵素の産生に必要なエネルギーが少なくなり、潜在的に飼料効率の上昇及び飼料転換率の低下がもたらされ得ることは理解されるであろう。
本明細書に開示される好ましい特徴のいずれもが、特に明記しない限り、上記に記載される態様のいずれにも等しく適用可能であると見なされることは理解されるであろう。任意の好ましい特徴はまた、本明細書に開示される任意の他の好ましい特徴との組み合わせで開示されるものとも見なされる。
ペプシン耐性アッセイ
本発明のαアミラーゼは、ペプシン耐性アッセイにより確定される。このアッセイは以下のプロトコルを含む、すなわち、αアミラーゼ（例えば１００μｌ酵素溶液）をトウモロコシベースの飼料（例えば１００ｍｇ）及びペプシン（例えば少なくとも９０００Ｕ／ｍｌの濃度、これは９００μｌの容量で添加され得る）と混合し、ｐＨ３で（例えば少なくとも約１２０分間）インキュベートする。加えて、前記αアミラーゼを同じトウモロコ
シベースの飼料とペプシンの存在なしに同じ条件下で対照として混合する。続いて試料及び対照のαアミラーゼ活性を測定する。
理論による拘束を望むものではないが、本発明者は、トウモロコシベースの飼料の存在がαアミラーゼのペプシン耐性に影響を及ぼし得ると考える。このペプシンアッセイで用いられる条件は、単胃動物の胃腸管で用いられる条件を模倣するように設けている。
ペプシンレベル及びインキュベーション時間：
本発明の一実施形態において、用いられるペプシンレベルは約９０００Ｕ／ｍｌであり、インキュベーション時間は約１２０分間である。かかる条件下で実質的にαアミラーゼ活性を維持するアミラーゼが、本発明に係るペプシン耐性αアミラーゼと見なされ得る。しかしながら、アッセイがインキュベーション時間とペプシンレベルとの釣り合いであることは理解されるであろう。従って、インキュベーション時間を増やすことにより、より低いペプシンレベルを用いてペプシン耐性のαアミラーゼを同定することができる。同様に、インキュベーション時間を減らすことにより、より高いペプシンレベルを用いてペプシン耐性のαアミラーゼを同定することができる。
従って、本発明が本明細書に詳述される特定のインキュベーション時間及びペプシンレベルと等価な選択基準を包含し得ることは理解されるであろう。
温度：
ペプシン耐性αアミラーゼ及びペプシンの双方が活性な任意の温度を用い得ることは理解されるであろう。例えば、３０〜５０℃の温度、好ましくは４０℃が用いられてもよい。
緩衝液：
このアッセイでは、緩衝溶液（例えば９００μｌ）が用いられ得る。例えば、ペプシンを含む緩衝溶液が用いられてもよく、対照用にペプシンを含まない緩衝溶液が用いられてもよい。
所要のｐＨを提供し得る任意の好適な緩衝液を用い得ることは理解されるであろう。かかる緩衝液の組成は、当業者には周知の一般的知識である。
好適なペプシンインキュベーション緩衝液の例は、０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０、３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、２．９ｍｇの無水塩化ナトリウム／ｍｌ、０．７３ｍｇの塩化カルシウム／ｍｌである。ペプシンを含む溶液について、インキュベーション緩衝液は、少なくとも９０００Ｕ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１００００Ｕ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１０５００Ｕ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１１０００Ｕ／ｍｌを含有するように調製される。好適には、インキュベーション緩衝液は９０００又は９２５０Ｕ／ｍｌを含有し得る。
例示として、２５ｍｇ／ｍｌ（９２５０Ｕ／ｍｌ）のペプシン（例えばＳｉｇｍａ Ｐ−７０００）を含む緩衝液を作製し得る。
１ペプシン単位は、ヘモグロビンを基質として使用してＴＣＡ可溶性生成物として計測して、ｐＨ２．０、３７℃で毎分０．００１のΔＯＤ２８０を生じる酵素の量として定義される（例えばＦｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｄｅｘに記載されるとおり）。
陽性対照もまた、同じトウモロコシベースの飼料とｐＨ５．６の緩衝溶液とを混合して調製することができ、ここで緩衝溶液はペプシンを含まず、ＢＳＡを追加的に含む。
例えば、陽性対照に好適なアッセイ緩衝液は、ＢＳＡ含有アミラーゼアッセイ緩衝液：リン酸−クエン酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ５．６、３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡであり得る。
加えて、αアミラーゼが添加されないさらなる試料を調製して、用いられる化学物質のバックグラウンド吸光度を確認してもよい。
好適には、試料及び対照試料の双方とも、デュプリケートで調製され得る。
従って、一実施形態において、試料は以下のとおり調製及びインキュベートされる。各１．５ｍｌ微量遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に１００ｍｇのトウモロコシベースの飼料を秤量する。所望のレベルのペプシン（すなわち少なくとも９０００Ｕ／ｍｌ）を含む、若しくは含まない９００μｌの容量のインキュベーション緩衝液又は９００μｌのアッセイ緩衝液（すなわち陽性対照用）を添加し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ ５４３６において５００ｒｐｍで５分間プレインキュベートする。
１００μｌの容量の酵素溶液（又は１００μｌのＨ２Ｏ）を各管に添加し、蓋を閉め、それらの管をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ ５４３６において５００ｒｐｍで所望の長さの時間にわたり（すなわち少なくとも１２０分間、例えば正確に１２０分間）４０℃でインキュベートする。
次にαアミラーゼ活性に関して試料を分析する。
ペプシンを含む試料のアミラーゼの活性が、対照試料の、すなわちペプシンの非存在下でのアミラーゼの活性と比較したとき少なくとも約７５％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％など）から約１２５％（又は約１２０％、１１５％、１１０％、１０５％、１０３％、１０２％若しくは１０１％）までの範囲である場合に、そのαアミラーゼは「ペプシン耐性」である、又は「実質的にαアミラーゼ活性を維持する」と見なされる。
従って、有用な実施形態において、ペプシンを含む試料における配列番号１に示すとおりのアミラーゼの活性は、対照試料の、すなわちペプシンの非存在下での前記アミラーゼの活性と比較したとき、少なくとも約７５％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％など）から約１２５％（又は約１２０％、１１５％、１１０％、１０５％、１０３％、１０２％若しくは１０１％）までの範囲である。
さらに有用な実施形態において、ペプシンを含む試料における配列番号３に示すとおりのアミラーゼの活性は、対照試料の、すなわちペプシンの非存在下での前記アミラーゼの活性と比較したとき、少なくとも約７５％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％など）から約１２５％（又は約１２０％、１１５％、１１０％、１０５％、１０３％、１０２％若しくは１０１％）までの範囲である。
本発明は、少なくとも約７５％〜約１２５％の間における下限値と上限値との任意の組み合わせを包含し得る。従って、例えば「ペプシン耐性αアミラーゼ」又はその活性を「実質的に維持する」と見なされるαアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、少なくとも約８０〜１２０％、８５〜１１５％、９０〜１１０％、９５〜１０５％、９６〜１０４％、９７〜１０３％、９８〜１０２％、又は９９〜１０１％を有し得る。従って、有用な実施形態において、ペプシンを含む試料における配列番号１に示すとおりのアミラーゼの活性は、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、７５％〜約１２５％の間にあり、例えば少なくとも約８０〜
１２０％、８５〜１１５％、９０〜１１０％、９５〜１０５％、９６〜１０４％、９７〜１０３％、９８〜１０２％、又は９９〜１０１％である。従って、有用な実施形態において、ペプシンを含む試料における配列番号３に示すとおりのアミラーゼの活性は、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、７５％〜約１２５％の間にあり、例えば少なくとも約８０〜１２０％、８５〜１１５％、９０〜１１０％、９５〜１０５％、９６〜１０４％、９７〜１０３％、９８〜１０２％、又は９９〜１０１％である。αアミラーゼは、ペプシンの非存在下でインキュベートした後のその活性と比較して、同じ活性を有し得る。
このアッセイで用いられるペプシンのレベルは、少なくとも９０００Ｕ／ｍｌである。好適には、用いられるペプシンのレベルは、少なくとも約１００００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１０５００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１１０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１２０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１３０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１４０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１５０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１６０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１７０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１８０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも１９０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも２００００Ｕ／ｍｌ、少なくとも２１０００Ｕ／ｍｌ、少なくとも２２０００Ｕ／ｍｌ又は少なくとも２３０００Ｕ／ｍｌのペプシンであり得る。
αアミラーゼはペプシンと共に少なくとも約２．５時間、少なくとも約３時間又は少なくとも約３．５時間インキュベートされ得る。
試料のαアミラーゼ活性の分析は、当該技術分野において公知の任意の方法により測定され得る。
一実施形態において、αアミラーゼの活性は、ＫｏｎｅＬａｂアッセイを用いて計測され得る。管をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ卓上遠心機で２分間スピンダウンし、１００μｌを抜き取り、９００μｌのアッセイ緩衝液（例えばアミラーゼアッセイ緩衝液：リン酸−クエン酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ５．６）と混合する。活性に関して試料をＫｏｎｅＬａｂ Ａｒｅｎａ ２０ＸＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）で直ちに分析する。従って、この実施形態において所与のペプシン濃度でのペプシン耐性は、ペプシンなしに上記のプロトコルに記載するとおりｐＨ３で同じ時間にわたりインキュベートした後にＫｏｎｅＬａｂアッセイにより計測される活性と相対的に計測される、上記のプロトコルに記載するとおりｐＨ３で少なくとも２時間にわたり所与のペプシン濃度でインキュベートした後にＫｏｎｅＬａｂアッセイにより計測されるアミラーゼの活性として定義される。
或いは、αアミラーゼ活性は、以下に記載するタブレットアッセイを用いて計測することができる。
ＫｏｎｅＬａｂアッセイ
ＫｏｎｅＬａｂアッセイは、ＫｏｎｅＬａｂロボット（ＫｏｎｅＬａｂ Ａｒｅｎａ ２０ ＸＴ）を使用して液体及び固体生成物の細菌α−アミラーゼ活性を測定するための比色法である。
応用及び原理
生成物抽出物のアリコートをＣｅｒａｌｐｈａ基質混合物と共に限定条件下でインキュベートする。トリス溶液（トリズマベース）を添加することにより反応を終了させると、黄色が発色する。４０５ｎｍでの吸光度を計測し、これが分析試料のα−アミラーゼのレベルと直接関係する。この吸光度計測値を、十分に定義された活性を有する校正用酵素の計測値と関係付けることにより、試料の酵素活性が定量的に決定される。
基質内の結合を切断することができるのは、α−アミラーゼのみである。基質混合物の一部であるグルコアミラーゼ及びα−グルコシダーゼの過剰量により、ブロッキングされない反応生成物はグルコース及び遊離ｐ−ニトロフェニルに切断される。反応物が遊離ｐ−ニトロフェニルを解離し、トリズマベースを添加すると黄色が発色する。
Ｃｅｒａｌｐｈａ基質はブロックドｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシドＢＰＮＰＧ７であり、これは真菌α−アミラーゼと細菌α−アミラーゼとを区別しない。
アミログルコシダーゼ及びα−グルコシダーゼのｐＨ及び温度感受性により、このアッセイはｐＨ範囲５．０〜６．０及び４０℃以下においてのみ用いることができる。
器具
ガラスフィルター、Ａｄｖａｎｔｅｃ Ｔｏｙｏ ＧＡ５５、１１０ｍｍ
マグネチックスターラ
各種ピペット
各種試験管
各種メスフラスコ
試験管シェーカー
Ｋｏｎｅｌａｂ Ａｒｅｎａ ２０ ＸＴロボット
化学物質
クエン酸一水和物（Ｍｅｒｃｋ）
リン酸水素二ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ）
塩化カルシウム水溶液（Ｍｅｒｃｋ）
無水塩化ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ Ａ ７９０６）
システイン（Ｍｅｒｃｋ ２８３８）
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｍｅｒｃｋ）
試薬
１．安定性試薬
溶解：
０．２０ｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、
０．０５ｇシステイン、
１０ｍＬ脱イオン水中２．０ｇ無水塩化ナトリウム
冷蔵又は冷凍保存。保存期間：冷蔵：５±３℃で１週間、及び冷凍：−１８℃で１年間（解凍後に再冷蔵可）。
２．アッセイ緩衝液：クエン酸−リン酸緩衝液、０．１Ｍ、ｐＨ＝５．６０
溶解：
４．４１ｇクエン酸一水和物、
１０．３ｇリン酸水素二ナトリウム二水和物（ｄｉ−Ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）、
２．９０ｇ無水塩化ナトリウム、
約８００ｍＬの脱イオン水中０．７３ｇ塩化カルシウム二水和物
１．００ｍＬの安定性試薬（１）をマグネチックスターラで撹拌しながら添加する。
溶解したら、ｐＨを５．６０に調整し（ＨＣｌ又はＮａＯＨ）、溶液を１０００ｍＬメスフラスコに移して蒸留水で１０００ｍＬに調整する。
３．停止液：１％（ｗ／ｖ）トリス（トリズマベース）
メスフラスコにおいて脱イオン水に１０ｇのトリス（（ヒドロキシメチル）アミノメタン）を溶解し、１０００ｍＬに調整する。
４．基質（Ｍｅｇａｚｙｍｅからの凍結乾燥Ｃｅｒａｌｐｈａ（ＢＰＮＰＧ７））
褐色瓶一本の穀粒α−アミラーゼアッセイ試薬（ＢＰＮＰＧ７）を１０．０ｍｌの蒸留水に溶解する（２）。
この溶液は褐色瓶中に−１８℃で冷凍保存する（１０ｍｌバッチ）
溶液は使用前に同様に蒸留水でさらに１：１希釈する。
１瓶のＣｅｒａｌｐｈａには５４．５ｍｇのＢＰＮＰＧ７及び１２５Ｕ（ｐＨ＝６．０）のα−グルコシダーゼが含まれる。
５．対照／標準試料
アミラーゼ（ＬＡＴ）標準：例えば４８５ＴＡＵ／ｇ（ロット番号１０２−０５２０８−００１）
さらにＬＡＴ対照試料、例えば（ロット番号１０２−０１１２８−ｌａｂ）、７９５７〜８１６２ＴＡＵ／ｇの範囲
手順
アミラーゼ標準曲線の作成
アミラーゼ標準（５）をＬＡＴが約１．９Ｕ／ｇの濃度になるよう希釈する。
希釈は全て、アッセイ緩衝液（２）で実行する。
さらなる希釈はＫｏｎｅｌａｂにプログラムされる、すなわち、
Figure 0006391601
ＯＤ範囲が０．２〜１．５でなければならない。
試料調製
試料毎に２つの秤量を行う。
液体生成物：０．５ｇの試料を５０ｍｌメスフラスコに秤量する。フラスコをアッセイ緩衝液（２）で充填して混合する。さらなる希釈もアッセイ緩衝液（２）で実施する。最終濃度が約０．２Ｕ／ｍｌでなければならない。
固体生成物：０．５ｇの試料を５０ｍｌメスフラスコに秤量し、約４０ｍｌのアッセイ緩衝液（２）に希釈する。その溶液をマグネチックスターラで１０分間撹拌し、緩衝液で充填する。溶液をｗｈａｔｍａｎガラスフィルターでろ過し、アッセイ緩衝液（２）でさ
らなる希釈を実施する。最終濃度が約０．２Ｕ／ｍｌでなければならない。
ブラインド：各ランに２つのブラインド試料（アッセイ緩衝液（２））を含める。
アッセイの反応条件
ｐＨ＝５．６０
インキュベーション温度＝３７℃±０．１℃
波長＝４０５ｎｍ
基質５０μｌ
プレインキュベーション５分
試料１０μｌ
インキュベーション１５分
停止液１００μｌ
酵素活性の計算
試料の活性は以下の式に従い計算される、すなわち、
Figure 0006391601
 ＯＤｓａｍｐｌｅ＝酵素試料の吸光度
ＤＦ＝試料の希釈係数
Ｗｓａｍｐｌｅ＝試料重量（ｇ）
α＝標準曲線の傾き
β＝標準曲線の切片
精度管理（ＱＣ）
二重に測定した活性計測値のＣＶ％が１０％を上回る場合、再度アッセイを行う必要がある。
タブレットアッセイ
応用及び原理
アズリン架橋デンプンからの染色オリゴマーの酵素的解離速度を計測することにより、酵素活性が決定される。試料の酵素活性は、吸光度計測値を、十分に定義された活性を有する校正用酵素の計測値と関係付けることにより決定される。
器具
ガラスフィルター、Ａｄｖａｎｔｅｃ Ｔｏｙｏ ＧＡ５５、１１０ｍｍ
マグネチックスターラ
各種ピペット
試験管
水浴、３７℃
ストップウォッチ
試験管シェーカー
分光光度計、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−１６０Ａ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｅｕｒｏｐａ ＧｍｂＨ
試薬
１．基質
Ｐｈａｄｅｂａｓアミラーゼテスト（Ｍａｇｌｅ ＡＢ、Ｌｕｎｄ、スウェーデン）。各タブレットは４５ｍｇの青色デンプン及び緩衝液を含有する。
２．アッセイ緩衝液
メスフラスコにおいて９．０ｇの無水塩化ナトリウム（ａｎｈｙｄｒｏｕｓ ｓｏｄｉｕｍ ｃｌｏｒｉｄｅ）（ＮａＣｌ）、２．０ｇのウシ血清アルブミン及び２．２ｇの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ２，２Ｈ２Ｏ）を蒸留水に希釈し、１０００ｍｌまで蒸留水を充填する。
３．停止液
０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液
メスフラスコにおいて２０．０ｇの水酸化ナトリウムを蒸留水に溶解し、蒸留水を１０００ｍｌまで充填する。
対照試料
各ランにおいて、ＱＣチェックとして既知の活性及び標準変動を有する対照試料を分析することができる。
試料調製
各試料について、デュプリケートで約１〜５ｇを正確に秤量する。試料を磁気撹拌しながら１００ｍｌアッセイ緩衝液に３０分間抽出する。
抽出物をガラスフィルターでろ過する。その後、試料を約０．３Ｕ／ｍｌの期待活性までアッセイ緩衝液で希釈する（この希釈を以下の式に加えるべきである）。
アッセイ手順
各試料について、２００μｌの抽出物及び４ｍｌのアッセイ緩衝液をピペットで試験管に入れる。試料は全て、デュプリケートで分析する。溶液を３７℃で５分間平衡化し、ｔ＝０分でＰｈａｄｅｂａｓ（商標）タブレット［Ｍａｇｌｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｕｎｄ，スウェーデン］を添加して１０秒間よく混合する。試料を３７℃で１５分間インキュベートし、続いて１ｍｌの停止液を添加することにより反応を停止させる。試験管シェーカーを使用して溶液を混合し；管を５分間（卓上に）静置し、再び混合した後、３５００ｒｐｍで１０分間遠心する。試薬ブランク（４．２ｍｌのアッセイ緩衝液）に対する６２０ｎｍの吸光度を計測する。
酵素試料の吸光度は、０．３〜０．５の範囲内になければならない。
酵素活性の計算
Ｐｈａｄｅｂａｓ（商標）タブレットには校正曲線が付いてくる。ＯＤ６２０に対応する活性をこの校正曲線から読み取り、次に試料の活性を以下の式に従い計算する、すなわち、
Figure 0006391601
 式中、Ａは、Ｐｈａｄｅｂａｓ（商標）校正曲線で分かる活性である。
精度管理（ＱＣ）
二重に測定した活性計測値のＣＶ％が１０％を上回る場合、再度アッセイを行う必要が
ある。
定量限界：１００Ｕ／ｋｇ
ヨウ素反応アッセイ
ウォルゲムート（Ｗｏｈｌｇｅｍｕｔｈ）ヨウ素反応法（Ｓａｎｄｓｔｅｄｔ，Ｒ．Ｍ．，Ｋｎｅｅｎ，Ｅ．，ａｎｄ Ｂｌｉｓｈ，Ｍ．Ｊ．：“Ａ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ Ｗｏｈｌｇｅｍｕｔｈ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ．１６，７１２−７２３（１９３９））もまた、αアミラーゼ活性を計測するために用いることができる。この方法は、長いデンプン鎖がヨウ素分子の周りに巻き付くと形成される青色に基づく。αアミラーゼがデンプンをデキストリンに変換すると、活性に比例して青色が弱まる。ヨウ素反応法は中程度の反応条件を用いるため、真菌酵素及び細菌酵素の双方の試料で機能する。
αアミラーゼ
αアミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、ＥＣ ３．２．１．１）は一酵素群を構成し、デンプン並びに他の直鎖状及び分枝状１，４−グルコシドオリゴ糖及び多糖の加水分解を触媒する。
本発明に係る、上述のアッセイの一つにより計測することのできる、アミロース分解活性を有するペプシン耐性αアミラーゼは、任意の供給源から単離することができる。好適には、αアミラーゼは、細菌（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えばＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）など）及び／又は真菌（トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、例えばトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）など）から単離され得る。
当業者は、ペプシン耐性αアミラーゼが、液体組成物としても、又は固体／顆粒状組成物としても提供され得ることを理解するであろう。
好ましくは、前記酵素が液体形態の場合、前記酵素は、前記酵素を含む細胞の培養後に中に酵素が分泌された培地中にある。好ましくは、前記培地は無細胞のものである（すなわち１つ又は複数の細胞が培地から分離されている）。好ましくは、前記培地は濃縮されたものである。培地を粒状化して固体酵素組成物を提供し得ることは理解されるであろう。
飼料補助剤は−用途及び／又は適用方法及び／又は投与方法に応じて−溶液の形態で、又は固体として提供され得ることがさらに理解されるであろう。
一実施形態において飼料補助剤は、摂取に好適な液体配合物であり、好ましくはかかる液体組成物は、緩衝液、塩、ソルビトール及び／又はグリセロールを含有する。
代替的実施形態において、本発明に係る飼料補助剤は、ペプシン耐性αアミラーゼを含む１つ以上の細胞として提供され得る。
一実施形態において飼料補助剤は粒状化されるか、又は他の酵素と共に粒状化される。
好ましくは、飼料補助剤は、少なくとも１つの生理学的に許容可能な担体をさらに含む。
少なくとも１つの生理学的に許容可能な担体は、好ましくは、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギ又はコムギ成分、スクロース、デ
ンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、安息香酸塩、ソルビエート（ｓｏｒｂｉａｔｅ）、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、グルコース、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩及びそれらの混合物からなる群から選択される。
一実施形態においてαアミラーゼ酵素は、生理学的に許容可能な担体上で乾燥される。
好ましい実施形態において、飼料補助剤又は飼料材料は少なくとも１つのさらなる酵素を含み得る。好ましい実施形態において、少なくとも１つのさらなる飼料酵素は、デンプン代謝、繊維分解、脂質代謝に関わるもの、グリコーゲン代謝に関わるタンパク質又は酵素、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−グルカナーゼ、グルカンリサーゼ、エンド−βグルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−グルコシダーゼを含むβ−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リアーゼ、脂肪分解酵素、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８）を含むキシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ２−オキシドレダクターゼ、ＥＣ １．１．３．５） β−グルカナーゼ、ペクチナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、酸性ホスファターゼ、３−フィターゼ（ＥＣ ３．１．３．８）又は６−フィターゼ（ＥＣ ３．１．３．２６）を含むフィターゼ、マンナナーゼ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。これらには、例えば飼料の粘度を調節する酵素が含まれる。
より好ましい実施形態において飼料補助剤又は飼料材料はまた、フィターゼ、脂肪分解酵素、キシラナーゼ及び／又はプロテアーゼも含む。最も好ましい実施形態において、飼料補助剤又は飼料材料は、フィターゼ、脂肪分解酵素、キシラナーゼ及びプロテアーゼをさらに含む。
好ましくは、アミラーゼは、約１０Ｕ／ｋｇ飼料〜約１００００Ｕ／ｋｇ飼料、より好ましくは、約５０Ｕ／ｋｇ飼料〜約７５００Ｕ／ｋｇ飼料、及びさらにより好ましくは、約１００Ｕ／ｋｇ飼料〜約５０００Ｕ／ｋｇ飼料の範囲で存在する。いくつかの態様について、ペプシン耐性αアミラーゼは、約４０００単位未満、約３０００単位未満、約２０００単位未満、約１９００単位未満、約１８００単位未満、約１７００単位未満、約１６００単位未満、約１５００単位未満、約１４００単位未満、約１３００単位未満、約１２００単位未満、約１１００単位未満、約１０００単位未満、約９００単位未満、約８００単位未満、約７００単位未満、約６００単位未満、約５００単位未満、約４００単位未満、約３００単位未満、又は約２００単位未満／飼料１ｋｇの量で存在する。１アミラーゼＵが、ｐＨ６．５及び３７℃で水不溶性架橋デンプン高分子基質から毎分１ｍｍｏｌのグルコシド結合を解離する酵素の量であることは理解されるであろう。
好ましくは、アミラーゼは、約５０〜３００、より好ましくは１００〜２００単位／飼料１ｋｇで存在する。
好ましくは、使用時、キシラナーゼが約１００Ｕ／ｋｇ〜約１００００Ｕ／ｋｇ飼料、より好ましくは約２５０Ｕ／ｋｇ飼料〜約７５００Ｕ／ｋｇ飼料、及びさらにより好まし
くは約５００Ｕ／ｋｇ飼料〜約５０００Ｕ／ｋｇ飼料の範囲で存在する。１キシラナーゼ（ｘｙｌａｎｓｅ）Ｕが、ｐＨ５．３及び５０℃でオートスペルトキシラン基質から毎分０．５μｍｏｌの還元糖当量を（ＤＮＳ［４］還元糖方法によるキシロースとして）解離する酵素の量であることは理解されるであろう（Ｂａｉｌｅｙ，Ｍ．Ｊ．Ｂｉｅｌｙ，Ｐ．ａｎｄ Ｐｏｕｔａｎｅｎ，Ｋ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２３，（３），Ｍａｙ １９９２，２５７−２７０）。
好ましくは、使用時、フィターゼが約２５０ＦＴＵ／ｋｇ〜約１５，０００ＦＴＵ／ｋｇ飼料（例えば約２５０〜約１０，０００ＦＴＵ／ｋｇ飼料、約４００〜約７，５００ＦＴＵ／ｋｇ飼料又は約５００〜約５０００ＦＴＵ／ｋｇ飼料）のレベルで存在する。
好ましくは、使用時、脂肪分解酵素が約１２５ＬＩＰＵ／ｋｇ〜約４５，０００ＬＩＰＵ／ｋｇ飼料材料（例えば約５００〜約３０，０００ＬＩＰＵ／ｋｇ、約１０００〜約２００００ＬＩＰＵ／ｋｇ及びまた約３０００〜約１００００ＬＩＰＵ／ｋｇ）のレベルで存在する。
好ましくは、使用時、プロテアーゼが約２５０Ｕ／ｋｇ飼料〜約１５，０００Ｕ／ｋｇ飼料（例えば約５００〜約１０，０００Ｕ／ｋｇ飼料、約１，０００〜約８，０００Ｕ／ｋｇ飼料、約２，０００〜約７，０００Ｕ／ｋｇ飼料又は約３，０００〜約６，０００ＦＴＵ／ｋｇ飼料）のレベルで存在する。１プロテアーゼＵが、ｐＨ７．５（４０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４／乳酸緩衝液）及び４０℃で基質（０．６％カゼイン溶液）から毎分１マイクログラムのフェノール化合物（チロシン当量として表される）を遊離する酵素の量であることは理解されるであろう。
飼料補助剤及び／又は飼料材料は任意の好適な動物用であってよいことは理解されるであろう。好ましくは、動物は単胃動物、例えば家禽又はブタである。
当業者には、本発明に係る飼料材料及び／又は飼料補助剤が他の成分、例えば、安定化剤及び／又は増量剤及び／又は他の酵素を含み得ることは明らかであろう。
好ましくは、本発明の飼料補助剤は、最高約７０℃；最高約８５℃；又は最高約９５℃までの熱処理に対して熱的に安定であり得る。熱処理は、最長約１分間；最長約５分間；最長約１０分間；最長約３０分間；最長約６０分間行われ得る。用語「熱的に安定」は、特定の温度に加熱する前に添加剤中において存在した／活性であった酵素成分の少なくとも約７５％が、室温に冷却後もなお存在する／活性であることを意味する。好ましくは、特定の温度に加熱する前に添加剤中において存在し、且つ活性であった酵素成分の少なくとも約８０％が、室温に冷却後もなお存在し、且つ活性である。
特に好ましい実施形態において、飼料補助剤はホモジナイズされ、粉末が生成される。
代替的な好ましい実施形態において、飼料補助剤は、参照により本明細書に援用される国際公開第２００７／０４４９６８号パンフレットに記載されるとおり顆粒（ＴＰＴ顆粒と称される）に配合される。
別の好ましい実施形態において飼料補助剤が顆粒に配合されるとき、顆粒は、タンパク質コアを被覆するバリア水和塩を含む。かかる塩コーティングの利点は、熱耐性の向上、貯蔵安定性の向上、及び本来酵素に有害な作用を有する他の飼料添加剤からの保護である。
好ましくは、塩コーティングに使用される塩は、０．２５より大きい水分活性又は２０
℃で６０％より高い一定湿度を有する。
好ましくは、塩はＮａ２ＳＯ４を含む。
飼料補助剤の調製方法はまた、粉末をペレット化するさらなるステップも含み得る。粉末は当該技術分野において公知の他の成分と混合されてもよい。粉末、又は粉末を含む混合物はダイに押し通されることができ、得られるストランドが各種長さの好適なペレットに切断される。
場合により、このペレット化するステップは、ペレットの形成前に蒸気処理、又は調湿工程を含み得る。粉末を含む混合物がコンディショナー、例えば蒸気噴射を備えるミキサーに入れられ得る。混合物はコンディショナーにおいて６０〜１００℃などの特定の温度まで加熱され、典型的な温度は７０℃、８５℃、９０℃又は９５℃であり得る。滞留時間は数秒間から数分間、さらには数時間まで様々であり得る。５秒間、１０秒間、１５秒間、３０秒間、１分間、２分間、５分間、１０分間、１５分間、３０分間及び１時間など。
本発明の飼料補助剤は、任意の適切な飼料原料に添加するのに好適であることが理解されるであろう。
本明細書で使用されるとき、用語「飼料原料」は、動物により摂取される基本的な飼料原料を指す。これには、例えば、少なくとも１つ又は複数の未加工の穀粒、及び／又は大豆粕又は骨粉などの加工された植物及び／又は動物材料が含まれ得ることがさらに理解されるであろう。
いくつかの実施形態において、飼料原料は、以下の成分の１つ以上を含み得る、すなわち、ａ）穀類、例えば、小粒穀類（例えば、小麦、大麦、ライ麦、オート麦及びそれらの組み合わせ）及び／又はトウモロコシ若しくはソルガムなどの大粒穀類；ｂ）穀類の副産物、例えば、コーングルテンミール、乾燥醸造粕（ＤＤＧＳ）、小麦ふすま、小麦ミドリング粉、小麦ショーツ、米糠、米の籾殻、オート麦の籾殻、パーム核油、及び柑橘パルプ；ｃ）ソーヤ、ヒマワリ、ピーナッツ、ルピナス、エンドウ豆、ソラ豆、綿、キャノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉骨粉、ジャガイモタンパク質、乳清、コプラ、ゴマなどの原料から得られるタンパク質；ｄ）植物源及び動物源から得られる油及び脂肪；ｅ）ミネラル及びビタミン。
本明細書で使用されるとき、用語「飼料材料」は、１つ以上の飼料補助剤が添加されている飼料原料を指す。
当業者は、動物毎に必要な飼料材料は異なり、さらには同じ動物が、動物の飼育目的に応じて異なる飼料材料を必要とし得ることを理解するであろう。さらに、出発飼料原料に応じて、飼料材料は高繊維飼料材料又は低繊維飼料材料であり得ることが理解されるであろう。
好ましくは、飼料材料は、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）又はトウモロコシ（ｃｏｒｎ）、小麦、オオ麦、ライ小麦、ライ麦、米、タピオカ、ソルガム、及び／又はその副産物のいずれか、並びに高タンパク成分、例えば大豆粕（ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｎ）、ナタネ粕、キャノーラ粕、綿実粕、ヒマワリ種子粕、畜産副産物ミール及びそれらの混合物を含む飼料原料を含み得る。より好ましくは、飼料材料は動物性脂肪及び／又は植物油を含み得る。
場合により、飼料材料はまた、さらなるミネラル、例えばカルシウムなど及び／又はさ
らなるビタミンを含有してもよい。
本明細書に定義するとおりの「低繊維飼料材料」は、１つ以上の飼料原料を含む飼料材料であって、約２５％の水不溶性細胞壁の最大含量、及び／又は約４％の可溶性非デンプン性多糖類の最大含量を含む飼料材料である。より好ましくは、約２２．５％、約２０％、約１７．５％、約１５％、約１２．５％の水不溶性細胞壁の最大含量；及び／又は約３％、約２．５％、約２％、約１．７５％、約１．５％、約１．２５％の可溶性非デンプン性多糖類の最大含量。
いくつかの実施形態において、飼料補助剤は、少なくとも１つの低繊維飼料原料、例えば、トウモロコシ、小麦、畜産副産物ミール、又は大豆及び／又はその副産物のいずれかと混合され、低繊維飼料材料を提供する。
好ましくは、飼料材料はトウモロコシ・大豆粕ミックスである。
一実施形態において、好ましくは飼料はペットフードではない。
本明細書に定義するとおりの「高繊維飼料材料」は、１つ以上の飼料原料を含む飼料材料であって、約２５％の水不溶性細胞壁の最小含量、及び／又は約４％の可溶性非デンプン性多糖類の最小含量を含む飼料材料である。より好ましくは、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％の水不溶性細胞壁の最小含量；及び／又は約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％の可溶性非デンプン性多糖類の最小含量。
いくつかの実施形態において、飼料補助剤は、少なくとも１つの高繊維飼料原料（好ましくは、小麦、大麦、ライ麦、オート麦、穀類の副産物、例えば、コーングルテンミール、乾燥醸造粕（ＤＤＧＳ）、小麦ふすま、小麦ミドリング粉、小麦ショーツ、米糠、米の籾殻、オート麦の籾殻、パーム核油、及び柑橘パルプからなる群から選択される）及び／又はその副産物のいずれかと混合され、高繊維飼料材料を提供する。
別の態様において、飼料材料の生産方法が提供される。飼料材料は、典型的には飼料工場で生産され、そこでは初めに原材料が好適な粒度に粉砕され、次に適切な添加剤と混合される。次に飼料材料がマッシュ又はペレットとして生産され得る；これには典型的には、温度を目標値に上昇させて、次に飼料をダイに通して特定のサイズのペレットを生産する方法が関わる。ペレットは冷却される。続いて脂肪及び酵素などの液体添加剤が添加され得る。飼料材料の生産には、ペレット化の前に、押出し又は膨張を含む−特に、少なくとも蒸気の使用を含み得る好適な技法による−さらなるステップも関わり得る。
飼料材料は、家禽（例えば、ブロイラー、産卵鶏、ブロイラー種鶏、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、水鳥）、ブタ（全年齢区分）、ペット（例えば、イヌ、ネコ）又は魚類などの、単胃動物用の飼料材料であってよく、好ましくは飼料材料は家禽用である。
場合により、飼料材料はさらなる添加剤を含んでもよい。例えばカルシウムが、動物の食事を補助するため、及び／又は増量剤として、任意の好適な量で飼料材料に添加されてもよい。
飼料材料は少なくとも０．０００１重量％の飼料補助剤を含み得る。好適には、飼料材料は少なくとも０．０００５重量％；少なくとも０．００１０重量％；少なくとも０．００２０重量％；少なくとも０．００２５重量％；少なくとも０．００５０重量％；少なくとも０．０１００重量％の飼料補助剤を含み得る。好適には、飼料材料は約０．００１０
重量％〜約０．０２００重量％；好ましくは約０．００５重量％〜約０．０１００重量％の飼料補助剤を含み得る。
さらなる態様において、飼料原料からの利用可能な代謝エネルギーを増加させるため飼料に使用されるペプシン耐性αアミラーゼが提供される。
本明細書で使用されるとき、用語「利用可能な代謝エネルギーを増加させる」は、アミラーゼ酵素又は飼料補助剤が添加されていない飼料原料の単位重量から利用可能な栄養分又はエネルギーの利用可能度と比較した、単位重量の飼料原料を摂取する動物が利用可能なエネルギー量の増加を意味する。
ここで本発明について、以下の図を参照して説明する。
バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のペプシン耐性αアミラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。 バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のペプシン耐性αアミラーゼのヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。 トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のペプシン耐性αアミラーゼのアミノ酸配列（配列番号３）を示す。 トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のペプシン耐性αアミラーゼのヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。 バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）αアミラーゼ（ＬＴＡＡと命名する）とバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペプシン耐性αアミラーゼ（ＬＡＴと命名する）との間のアラインメントを示す。ＬＡＴ内の対象のアミノ酸に下線を引く。 バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）αアミラーゼ（ＬＡＴ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ（ＬＴＡＡ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）α−アミラーゼ（Ｔｒｉｃ．ａｍｙｌ．＃２６６）及び市販のα−アミラーゼ（ＢＡＮ）のペプシン耐性を示す。 バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ（ＬＴＡＡ）及びバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）変異αアミラーゼ（ＦＲＥＤ）のペプシン耐性を示す。 バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）変異αアミラーゼ（ＦＲＥＤ）のアミノ酸配列を示す。 バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のαアミラーゼ（ＬＡＴ）及びバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のαアミラーゼ（ＬＴＡＡ）で処理したブロイラー雛についての０〜４２日の体重増加を示す（４試験のメタ分析）。ＬＡＴ処理は統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。 ０〜４２日の飼料転換率（体重について補正）を示す。これは４試験のメタ分析である。ＬＡＴ処理は統計的に有意である（Ｐ＜０．０５）。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，２０ ＥＤ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、及びＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）が、本開示において使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
本開示は、本明細書に開示される例示的な方法及び材料に限定されるものでなく、本開示の実施形態の実施又は試験においては、本明細書に記載されるものと同様の又は等価な任意の方法及び材料を用いることができる。数値範囲は、その範囲を定義する数値を含む。特に指示されない限り、それぞれ、核酸配列は５’から３’の向きに左から右に書かれ；アミノ酸配列はアミノからカルボキシの向きに左から右に書かれる。
本明細書に提供される見出しは、全体として本明細書を参照することにより理解され得る本開示の様々な態様又は実施形態を限定するものではない。従って、このすぐ下に定義する用語は、本明細書を全体として参照することにより、さらに十分に定義される。
アミノ酸は、本明細書では、アミノ酸名、三文字略号又は一文字略号を使用して参照される。
用語「タンパク質」は、本明細書で使用されるとき、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを含む。
用語「〜と等価なアミノ酸残基」、「〜に対応するアミノ酸」及びその文法上の同義語は、本明細書では、特定のタンパク質の特定のアミノ酸配列に指示されるものと同様の位置及び作用を有するタンパク質のアミノ酸残基を指して使用される。当業者は、同等のタンパク質における指定された残基の等価性を認識するであろう。
ポリペプチドの文脈において用語「特性」又はその文法上の同義語は、本明細書で使用されるとき、選択又は検出し得るポリペプチドの任意の特徴又は属性を指す。これらの特性としては、限定はされないが、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、熱安定性、温度及び／又はｐＨ活性プロファイル、飼料加工安定性、及び分泌され易さが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義語である。ある場合には、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義語である。ある場合には、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義語である。
アミノ酸配列は好適な供給源から調製／単離されてもよく、又は合成的に作製されてもよく、又は組換えＤＮＡ技法を用いて調製されてもよい。
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書では同義的に使用される。本開示及び特許請求の範囲では、従来のアミノ酸残基一文字及び三文字コードが使用される。ＩＵＰＡＣＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に準拠して定義されるとおりのアミノ酸三文字コード。また、遺伝子コードの縮重に起因して、ポリペプチドが２つ以上のヌクレオチド配列によってコードされ得ることも理解される。
用語「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」は、成熟形態又は前駆体形態のタンパク質の分泌に関与し得るヌクレオチド及び／又はアミノ酸の任意の配列を指す。シグナル配列のこの定義は機能上のもので、タンパク質の分泌の遂行に関与する、タンパク質遺伝子のＮ末端部分によってコードされるアミノ酸配列全てを含むことが意図される。シグナ
ル配列は、例外がないわけではないが、多くの場合にタンパク質のＮ末端部分又は前駆タンパク質のＮ末端部分に結合する。
「機能的断片」とは、ポリペプチドの断片であって、当該ポリペプチドの特徴的な特性を維持する断片を意味する。本発明の文脈では、フィターゼ又は脂肪分解酵素の機能的断片は、全タンパク質のフィターゼ又は脂肪分解酵素切断能を維持する断片である。
用語「単離された」、「回収された」又は「精製された」は、その元の環境から取り出される材料を指す。用語「実質的に精製された」は、その材料が少なくとも実質的な程度まで精製されていることを意味する。
一態様において、好ましくはヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は単離された形態である。用語「単離された」は、配列が自然中で及び自然中に見出されるとき天然に関連付けられている少なくとも１つの他の構成要素から、配列が少なくとも実質的に自由であることを意味する。
用語の他の定義は、本明細書全体を通じて明らかになり得る。例示的実施形態をさらに詳細に記載する前に、本開示が、記載される特定の実施形態に限定されず、従って当然ながら異なり得ることが理解されなければならない。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定され得るため、本明細書で使用される用語法はあくまでも特定の実施形態を記載するためのもので、限定することは意図されないことも理解されなければならない。
値の範囲が提供される場合、当該範囲の上限値と下限値との間にある各値もまた、文脈上特に明確に指示されない限り下限値の単位の１０分の１まで、具体的に開示されることが理解される。任意の記載された値又は記載された範囲において中間にある値と、任意の他の記載された値、又は当該の記載された範囲において中間にある値との間のより小さい各範囲が、本開示の範囲内に包含される。それらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、独立してその範囲に含まれ又は除かれることができ、及びより小さい範囲に一方の限界値が含まれるか、いずれの限界値も含まれないか、又は双方の限界値とも含まれる各範囲もまた、記載された範囲における任意の具体的に除かれる限界値を条件として、本開示の範囲内に包含される。記載された範囲が限界値の一方又は双方を含む場合、それらの含まれた限界値の一方又は双方を除く範囲もまた、本開示に含まれる。
本明細書で使用されるとき、及び添付の特許請求の範囲において、文脈上特に明確に指示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「遺伝子（ａ ｇｅｎｅ）」に対する参照は複数のかかる候補薬剤を含み、「細胞（ｔｈｅ ｃｅｌｌ）」に対する参照は、１つ以上の細胞及び当業者に公知のその均等物に対する参照を含む等となる。
本明細書において考察される刊行物は、本願の出願日に先行する開示についてのみ提供される。本明細書中のいかなる事項も、かかる刊行物が本明細書に添付される特許請求の範囲の先行技術をなすことを認めるものとして解釈されてはならない。
本発明において使用される酵素は、バッチ処理、フェドバッチ処理及び連続フロー処理を含め、固体培養又は液内培養のいずれによっても産生することができる。培養は、水性無機塩培地、有機成長因子、炭素源及びエネルギー源材料、分子酸素、及び当然ながら、用いられる１つ以上の特定の微生物種の出発接種材料を含む成長培地で達成される。
変異体／誘導体
本発明はまた、酵素の任意のアミノ酸配列又はかかる酵素をコードする任意のヌクレオチド配列の変異体、相同体及び誘導体の使用も包含する。
変異アミノ酸配列は、グリシン残基又はβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えて、メチル基、エチル基又はプロピル基などのアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基間に挿入され得る好適なスペーサー基を含み得る。変異体のさらなる形態には、ペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在が関わり、当業者は十分に理解するであろう。誤解を避けるため、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素上でなく、残基の窒素原子上にある変異アミノ酸残基を指して用いられる。ペプトイド形態のペプチドの調製方法は、当該技術分野において、例えばＳｉｍｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１及びＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４で公知である。
他の成分
本発明の飼料補助剤は、他の成分又は担体と組み合わせて用いられ得る。
飼料酵素に好適な担体としては、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギ又はコムギ成分、スクロース、デンプン、消泡剤、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、安息香酸塩、ソルビエート（ｓｏｒｂｉａｔｅ）、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、グルコース、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩及びそれらの混合物が挙げられる。加えて、脂肪／ワックス被覆、植物ガムの添加等に基づくものを含め、数多くの封入技法がある。
他の成分の例としては、以下の１つ以上が挙げられる、すなわち、増粘剤、ゲル化剤、乳化剤、結合剤、結晶改質剤、甘味料（人工甘味料を含む）、レオロジー改質剤、安定化剤、抗酸化剤、色素、酵素、担体、媒体、賦形剤、希釈剤、潤滑剤、香味剤、着色物質、懸濁剤、崩壊剤、顆粒結合剤等。これらの他の成分は天然であってもよい。これらの他の成分は、化学的及び／又は酵素的技法を用いて調製されてもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「増粘剤又はゲル化剤」は、本明細書で使用されるとき、不混和性液体の液滴、空気又は不溶性固体のいずれかである粒子の移動を減速させるか、又は妨げることによって分離を防止する生成物を指す。
用語「安定化剤」は、本明細書で使用されるとき、時間の経過に伴い生成物（例えば食品）が変化するのを防ぐ成分又は成分の組み合わせとして定義される。
用語「乳化剤」は、本明細書で使用されるとき、乳剤の分離を防止する成分（例えば食品成分）を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「結合剤」は、物理的又は化学的反応によって生成物を一体に結合する成分（例えば食品成分）を指す。
用語「結晶改質剤」は、本明細書で使用されるとき、脂肪又は水のいずれかの結晶化に作用する成分（例えば食品成分）を指す。
「担体」又は「媒体」は、化合物投与に好適な材料を意味し、非毒性で、且つ組成物のいずれの構成成分とも有害な形で相互作用することのない、当該技術分野において公知の任意のかかる材料、例えば、任意の液体、ゲル、溶媒、希釈液、可溶化剤などを含む。
栄養学的に許容可能な担体の例としては、例えば、穀粒、水、塩溶液、アルコール、シリコーン、ワックス、石油ゼリー、植物油などが挙げられる。
賦形剤の例としては、以下の１つ以上が挙げられる、すなわち、微結晶性セルロース及び他のセルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、グリシン、デンプン、乳糖及び高分子量ポリエチレングリコール。
崩壊剤の例としては、以下の１つ以上が挙げられる、すなわち、デンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及び特定の複合ケイ酸塩。
顆粒結合剤の例としては、以下の１つ以上が挙げられる、すなわち、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、マルトース、ゼラチン及びアカシア。
潤滑剤の例としては、以下の１つ以上が挙げられる、すなわち、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル及びタルク。
希釈剤の例としては、以下の１つ以上が挙げられる、すなわち、水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリン、及びそれらの組み合わせ。
他の成分が、同時に用いられても（例えばそれらが共に混合された状態にある場合、若しくはさらにはそれらが異なる経路で送達される場合であっても）、又は逐次的に用いられてもよい（例えばそれらは異なる経路で送達され得る）。
本明細書で使用されるとき、用語「動物又はヒトの食用として好適な構成成分」は、栄養上有益なものであっても、繊維代用物であっても、又は消費者にとって極めて有益な作用を有してもよい補助剤として、本発明の組成物に添加される、又は添加することのできる化合物を意味する。
例として、構成成分は、アルギン酸塩、キサンタン、ペクチン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、イヌリン、グアーガム、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ラクトスクロース、大豆オリゴ糖、パラチノース、イソマルトオリゴ糖、グルコオリゴ糖及びキシロオリゴ糖などのプレバイオティクスであり得る。
リパーゼ単位（ＬＩＰＵ）
本明細書で使用されるとき、１ＬＩＰＵ（リパーゼ単位）は、本明細書において以下に記載する条件下で毎分１μｍｏｌのＨ＋を解離する酵素の量として定義される。
５％（ｖ／ｖ）トリブチリン基質は、１５．００ｍｌのトリブチリン、５０．００ｍｌの乳化剤及び２３５ｍｌの蒸留水をホモジナイザーで２０秒間混合することにより調製される。基質のｐＨは、０．５ＭのＮａＯＨによって約５．４に調整される。
乳化剤は、２０００ｍｌビーカーにおいて１７．９ｇのＮａＣｌ、０．４１ｇのＫＨ２ＰＯ４、４００ｍｌの蒸留水、及び４５０ｍｌのグリセロールを混合することにより調製される。激しく撹拌しながら６．０ｇのアラビアゴムを添加し、アラビアゴムが完全に溶解するまで撹拌を続ける。溶液を１０００ｍｌメスフラスコに移し、印まで蒸留水を充填する。
乾燥試料について：メスフラスコに、最終希釈の半分で約３．５ＬＩＰＵ／ｍｌの最終溶液が得られるよう計算された所定量の酵素を溶解し、２０分間の磁気撹拌に供する。
撹拌後、蒸留水で最終希釈に調整する。さらなる希釈はいずれも蒸留水で行わなければならない。溶液状の試料は、蒸留水に直接希釈する。
２５．００ｍＬの基質を３０．０℃に調整する。
基質のｐＨをＮａＯＨ／ＨＣｌで５．５０に調整する。
撹拌しながら２．００ｍＬの試料を添加し、直ちにｐＨスタット滴定装置を始動させる。
６分間後、滴定を停止する。
滴定曲線の傾きを計算する。滴定曲線の傾きは３〜６分のデータから計算する。傾きは０．１〜０．２ｍＬ／分の間でなければならない。
以下を用いて酵素の活性（ＬＩＰＵ／ｇ）を計算する、すなわち、
Figure 0006391601
 ｍｌ／分：滴定曲線の傾き
Ｎ：ＮａＯＨの規定度
Ｆ：試料の希釈
Ａ：秤量試料（グラム）
２：試料（ｍｌ）
単離
一態様において、好ましくは本発明において使用されるペプシン耐性αアミラーゼ酵素は単離された形態である。用語「単離された」は、酵素が自然中で及び自然中に見出されるとき天然に関連付けられている少なくとも１つの他の構成要素から、ペプシン耐性αアミラーゼ酵素が少なくとも実質的に自由であることを意味する。用語「単離された」は、ペプシン耐性αアミラーゼ酵素が、それを産生する培養培地中の少なくとも１つの他の構成要素から少なくとも実質的に自由であることを意味してもよい。本発明のペプシン耐性αアミラーゼ酵素は、本来その物質が関連付けられ得る、又は酵素が共に産生され得る１つ以上の夾雑物を実質的に含まない形態で提供され得る。
従って、例えばそれは１つ又は複数の細胞又は１つ以上の潜在的に夾雑性のポリペプチド及び／又は核酸分子を実質的に含まないものであり得る。αアミラーゼは、発酵中又は発酵後のブロスから、脂肪分解酵素がブロス中に残るように１つ又は複数の細胞を分離することにより単離されてもよい。αアミラーゼは、発酵ブロスを真空ろ過による細胞分離に供することにより単離されてもよい。
精製
一態様において、好ましくは本発明において使用されるペプシン耐性αアミラーゼは精製された形態である。用語「精製された」は、所与の構成成分が高レベルで存在することを意味する。構成成分は、望ましくは組成物中に存在する主構成成分である。好ましくは
、構成成分は、少なくとも約６０％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％のレベルで存在し、前記レベルは検討対象の全組成に関する乾燥重量／乾燥重量基準で決定される。実施形態によっては、その大きさは少なくとも約８５％であり、前記レベルは検討対象の全組成に関する乾燥重量／乾燥重量基準で決定される。
濃縮
一態様において、好ましくは本発明において使用されるペプシン耐性αアミラーゼは濃縮物として使用される。濃縮物は、中に酵素が排出された培地の濃縮された形態であってもよい。好ましくは、濃縮物は、中に酵素が分泌された、且つ１つ又は複数の細胞が取り除かれている培地の濃縮された形態であってもよい。
ヌクレオチド配列
本発明の範囲は、本明細書に定義するとおりの特定の特性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。
用語「ヌクレオチド配列」は、本明細書で使用されるとき、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、並びにその変異体、相同体、断片及び誘導体（その一部分など）を指す。ヌクレオチド配列はゲノム起源又は合成起源又は組換え起源であってよく、二本鎖又は一本鎖（センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれに相当するのであれ）であってよい。
本発明に関する用語「ヌクレオチド配列」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡを含む。好ましくは、それは、本発明をコードするＤＮＡ、より好ましくはｃＤＮＡ配列を意味する。
好ましい実施形態において、本発明の範囲それ自体に関するときの、且つそれにより包含されるときのヌクレオチド配列は、その天然環境中にあるときの、及びそれが同様にその天然環境中にあるその天然に関連付けられている１つ又は複数の配列と連結されているときの本発明に係る天然ヌクレオチド配列を含まない。参照を容易にするため、本発明者らはこの好ましい実施形態を「非天然ヌクレオチド配列」と呼ぶものとする。この点について、用語「天然ヌクレオチド配列」は、その天然環境中にあるヌクレオチド配列であって、且つそれが天然に関連付けられている、同様にその天然環境中にあるプロモーター全体に作動可能に連結されているときのヌクレオチド配列全体を意味する。しかしながら、本発明の範囲により包含されるアミノ酸配列は、その天然の生物におけるヌクレオチド配列の発現後に単離及び／又は精製することができる。しかしながら好ましくは、本発明の範囲により包含されるアミノ酸配列は、その天然の生物におけるヌクレオチド配列であって、しかし当該の生物体内でそれが天然に関連付けられているプロモーターの制御下にないヌクレオチド配列によって発現され得る。
典型的には、本発明の範囲により包含されるヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技法を用いて調製される（すなわち組換えＤＮＡ）。しかしながら、本発明の代替的実施形態では、ヌクレオチド配列は、全面的に、又は部分的に、当該技術分野において公知の化学的方法を用いて合成され得る（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２１５−２３及びＨｏｒｎ Ｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２２５−２３２を参照のこと）。
ヌクレオチド配列の調製
本明細書に定義するとおりの特定の特性を有するタンパク質又は修飾に好適なタンパク
質のいずれかをコードするヌクレオチド配列は、前記タンパク質を産生する任意の細胞又は生物から同定及び／又は単離及び／又は精製され得る。ヌクレオチド配列の同定及び／又は単離及び／又は精製については、当該技術分野内で様々な方法が周知されている。例として、好適な配列が同定及び／又は単離及び／又は精製された後、より多くの配列を調製するＰＣＲ増幅技法が用いられてもよい。
さらなる例として、酵素を産生する生物から染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを使用してゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリを作製し得る。酵素のアミノ酸配列が分かっている場合、標識オリゴヌクレオチドプローブが合成され、それを使用してその生物から作製されたゲノムライブラリから、酵素をコードするクローンが同定され得る。或いは、任意の既知の酵素遺伝子と相同な配列を含む標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して、酵素をコードするクローンを同定することができる。後者の場合、より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件が用いられる。
或いは、ゲノムＤＮＡの断片をプラスミドなどの発現ベクターに挿入し、得られるゲノムＤＮＡライブラリで酵素陰性細菌を形質転換し、次にその形質転換細菌を、酵素に対する基質（すなわちマルトース）を含有する寒天プレートに播いて、それにより酵素を発現するクローンの同定を可能にすることにより、酵素をコードするクローンを同定してもよい。
さらに別の代替例において、酵素をコードするヌクレオチド配列は、確立された標準方法、例えば、Ｂｅｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２，ｐ １８５９−１８６９により記載されるホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）方法、又はＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３，ｐ ８０１−８０５により記載される方法により合成的に調製されてもよい。ホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）方法では、オリゴヌクレオチドが、例えば自動ＤＮＡ合成機で合成され、精製され、アニールされ、ライゲートされ、及び適切なベクターにクローニングされる。
ヌクレオチド配列は、ゲノム及び合成の混合型起源、合成及びｃＤＮＡの混合型起源、又はゲノム及びｃＤＮＡの混合型起源であってよく、合成起源、ゲノム起源又はｃＤＮＡ起源の断片（必要に応じて）を、標準技術に従いライゲートすることにより調製される。各ライゲートされた断片は、ヌクレオチド配列全体の様々な部分に対応する。ＤＮＡ配列はまた、例えば米国特許第４，６８３，２０２号明細書又はＳａｉｋｉ Ｒ Ｋ ｅｔ ａｌ．，（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐｐ ４８７−４９１）に記載されるとおり、特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製されてもよい。
アミノ酸配列
本発明の範囲はまた、本明細書に定義するとおりの特定の特性を有する酵素のアミノ酸配列も包含する。
本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義語である。ある場合には、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義語である。ある場合には、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義語である。
アミノ酸配列は好適な供給源から調製／単離されてもよく、又は合成的に作製されてもよく、又は組換えＤＮＡ技法を用いて調製されてもよい。
本発明に包含されるタンパク質は、他のタンパク質、特に酵素と共に使用され得る。従って本発明はタンパク質の組み合わせも包含し、ここでその組み合わせは、本発明のタンパク質／酵素と、本発明に係る別のタンパク質／酵素であってよい別のタンパク質／酵素とを含む。
好ましくは、本発明の範囲それ自体に関するときの、且つそれにより包含されるときのアミノ酸配列は、天然酵素ではない。この点について、用語「天然酵素」は、その天然環境中にある、及びそれがその天然ヌクレオチド配列により発現されたときの酵素全体を意味する。
配列同一性又は配列相同性
本発明はまた、本明細書に定義される特定の特性を有するポリペプチドの１つ又は複数のアミノ酸配列又はかかるポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列と一定の配列同一性又は配列相同性を有する配列（以下、「相同配列」と称する）の使用も包含する。ここで、用語「相同体」は、対象のアミノ酸配列及び対象のヌクレオチド配列と一定の相同性を有する実体を意味する。ここで、用語「相同性」は「同一性」と等しく扱われ得る。
相同アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は、酵素の機能的活性を維持し、及び／又は活性を亢進するポリペプチドを提供及び／又はコードしなければならない。
本明細書の文脈では、相同配列は、対象配列と少なくとも７５、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であってよいアミノ酸配列を含むものと解釈される。典型的には、相同体は対象アミノ酸配列と同じ活性部位等を含み得る。相同性はまた、類似性の観点でも考慮され得るが（すなわち類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明の文脈では配列同一性の観点で相同性を表現することが好ましい。
本明細書の文脈では、相同配列は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（対象配列）と少なくとも７５、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であってよいヌクレオチド配列を含むものと解釈される。典型的には、相同体は対象配列と同じ、活性部位等をコードする配列を含み得る。相同性はまた、類似性の観点でも考慮され得るが（すなわち類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明の文脈では配列同一性の観点で相同性を表現することが好ましい。
相同性の比較は肉眼で行うことができ、又はより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを用いて行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の％相同性を計算することができる。
％相同性は、連続する配列にわたって計算することができ、すなわち一つの配列を他の配列と整列させて、一方の配列の各アミノ酸を他方の配列の対応するアミノ酸と、一度に１残基ずつ直接比較する。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。典型的には、かかるギャップなしアラインメントは比較的少ない残基数に関してのみ行われる。
これは極めて単純で一貫した方法であるものの、例えば、本来は同一の配列ペアにおいて、一つの挿入又は欠失があるために続くアミノ酸残基がアラインメントから外れる点を考慮に入れることができず、従って大域的アラインメントを行うと潜在的に％相同性が大きく低下し得る。結果的に、ほとんどの配列比較方法は、全体的な相同性スコアに過度のペナルティを加えることなく、可能性のある挿入又は欠失を考慮に入れる最適アラインメントを生成するように設計される。これは、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入して局所的な相同性の最大化を試みることにより実現される。
しかしながら、これらのより複雑な方法は、同数の同じアミノ酸について、ギャップが可能な限り少ない−２つの比較される配列間のより高い関連性を反映する−配列アラインメントが、ギャップの多いものと比べて高いスコアを実現し得るように、アラインメントに現れる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。典型的には「アフィンギャップコスト」が用いられ、これはギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップにおけるそれぞれの後続残基に対してより小さいペナルティを課す。これは最も一般的に用いられているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然ながらギャップがより少ない最適化されたアラインメントを生成し得る。ほとんどのアラインメントプログラムでギャップペナルティを変更することができる。しかしながら、配列比較にかかるソフトウェアを使用する場合、初期値を使用することが好ましい。
従って最大％相同性の計算には、初めに、ギャップペナルティを考慮した、最適アラインメントの生成が必要である。かかるアラインメントの実行に好適なコンピュータプログラムは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）である。配列比較を実行することのできるソフトウェアの例としては、限定はされないが、例えば、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ １９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ − Ｃｈａｐｔｅｒ
１８を参照のこと）、ＢＬＡＳＴ ２（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７７（１）：１８７−８及びｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ １９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）及びＡｌｉｇｎＸが挙げられる。少なくともＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ ２及びＦＡＳＴＡは、オフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ １９９９，７−５８〜７−６０頁を参照のこと）。
最終的な％相同性は同一性の観点で計測することができるが、アラインメントプロセスそれ自体は、典型的にはオール・オア・ナッシングのペア比較に基づくものではない。代わりに、概してスケーリングした類似性スコア行列が用いられ、これは、化学的類似性又は進化距離に基づき各ペアワイズ比較にスコアを割り当てる。一般的に用いられるかかる行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列−ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルト行列−である。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩプログラムは、概して公式の初期値か、又は供給がある場合、カスタム記号比較テーブルのいずれかを使用する（さらなる詳細についてはユーザマニュアルを参照のこと）。適用によっては、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩパッケージの初期値を使用することが好ましい。
或いは相同性百分率は、アルゴリズムベースの、ＣＬＵＳＴＡＬに類似した、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）の多重アラインメント機能を用いて計算されてもよい（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ ＆ Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ ７３（１），２３７−２４４）。
ソフトウェアが最適アラインメントを生成すると、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能になる。ソフトウェアは、典型的には配列比較の一部としてこれを行い、数値的な結果を出す。
配列同一性を決定するときにギャップペナルティが用いられる場合、好ましくはペアワイズアラインメントに以下のパラメータが用いられる、すなわち、
Figure 0006391601
Figure 0006391601
一実施形態では、ＣＬＵＳＴＡＬは、上記に定義するとおりのギャップペナルティとギャップ伸長との組み合わせと共に用いられ得る。
好適には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、少なくとも２０連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも３０連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも４０連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも５０連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも６０連続ヌクレオチドにわたり、好ましくは少なくとも１００連続ヌクレオチドにわたり決定される。
好適には、ヌクレオチド配列に関する同一性の程度は、全配列にわたり決定され得る。
変異体／相同体／誘導体
本発明はまた、タンパク質の任意のアミノ酸配列又はかかるタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列の変異体、相同体及び誘導体の使用も包含する。
ここで、用語「相同体」は、対象のアミノ酸配列及び対象のヌクレオチド配列と一定の相同性を有する実体を意味する。ここで、用語「相同性」は「同一性」と等しく扱われ得る。
ここでの文脈では、相同配列は、対象配列と少なくとも７５、８０、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８又は９９％同一であってよいアミノ酸配列を含むものと解釈される。典型的には、相同体は対象アミノ酸配列と同じ活性部位等を含み得る。相同性はまた、類似性の観点でも考慮され得るが（すなわち類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明の文脈では配列同一性の観点で相同性を表現することが好ましい。
ここでの文脈では、相同配列は、本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列（対象配列）と少なくとも７５、８０、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８又は９９％同一であってよいヌクレオチド配列を含むものと解釈される。好ましい実施形態では、本発明において有用なヌクレオチド配列は、配列番号１に示すとおりのヌクレオチド配列と７５、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。さらに、本発明において有用なヌクレオチド配列は
、配列番号３に示すとおりのヌクレオチド配列と７５、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であるヌクレオチド配列を含む。典型的には、相同体は対象配列と同じ、活性部位等をコードする配列を含み得る。相同性はまた、類似性の観点でも考慮され得るが（すなわち類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明の文脈では配列同一性の観点で相同性を表現することが好ましい。
相同性の比較は肉眼で行うことができ、又はより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを用いて行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の％相同性を計算することができる。
％相同性は、連続する配列にわたって計算することができ、すなわち一つの配列を他の配列と整列させて、一方の配列の各アミノ酸を他方の配列の対応するアミノ酸と、一度に１残基ずつ直接比較する。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。典型的には、かかるギャップなしアラインメントは比較的少ない残基数に関してのみ行われる。
これは極めて単純で一貫した方法であるものの、例えば、本来は同一の配列ペアにおいて、一つの挿入又は欠失があるために続くアミノ酸残基がアラインメントから外れる点を考慮に入れることができず、従って大域的アラインメントを行うと潜在的に％相同性が大きく低下し得る。結果的に、ほとんどの配列比較方法は、全体的な相同性スコアに過度のペナルティを加えることなく、可能性のある挿入又は欠失を考慮に入れる最適アラインメントを生成するように設計される。これは、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入して局所的な相同性の最大化を試みることにより実現される。
しかしながら、これらのより複雑な方法は、同数の同じアミノ酸について、ギャップが可能な限り少ない−２つの比較される配列間のより高い関連性を反映する−配列アラインメントが、ギャップの多いものと比べて高いスコアを実現し得るように、アラインメントに現れる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。典型的には「アフィンギャップコスト」が用いられ、これはギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップにおけるそれぞれの後続残基に対してより小さいペナルティを課す。これは最も一般的に用いられているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然ながらギャップがより少ない最適化されたアラインメントを生成し得る。ほとんどのアラインメントプログラムでギャップペナルティを変更することができる。しかしながら、配列比較にかかるソフトウェアを使用する場合、初期値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列に対するデフォルトのギャップペナルティはギャップについて−１２であり、伸長毎に−４である。
従って最大％相同性の計算には、初めに、ギャップペナルティを考慮した、最適アラインメントの生成が必要である。かかるアラインメントの実行に好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ １９８４ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２ ｐ３８７）。配列比較を実行することのできる他のソフトウェアの例としては、限定はされないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ − Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照のこと）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールスイートが挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡの双方は、オフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７−５８〜７−６０頁を参照のこと）。しかしながら、適用によっては、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用する
ことが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと称される新しいツールもまた、タンパク質及びヌクレオチドの配列比較に利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
Ｌｅｔｔ １９９９ １７７（１）：１８７−８及びｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと）。
最終的な％相同性は同一性の観点で計測することができるが、アラインメントプロセスそれ自体は、典型的にはオール・オア・ナッシングのペア比較に基づくものではない。代わりに、概してスケーリングした類似性スコア行列が用いられ、これは、化学的類似性又は進化距離に基づき各ペアワイズ比較にスコアを割り当てる。一般的に用いられるかかる行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列−ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルト行列−である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、概して公式の初期値か、又は供給がある場合、カスタム記号比較テーブルのいずれかを使用する（さらなる詳細についてはユーザマニュアルを参照のこと）。適用によっては、ＧＣＧパッケージの公式初期値、又は他のソフトウェアの場合、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用することが好ましい。
或いは相同性百分率は、アルゴリズムベースの、ＣＬＵＳＴＡＬに類似した、ＤＮＡＳＩＳ（商標）（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）の多重アラインメント機能を用いて計算されてもよい（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ ＆ Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ ７３（１），２３７−２４４）。
ソフトウェアが最適アラインメントを生成すると、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能になる。ソフトウェアは、典型的には配列比較の一部としてこれを行い、数値的な結果を出す。
配列はまた、サイレントな変化を生じて機能的に等価な物質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換も有し得る。物質の二次結合活性が保たれる限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質の類似性に基づいて意図的なアミノ酸置換を行うことができる。例えば、負電荷のアミノ酸としてはアスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ；正電荷のアミノ酸としてはリジン及びアルギニンが挙げられ；及び同様の親水性値を有する非荷電極性頭部基を含むアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが挙げられる。
保存的置換を、例えば以下の表に従い行うことができる。第２列の同じブロックにあるアミノ酸、及び好ましくは第３列の同じラインにあるアミノ酸が、互いに置換され得る：
Figure 0006391601
本発明はまた、起こり得る相同性置換（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）の双方が、本明細書では、現在のアミノ酸残基を代替の残基に入れ替えることを意味して用いられる）、すなわち、塩基性に対して塩基性、酸性に対して酸性、極性に対して極性など、同種同士の置換も包含する。非相同性置換、すなわち一つの残基クラスから別の残基クラスへの置換、或いは、オルニチン（以下、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと称する）、ピリイルアラニン（ｐｙｒｉｙｌａｌａｎｉｎｅ）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の取り込みを伴う置換もまた起こり得る。
置換はまた、非天然アミノ酸；α＊及びα−二置換＊アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、天然アミノ酸のハロゲン化物誘導体、例えば、トリフルオロチロシン＊、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン＊、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン＊、Ｌ−アリル−グリシン＊、β−アラニン＊、Ｌ−α−アミノ酪酸＊、Ｌ−γ−アミノ酪酸＊、Ｌ−α−アミノイソ酪酸＊、Ｌ−ε−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸＊、Ｌ−メチオニンスルホン＊、Ｌ−ノルロイシン＊、Ｌ−ノルバリン＊、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン＊、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン＊、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体、例えば、４−メチル−Ｐｈｅ＊、ペンタメチル−Ｐｈｅ＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）＊、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）＊、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）＊、Ｌ−ジアミノプロピオン酸及びＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）＊によっても行われ得る。記号＊は、上記の考察（相同性又は非相同性置換に関する）の目的上、誘導体の疎水性の性質を示すために利用しており、一方、＃は、誘導体の親水性の性質を示すために利用しており、＃＊は両親媒性の特性を示す。
変異アミノ酸配列は、グリシン残基又はβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えて、メチル基、エチル基又はプロピル基などのアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基間に挿入され得る好適なスペーサー基を含み得る。変異体のさらなる形態には、ペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在が関わり、当業者は十分に理解するであろう。誤解を避けるため、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素上でなく、残基の窒素原子上にある変異アミノ酸残基を指して用いられる。ペプトイド形態のペプチドの調製方法は、当該技術分野において、例えばＳｉｍｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１及びＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４で公知である。
本発明において使用されるヌクレオチド配列は、その中に、合成又は修飾ヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドに対する数多くの異なる種類の修飾が、当該技術分野において公知である。それらには、メチルホスホネート骨格及びホスホロチオエート骨格及び／又は分子の３’末端及び／又は５’末端におけるアクリジン鎖又はポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明の目的上、本明細書に記載されるヌクレオチド配列は当該技術分野において利用可能な任意の方法により修飾され得ることが理解されるべきである。かかる修飾は、本発明のヌクレオチド配列のインビボ活性又は寿命を高めるために実施され得る。
本発明はまた、本明細書に提示される配列と相補的なヌクレオチド配列、又はその任意の誘導体、断片若しくは誘導体の使用も包含する。配列がその断片に相補的な場合、当該の配列をプローブとして使用して、他の生物等における類似のコード配列を同定することができる。
本発明の配列と１００％相同でないが、本発明の範囲内に含まれるポリヌクレオチドを、数多くの方法で得ることができる。本明細書に記載される配列の他の変異体が、例えば、様々な個体、例えば種々の集団の個体から作製されたＤＮＡライブラリを探索することにより得られ得る。加えて、他の相同体を得ることができ、かかる相同体及びその断片は、一般に、本明細書の配列表に示される配列と選択的にハイブリダイズする能力を有し得る。かかる配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリ又は他の動物種のゲノムＤＮＡライブラリを探索し、かかるライブラリを、添付の配列表にある配列のうちの任意の１つの全て又は一部を含むプローブにより、中程度〜高ストリンジェンシーの条件下で探索することにより得てもよい。同様の考察が、本発明のポリペプチド配列又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立遺伝子変異体を得ることに対しても該当する。
変異体及び株／種相同体はまた縮重ＰＣＲを用いて得てもよく、縮重ＰＣＲは、本発明の配列内の保存アミノ酸配列をコードする変異体及び相同体内にある配列を標的とするように設計されたプライマーを使用し得る。保存配列は、例えばいくつかの変異体／相同体からのアミノ酸配列を整列させることにより予測し得る。配列アラインメントは、当該技術分野で周知されているコンピュータソフトウェアを使用して行うことができる。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く使用されている。
縮重ＰＣＲで使用されるプライマーは１つ以上の縮重位置を含み、既知の配列に対する単一の配列プライマーによる配列のクローニングに用いられるものと比べて低いストリンジェンシー条件で用いられ得る。
或いは、かかるポリヌクレオチドは、特徴付けられた配列の部位特異的突然変異誘発により得てもよい。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列を発現させる特定の宿主細胞に対するコドン選択を最適化するためにサイレントなコドン配列変化が要求される場合に、有用であり得る。制限酵素認識部位を導入するため、又はポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの特性若しくは機能を改変するため、他の配列変化が望ましいこともある。
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）を使用して、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、選択的増幅反応用のプライマー、例えば従来の手段により放射性又は非放射性標識を使用して指示的標識（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｌａｂｅｌ）で標識されたプローブが産生されてもよく、又はポリヌクレオチドはベクターにクローニングされてもよい。かかるプライマー、プローブ及び他の断片は、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０又は４０ヌクレオチド長であり、本明細書で使用されるとおりの本発明の用語ポリヌクレオチドに同様に包含される。
本発明に係るＤＮＡポリヌクレオチド及びプローブなどのポリヌクレオチドは、組換え的に、合成的に、又は当業者に利用可能な任意の手段により作製され得る。それらはまた、標準的な技術によりクローニングされてもよい。
一般に、プライマーは、一度に１ヌクレオチドずつの、所望の核酸配列の段階的な製造が関わる合成手段により作製され得る。自動化された技法を用いてこれを達成する技法が、当該技術分野において容易に利用可能である。
長いポリヌクレオチドほど、概して組換え手段を用いて、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて作製され得る。プライマーは好適な制限酵素認識部位を含むように設計されてもよく、それにより増幅されたＤＮＡを好適なクローニングベクターにクローニングすることができる。
ハイブリダイゼーション
本発明はまた、本発明の核酸配列に相補的な配列、又は本発明の配列若しくはそれと相補的な配列のいずれかとのハイブリダイゼーション能を有する配列も包含する。
用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で使用されるとき、「核酸鎖を塩基対形成によって相補鎖とつなぎ合わせる方法」並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法で実施されるとおりの増幅方法を含むものとする。
本発明はまた、本明細書に提示される配列に相補的な配列とのハイブリダイゼーション能を有するヌクレオチド配列、又はその任意の誘導体、断片若しくは誘導体の使用も包含する。
用語「変異体」はまた、本明細書に提示されるヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション能を有する配列に相補的な配列も包含する。
好ましくは、用語「変異体」は、ストリンジェントな条件下（例えば５０℃及び０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａ３ ｐＨ７．０｝）において本明細書に提示されるヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション能を有する配列に相補的な配列を包含する。
より好ましくは、用語「変異体」は、高ストリンジェントな条件下（例えば６５℃及び０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａ３ ｐＨ７．０｝）において本明細書に提示されるヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション能を有する配列に相補的な配列を包含する。
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に提示される配列の相補配列を含む）とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列にも関する。
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に提示される配列の相補配列を含む）とハイブリダイズすることができる配列と相補的なヌクレオチド配列にも関する。
また、本発明の範囲内には、中程度〜最高のストリンジェンシーの条件下において本明細書に提示されるヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション能を有するポリヌクレオチド配列も含まれる。
好ましい態様において、本発明は、ストリンジェントな条件下（例えば５０℃及び０．
２×ＳＳＣ）において本発明のヌクレオチド配列、又はその相補体とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を対象とする。
より好ましい態様において、本発明は、高ストリンジェントな条件下（例えば６５℃及び０．１×ＳＳＣ）において本発明のヌクレオチド配列、又はその相補体とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を対象とする。
分子進化
非限定的な例として、インビボで、或いはインビトロで、ヌクレオチド配列に多数の部位特異的突然変異又はランダム突然変異を生じさせ、続いてコードされたポリペプチドの機能性の向上について様々な手段によってスクリーニングすることが可能である。
加えて、ポリヌクレオチド配列の突然変異体又は天然の変異体を、野生型又は他の突然変異体、或いは天然の変異体のいずれかと組み換え、新規変異体を作製することができる。かかる新規変異体もまた、コードされたポリペプチドの機能性の向上についてスクリーニングすることができる。好ましい新規変異体の作製は、当該技術分野で十分に確立された様々な方法、例えば、エラー閾値突然変異誘発（Ｅｒｒｏｒ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（国際公開第９２／１８６４５号パンフレット）、オリゴヌクレオチド媒介ランダム突然変異誘発（米国特許第５，７２３，３２３号明細書）、ＤＮＡシャフリング（米国特許第５，６０５，７９３号明細書）、エキソ媒介（ｅｘｏ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）遺伝子構築 国際公開第００／５８５１７号パンフレットにより実現することができる。これらの、及び類似のランダム定方向分子進化法を適用することで、タンパク質の構造又は機能についての予備知識が全くなくても、好ましい特性を有する本発明の酵素の変異体の同定及び選択が可能になり、予測不可能な、しかし有益な突然変異又は変異体の作製が可能になる。当該技術分野においては、酵素活性の最適化又は改変に分子進化を適用する例は数多くあり、かかる例としては、限定はされないが、以下の１つ以上が挙げられる、すなわち、宿主細胞又はインビトロでの発現及び／又は活性の最適化、酵素活性の増進、基質及び／又は産物特異性の変更、酵素的又は構造的安定性の増進又は低減、好ましい環境条件下、例えば温度、ｐＨ、基質における酵素活性／特異性の変更。
部位特異的突然変異誘発
タンパク質コードヌクレオチド配列が単離された後、又は推定上のタンパク質コードヌクレオチド配列が同定された後、本発明のタンパク質を調製するために配列を変異させることが望ましいこともある。
突然変異は合成オリゴヌクレオチドを使用して導入され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の突然変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含む。
好適な方法は、Ｍｏｒｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）２，ｐ６４６−６４９）に開示される。酵素をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入する別の方法が、Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｎｇ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９），１８０，ｐ １４７−１５１）に記載される。
組換え
一態様では、本発明において使用される配列は組換え配列−すなわち組換えＤＮＡ技法を用いて調製された配列である。
これらの組換えＤＮＡ技法は、当業者の能力の範囲内である。かかる技法は、文献、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ
，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに説明されている。
合成
一態様では、本発明において使用される配列は合成配列−すなわち化学的又は酵素的インビトロ合成により調製された配列である。これには、限定はされないが、宿主生物−メチロトローフ酵母のピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）及びハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）など−に最適なコドン使用頻度で作製された配列が含まれる。
酵素の発現
本発明において使用されるヌクレオチド配列は、複製能を有する組換えベクターに組み込まれ得る。このベクターを使用して、適合する宿主細胞内で、及び／又はそこから、タンパク質／酵素の形態で、ヌクレオチド配列が複製及び発現され得る。
発現は、制御配列、例えば調節配列を使用して制御され得る。
宿主組換え細胞によってヌクレオチド配列の発現により産生されるタンパク質は、使用される配列及び／又はベクターに応じて、分泌されてもよく、又は細胞内に含まれていてもよい。コード配列はシグナル配列と共に設計されてもよく、シグナル配列は、特定の原核又は真核細胞膜を介した、物質をコードする配列の分泌を誘導する。
発現ベクター
用語「発現ベクター」は、インビボ又はインビトロ発現能を有するコンストラクトを意味する。
好ましくは、発現ベクターは好適な宿主生物のゲノムに組み込まれる。用語「組み込まれる」は、好ましくはゲノムへの安定な組み込みを対象とする。
本発明のヌクレオチド配列はベクター内に存在することができ、そこでヌクレオチド配列は、好適な宿主生物によるヌクレオチド配列の発現を提供する能力を有する調節配列に作動可能に連結されている。
本発明において使用されるベクターは、以下に記載するとおりの好適な宿主細胞に形質転換されることにより、本発明のポリペプチドの発現を提供し得る。
ベクターの選択、例えばプラスミド、コスミド、又はファージベクターは、多くの場合、それが導入される宿主細胞に依存し得る。
本発明において使用されるベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子−例えば、抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与する遺伝子を含み得る。或いは、選択は同時形質転換により達成されてもよい（国際公開第９１／１７２４３号パンフレットに記載されるとおり）。
ベクターは、インビトロで例えばＲＮＡを作製するために用いられ得るか、又は宿主細胞のトランスフェクション、形質転換、形質導入若しくは感染に用いられ得る。
従って、さらなる実施形態において、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を複製能を有するベクターに導入し、そのベクターを適合する宿主細胞に導入し、及びベクターの複製をもたらす条件下でその宿主細胞を成長させることによる、本発明のヌクレオチド配列
の作製方法を提供する。
ベクターは、当該の宿主細胞におけるベクターの複製を可能にするヌクレオチド配列をさらに含み得る。かかる配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１及びｐＩＪ７０２の複製起点である。
調節配列
適用によっては、本発明において使用されるヌクレオチド配列は、選択された宿主細胞によるなどの、ヌクレオチド配列の発現を提供する能力を有する調節配列に作動可能に連結されている。例として、本発明は、かかる調節配列に作動可能に連結された本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを対象とし、すなわちこのベクターは発現ベクターである。
用語「作動可能に連結された」は、記載される構成成分が、それらの意図された形での動作を可能にする関係にあって並んだ状態を指す。コード配列に「作動可能に連結された」調節配列は、制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が実現されるような方法でライゲートされる。
用語「調節配列」は、プロモーター及びエンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む。
用語「プロモーター」は、当該技術分野の通常の意味で用いられ、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の発現の亢進はまた、異種調節領域、例えばプロモーター領域、分泌リーダー領域及びターミネーター領域の選択によって実現されてもよい。
好ましくは、本発明に係るヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターに作動可能に連結される。
さらには他のプロモーターを使用して本発明のポリペプチドの発現を誘導してもよい。
細菌、真菌又は酵母宿主におけるヌクレオチド配列の転写を誘導するのに好適なプロモーターの例は、当該技術分野において周知されている。
プロモーターは、好適な宿主での発現を確実にする、又は増加させる特徴をさらに含み得る。例えば、それらの特徴は、プリブノーボックス又はＴＡＴＡボックスなどの保存領域であり得る。
コンストラクト
用語「コンストラクト」−これは「コンジュゲート」、「カセット」及び「ハイブリッド」などの用語と同義語である−には、プロモーターに直接的又は間接的に結合された、本発明により使用されるヌクレオチド配列が含まれる。
直接的な結合の例は、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列との中間にあるイントロン配列、例えばＳｈ１−イントロン又はＡＤＨイントロンなどの、好適なスペーサー基の提供である。同じことが、本発明との関連における用語「融合した」にも当てはまり、これには直接的又は間接的な結合が含まれる。ある場合には、これらの用語は、通常野生型遺伝子プロモーターと関連付けられている、及びそれらが双方ともその天然環境にある
ときの、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の天然の組み合わせを対象としない。
さらにはコンストラクトは、遺伝子コンストラクトの選択を可能にするマーカーを含み、又はそれを発現し得る。
適用によっては、好ましくは本発明のコンストラクトは、プロモーターに作動可能に連結された本発明の少なくともヌクレオチド配列を含む。
宿主細胞
用語「宿主細胞」は−本発明との関連において−、上記に記載したとおりのヌクレオチド配列又は発現ベクターのいずれかを含み、且つ本明細書に定義するとおりの特定の特性を有するタンパク質の組換え産生に使用される任意の細胞を含む。
従って、本発明のさらなる実施形態は、本発明のタンパク質を発現するヌクレオチド配列で形質転換された、又はそれをトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。細胞は前記ベクターと適合するように選択され、例えば原核細胞（例えば細菌細胞）、真菌細胞、酵母細胞又は植物細胞であってもよい。
好適な細菌宿主生物の例は、グラム陽性又はグラム陰性細菌種である。
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の性質、及び／又は発現したタンパク質をさらに処理することの望ましさによっては、酵母又は他の真菌などの真核生物宿主が好ましいこともある。一般に、酵母細胞の方が操作し易いため、真菌細胞より酵母細胞が好ましい。しかしながら、タンパク質によっては、酵母細胞からの分泌が低いか、或いは場合によっては適切にプロセッシングされない（例えば酵母における過剰糖鎖付加）。そのような場合、異なる真菌宿主生物が選択されなければならない。
好適な宿主細胞−酵母、真菌及び植物宿主細胞など−を使用することにより、本発明の組換え発現産物に最適な生物活性を付与するために必要であり得るとおりの翻訳後修飾（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、トランケーション、ラピデーション（ｌａｐｉｄａｔｉｏｎ）及びチロシン、セリン又はスレオニンリン酸化）が提供され得る。
宿主細胞はプロテアーゼ欠損株又はプロテアーゼマイナス株であってもよい。これは、例えば、「ａｌｐ」と名付けられたアルカリプロテアーゼ遺伝子を欠失させたプロテアーゼ欠損株アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＪａＬ １２５であってもよい。この株は、国際公開第９７／３５９５６号パンフレットに記載されている。
生物
本発明との関連において用語「生物」は、本発明に係るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又はそれから得られる産物を含み得る任意の生物、及び／又はその生物体内に存在するときプロモーターによる本発明に係るヌクレオチド配列の発現を可能にし得る任意の生物を含む。
好適な生物としては、原核生物、真菌、酵母又は植物を挙げることができる。
本発明との関連において用語「トランスジェニック生物」は、本発明に係るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又はそれから得られる産物を含む任意の生物、及び／又はその生物体内にあるプロモーターによる本発明に係るヌクレオチド配列の発現を可能にし得る任意の生物を含む。好ましくはヌクレオチド配列は生物のゲノムに組み込ま
れる。
用語「トランスジェニック生物」は、その天然環境中にある天然ヌクレオチドコード配列であって、同様にその天然の環境中にあるその天然のプロモーターの制御下にあるときの天然ヌクレオチドコード配列を対象としない。
従って、本発明のトランスジェニック生物は、本発明に係るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、本発明に係るコンストラクト、本発明に係るベクター、本発明に係るプラスミド、本発明に係る細胞、本発明に係る組織、又はその産物のいずれか一つ、又はその組み合わせを含む生物を含む。
例えばトランスジェニック生物はまた、異種プロモーターの制御下で本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含み得る。
宿主細胞／生物の形質転換
先に示したとおり、宿主生物は原核生物又は真核生物であり得る。好適な原核生物宿主の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。
原核生物宿主の形質転換に関する教示は当該技術分野において十分に解説されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと。原核生物宿主が使用される場合、ヌクレオチド配列は形質転換前に好適な修飾−イントロンの除去によるなど−が必要となり得る。
糸状菌細胞は、当該技術分野において公知の様々な方法−プロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換と、それに続く公知の方法による細胞壁の再生が関わる方法など−を用いて形質転換され得る。宿主微生物としてのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の使用が、欧州特許第０ ２３８ ０２３号明細書に記載されている。
別の宿主生物は植物であり得る。植物の形質転換に用いられる一般的な技法についての概説は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ［１９９１］ ４２：２０５−２２５）及びＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｈｉ−Ｔｅｃｈ Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ １９９４ １７−２７）に見ることができる。植物の形質転換に関するさらなる教示は、欧州特許出願公開第Ａ−０４４９３７５号明細書に見ることができる。
以下の節に、真菌、酵母及び植物の形質転換に関する一般的な教示を提供する。
形質転換真菌
宿主生物は真菌−カビなど−であってもよい。好適なかかる宿主の例としては、サーモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などに属する任意のメンバーが挙げられる。
一実施形態において、宿主生物は糸状菌であってもよい。
糸状菌の形質転換は米国特許第Ａ−５７４１６６５号明細書に考察され、この明細書は
、糸状菌の形質転換及び真菌の培養についての標準的な技術が当該技術分野において公知であると述べている。アカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）に適用されるとおりの技法の広範な概説が、例えばＤａｖｉｓ ａｎｄ ｄｅ Ｓｅｒｒｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９７１）１７Ａ：７９ １４３に見られる。
同様に糸状菌の形質転換に利用され得るさらなる教示が、米国特許第Ａ−５６７４７０７号明細書に概説されている。
加えて、糸状菌における遺伝子発現が、Ｐｕｎｔ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００２ Ｍａｙ；２０（５）：２００−６，Ａｒｃｈｅｒ ＆ Ｐｅｂｅｒｄｙ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９７）１７（４）：２７３−３０６に教示されている。
本発明は、これらの標準的な技術を用いて調製される本発明に係るトランスジェニック糸状菌の産生を包含する。
一態様において、宿主生物はアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のもの、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）であり得る。
本発明に係るトランスジェニックのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）もまた、例えば、Ｔｕｒｎｅｒ Ｇ．１９９４（Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ Ｓ．Ｄ．，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ
Ｊ．Ｒ．（Ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ：５０ ｙｅａｒｓ ｏｎ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ ２９．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ １９９４．ｐｐ．６４１−６６６）の教示に従い調製することができる。
形質転換酵母
別の実施形態において、トランスジェニック生物は酵母であり得る。
酵母における異種遺伝子発現の原理の概説は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９５），４９：３４１−５４、及びＣｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９７）Ｏｃｔ；８（５）：５５４−６０に提供される。
これに関連して、酵母−サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ）又はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの種（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ（２０００ ２４（１）：４５−６６を参照のこと）を、異種遺伝子発現の媒体として使用することができる。
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における異種遺伝子発現及び遺伝子産物の分泌の原理の概説は、Ｅ Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ Ｅ Ｋｅｎｎｙ（１９９３，“Ｙｅａｓｔ ａｓ ａ ｖｅｈｉｃｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ”，Ｙｅａｓｔｓ，Ｖｏｌ ５，Ａｎｔｈｏｎｙ Ｈ Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｊ Ｓｔｕａｒｔ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，ｅｄｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．）により提供される。
酵母の形質転換について、いくつかの形質転換プロトコルが開発されている。例えば、本発明に係るトランスジェニックのサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は、Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ ７５，１９２９）；Ｂｅｇｇｓ，Ｊ Ｄ（１９７８，Ｎａｔｕｒｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，２７５，１０４）；及びＩｔｏ，Ｈ ｅｔ ａｌ（１９８３，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
１５３，１６３−１６８）の教示に従い調製することができる。
形質転換酵母細胞は、様々な選択的マーカー−栄養要求性マーカー優性抗生物質耐性マーカーなど−を使用して選択され得る。
形質転換植物／植物細胞
本発明に好適な宿主生物は植物であってもよい。この点で、遺伝子修飾された植物の作製における基本的な原理は、挿入された遺伝物質の安定維持が達成されるように植物ゲノムに遺伝情報を挿入することである。一般的技法の概説は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（Ａｎｎｕ
Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ［１９９１］
４２：２０５−２２５）及びＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｈｉ−Ｔｅｃｈ Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ １９９４ １７−２７）による論文に見ることができる。
アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による植物組織の直接感染は、広く用いられている単純な技法であり、Ｂｕｔｃｈｅｒ Ｄ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（１９８０），Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ，ｅｄｓ．：Ｄ．Ｓ．Ｉｎｇｒａｍｓ ａｎｄ Ｊ．Ｐ．Ｈｅｌｇｅｓｏｎ，２０３−２０８に記載されている。
植物を形質転換する他の技法としては、バリスティック形質転換、炭化ケイ素ホイスカー技法（Ｆｒａｍｅ ＢＲ，Ｄｒａｙｔｏｎ ＰＲ，Ｂａｇｎａａｌｌ ＳＶ，Ｌｅｗｎａｕ ＣＪ，Ｂｕｌｌｏｃｋ ＷＰ，Ｗｉｌｓｏｎ ＨＭ，Ｄｕｎｗｅｌｌ ＪＭ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＡ ＆ Ｗａｎｇ Ｋ（１９９４）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｔｉｌｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｉｚｅ ｐｌａｎｔｓ ｂｙ ｓｉｌｉｃｏｎ
ｃａｒｂｉｄｅ ｗｈｉｓｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：９４１−９４８を参照のこと）及びウイルス形質転換技法（例えば、Ｍｅｙｅｒ Ｐ，Ｈｅｉｄｍａｎｎ Ｉ ＆ Ｎｉｅｄｅｎｈｏｆ Ｉ（１９９２）Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｃａｓｓａｖａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｐｌａｎｔｓ，Ｇｅｎｅ １１０：２１３−２１７を参照のこと）が挙げられる。
植物の形質転換に関するさらなる技法は、欧州特許出願公開第Ａ−０４４９３７５号明細書に見ることができる。
植物細胞は、アミノ酸、植物ホルモン、ビタミン等の必須成長因子を補充した好適な培養培地で細胞を培養することによるなど、公知の組織培養方法に従い成長及び維持され得る。
さらなる態様において、本発明は、本発明に係るヌクレオチド配列又はコンストラクトを含む、且つそのヌクレオチド配列又はコンストラクトを植物などの生物のゲノムに導入する能力を有するベクター系に関する。ベクター系は１つのベクターを含んでもよいが、２つのベクターを含んでもよい。２つのベクターの場合、ベクター系は通常、バイナリーベクター系と称される。バイナリーベクター系については、Ｇｙｎｈｅｕｎｇ Ａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８０），Ｂｉｎａｒｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ３，１−１９にさらに詳細に記載される。
植物細胞の形質転換に広く用いられる一つのシステムは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のＴｉプラスミド又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）由来のＲｉプラスミドを使用する Ａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６），Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８１，３０１−３０５及びＢｕｔｃｈｅｒ Ｄ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（１９８０），Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ，ｅｄｓ．：Ｄ．Ｓ．Ｉｎｇｒａｍｓ ａｎｄ Ｊ．Ｐ．Ｈｅｌｇｅｓｏｎ，２０３−２０８。植物における所望のプロモーター又は本発明に係るコンストラクト又はヌクレオチド配列の各導入方法の後、さらなるＤＮＡ配列の存在及び／又は挿入が必要であり得る。例えば、形質転換に植物細胞のＴｉプラスミド又はＲｉプラスミドが用いられる場合、Ｔｉプラスミド及びＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの少なくとも右側境界、しかしながら多くの場合に右側及び左側境界が、導入された遺伝子のフランキング領域として、つなげられ得る。植物細胞の形質転換に対するＴ−ＤＮＡの使用は集中的に研究されており、欧州特許出願公開第Ａ−１２０５１６号明細書；Ｈｏｅｋｅｍａ：Ｔｈｅ Ｂｉｎａｒｙ Ｐｌａｎｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｏｆｆｓｅｔ−ｄｒｕｋｋｅｒｉｊ Ｋａｎｔｅｒｓ Ｂ．Ｂ．，Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ，１９８５，Ｃｈａｐｔｅｒ Ｖ；Ｆｒａｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，４：１−４６；及びＡｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：２７７−２８４に記載されている。
培養及び産生
本発明のヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、コードされたポリペプチドの産生をもたらす条件であって、細胞及び／又は培養培地からのポリペプチドの回収を促進する条件下で培養され得る。
細胞の培養に用いられる培地は、当該の宿主細胞を成長させてポリペプチドの発現を達成するのに好適な任意の従来の培地であってよい。
組換え細胞により産生されるタンパク質は、細胞表面に提示され得る。
タンパク質は宿主細胞から分泌されることができ、公知の手順を用いて培養培地から好都合に回収され得る。
分泌
多くの場合に、タンパク質は発現宿主から培養培地に分泌されることが望ましく、タンパク質はそこから容易に回収され得る。本発明によれば、所望の発現宿主に基づき分泌リーダー配列が選択され得る。ハイブリッドシグナル配列もまた、本発明との関連において用いられ得る。
異種分泌リーダー配列の典型的な例は、真菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（ｇｌａＡ−例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来の、１８及び２４アミノ酸型の双方）、ａ因子遺伝子（酵母、例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）及びハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ））又はα−アミラーゼ遺伝子（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））を起源とするものである。
例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における異種タンパク質の分泌が、Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）１８２：１３２−４３に概説される。
検出
アミノ酸配列の発現を検出及び計測するための様々なプロトコルが、当該技術分野において公知である。例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光活性化細胞分離法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
多種多様な標識及びコンジュゲーション技法が当業者に公知であり、様々な核酸及びアミノ酸アッセイに用いることができる。
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、及びＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）などの数多くの企業が、これらの手順用に市販キット及びプロトコルを供給している。
好適なレポーター分子又は標識としては、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、又は発色剤並びに基質、補因子、阻害薬、磁性粒子などが挙げられる。かかる標識の使用を教示する特許には、米国特許第Ａ−３，８１７，８３７号明細書；米国特許第Ａ−３，８５０，７５２号明細書；米国特許第Ａ−３，９３９，３５０号明細書；米国特許第Ａ−３，９９６，３４５号明細書；米国特許第Ａ−４，２７７，４３７号明細書；米国特許第Ａ−４，２７５，１４９号明細書及び米国特許第Ａ−４，３６６，２４１号明細書が含まれる。
また、米国特許第Ａ−４，８１６，５６７号明細書に示されるとおり、組換え免疫グロブリンが作製されてもよい。
さらなる目的タンパク質（ＰＯＩ）
本発明により使用される配列はまた、１つ以上のさらなる目的タンパク質（ＰＯＩ）又は目的ヌクレオチド配列（ＮＯＩ）と共に用いられ得る。
ＰＯＩの非限定的な例としては、デンプン代謝に関わるタンパク質又は酵素、グリコーゲン代謝に関わるタンパク質又は酵素、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリサーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、脂肪分解酵素、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、３−フィターゼ（ＥＣ ３．１．３．８）又は６−フィターゼ（ＥＣ ３．１．３．２６）を含むフィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８）を含むキシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ２−オキシドレダクターゼ、ＥＣ １．１．３．５）又はそれらの組み合わせが挙げられる。ＮＯＩはさらには、これらの配列のいずれかのアンチセンス配列であってもよい。
ＰＯＩはさらには、例えば抽出及び精製に役立つ、融合タンパク質であってもよい。
ＰＯＩはさらには、分泌配列と融合してもよい。
他の配列もまた、分泌を促進し、又は分泌されるＰＯＩの収率を増加させることができ
る。かかる配列は、例えば英国特許出願第９８２１１９８．０号明細書に記載されるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ｃｙｐ Ｂ遺伝子の産物として、シャペロンタンパク質をコードし得る。
ＮＯＩは、限定はされないが、その発現産物のプロセッシング及び／又は発現を修飾する変化を含め、様々な理由からその活性を変化させるために改変され得る。さらなる例として、ＮＯＩはまた、特定の宿主細胞における発現が最適化されるように修飾されてもよい。制限酵素認識部位を導入するため、他の配列変化が望ましいこともある。
ＮＯＩは、その範囲内に、合成又は修飾ヌクレオチド−メチルホスホネート骨格及びホスホロチオエート骨格などを含み得る。
ＮＯＩは、細胞内安定性及び半減期が増加するように修飾されてもよい。可能性のある修飾としては、限定はされないが、分子の５’末端及び／又は３’末端のフランキング配列の付加又は分子の骨格内における、ホスホジエステラーゼ結合でなく、ホスホロチオエート又は２’−Ｏ−メチルの使用が挙げられる。
ここで本発明を、単に例として、以下の実施例を参照して説明する。
実施例１
本例は、単胃動物の消化器系におけるアミラーゼの残存を評価するために設計した。インビボでは、動物はアミラーゼを排出するため、添加した酵素の残存を調べることは困難である。従ってインビトロ試験を開発した。実験セットアップの条件は、単胃動物の胃腸管（ＧＩＴ）内の条件を模倣して設計した。アミラーゼを試験して、そのような条件に曝露された後にアミラーゼが活性かどうかを見た。α−アミラーゼ酵素ＬＴＡＡは動物試験で畜産能力を改善することが公知であったため、このα−アミラーゼを参照として使用した。
材料及び方法
緩衝液：
ペプシンインキュベーション緩衝液：０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０、３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、２．９ｍｇの無水塩化ナトリウム／ｍＬ、０．７３ｍｇの塩化カルシウム／ｍＬ。ペプシンを含む溶液について、２５ｍｇ／ｍｌ（９２５０Ｕ／ｍｌ）のペプシン（Ｓｉｇｍａ Ｐ−７０００）を含むようにインキュベーション緩衝液を調製し、続いて３つの連続１０倍希釈を行い、最終的に、それぞれ２５、２．５、０．２５、及び０．０２５ｍｇ／ｍｌのペプシンを含む４つの溶液とする。１ペプシン単位は、ヘモグロビンを基質として使用してＴＣＡ可溶性生成物として計測して、ｐＨ２．０、３７℃で毎分０．００１のΔＯＤ２８０を生じる酵素の量として定義される（Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｄｅｘに記載される）。
アミラーゼアッセイ緩衝液：リン酸−クエン酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ５．６。
アミラーゼアッセイ緩衝液、ＢＳＡ含有：リン酸−クエン酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ５．６、３ｍｇ／ＢＳＡ１ｍｌ。
酵素：
・ＦＲＥＤ（バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ、ＬＡＴの変異体）、Ｇｅｎｅｎｃｏｒから入手可能、国際公開第２００９／１４９２７１号パンフレットに記載されている。
・ＬＡＴ（バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ）、Ｇｅｎｅｎｃｏｒから入手可能（Ｐｕｒａｓｔａｒ ＳＴ１５０００Ｌ（著作権））、米国特許第６２１１１３４号明細書に記載されている。
・ＬＴＡＡ又はＥＢＡ（バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ）は飼料酵素業務によって用いられる酵素標準であったとともに、米国特許第５７６３３８５号明細書に記載されている。活性：５７４９２ＦＦＩ Ｕ／ｇ。
・ＢＡＮ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓから入手可能）。
・Ｔｒｉｃ． Ａｍｙｌ ＃２６（ＴｒＡＡ−トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）α−アミラーゼ）、国際公開第２００８／１１２７２９号パンフレットに記載される。
漸増ペプシン濃度に対する耐性：
いずれの酵素のセットアップも同じとした：酵素及び飼料による６つの試料を調製した（デュプリケートで）：緩衝液（ｐＨ３）中漸増量のペプシンを含む４つの試料、ペプシンを含まない、しかしインキュベーション緩衝液（ｐＨ３）中の１つの試料、及びＢＳＡ含有アッセイ緩衝液中に酵素を含む１つの陽性対照試料。これはデュプリケートで行い、すなわちペプシン耐性について試験する各酵素につき１２本のエッペンドルフ管（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｔｕｐｅ）が調製された。
試験する各酵素の２×６本の管に加え、酵素を添加しない２×６本の同様の試料を調製して、化学物質からのバックグラウンド吸光度を確認した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆからの各１．５ｍｌ微量遠心管に、１００ｍｇのトウモロコシベースの飼料を秤量した。漸増量のペプシンを含む、又は含まない９００μｌの容量のインキュベーション緩衝液又は９００μｌのアッセイ緩衝液を添加し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ ５４３６において５００ｒｐｍで５分間プレインキュベートした。１００μｌの容量の酵素溶液（又は１００μｌのＨ２Ｏ）を各管に添加し、蓋を閉め、その後、それらの管を４０℃で、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ ５４３６において５００ｒｐｍでインキュベートした。正確に１２０分間インキュベートした後、管（一度に６本）をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ卓上遠心機で２分間スピンダウンし、１００μｌを抜き取って９００μｌのアッセイ緩衝液と混合した。ＫｏｎｅＬａｂ Ａｒｅｎａ ２０ＸＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）で活性について試料を直ちに分析した。
所与のペプシン濃度におけるペプシン耐性は、ペプシンなしに上記のプロトコルに記載されるとおりｐＨ３で２時間インキュベートした後にＫｏｎｅＬａｂアッセイにより計測される活性と相対的に計測される、上記のプロトコルに記載されるとおりｐＨ３で２時間にわたり所与のペプシン濃度でインキュベートした後にＫｏｎｅＬａｂアッセイにより計測されるアミラーゼの活性として定義される。
ＫｏｎｅＬａｂアッセイ
化学物質：
クエン酸一水和物（Ｍｅｒｃｋ）
リン酸水素二ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ）
塩化カルシウム水溶液（Ｍｅｒｃｋ）
無水塩化ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ Ａ ７９０６）
システイン（Ｍｅｒｃｋ ２８３８）
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｍｅｒｃｋ）
試薬：
１．安定性試薬
溶解：
０．２０ｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、
０．０５ｇシステイン、
１０ｍＬ脱イオン水中２．０ｇ無水塩化ナトリウム。
２．アッセイ緩衝液：クエン酸−リン酸緩衝液、０．１Ｍ、ｐＨ＝５．６０
溶解：
４．４１ｇクエン酸一水和物、
１０．３ｇリン酸水素二ナトリウム二水和物（ｄｉ−Ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）、
２．９０ｇ無水塩化ナトリウム、
約８００ｍＬの脱イオン水中０．７３ｇ塩化カルシウム二水和物。
１．００ｍＬの安定性試薬（１）をマグネチックスターラで撹拌しながら添加する。
溶解したら、ｐＨを５．６０に調整し（ＨＣｌ又はＮａＯＨ）、溶液を１０００ｍＬメスフラスコに移して蒸留水で１０００ｍＬに調整する。
３．停止液：１％（ｗ／ｖ）トリス（トリズマベース）
メスフラスコにおいて脱イオン水に１０ｇのトリス（（ヒドロキシメチル）アミノメタン）を溶解し、１０００ｍＬに調整する。
４．基質（Ｍｅｇａｚｙｍｅからの凍結乾燥Ｃｅｒａｌｐｈａ（ＢＰＮＰＧ７））
褐色瓶一本の穀粒α−アミラーゼアッセイ試薬（ＢＰＮＰＧ７）を１０．０ｍｌの蒸留水に溶解した（２）。
溶液は使用前に同様に蒸留水でさらに１：１希釈した。
１瓶のＣｅｒａｌｐｈａには５４．５ｍｇのＢＰＮＰＧ７及び１２５Ｕ（ｐＨ＝６．０）のα−グルコシダーゼが含まれる。
５．対照／標準試料
アミラーゼ（ＬＡＴ）標準：４８５ＴＡＵ／ｇ（ロット番号１０２−０５２０８−００１）
さらにＬＡＴ対照試料（ロット番号１０２−０１１２８−ｌａｂ）、７９５７〜８１６２ＴＡＵ／ｇの範囲。
手順
アミラーゼ標準曲線の作成：
アミラーゼ標準（５）をＬＡＴが約１．９Ｕ／ｇの濃度になるよう希釈する。
希釈は全て、アッセイ緩衝液（２）で実行する。
さらなる希釈はＫｏｎｅｌａｂにプログラムされる：
Figure 0006391601
ＯＤ範囲が０．２〜１．５でなければならない
試料調製：
試料毎に２つの秤量を行った。
液体生成物：０．５ｇの試料を５０ｍｌメスフラスコに秤量する。フラスコをアッセイ緩衝液（２）で充填して混合する。さらなる希釈もアッセイ緩衝液（２）で実施する。最終濃度が約０．２Ｕ／ｍｌでなければならない。
固体生成物：０．５ｇの試料を５０ｍｌメスフラスコに秤量し、約４０ｍｌのアッセイ緩衝液（２）に希釈する。その溶液をマグネチックスターラで１０分間撹拌し、緩衝液で充填する。溶液をｗｈａｔｍａｎガラスフィルターでろ過し、アッセイ緩衝液（２）でさらなる希釈を実施した。最終濃度は約０．２Ｕ／ｍｌであった。
試料の重量は、後の計算のため、少数４桁で記録した。
この希釈手順を簡単にするため、希釈は全て、ダイリューター（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を使用して実施した。
ブラインド：各ランに２つのブラインド試料（アッセイ緩衝液（２））を含めた。
アッセイの反応条件：
ｐＨ＝５．６０
インキュベーション温度＝３７℃±０．１℃
波長＝４０５ｎｍ
基質５０μｌ
プレインキュベーション５分
試料１０μｌ
インキュベーション１５分
停止液１００μｌ
酵素活性の計算：
試料の活性を以下の式に従い計算した、すなわち、
Figure 0006391601
 ＯＤｓａｍｐｌｅ＝酵素試料の吸光度
ＤＦ＝試料の希釈係数
Ｗｓａｍｐｌｅ＝試料重量（ｇ）
α＝標準曲線の傾き
β＝標準曲線の切片
結果
結果を図６及び図７に見ることができる。興味深いことに、飼料に使用される既存のα−アミラーゼ−ＬＴＡＡ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）及びＢＡＮ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）は、ペプシン濃度が高くなると活性の低下を示したのに対し、ＦＲＥＤ、ＬＡＴ及びＴｒＡＡは、低ｐＨ及びペプシンに対して１０％飼料の存在で優れた安定性を示した。
実験セットアップの条件は、単胃動物の胃腸管（ＧＩＴ）内の条件を模倣して設計した。ＬＴＡＡは畜産能力を改善することが公知であるため、このα−アミラーゼを参照として試験した。ＦＲＥＤ、ＬＡＴ及びＴｒＡＡはアッセイにおいてより優れた安定性を示すため、従ってこれらはＧＩＴにおいて同等の、又はより優れた安定性を示すことが予想される。
実施例２
この例は、２つのアミラーゼ、ＬＴＡＡ（現在飼料に使用されているＢ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）αアミラーゼ）と、本発明に係るペプシン耐性αアミラーゼであるＬＡＴとの能力を比較するために設計した。その目的は、さらに、インビトロで行った２つのアミラーゼの評価／比較を動物試験でバリデートできるかどうかを試験することであった。ＬＴＡＡは、供給業者（Ｄａｎｉｓｃｏ）が推奨するとおり、２０００Ｕ／飼料１ｋｇで投与したのに対し、ＬＡＴは、実験室試験に基づいて能力上等価な量、すなわち１００Ｕ／ｋｇ飼料で投与した。
材料及び方法（試験１、２、３及び４）
能力試験
雄ブロイラー（Ｒｏｓｓ ３０８）の初生雛を商業的な孵化場から入手し、秤量し、体重に基づいて平飼い用の４８ペンに割り当てた：レプリケートの８ペンで６処置。平飼い用ペンは環境が制御された室内に位置した。各ペンのレイアウトは同じで、ペン毎に１つのベル型給水器と１つの飼料ホッパーとを備えた。マッシュ形態の飼料を適宜与え、水は試験全体を通して自由に飲めるようにした。成分及び飼料組成計算値を表１及び表２に提供する。１日目、２１日目及び４２日目に体重及び飼料摂取量を記録した。死亡率は毎日記録した。死亡した鳥は全て秤量し、その重さを使用して飼料転換率を調整した。飼料転換率は、全飼料摂取量を、生きている鳥＋死亡した鳥の体重増加量で除すことにより計算した。
統計的分析
食事性の酵素の主効果、並びに試験場及びブロック×試験場の変量効果を含む一般化線形モデル（Ｐｒｏｃ Ｍｉｘｅｄ；ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して、データを分析した。多重ｔ検定により最小二乗平均分離を行った。有意性はＰ＜０．０５で評価した。
添加酵素
アミラーゼ；バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）αアミラーゼ（ＬＴＡＡ）、２０００Ｕ／飼料１ｋｇ、又はバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）αアミラーゼ（ＬＡＴ）、１００Ｕ／飼料１ｋｇ。双方の飼料に対し、２０００Ｕ／ｋｇのトリコデル
マ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）キシラナーゼも添加した。
Figure 0006391601
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結果
結果は図９及び図１０に詳細に示す。ペプシン耐性αアミラーゼ（ＬＡＴ）を使用すると、対照アミラーゼＬＴＡＡと比較して統計的に有意な体重増加が得られた（図９）。ペプシン耐性αアミラーゼ（ＬＡＴ）の使用はまた、対照と比較して飼料要求率の改善（統計的に有意）ももたらした（図１０）。ここで飼料要求率とは、動物の１ｋｇの増体に必要な飼料の量（飼料効率の逆数）である。
上記の明細書において言及される刊行物は全て、参照により本明細書に援用される。当業者には、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、記載される本発明の方法及びシステムの様々な改良例及び変形例が明らかであろう。本発明は具体的な好ましい実施形態との関連において記載しているが、特許請求されるとおりの本発明が必要以上にかかる具体的な実施形態に限定されてはならないことが理解されなければならない。実際に、生化学及びバイオテクノロジーの技術分野又は関連分野の当業者には明らかな、記載される本発明の実施態様の様々な改良例が、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。

Claims (25)

  1. ペプシン耐性αアミラーゼ、並びにマルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギ又はコムギ成分、スクロース、デンプン、Ｎａ2ＳＯ4、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、ベンゾエート、ソルベート（ｓｏｒｂｉａｔｅ）、グリセリン、スクロース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、グルコース、パラベン、塩化ナトリウム、シトレート、アセテート、ホスフェート、カルシウム、メタビスルフィット、ホルメート及びそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの生理学的に許容可能な担体を含む家禽用飼料補助剤。
  2. 配列番号１とのギャップアラインメントでのペプシン耐性αアミラーゼが、Ｋ８８；Ｉ１０３；Ｈ１３３；Ｙ１７５；Ｙ２９０；Ｆ２９２；Ｒ４４２及びＨ４５０からなる群から選択されるアミノ酸のうちの任意の１つ以上を含み、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関係する、請求項１に記載の飼料補助剤。
  3. ペプシン耐性トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）αアミラーゼを含む家禽用飼料補助剤。
  4. ペプシン耐性αアミラーゼが、
    ｉ）配列番号３に示されるとおりであるか；
    ii）１個又は数個のアミノ酸付加／挿入、欠失又は置換を除いては配列番号３に示されるとおりであるか；
    iii）配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有するか；又は
    iv）配列番号４の配列を含むヌクレオチド配列の発現により生産されるか；
    ｖ）遺伝子コードの縮重に起因して配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により生産されるか；
    vi）１個又は数個のヌクレオチド付加／挿入、欠失又は置換だけ配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により生産されるか；若しくは
    vii）配列番号４と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列の発現により生産される
    アミノ酸配列を有する、請求項３に記載の飼料補助剤。
  5. ペプシン耐性αアミラーゼを含む家禽用飼料補助剤。
  6. ペプシン耐性αアミラーゼが、
    ｉ）配列番号１に示されるとおりであるか；
    ii）１個又は数個のアミノ酸付加／挿入、欠失又は置換を除いては配列番号１に示されるとおりであるか；
    iii）配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有するか；又は
    iv）配列番号２の配列を含むヌクレオチド配列の発現により生産されるか；
    ｖ）遺伝子コードの縮重に起因して配列番号２と異なるヌクレオチド配列の発現により生産されるか；
    vi）１個又は数個のヌクレオチド付加／挿入、欠失又は置換だけ配列番号２と異なるヌクレオチド配列の発現により生産されるか；若しくは
    vii）配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列の発現により生産される
    アミノ酸配列を有する、請求項４に記載の飼料補助剤。
  7. 配列番号１とのギャップアラインメントでのペプシン耐性αアミラーゼが、Ｋ８８；Ｉ１０３；Ｈ１３３；Ｙ１７５；Ｙ２９０；Ｆ２９２；Ｒ４４２及びＨ４５０からなる群から選択されるアミノ酸のうちの任意の１つ以上を含み、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関係する、請求項５又は６に記載の飼料補助剤。
  8. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の飼料補助剤を、１つ以上の飼料材料と混合するステップを含む、家禽用飼料の調製方法であって、好ましくはここで前記１つ以上の飼料材料が、ａ）穀類、例えば小粒穀類（例えば、小麦、大麦、ライ麦、オート麦及びそれらの組み合わせ）及び／又はメイズ若しくはソルガムなどの大粒穀類；ｂ）穀類の副産物、例えばコーングルテンミール、トウモロコシ蒸留粕（ＤＤＧＳ）、小麦ふすま、小麦ミドリング粉、小麦ショーツ、米糠、米の籾殻、オート麦の籾殻、あぶらやしの種、及び柑橘パルプ；ｃ）大豆、ヒマワリ、ピーナッツ、ルピナス、エンドウ豆、ソラ豆、綿、キャノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉骨粉、ジャガイモタンパク質、ホエー、コプラ、ゴマなどの原料から得られるタンパク質；ｄ）植物源及び動物源から得られる油及び脂肪；及びｅ）ミネラル及びビタミン；ｆ）ａ）〜ｅ）の任意の１つ以上のプレミックスからなる群から選択される、上記方法。
  9. 請求項８に記載の方法により調製される、又は請求項１〜４のいずれか一項に記載の飼料補助剤を含む、家禽用飼料。
  10. ペプシン耐性トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）αアミラーゼを含む家禽用飼料。
  11. ペプシン耐性αアミラーゼが、
    ｉ）配列番号３に示されるとおりであるか；
    ii）１個又は数個のアミノ酸付加／挿入、欠失又は置換を除いては配列番号３に示されるとおりであるか；
    iii）配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有するか；又は
    iv）配列番号４の配列を含むヌクレオチド配列の発現により生産されるか；
    ｖ）遺伝子コードの縮重に起因して配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により生産されるか；
    vi）１個又は数個のヌクレオチド付加／挿入、欠失又は置換だけ配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により生産されるか；若しくは
    vii）配列番号４と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列の発現により生産される
    アミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の飼料。
  12. ペプシン耐性αアミラーゼを含む家禽用飼料であって、飼料１キログラム当たり３０００単位未満のペプシン耐性αアミラーゼを含む、該飼料。
  13. ペプシン耐性αアミラーゼが、
    ｉ）配列番号１又は配列番号３に示されるとおりであるか；
    ii）１個又は数個のアミノ酸付加／挿入、欠失又は置換を除いては配列番号１又は配列番号３に示されるとおりであるか；
    iii）配列番号１と少なくとも８５％の同一性；若しくは配列番号３と少なくとも７０
    ％の同一性を有するか；
    iv）配列番号２又は配列番号４の配列を含むヌクレオチド配列の発現により生産されるか
    ｖ）遺伝子コードの縮重に起因して配列番号２又は配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により生産されるか；
    vi）１個又は数個のヌクレオチド付加／挿入、欠失又は置換だけ配列番号２又は配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により生産されるか；又は
    vii）配列番号２又は配列番号４と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列の発現により生産される
    アミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の飼料。
  14. 配列番号１とのギャップアラインメントでのペプシン耐性αアミラーゼが、Ｋ８８；Ｉ１０３；Ｈ１３３；Ｙ１７５；Ｙ２９０；Ｆ２９２；Ｒ４４２及びＨ４５０からなる群から選択されるアミノ酸のうちの任意の１つ以上を含み、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関係する、請求項１３に記載の飼料。
  15. 家禽用飼料補助剤及び／又は家禽用飼料に使用されるペプシン耐性αアミラーゼであって、１００，０００Ｕ／ｍｌのペプシンの存在下で実質的にαアミラーゼ活性を維持する、上記ペプシン耐性αアミラーゼ。
  16. ペプシン耐性αアミラーゼが、
    ｉ）配列番号３に示されるとおりであるか、若しくは
    ii）１個又は数個のアミノ酸付加／挿入、欠失又は置換を除いては配列番号３に示されるとおりであるか；
    iii）配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有するか；又は
    iv）配列番号４の配列を含むヌクレオチド配列の発現により生産されるか；
    ｖ）遺伝子コードの縮重に起因して配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により生産されるか；若しくは
    vi）１個又は数個のヌクレオチド付加／挿入、欠失又は置換だけ配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により生産されるか；若しくは
    vii）配列番号４と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列の発現により生産される
    アミノ酸配列を有する、請求項１５に記載のペプシン耐性αアミラーゼ。
  17. 家禽用飼料補助剤であって、前記飼料補助剤が、畜産能力を改善するためペプシン耐性αアミラーゼを含む、上記飼料補助剤。
  18. 家禽の体重増加を増進する方法であって、該家禽にペプシン耐性αアミラーゼを含む飼料を与えるステップを含む、上記方法。
  19. 家禽における内在性αアミラーゼの発現を低下させるためのペプシン耐性αアミラーゼの使用。
  20. 畜産能力を改善し、そして／又はエネルギー吸収及び／又は飼料効率を高めるための、そして／又は飼料中の原材料の消化率（例えばデンプン消化率などの栄養分消化率）を改善するための、そして／又は飼料転換率（ＦＣＲ）を改善するための、そして／又は動物の体重増加を改善するための、ペプシン耐性αアミラーゼを含む家禽用飼料補助剤の使用。
  21. ペプシン耐性αアミラーゼを含む家禽用飼料補助剤と、少なくとも１つのミネラル及び／又は少なくとも１つのビタミンとを含むプレミックス。
  22. 請求項１〜７又は１７のいずれか一項に記載の飼料補助剤を含む、請求項２１に記載のプレミックス。
  23. 家禽用飼料補助剤の調製方法であって、ペプシン耐性αアミラーゼを、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギ又はコムギ成分、スクロース、デンプン、Ｎａ2ＳＯ4、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、ベンゾエート、ソルベート（ｓｏｒｂｉａｔｅ）、グリセリン、スクロース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、グルコース、パラベン類、塩化ナトリウム、シトレート、アセテート、ホスフェート、カルシウム、メタビスルフィット、ホルメート及びそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの生理学的に許容可能な担体と混合するステップを含む、上記方法。
  24. 前記ペプシン耐性αアミラーゼが、
    ｉ）配列番号１又は配列番号３に示されるとおりであるか；
    ii）１個又は数個のアミノ酸付加／挿入、欠失又は置換を除いては配列番号１又は配列番号３に示されるとおりであるか；
    iii）配列番号１と少なくとも８５％の同一性、若しくは配列番号３と少なくとも７０
    ％の同一性を有するか；
    iv）配列番号２又は配列番号４の配列を含むヌクレオチド配列の発現により生産されるか；
    ｖ）遺伝子コードの縮重に起因して配列番号２又は配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により生産されるか；
    vi）１個又は数個のヌクレオチド付加／挿入、欠失又は置換だけ配列番号２又は配列番号４と異なるヌクレオチド配列の発現により生産されるか；又は
    vii）配列番号２又は配列番号４と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列の発現により生産される
    アミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の方法。
  25. 配列番号１とのギャップアラインメントでのペプシン耐性αアミラーゼが、Ｋ８８；Ｉ１０３；Ｈ１３３；Ｙ１７５；Ｙ２９０；Ｆ２９２；Ｒ４４２及びＨ４５０からなる群から選択されるアミノ酸のうちの任意の１つ以上を含み、ここでアミノ酸の付番は配列番号１に関係する、請求項２３に記載の方法。
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