CN107531766B - 葡聚糖酶的生产和使用其的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于在转基因植物中生产葡聚糖酶的方法和组成物，然后将转基因植物的部分引入动物饲料中。饲料中的葡聚糖酶显示出广泛pH范围内的活性和对温度的耐受性，这在动物饲料制备过程中经常会遇到。在转基因植物中生产该酶能够提高酶的热稳定性。

Description

葡聚糖酶的生产和使用其的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年5月14日提交的美国临时申请No.62/161.482的权利，并通过引用将其全部合并于此。
与本申请一起电子提交标题为“序列表”的序列表创建于2016年5月14日，其大小为145921字节，通过引用将其全部合并于此。
技术领域
本发明涉及表达具有提高热稳定性的葡聚糖酶的转基因植物、编码所述葡聚糖酶的核酸，和加工转基因植物与组织的方法，以及动物饲料的生产与利用方法。本发明还涉及饲料添加剂，以及含有所述葡聚糖酶的粮食和纤维加工助剂。
背景技术
单胃和反刍动物的食物中非淀粉多糖的丰度(NSPs)会对饲料的营养价值产生不利影响，同时，如果它们能在饮食中被降解或者转化为有益的营养成分，则也提供了改善营养成分的机会。NSPs是植物细胞壁的主要结构成分(纤维素、半纤维素、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖等)，并且在某些植物中也可作为碳水化合物的存储储备。此外，果胶和树胶被认为是非细胞壁NSP。由于其多种多样的结构和生物学作用，NSPs常常约束或包围存在于以植物为基础的饲料原料(如谷物、豆类、青贮饲料等)和其他配料中的淀粉、蛋白质、脂肪和其他营养成分，抑制动物有效消化营养物质的能力。饮食中NSPs水平的增加会增加肠道内容物的粘度，这会干扰消化酶并降低营养物质的消化率，从而增加饲料转化率(饲料质量除以产肉质量)并减少体重增加量(Iji,P.A.1999.The impacts ofcereal non-starch polysaccharides on intestinal development and function inthe broiler chickens.Worlds Poult.Sci.J.55:375–387，通过引用将其全部并入本文)。例如，肉鸡饲料中增加瓜尔豆粉胚芽部分(0％、5％或7.5％)或瓜尔豆粉谷壳部分(0％、2.5％或5％)的水平导致食糜粘度增加(Lee,J.T.,C.A.Bailey,andA.L.Cartwright.2003.β-Mannanase ameliorates viscosity-associated depressionof growth in broiler chickens fed guar germ and hull fractions.Poult.Sci.82:1925-1931，通过引用将其全部并入本文)。除了增加粘度外，随着瓜尔豆粉谷壳部分的增加，体重增加量和饲料转化率也更低，表明高粘度对动物生产性能的负面影响。
也已知，NSPs不经意地会触发肠道免疫反应，这会进一步降低饲料利用率，并对动物健康产生影响。
除了谷物成分，现在的饮食也通常含有DDGS(干酒糟及可溶物)，这也不易消化。多项研究表明，补充酶能够提高饮食代谢能(ME)和/或降低含有高水平小麦、大麦、DDGS或其他纤维成分的饮食粘度。当配方降低3％的饮食代谢能时，在玉米豆粉型肉鸡饮食中添加糖酶已经完成，而不影响在寒暑季节饲养的肉鸡的饲料转化率。已经确定的是，水解的β-D-葡聚糖是改善生长的原因。
发明内容
一方面，本发明涉及在样本中识别玉米事件4588.259、4588.757或4588.652的方法。该方法包括将样本与第一引物和第二引物接触。该方法包括扩增样本中的核酸以获得扩增产物。该方法还包括检测述扩增产物，所述扩增产物对玉米事件4588.259、4588.757或4588.652中靶序列是特异性的。
一方面，本发明涉及含有转基因植物或其部分的动物饲料。该转基因植物或其部分含有编码葡聚糖酶的人工合成的核酸。该葡聚糖酶包括的氨基酸序列与选自由SEQ IDNOS:4–6所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性，并能够降解一种或多种多糖。
一方面，本发明涉及生产动物饲料的方法。该方法包括将转基因植物或其部分与植物材料混合以形成混合物。该转基因植物或其部分包括编码葡聚糖酶的人工合成的核酸。该葡聚糖酶包括的氨基酸序列与选自由SEQ ID NOS:4-6所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性，并能够降解一种或多种多糖。
一方面，本发明涉及提高饮食代谢能的方法。该方法包括将转基因植物或其部分与饲料成分混合。所述转基因植物或其部分包括编码葡聚糖酶的人工合成的核酸，该葡聚糖酶包括的氨基酸序列与选自由SEQ ID NOS:4-6所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性，并能够降解一种或多种多糖。
一方面，本发明涉及提高谷物中可发酵糖产出(production)的方法。该方法包括将来自本文描述的所述转基因植物中任意一种的谷物与来自其他植物的谷物混合，以形成混合谷物。该方法还包括将混合谷物加工成可发酵糖。所述可发酵糖随后转化为乙醇或类似的发酵产物，其中可以包括丁醇、乳酸、柠檬酸、醋酸或其他燃料或化学品。
一方面，本发明涉及包括编码葡聚糖酶的人工合成的核酸的转基因植物、转基因谷物或转基因生物质。该葡聚糖酶包括的氨基酸序列与选自由SEQ ID NOS:4–6所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性，并能够降解一种或多种多糖。
一方面，本发明涉及人工合成的多肽或其片段。该人工合的成多肽或其片段包括的氨基酸序列与选自由SEQ ID NOS:4–6所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性。该葡聚糖酶能够降解一种或多种多糖。
附图说明
结合附图阅读将更好地理解本发明优选实施方式的以下详细描述。为了说明本发明，附图中显示出了具体实施方式。然而，应当理解，本发明不限于展示的精确安排和手段。在附图中：
图1表明携带单个饲料葡聚糖酶表达单位的表达载体pAG4258。
图2表明携带单个饲料葡聚糖酶表达单位的表达载体pAG4588。
图3表明携带单个饲料葡聚糖酶表达单位的表达载体pAG4597。
图4表明携带单个饲料葡聚糖酶表达单位的表达载体pAG4708。
图5表明携带两个饲料葡聚糖酶表达单位的表达载体pAG4766。
图6表明携带两个饲料葡聚糖酶表达单位的表达载体pAG4767。
图7表明携带三个饲料葡聚糖酶表达单位的表达载体pAG4770。
图8表明携带三个饲料葡聚糖酶表达单位的表达载体pAG4771。
图9为表明从携带pAG4588构建体的玉米植株的谷穗中获得的葡聚糖酶活性范围的图表。
图10为表明从携带pAG4597构建体的玉米植株的谷穗中获得的葡聚糖酶活性范围的图表。
图11为显示玉米事件4588.652第7号染色体上的T-DNA整合位点的图表。
图12为表明在T1代植株中观察到的葡聚糖酶活性的图表。
图13为表明半合子、纯合子和杂交植株的种子中的葡聚糖酶活性的图表。
图14表明了实时PCR试验的总体设计，用于确定转基因事件中T-DNA位点(标准和实时PCR)和接合性(仅实时PCR)的存在。带箭头的字母A、B、X和Y指示引物结合位点。矩形框A+B和X+Y代表从各自引物对扩增的PCR产物。
图15表明了标准PCR检测的总体设计，用于确定转基因事件中T-DNA位点和接合性(zygosity)的存在。带箭头的字母A、B和C指示引物结合位点。矩形框A+B和A+C代表从各自引物对扩增的PCR产物。
图16表明自交分离(selfed segregating)4588.652植株的标准多重PCR分析。
图17为表明用于确定玉米事件4588.259(FG259)中T-DNA位点和接合性存在的实时PCR数据的图表。
图18A和18B为表明在制粒前后生长饲料(Grower Diet)(图18A)和开口饲料(Starter Diet)(图18B)中的葡聚糖酶活性的图表。
图19A和19B为表明在混合有微生物葡聚糖酶的野生型(WT)面粉和产生葡聚糖酶的转基因面粉中，在温度为130℃(图19A)和94℃(图19B)的热处理后的葡聚糖酶活性的图表。
图20和21为表明在37℃(图20)和80℃(图21)的检测中，测量AGR2314活性的最佳pH的图表。
图22为表明转基因面粉中产生的饲料葡聚糖酶的最佳pH的实例的图表。
图23A和23B为表明在37℃(图23A)和80℃(图23B)下，葡聚糖酶在多种基质上的活性的图表。
图24A和24B为表明表达AGR2314的转基因玉米植株的未处理的种子纤维的酶水解的图表。图24A显示葡萄糖产量，图24B显示木糖产量。
图25A和25B为表明表达AGR2314的转基因玉米植株的用稀酸预处理的种子纤维的酶水解的图表。图25A显示葡萄糖产量，而图25B显示木糖产量。
图26为表明在为期28天的家禽饲养试验中的体重增加量(BWG)的图表。
图27为表明在为期28天的饲养试验中，每个时间间隔家禽BWG的变化的图表。
图28为表明在为期28天的家禽饲养试验中，使用含(+)或不含(-)葡聚糖酶的两种不同饮食(玉米/大麦型和玉米/LF-DDGS型)的饲料消耗的图表。
图29为表明在为期28天的家禽饲养试验中，使用含(+)或不含(-)葡聚糖酶的两种不同饮食(玉米/大麦型和玉米/LF-DDGS型)的饲料转化率(FCR)的图表。
图30为表明在试验处理中葡聚糖酶对家禽BWF的影响的图表。
具体实施方式
为方便起见，下列描述中使用了某些术语，并非限制。
本文所用的“人工合成的核酸序列”、“人工合成的多核苷酸”、“人工合成的寡核苷酸”、“人工合成的DNA”或“人工合成的RNA”是指不同于自然界中发现的核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、DNA或RNA，其区别在于具有不同于自然界中发现的序列或在自然界中未发现的化学修饰。这可以包括但不限于使用生物技术工具构建的DNA序列。此类工具包括但不限于重组DNA技术、聚合酶链式反应(PCR)、生物诱变技术(使用PCR或包括DNA的酶切和连接的重组技术)、化学诱变技术、化学合成或直接使用核酸酶(所谓的“基因组编辑”或“基因优化”技术)。
本文所用的“人工合成的蛋白”、“人工合成的多肽”、“人工合成的寡肽”或“人工合成的肽”是指通过合成工艺制成的蛋白、多肽、寡肽或肽。合成工艺可以包括但不限于化学合成或重组技术。合成工艺可以包括通过在活细胞中表达人工合成的核酸序列或通过使用无细胞提取物进行体外表达以进行蛋白、多肽、寡肽或肽的生产。
如本文所用，“突变体”是指保留与原序列相同或基本相似的生物活性的分子。突变体可以来自相同或不同的物种，也可以是基于天然或先前分子的人工合成的序列。
如本文所用，“比对”是指多个核酸或氨基酸序列的纵向排列，用于常见共用核苷酸或氨基酸的目视识别。常见共用核苷酸或氨基酸的百分比与序列间的同源性或同一性有关。比对可以决定于或用于识别序列间的保守结构域和相关性。比对应由计算机程序来确定，如CLUSTAL O(1.2.1)(Sievers et al.(2011)Molecular Systems Biology 7:539doi:10.1038/msb.2011.75)。
如在权利要求和说明书的相应部分中使用的词“一种(a)”和“一个(one)”被定义为包括一个或多个被引用的项目，除非另有说明。
在一种实施方式中，提供了一种编码葡聚糖酶的人工合成的核酸。该人工合成的核酸可以包括与选自由SEQ ID NO:1[AGR2314]、SEQ ID NO:2[AGR2414]和SEQ ID NO:3[AGR2514]所组成的组中的参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列。编码的葡聚糖酶能够降解一种或多种多糖。
一种实施方式包括的葡聚糖酶包括与选自由SEQ ID NO:4[AGR2314]、SEQ ID NO:5[AGR2414]和SEQ ID NO:6[AGR2514]所组成的组中的参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的人工合成的多肽。该葡聚糖酶能够降解一种或多种多糖。该葡聚糖酶可以被改性以提高热稳定性。
热稳定性改性的葡聚糖酶可使用标准分子生物学技术进行生产和筛选。可以对该葡聚糖酶进行突变，然后进行热稳定性筛选。可以利用的筛选系统包括λ噬菌体、酵母或其他允许生产蛋白和/或测试其物理和/或功能特性的表达系统。从一组改性蛋白质中可以分离出候选者，并进一步分析。进一步分析可以包括DNA测序、功能试验、结构试验、酶活性试验以及监测热稳定性变化，或响应高温条件的结构。
在一种实施方式中，葡聚糖酶可以在植物或植物组织中生产。该葡聚糖酶可以从植物或植物组织中分离。
一种实施方式包括一种含有一种或多种葡聚糖酶的组分、基本上由或由一种或多种葡聚糖酶组成的组分。该组分可以为但不限于包括一种或多种葡聚糖酶的转基因植物、含有一种或多种葡聚糖酶的动物饲料或动物饲料添加剂，或含有一种或多种葡聚糖酶的酶混合物。组分中的葡聚糖酶可以由本文所述的任意一人工合成的核酸编码。如本文所用的，术语“葡聚糖酶”是指能够催化复杂碳水化合物的降解或解聚的酶。
组分中的葡聚糖酶可以使一种或多种双糖、三糖和寡糖降解为低分子量糖类。组分中的葡聚糖酶可以使一种或多种纤维低聚糖、木质纤维素、纤维素、半纤维素和果胶降解。组分中的葡聚糖酶可作用于纤维素或混合连接的β-葡聚糖。某些葡聚糖酶可以具有更广泛的底物特异性，并可以作用于多种碳水化合物聚合物。组分中的葡聚糖酶可以对一系列碳水化合物聚合物具有酶活性。这种酶的活性可以是但不限于内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶、内切-1,4-β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase)、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖糖化酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶或果胶裂解酶的活性。组分中的葡聚糖酶可以使一种或多种β-葡聚糖、纤维素、纤维二糖、pNP-D-吡喃葡萄糖苷(pNP-D-glucopyranoside)和木聚糖降解。用于确定葡聚糖酶降解多种底物的活性的检测为本领域所公知。β-葡萄糖苷酶检测、内切纤维素酶检测、外切纤维素酶(纤维二糖水解酶)检测、淀粉酶检测、内切木聚糖酶检测、果胶酶检测、1,3-β-葡萄糖苷酶检测、1,4-β-葡萄糖苷酶检测在本文实施例13中进行了描述。
组分中的葡聚糖酶可以包括、基本上由或由与选自由SEQ ID NO:4[AGR2314]、SEQID NO:5[AGR2414]和SEQ ID NO:6[AGR2514]所组成的组中的参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列组成。
一种实施方式包括一种组分，该组分含有、基本上由或由本文的单个葡聚糖酶或者两个或多个葡聚糖酶的组合组成。
在一种实施方式中，组分中的葡聚糖酶可以是突变体。突变体可以包括保守氨基酸替换；即，具有相似性质的氨基酸的替换。保守替换可以是极性氨基酸替换极性氨基酸(甘氨酸(G，Gly)、丝氨酸(S，Ser)、苏氨酸(T，Thr)、酪氨酸(Y，Tyr)、半胱氨酸(C，Cys)、天冬酰胺(N，Asn)和谷氨酰胺(Q，Gln))；非极性氨基酸替换非极性氨基酸(丙氨酸(A，Ala)、缬氨酸(V，Val)、色氨酸(W，Trp)、亮氨酸(L，Leu)、脯氨酸(P，Pro)、甲硫氨酸(M，Met)、苯丙氨酸(F，Phe))；酸性氨基酸替换酸性氨基酸(天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酸(E，Glu))；碱性氨基酸替换碱性氨基酸(精氨酸(R，Arg)、组氨酸(H，His)、赖氨酸(K，Lys))；带电荷氨基酸替换带电荷氨基酸(天冬氨酸(D，Asp)、谷氨酸(E，Glu)、组氨酸(H，His)、赖氨酸(K，Lys)和精氨酸(R，Arg))；以及疏水氨基酸替换疏水氨基酸(丙氨酸(A，Ala)、亮氨酸(L，Leu)、异亮氨酸(I，Ile)、缬氨酸(V，Val)、脯氨酸(P，Pro)、苯丙氨酸(F，Phe)、色氨酸(W，Trp)和甲硫氨酸(M，Met))。保守核苷酸替换可以通过在核酸序列中用同一氨基酸的不同密码子替换原有密码子进行。突变体可以包括非保守替换。与未改变的葡聚糖酶相比，突变体可以具有40％的葡聚糖酶活性。与未改变的葡聚糖酶相比，突变体可以具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性，或本文任意两个值之间的整数。
在一种实施方式中，与SEQ ID NOS:4-6的相应氨基酸序列具有少于100％的同一性的一种或多种蛋白，为参考的蛋白或氨基酸的突变体。在一种实施方式中，具有与具有SEQ ID NOS:4–6中任意一序列的蛋白具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列的分离的蛋白、多肽、寡肽或肽可以是小于全长的蛋白，该蛋白具有的序列与SEQ ID NO:4–6中任意一条沿着蛋白的6、10到50、10到100、10到150、10到300、10到400、10到500、10到600、10到700、10到800、10到900或10到全部氨基酸具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性。该序列长度列表包括SEQID NOS:4-6中每条全长蛋白和该列表中每条较小的长度，即使是含有少于400个氨基酸的蛋白。例如，6、10到50、10到100、10到150、10到300、10到400和10到全部氨基酸的长度将应用于(apply to)包括322个氨基酸的序列。本文列举的一系列氨基酸序列长度包括该范围内每一个氨基酸序列的长度，包括端点。列举的氨基酸长度可以起始于参考序列内任意单个位置，其中足够的氨基酸跟随单个位置以提供列举的长度。序列长度的范围可以通过10到100N氨基酸的增量来扩展，其中，对于1000个氨基酸或更长的序列，N＝十或更大的整数。该葡聚糖酶片段可以是本文所述多肽的子序列，其保留至少40％的葡聚糖酶活性。该片段可以有316、317或322个氨基酸。该片段可以包括20、30、40、50、100、150、200或300个连续氨基酸。实施方式还包括编码所述氨基酸序列的核酸以及识别所述氨基酸序列上抗原决定簇的抗体。
小于全长的氨基酸序列可以选自SEQ ID NOS:4-6的序列之一的任何部分，并对应于列举的氨基酸长度。小于全长的氨基酸序列可以选自任一SEQ ID NOS:4-6的一部分，其包括催化结构域。所述片段可以包括葡聚糖酶的催化结构域。例如，SEQ ID NO:4[AGR2314]的葡聚糖酶的催化结构域包括以下序列：
Figure BDA0001467438630000111
在SEQ ID NO:21的序列中，活性部位的催化残基用放大字符加粗显示。与底物相互作用的其他活性部位残基是斜体、加粗并标有下划线。
例如，SEQ ID NO:21中第136位和253位是活性部位的催化残基，并且选自SEQ IDNO:21的小于全长的氨基酸序列可以在列举长度内任意两个各自连续的位置包括残基134和135。小于全长的氨基酸序列可以选自SEQ ID NO:21的任意一部分，且可以具有与底物相互作用的其他活性位置残基。例如，SEQ ID NO:21的20、35、36、135、198、205、210和286位置是与底物相互作用的活性位置残基，并且选自SEQ ID NO:21的小于全长的氨基酸序列可以在列举长度内任意各自连续位置包括残基20、35、36、135、198、205、210和286。
小于全长的氨基酸序列可以选自SEQ ID NO:21的任意一部分，且可以包括氨基酸136-253。小于全长的氨基酸序列可以具有葡聚糖酶活性。小于全长的氨基酸序列能够降解多糖。小于全长的氨基酸序列可以包括那些将包括活性部位残基的氨基酸。
催化结构域可以为保守结构域。文本的“保守结构域”是指异源多核苷酸或多肽序列中的区域，其中，在不同序列之间具有相对高度的序列同一性。关于编码保守结构域的多核苷酸，优选长度至少为10个碱基对(bp)。
本文所述的任意一多肽的保守结构域是指葡聚糖酶中表现出更高度的序列同一性的结构域。高度的序列同一性可以是与本文所述多肽的连续氨基酸残基具有至少50％的同一性、至少55％的同一性、至少60％的同一性、至少65％、至少70％的同一性、至少75％的同一性、至少80％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、至少91％的同一性、至少92％的同一性、至少93％的同一性、至少94％的同一性、至少95％的同一性、至少96％的同一性、至少97％的同一性、至少98％的同一性、至少99％的同一性或至少100％的同一性。保守结构域可以被认为是与特定共有序列具有同一性的结构域。保守结构域可以通过使用比对的方法进行识别。保守结构域可以使用相关蛋白质的多序列比对进行识别。这些比对显示了包括相同或相似氨基酸模式的序列区域。保守结构域的多序列比对、三维结构和三维结构叠加可以用于推断序列、结构和功能关系。由于多肽中特定的保守结构域的存在与进化上保守的功能高度相关，保守结构域数据库可以用于识别蛋白质序列中推定的参与如降解多糖的功能的氨基酸，正如从保守结构域注释映射(mapped)到查询序列。例如，在结构和系统发育上类似于随附序列表的多肽中一个或多个结构域的SEQ ID NO:21序列在蛋白中的存在是植物中相关功能的有力指示器。本文序列是指与具有含有SEQ ID NOS:4-6序列的多肽的序列或结构域功能相关和/或密切相关，且该序列可以具有在长度上共享至少十个氨基酸并且与AGR2314、AGR2414和AGR2514的序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或96％、97％、98％或至少99％或约为100％氨基酸同一性的保守结构域，并且具有即时描述的多肽的类似功能。
在一个实施例中，AGR2314、AGR2414和AGR2514的序列可以按照如下显示进行比对。
AGR2414序列是一个海栖热袍菌(Thermotoga maritima)Cel5A的序列(在ProteinData Bank和PubMed蛋白质序列数据库中的3AMC)。与底物相互作用的残基标有下划线并用放大的粗体字符显示：N20、H95、H96、N135、E136(催化残基)、Y198、H205、W210、E253(催化残基)、W286。(T.Wu et al.(2011),Biochim.Biophys.Acta 1814,1832-1840，通过引用将其全部并入本文)。AGR2514中这些残基的编号(numbering)大一(one higher)，因为在该序列的N-末端存在一个额外的残基。
在一个实施例中，AGR2314和AGR2414的序列在317个残基中具有305个保守残基，并具有96％的同一性。
CLUSTAL O(1.2.1)多序列比对
Figure BDA0001467438630000131
Figure BDA0001467438630000141
在一个实施例中，以下AGR2414和AGR2514的序列在318个残基中具有310个保守残基，并具有97％的同一性。
CLUSTAL O(1.2.1)多序列比对
Figure BDA0001467438630000142
在一个实施例中，AGR2314和AGR2514的序列在318个残基中具有308个保守残基，并具有97％的同一性。
CLUSTAL O(1.2.1)多序列比对
Figure BDA0001467438630000151
本文描述了具有或编码符合这些同一性百分比标准的保守结构域、且与目前的多肽序列具有可比较的生物活性和调节活性、因此识别为葡聚糖酶的序列。具有较低程度同一性但具有可比较的生物活性的序列被认为是等价物。
葡聚糖酶、其突变体或其片段的功能可以使用任何方法确定。葡聚糖酶的功能可以通过实施例3中描述的任一检测方法进行测量。
通过将任何一个或多个本文描述的人工合成的核酸引入植物基因组，本文的任何一个或多个葡聚糖酶可以在植物中表达。将人工合成的核酸引入植物的方法在技术上众所周知。该方法可以使用含有人工合成的核酸的载体转化植物。
在一种实施方式中，提供了具有与选自由SEQ ID NO:7[pAG4258]、SEQ ID NO:8[pAG4588]、SEQ ID NO:9[pAG4597]、SEQ ID NO:10[pAG4708]、SEQ ID NO:11[pAG4766]、SEQ ID NO:12[pAG4767]、SEQ ID NO:13[pAG4770]、SEQ ID NO:14[pAG4771]、SEQ ID NO:15[pAG4257]、SEQ ID NO:16[pAG4692]、SEQ ID NO:17[pAG4693]、SEQ ID NO:18[pAG4705]和SEQ ID NO:19[pAG4706]所组成的组中的参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列的人工合成的多核苷酸。该人工合成的多核苷酸可以包括本文所述的编码葡聚糖酶并能够降解多糖的任一人工合成的核酸。
在一个实施方式中，提供了载体。该载体可以包括任一本文所述的人工合成的多核苷酸或核酸。
在一个实施方式中，提供了具有如前所述的本文所列任一核酸序列或其互补序列的人工合成的核酸。在一个实施方式中，提供了分离的核酸，该分离的核酸包括与具有本文所列任一核酸序列或其互补序列的核酸杂交的序列。在一个实施方式中，杂交条件为低严格度条件。在一个实施方式中，杂交条件为中严格度条件。在一个实施方式中，杂交条件为高严格度条件。该杂交可以沿着人工合成的核酸的长度。所述杂交可以沿着所述人工合成的核酸的长度。用于杂交方案的实施例和用于优化杂交方案的方法描述于以下出版物：Molecular Cloning,T.Maniatis,E.F.Fritsch,and J.Sambrook,Cold Spring HarborLaboratory,1982；和当前方案描述于Molecular Biology,F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Seidman,J.A.Smith,K.Struhl,Volume 1,John Wiley &Sons,2000(标准方案)和Amersham Gene Images AlkPhos Direct Labeling andDetection System(GE Healthcare UK,Ltd)，通过引用将其全部并入本文。
在AlkPhos直接标记和检测系统(AlkPhos Direct Labeling and DetectionSystem)中，中度条件(moderate conditions)可以如下：加载了DNA样本的膜在55℃下在杂交缓冲液(12％(w/v)尿素、0.5M NaCl、4％(w/v)封闭液)中预杂交至少15分钟。将标记探针添加到同一溶液中，在55℃下杂交过夜。膜在55℃下在主洗液(2M尿素、0.1％(W/v)SDS、50mM的0.5M磷酸钠pH 7.0、150mM NaCl、1mM的1.0M MgCl2和0.2％(w/v)封闭液)中清洗10分钟。重复清洗程序。将膜放置于干净容器中，并在次级缓冲液(1M Tris碱和2M NaCl)中清洗5分钟。在次级溶液中的清洗多进行两次。使用碱性磷酸酶的
Figure BDA0001467438630000171
底物检测化学发光。低严格度是指低温杂交条件，例如，在37℃和60℃之间。高严格度是指高温杂交条件，例如，高于68℃。
在标准方案中，中度条件可以为如下条件：装载有DNA样本的过滤器在68℃下在含有6×柠檬酸盐缓冲液(SSC；Amresco,Inc.,Solon,OH)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS；Amresco,Inc.,Solon,OH)、5×Denhardt溶液(Amresco,Inc.,Solon,OH)和变性鲑鱼精(Invitrogen Life Technologies,Inc.Carlsbad,CA)的溶液中预处理2-4小时。杂交在进行了如下修改的同一溶液中进行：0.01M EDTA(Amresco,Inc.,Solon,OH)、100μg/ml鲑鱼精DNA和5-20×106cpm 32P-标记或荧光标记探针。过滤器在杂交混合物中孵育16-20小时，然后在含有2×SSC和0.1％SDS的溶液中清洗15分钟。第二次清洗时，用含有0.1×SSC和0.5％SDS的溶液替换洗液，并在低于Tm(解链温度，单位℃)20℃到29℃的温度下额外孵育2小时。Tm＝81.5+16.61Log10([Na+]/(1.0+0.7[Na+]))+0.41(％[G+C])-(500/n)-P-F。[Na+]＝钠离子摩尔浓度。％[G+C]＝在DNA序列中G+C碱基的百分比。N＝DNA序列的长度，以碱基计。P＝％错配碱基对的温度修正(～1℃每1％错配)。F＝甲酰胺浓度修正(＝0.63℃每1％甲酰胺)。过滤器在成像仪中或通过放射自显影技术显影。低严格度条件是指低温下的杂交条件，例如，在37℃和60℃之间，以及第二次清洗使用较高[Na+](高达0.825M)和在低于Tm 40℃到48℃的温度下。高严格度是指高温下的杂交条件，例如，高于68℃，并且第二次清洗使用[Na+]＝0.0165到0.0330M，在低于Tm 5℃到10℃的温度下。在一个实施方式中，提供了人工合成的核酸，其具有的序列沿其长度与具有本文所列任一序列或其互补序列的核酸的连续部分(contiguous portion)具有至少75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性。该连续部分可以是本文所述序列的整个长度或其互补序列。
在一个实施方式中，人工合成的核酸可以编码具有316、317或322个氨基酸的葡聚糖酶片段。该人工合成的核酸可以编码包括20、30、40、50、100、150、200或300个连续氨基酸的片段，并保留至少40％的葡聚糖酶活性。葡聚糖酶、其突变体或片段的功能可以使用任何方法确定。葡聚糖酶的功能可以通过实施例3中描述的任一检测方法进行测量。
确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比同一性可以包括在两条序列中的相应位置比对或比较氨基酸残基或核苷酸。如果两条序列中的所有位置被相同的氨基酸残基或核苷酸占据，则序列被称为100％同一性。百分比同一性可以使用Smith Waterman算法进行测定(Smith TF,Waterman MS 1981“Identification of Common MolecularSubsequences,”Journal of Molecular Biology 147:195-197，通过引用将其全部并入本文)。
在一个实施方式中，提供了人工合成的核酸、多核苷酸或寡核苷酸，它们具有在本文任一所列核酸条或其互补序列中所列序列的一个部分。这些分离的核酸、多核苷酸或寡核苷酸不限于但可以具有来自如下范围的长度：10到全长、10到800、10到600、10到500、10到400、10到300、10到200、10到100、10到90、10到80、10到70、10到60、10到50、10到40、10到35、10到30、10到25、10到20、10到15或20到30核苷酸或10、15、20或25核苷酸。长度在上述范围内的人工合成的核酸、多核苷酸或寡核苷酸可以具有所述范围内的任何特定长度，包括端点。在一个实施方式中，杂交探针或引物与和所述探针或引物有相同长度的核酸为85到100％、90到100％、91到100％、92到100％、93到100％、94到100％、95到100％、96到100％、97到100％、98到100％、99到100％或100％互补，并且具有的序列选自与探针或引物长度相对应的核苷酸的长度，所述探针或引物长度在本文所列任一核酸的一部分内。在一个实施方式中，杂交探针或引物沿其长度与具有在本文所列任一核酸中所列序列的相应长度的核酸杂交。在一个实施方式中，杂交条件为低严格度。在一个实施方式中，杂交条件为中严格度。在一个实施方式中，杂交条件为高严格度。
在一个实施方式中，提供了包括编码本文所述任何一种或多种葡聚糖酶的人工合成的核酸的转基因植物。本文中在转基因植物中表达的一种或多种葡聚糖酶可以在从2.0到10.00的pH范围内具有活性。pH可以是2.0、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0、9.5或10，或是pH在任何两个上述pH值(包括端点)之间的范围内。当暴露在25℃到130℃范围的温度下，包括端点，本文在转基因植物中表达的一种或多种葡聚糖酶可以具有活性。温度可以是25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、25℃到30℃、25℃到35℃、25℃到40℃、25℃到45℃、25℃到50℃、25℃到55℃、25℃到60℃、25℃到65℃、25℃到70℃、25℃到75℃、25℃到80℃、25℃到85℃、25℃到90℃、25℃到95℃、25℃到100℃、25℃到105℃、25℃到110℃、25℃到115℃、25℃到120℃、25℃到125℃或低于130℃。与具有相同氨基酸序列但在细菌细胞中表达的葡聚糖酶相比，在转基因植物中表达的葡聚糖酶可以具有提高的活性。与在细菌细胞中表达的葡聚糖酶的活性相比，该葡聚糖酶可以具有提高的热稳定性。
一种或多种葡聚糖酶可以在任何转基因植物中生产。转基因植物可以是但不限于小麦、玉米、大豆、大麦和高粱。
在一个实施方式中，提供了制备包括葡聚糖酶的转基因植物的方法。该方法可以包括用本文的任一人工合成的核酸接触植物细胞。该人工合成的核酸可以是本文所述任一载体的一部分。该载体可以包括编码葡聚糖酶的人工合成的核酸。该葡聚糖酶可以包括、主要由或由与选自由SEQ ID NO:4[AGR2314],SEQ ID NO:5[AGR2414]和SEQ ID NO:6[AGR2514]所组成的组中的参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列组成。该方法也可以包括由转基因植物细胞再生转基因植物。该方法可以包括选择表达葡聚糖酶的转基因植物。
本文的转基因植物也被称为“事件”。事件的特征是存在包括编码葡聚糖酶的人工合成的核酸的转基因。术语“事件”也是指转化的亲代的基因组区域，包括插入的人工合成的核酸序列和插入序列(insertion)侧翼的亲代基因组序列。术语“事件”也是指转基因植物与相同基因背景的非转基因植物杂交(crossing)产生的子代。术语“品系”也是指转基因植物和带有任何基因背景的非转基因植物杂交产生的子代。经过反复杂交，原始转化的亲代的转基因及侧翼序列可以存在于子代植物基因组中的相同位置，或与转化的亲代位于相同染色体上。
该转基因植物可以是转基因的纯合子，包括编码葡聚糖酶的人工合成的核酸。
该转基因植物可以是转基因的半合子，包括编码葡聚糖酶的人工合成的核酸。为了生产表达葡聚糖酶的纯合子植物，半合子转基因植物可以进行自交。从此类杂交中可以获得子代。该子代可以包括纯合子、半合子和野生型植物。半合子植物可以与野生型植物间没有表型区别。该方法可以包括分析子代是否存在转基因和选择包括转基因的子代植物。本文在实施例8中描述了通过PCR鉴定纯合子事件的方法。
在一个实施方式中，该方法可以进一步包括将半合子转基因植物与另一相同转基因的半合子转基因植物进行杂交。该方法可以包括选择转基因为纯合子的第一代子代植物。该方法可以进一步包括将转基因植物与带有相同或不同基因背景的野生型植物进行杂交。从此类杂交中可以获得子代。该子代可以包括半合子和野生型植物。该方法可以包括选择转基因为半合子的第一代子代植物。该方法可以进一步包括将第一代半合子子代植物进行自交，并选择转基因为纯合子的第二代子代植物，其中转基因含有编码葡聚糖酶的人工合成的核酸。
当暴露于本文所述的高温时，该葡聚糖酶可以具有活性和提高的热稳定性。
人们意外地发现，相对于微生物产生的同一种酶，酶在植物中的表达和积累为酶提供了额外的热稳定性。
在一个实施方式中，产生转基因植物的方法包括转化。对于转化，可以将核酸引入到载体中。合适的载体可以是克隆载体、转化载体、表达载体或基于病毒的载体。载体的表达组件部分可以进一步包括调控元件，调控元件可操作地与编码葡聚糖酶的核酸连接。在这样的背景下，可操作连接意味着调控元件在核酸上发挥(impart)其功能。例如，调控元件可以为启动子，并且该可操作连接的启动子可以控制核酸的表达。
来自表达组件的编码葡聚糖酶的核酸的表达可以受到启动子的控制，所述启动子为核酸在植物中提供转录。该启动子可以为组成型启动子、或组织特异性、或可诱导型启动子。组成型启动子可以在植物的大多数细胞和组织中、在许多发育阶段但并非所有阶段提供核酸的转录。可诱导型启动子仅当暴露于特定化学或环境刺激时才可以启动核酸序列的转录。组织特异性启动子可以在特定植物组织中启动转录。植物组织可以是但不限于茎、叶、毛状体、花药、穗轴、种子、胚乳或胚。组成型启动子可以是但不限于玉米泛素启动子(ZmUbi1)、花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、夜香树黄化卷曲病毒启动子(CMP)、肌动蛋白启动子或Rubisco(核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶)小亚基启动子。组织特异性启动子可以为玉米球蛋白启动子(ZmGlb1)、水稻谷蛋白启动子(prGTL)、玉米醇溶蛋白启动子(ZmZ27)或玉米油质蛋白启动子(ZmOle)。该启动子可以提供人工合成的多核苷酸的转录，该多核苷酸具有与选自由SEQ ID NO:7[pAG4258]、SEQ ID NO:8[pAG4588]、SEQ ID NO:9[pAG4597]、SEQ ID NO:10[pAG4708]、SEQ ID NO:11[pAG4766]、SEQ ID NO:12[pAG4767]、SEQ ID NO:13[pAG4770]、SEQ ID NO:14[pAG4771]、SEQ ID NO:15[pAG4257]、SEQ ID NO:16[pAG4692]、SEQ ID NO:17[pAG4693]、SEQ ID NO:18[pAG4705]和SEQ ID NO:19[pAG4706]所组成的组中的参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列，并且表达能够降解多糖的葡聚糖酶。
在一个实施方式中，产生转基因植物的方法中的转化可以为稳定转化，其中编码葡聚糖酶的核酸整合到转化的植物的基因组中。转化可以是使用适合于本文描述的稳定转化的载体进行的农杆菌(Agrobacterium)介导的转化。产生转基因植物的方法可以包括任何其他转化植物的方法，例如，粒子轰击，或通过DNA直接导入的原生质体转化。转基因植物可以包括本文的任何人工合成的核酸、氨基酸序列或载体。
在一个实施方式中，产生转基因植物的方法可以包括瞬时转化，用以瞬时表达重组蛋白。术语“瞬时表达”是指传递到细胞中的外源核酸分子的表达：例如，植物细胞，但不整入植物细胞染色体中。来自外部染色体的外源核酸分子的表达可以在DNA传递后一段时间后检测到。病毒载体可以被用于携带和表达外源核酸分子。病毒载体可以在植物体内系统地复制和传播。病毒载体的使用可以导致转基因植物中葡聚糖酶非常高水平的积累。
产生转基因植物的方法、提高动物中非淀粉多糖利用率的方法、提高来自谷粒的可发酵糖的生产方法、提高饮食代谢能的方法、动物饲料的制备方法和生产含有编码葡聚糖酶的人工合成的核酸的基因工程植物纯合子的方法可以包括本文的检测方法，其作为产生转基因植物和/或识别包括本文人工合成的核酸的植物、植物生物质或动物饲料的一部分。
一个实施方式包括用于鉴定样本中玉米事件4588.259、4588.757或4588.652的试剂盒。该试剂盒可以包括第一引物和第二引物。
该第一引物和第二引物可以扩增事件特异性的靶序列。该靶序列可以包括与选自SEQ ID NOS:51-55的参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的核酸。该靶序列可以是包括在转化植物的基因组序列之间的结合点中的序列和T-DNA插入的序列。该靶序列可以包括在与选自SEQ ID NOS:22-31的参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的序列。
该试剂盒可以包括第一引物，第一引物含有选自SEQ ID NOS(选自SEQ ID NOS:38、41和47的核酸序列)的核酸序列。该试剂盒可以包括第二引物，第二引物含有选自SEQID NOS:39、42、43、45和46的核酸序列。该试剂盒可以包括含有SEQ ID NO:38的核酸序列的第一引物和含有SEQ ID NO:39的核酸序列的第二引物。该试剂盒可以包括含有SEQ ID NO:41的核酸序列的第一引物和含有SEQ ID NO:42的核酸序列的第二引物。该试剂盒可以包括含有SEQ ID NO:41的核酸序列的第一引物和含有SEQ ID NO:43的核酸序列的第二引物。该试剂盒可以包括含有SEQ ID NO:47的核酸序列的第一引物和含有SEQ ID NO:45的核酸序列的第二引物。该试剂盒可以包括含有SEQ ID NO:47的核酸序列的第一引物和含有SEQ IDNO:46的核酸序列的第二引物。该第一引物和第二引物可以扩增靶序列以产生扩增产物。该扩增产物或靶序列可以在高严格度条件下与含有SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:44序列的核酸序列杂交。靶序列可以用作诊断本文任一所述事件的探针。
样本可以包括任何样本，在样本中存在来自植物材料的核酸。样本可以是蛋白样本。蛋白样本可以包括任何样本，在样本中存在来自植物材料的蛋白。该样本或蛋白样本可以包括任何植物材料。该植物材料可以取自植物或其部分。该植物材料可以取自动物饲料或食品。
在一个实施方式中，提供了在样本中鉴定玉米事件4588.259、4588.757或4588.652的方法。该方法可以包括用第一引物和第二引物接触样本。该方法可以包括扩增含有玉米事件特异性靶序列的人工合成的多核苷酸。该靶序列可以是本文任何所述的靶序列。该第一引物和第二引物可以扩增该靶序列以生产扩增产物。该扩增产物可以被用于确定源于有性杂交或自交的植物是否包括一种或多种靶序列并诊断特异性事件。来自玉米事件的样本的扩增产物的长度可以不同于来自相同基因背景的野生型植物样本的扩增产物的长度。来自事件样本的扩增产物可以进一步用作高严格度条件下的探针，所述探针与包括编码葡聚糖酶的特异性区域的人工合成的多核苷酸杂交。该方法可以包括进一步检测至少一个探针与靶序列特异性区域的杂交。
在一个实施方式中，提供了含有本文所述任何一种或多种转基因植物或转基因植物的部分的动物饲料。术语“动物饲料”是指适合并意在由动物为了其营养、维持或生长而摄取的任何食物、饲料、饲料组合物、饮食、制剂、添加剂、补充剂或混合物。包括在转基因植物和动物饲料中的葡聚糖酶在动物的胃肠道或瘤胃环境中可以是有活性的。该动物可以为单胃动物。该动物可以为反刍动物。该单胃动物可以是但不限于鸡、火鸡、鸭、猪、鱼、猫或狗。该反刍动物可以是但不限于牛、奶牛、肉用公牛(steer)、绵羊或山羊。葡聚糖酶可以在动物饲料制备后是有活性的。饲料在青贮过程中暴露的温度可以在20℃到70℃范围内。饲料在粒化过程中暴露的温度可以在70℃到130℃范围内。在饲料粒化过程中，葡聚糖酶可以具有提高的热稳定性，并可以在暴露于高温后保留活性。具有提高热稳定性的葡聚糖酶可以包括、主要由或由与选自由SEQ ID NO:4[AGR2314]、SEQ ID NO:5[AGR2414]和SEQ IDNO:6[AGR2514]所组成的组中的参考序列具有至少70、72、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列组成。
在一个实施方式中，葡聚糖酶可以在被纳入动物饲料之前从转基因植物中分离。该葡聚糖酶可以为本文所述的任一葡聚糖酶。
在一个实施方式中，动物饲料可以进一步包括饲料补充剂。该饲料补充剂可以为任何植物材料。该植物材料可以为非转基因植物或其部分。该植物材料可以包括工程植物或突变植物。该饲料补充剂可以为矿物质。该矿物质可以为微量矿物质。该矿物质可以为巨量矿物质(macro mineral)。该饲料补充剂可以为至少一种维生素。该至少一种维生素可以为脂溶性维生素。该饲料补充剂可以包括一种或多种外源酶。该一种或多种外源酶可以包括水解酶。该水解酶可以为EC3.4分类下酶作为水解酶。该水解酶可以是但不限于木聚糖酶、甘露糖酶、糖酶、蛋白质酶、肽酶、植酸酶、纤维素酶、脂肪酶、磷脂酶、果胶酶、半乳糖苷酶、漆酶、淀粉酶、半纤维素酶或纤维二糖水解酶。该水解酶可以在包括于饲料补充剂中的工程植物或其部分中表达。该饲料补充剂可以包括纯化的水解酶。该饲料补充剂可以是但不限于生长提高添加剂(growth improving additives)、着色剂、调味剂、稳定剂、石灰岩、硬脂酸、淀粉、糖类、脂肪酸、或树胶。该着色剂可以为类胡萝卜素。该类胡萝卜素可以是但不限于鸡油菌素、β-胡萝卜素、虾青素或叶黄素。该脂肪酸可以为多不饱和脂肪酸。该多不饱和脂肪酸可以包括但不限于花生四烯酸、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)或γ-亚麻油酸。该饲料补充剂可以为非转基因植物或其部分。该非转基因植物或其部分可以包括至少一种选自由大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、水稻、小黑麦甜菜、甜菜、菠菜、甘蓝、藜麦、玉米粉、玉米粒、玉米油、酒糟、饲料、面粉、小麦颗粒(wheat pellets)、小麦籽粒(wheatgrain)、大麦籽粒、大麦颗粒、大豆粉、大豆油渣饼、羽扇豆粉、菜籽粉、高粱籽粒、高粱颗粒、菜籽、葵花籽和棉籽所组成的组中的成分。
该饲料补充剂可以包括至少一种选自由以下所组成的组中的成分：可溶性固形物、脂肪、蛭石、石灰岩、普通盐、DL-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、莫能菌酸钠预混料(
Figure BDA0001467438630000261
PREMIX)、维生素预混料、无机饲料磷酸盐、磷酸一钙、磷酸二钙、磷酸三钙、磷酸一二钙、磷酸岩、硒预混料、氯化胆碱、氯化钠和矿物质预混料。
该饲料补充剂可以包括鱼粉、鱼油、骨粉、羽毛粉、动物脂肪。该饲料补充剂可以包括酵母或酵母提取物。
在一个实施方式中，提供了生产动物饲料的方法。该方法可以包括在动物饲料中包括转基因植物，其中，所述转基因植物包括任何一种或多种本文所述的葡聚糖酶。该动物饲料可以包括、主要由或由转基因植物组成。该方法可以进一步包括将转基因植物与饲料补充剂相结合。该饲料补充剂可以为非转基因植物或其部分。该转基因植物可以用本文所述任一方法生产。该饲料补充剂可以为矿物质。该补充剂可以包括一种或多种外源酶。外源酶可以是但不限于木聚糖酶、甘露糖酶、糖酶、蛋白质酶、肽酶、植酸酶、纤维素酶、脂肪酶、磷脂酶、果胶酶、半乳糖苷酶、漆酶、淀粉酶、半纤维素酶或纤维二糖水解酶。
在一个实施方式中，提供了肉类生产的方法。该方法可以包括给动物饲喂动物饲料或由本文所述任意方法生产的动物饲料。该方法可以包括制备包括表达葡聚糖酶的转基因植物的动物饲料。
在一个实施方式中，提供了饲养动物的方法。该方法可以包括给动物饲喂动物饲料或由本文所述任意方法生产的动物饲料。该方法可以包括制备包括表达葡聚糖酶的转基因植物的动物饲料。
在一个实施方式中，提供了增加动物中非淀粉多糖利用率的方法。该方法可以包括给动物饲喂包括任何一种或多种本文所述转基因植物的动物饲料。该方法可以包括制备动物饲料。
在一个实施方式中，提供了降低动物胃肠道粘度的方法。该方法可以包括给动物饲喂包括任何一种或多种本文所述转基因植物的动物饲料。该方法可以包括制备动物饲料。
添加统称为糖酶的外源酶可以改善动物饮食中非淀粉多糖(NSPs)的影响。包括任何一种或多种本文所述葡聚糖酶的动物饲料可以增加摄入饲料的动物对NSPs的利用，或者可以降低NSP对摄入饲料的动物的抗营养作用，并提高动物的生长。制备动物饲料可以包括将本文的一种或多种转基因植物与任何其他饲料补充剂相结合。该葡聚糖酶可以作为纯葡聚糖酶被分离、纯化和添加到动物饲料中。该葡聚糖酶可以与其他饲料补充剂混合添加到动物饲料中。包括该葡聚糖酶或纯化的葡聚糖酶的转基因植物可以配合其他饲料补充剂形成预混剂。
动物饲料可以被生产为粉状饲料。该动物饲料可以被生产为颗粒。磨碎的饲料可以与预混剂混合，预混剂中包括任一含有葡聚糖酶的转基因植物。磨碎的饲料可以包括植物材料和本文所述的饲料补充剂。该饲料补充剂可以包括一种或多种本文所述的外源酶。酶可以以液体或固体制剂的形式添加。对于粉状饲料，固体或液体酶制剂可以在混合步骤之前或期间添加。对于颗粒饲料，酶制剂可以在制粒步骤之前或之后添加。葡聚糖酶可以包括在预混剂中。预混剂也可以包括维生素和微量矿物质。巨量矿物质(macro minerals)可以单独添加到动物饲料中。
在一个实施方式中，提供了提高饮食代谢能的方法。代谢能(ME)是指，在消化和吸收的过程中一些能量被利用掉并且一些材料未消化或无法消化而损失掉后，饮食或饲料提供给动物的净能量。代谢能可以为表观代谢能(AME)，测量方式为动物消耗的饲料和饲料消耗后收集的粪便的卡路里之间的差值。代谢能可以为真代谢能(TME)，它类似于AME，除了它也考虑到内生能量之外。饮食或饲料成分中的能量含量可以使用几种方法学之一进行确定(NRC.1994.Nutrient Requirements of Poultry.9th rev.ed.Natl.Acad.Press,Washington,DC.，通过引用将其全部并入本文)。总能量(GE)是使用隔热热量计进行直接测量，它测量在高氧环境中样本的燃烧热。表观消化能(DE)是饲料或饲料营养(feedstuff)的GE仅减去粪便的GE。表观代谢能(AME)是饲料或饲料营养的GE减去从消化而来的粪便、尿液和气态产物的GE。对于家禽，气体释放非常低，并且通常由于其值很小而被忽略，而尿液和粪便一起排泄，大多数情况下不单独收集。真代谢能(TME)表示为(accounts for)，仅来自饲料或饲料营养来源的排泄物的GE，减去来自非饲料来源的内源能量损失(即，肠道细胞脱落)。用于动物中饲料营养的另一种能量测量是净能量(NE)，它针对热增耗进行了调整。由于热增耗取决于生产力水平，它由于家禽的寿命短而在家禽中存在波动，这一变量在家禽中不经常使用。
TME公鸡试验可以被用于说明GE的内源性(非饲料)损失，通过包括禁食公鸡(fasted rooster)并收集排泄物，来纠正来自喂食(饲料/饲料营养)公鸡的GE。见Sibbald,1976,Poultry Science 55:303-308，通过引用将其全部并入本文。该试验通常被用来确定个别饲料营养的TME而非全部(complete)饲料，并且要求定制的(cecetomized)公鸡(手术切除盲肠)随时可用。该试验涉及强迫喂食(农作物)已知量的成分(对于禽类，提前禁食24-48小时)，然后收集24-48小时时期内的粪便。给出了用于计算TME的方程式，为：TME＝{(GEf×FI)-[(GEe×EO)+-(GEe×EO)-]}/FI，其中，总能量(GE)由弹式量热法确定，单位kcal/kg；FI是采食量(kg)；EO是喂食禽类的排泄物输出(kg)；GEe是排泄物内容物的总能量；GEf是饲料的总能量；“+”表示该数量是来自喂食禽类的能量输出；而“-”表示该数量是来自禁食禽类的能量输出。在TME试验中使用的公鸡(或火鸡)为成年禽类，消化道发育完全。研究表明，在分析相同的饲料成分时，使用公鸡(分层饲养)、火鸡和肉鸡在ME确定中存在差异(Cozannet et al,2010J.Anim,Sci.,88(7):2382-2392，通过引用将其全部并入本文)。所以使用公鸡模型确定TME或AME可能与肉仔鸡中观察到的不等效，但是在科研和产业中是常用的代替物(proxy)。
对于肉鸡，AME试验可以被用于确定全部饲料和一些能量供应饲料营养，以及添加有助于消化的饲料成分的效果。有两种确定ME的常用方法：1)在一段时间内进行总排泄物收集和称重并记录饲料消耗(下面方程式1)，或者2)在饲料中使用无法消化的标记物(氧化铬、氧化钛或酸不溶性灰分)并对粪便进行二次抽样，没有重量要求(下面方程式2)。可以使用AME确定的标记物方法，其中，不要求对饲料消耗或总粪便收集进行称重，并且不需要从粪便中分离洒出(spilled)的饲料。使用标记物法，至少在两天中要给禽类喂食标记物(但优选为五天或更多天)。收集几天的粪便(例如，三天)，每天收集复合成一个样本。
使用总收集法的AME(方程式1)的计算如下：
AME＝[(GEf×FI)-(GEe×EO)]/FI，
其中，总能量(GE)由弹式量热法测量(kcal/kg)；FI是采食量(kg)；EO是排泄物输出(kg)；e是指排泄物内容物；而f是指饲料内容物。使用标记物法的AME的计算为：AME＝[(GEe/Me)-(GEf/Mf)]/(GEe/Me)，其中，总能量是GE(kcal/kg)；M是标记物(ppm或％)；“e”＝排泄物内容物；“f”＝饲料内容物。
在研究有助于消化的饲料添加剂时，可以用于确定饲料AME的另一种方法是回肠消化能(IDE)。该方法使用AME标记物法(如上所述)，但是对禽类实行安乐死，然后切除一段回肠并去除内容物，干燥并分析GE和标记物。IDE法可以被有效地用于检测和比较用于提高饲料能量的消化/吸收的饲料添加剂。IDE的益处是不要求带收集盘的笼子，并且可以在地面鸡圈(floor-pen)研究期间收集。使用标记物法，至少在两天中要给禽类喂食标记物(但优选为五天或更多天)。
使用IDE标记物法的AME(方程式2)的计算如下：
AME＝GEf-(GEd×Mf/Md)，
其中，GE(kcal/kg)；M代表标记物；“d”代表食糜内容物；而“f”表示饲料内容物。
AME和TME可以用氮贮留(AMEn和TMEn)进行校正。为了调整，N的克数乘以8.22kcal/g(尿酸的GE；用于氧化供能的蛋白组织的主要排泄产物)，这也减去了消耗的GE。见Hill,F.W.,and D.L.Anderson,1958,“Comparison of metabolizable energy andproductive energy determinations with growing chicks.”J.Nutr.64:587-603，通过引用将其全部并入本文。AMEn标记物法的总收集的计算分别显示于以下方程式3和方程式4。
方程式3：AMEn，总收集：
AMEn＝{(GEf×FI)-(GEe×EO)-[8.22×(Nf-Ne)]}/FI,
其中，GE＝kcal/kg；FI＝采食量(kg)；EO＝排泄物输出(kg)；N＝氮(g)；e＝排泄物内容物；f＝饲料内容物。
方程式4：IDEn，标记物法：
AMEn＝GEf-(GEd×Mf/Md)-{8.22×[Nf-(Nd×Mf/Md)]},
其中，GE＝kcal/kg；M＝标记物；N＝氮(g/kg)；“d“＝食糜内容物；“f“＝饲料内容物。
由于TME法可以被用于确定个别成分的ME，AME(IDE)法可以使用肉鸡被用于测量个别成分或总饮食中的ME，并检测通过使用酶或其他饲料添加剂来提高ME的效果。
饮食或饲料可以包括任何饲料成分或包括水的成分混合物。饮食可以是包括在本文所述动物饲料中的任何食物、饲料、饲料组合物、饮食、制剂、添加剂、补充剂或混合物。饮食在技术上众所周知，并且至少在以下出版物中进行过描述：Nutrient Requirements ofPoultry,1994,National Research Council,National Academy Press,Washington,D.C.；Broiler Performance and Nutrition Supplement,Cobb-500TM,L-2114-07EN,July,2015；Broiler Performance and Nutrition Supplement,Cobb-700TM,L-21124-13EN,Dec21,2012；Broiler Performance and Nutrition Supplement,CobbAvianTM,L-2144-04EN,April,2012；Broiler Performance and Nutrition Supplement,CobbSassoTM,L-2154-01,May 7,2008；Ross 308Broiler:Nutrition Specifications,2014Aviagen,0814-AVNR-035；Ross Nutrition Supplement 2009,Aviagen；Ross 708Broiler:NutritionSpecification,2014 Aviagen,0814-AVNR-036；Ross PM3 Brioler NutritionSpecification,2014 Aviagen,0814-AVNR-037；Arbor Acres Plus Broiler NutritionSpecifications,2014 Aviagen,1014-AVNAA-043；Arbor Acres Broiler NutritionSupplement,2009 Aviagen；以及美国饲料管理官员协会(Association of American FeedControl Officials，AAFCO)2015官方出版物，Nutrient Requirements for Poultry，所有这些通过引用将其全部并入本文。
在一个实施方式中，饮食可以是肉鸡饮食。该肉鸡饮食可以由下列一种或多种成分组成：51.49％(w/w)-61.86％(w/w)玉米、25.45％(w/w)-35.03％(w/w)大豆粉、5.00％(w/w)玉米干酒糟颗粒加可溶性固形物、2.00％(w/w)蛭石、0.30％(w/w)-1.99％(w/w)磷酸氢钙、1.00％(w/w)家禽脂肪、0.81％(w/w)-4.01％(w/w)石灰岩、0.24％(w/w)-0.50％(w/w)盐(NaCl)、0.13％(w/w)-0.45％(w/w)DL-甲硫氨酸、0.20％(w/w)氯化胆碱60、0.20％(w/w)矿物质预混剂、0.05％(w/w)维生素预混剂、0.13％(w/w)-0.23％(w/w)L-赖氨酸、0.08％(w/w)-0.14％(w/w)L-苏氨酸、0.05％(w/w)莫能菌素、0.05％(w/w)硒预混剂、0.15％(w/w)碳酸氢钠和0.10％(w/w)沙子。饮食中的可消化赖氨酸可以为1.00％(w/w)到1.20％(w/w)。饮食中的可消化甲硫氨酸可以为0.47％(w/w)到0.54％(w/w)。饮食中的可消化甲硫氨酸和半胱氨酸可以为0.98％(w/w)到1.10％(w/w)。饮食中的可消化苏氨酸可以为0.68％(w/w)到0.84％(w/w)。饮食中的可消化色氨酸可以为0.17％(w/w)到0.22％(w/w)。饮食中的钙可以为0.71％(w/w)到0.96％(w/w)。饮食中的可利用磷可以为0.17％(w/w)到0.46％(w/w)。饮食中的钠可以为0.17％(w/w)到0.19％(w/w)。本文任一范围内每种成分的浓度可以是包括在所述范围内任意两个浓度点之间的任何值。在一个实施方式中，饮食可以是肉鸡饮食，由下列一种或多种成分组成：30.00％(w/w)-75.00％(w/w)玉米、5.00％(w/w)-75.00％(w/w)小麦；5.00％(w/w)-65.00％(w/w)大麦；5.00％(w/w)-30.00％(w/w)高粱、5.00％(w/w)-50.00％(w/w)小米、10.00％(w/w)-45.00％(w/w)大豆粉、5.00％(w/w)-20.00％(w/w)油菜籽(Canola(Rapeseed))粉、2.00％(w/w)-15.00％(w/w)玉米蛋白粉、5.00％(w/w)-15.00％(w/w)葵花籽粉、5.00％(w/w)-30.00％(w/w)玉米干酒糟颗粒加可溶性固形物、1.00％(w/w)-8.00％(w/w)家禽/猪/牛的肉和骨粉、1.00％(w/w)-8.00％(w/w)鱼粉、0.10％(w/w)-2.1％(w/w)磷酸氢二钙或磷酸二氢钙或脱氟磷酸、0.50％(w/w)-6.00％(w/w)大豆油或植物油或动物脂肪或油脂或它们的组合、0.81％(w/w)-2.00％(w/w)石灰岩、0.50％(w/w)-7.00％大豆皮、0.24％(w/w)-0.50％(w/w)盐(NaCl)、0.13％(w/w)-0.50％(w/w)DL-甲硫氨酸、0.01％(w/w)-0.20％(w/w)氯化胆碱60、0.10％(w/w)-0.20％(w/w)矿物质预混剂、0.05％(w/w)-0.25％(w/w)维生素预混剂、0.05％(w/w)-0.30％(w/w)L-赖氨酸、0.10％(w/w)-0.30％(w/w)DL-甲硫氨酸或甲硫氨酸类似物(MHA)、0.05％(w/w)-0.20％(w/w)L-苏氨酸、0.05％(w/w)莫能菌素、0.05％(w/w)硒预混剂、0.05％(w/w)-0.15％(w/w)碳酸氢钠以及250FTU/kg-2000FTU/kg植酸酶。饮食的代谢能可以为1225(kcal/lb)-1491(kcal/lb)。饮食中的粗蛋白(CP)可以为15％(w/w)到25％(w/w)。饮食中的可消化赖氨酸可以为0.85％(w/w)到1.30％(w/w)。饮食中的可消化甲硫氨酸可以为0.45％(w/w)到0.70％(w/w)。饮食中的可消化甲硫氨酸和半胱氨酸可以为0.65％(w/w)到1.10％(w/w)。饮食中的可消化苏氨酸可以为0.60％(w/w)到0.84％(w/w)。饮食中的可消化色氨酸可以为0.10％(w/w)到0.25％(w/w)。饮食中的钙可以为0.68％(w/w)到1.10％(w/w)。饮食中的可利用磷可以为0.17％(w/w)到0.50％(w/w)。饮食中的钠可以为0.17％(w/w)到0.19％(w/w)。饮食中的植酸酶可以为500FTU/kg(w/w)到8,000FTU/kg(w/w)。本文任一范围内每种成分的浓度可以是包括在所述范围内的任意两个浓度点之间的任何值。这些成分的浓度变化也可以被用于饮食。
该方法可以包括将转基因植物或其部分与饲料成分混合，以获得混合物。该饲料成分可以是本文所述饮食中包括的一种或多种成分。该转基因植物或其部分可以是本文所述的任何转基因植物或其部分。该方法可以包括用混合物喂食动物。喂食包括葡聚糖酶的混合物的动物的体重增加量(BWG)可以比对照动物的BWG高，对照动物喂食未混合包括葡聚糖酶的转基因植物的相同饲料成分。在一个实施方式中，喂食包括葡聚糖酶混合物的动物的BWG可以类似于对照动物的BWG，对照动物喂食高能饮食或与包括葡聚糖酶的混合物相比包括更多或更高浓度成分的饮食。在一个实施方式中，喂食包括葡聚糖酶的混合物的动物的饲料转化率(FCR)可以比对照动物的FCR低，对照动物喂食未混合包括葡聚糖酶的转基因植物的相同饲料成分。FCR的定义是，动物进食的饲料的质量除以动物的质量。在一个实施方式中，喂食包括葡聚糖酶的混合物的动物的FCR可以类似于对照动物的FCR，对照动物喂食高能饮食或与包括葡聚糖酶的混合物相比包括更多或更高浓度成分的饮食。
在一个实施方式中，提供了提高葡聚糖酶热稳定性的方法。该方法可以包括生产转基因植物，该转基因植物包括编码葡聚糖酶的人工合成的核酸。该人工合成的核酸可以包括本文所述的任一序列。当暴露在70℃到130℃的温度范围内，包括端点时，该葡聚糖酶可以是热稳定的。
当暴露在25℃到130℃的温度范围内，包括端点时，该葡聚糖酶可以是热稳定的。当暴露在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、25℃到30℃、25℃到35℃、25℃到40℃、25℃到45℃、25℃到50℃、25℃到55℃、25℃到60℃、25℃到65℃、25℃到70℃、25℃到75℃、25℃到80℃、25℃到85℃、25℃到90℃、25℃到95℃、25℃到100℃、25℃到105℃、25℃到110℃、25℃到115℃、25℃到120℃、25℃到125℃或低于130℃的温度范围内时，该葡聚糖酶可以是热稳定的。当暴露在70℃到130℃的温度范围内，包括端点时，该葡聚糖酶可以是热稳定的。当暴露在70℃到75℃、70℃到80℃、70℃到85℃、70℃到90℃、70℃到95℃、70℃到100℃、70℃到105℃、70℃到110℃、70℃到115℃、70℃到120℃或70℃到130℃的温度范围内，包括端点时，该葡聚糖酶可以是热稳定的。
上述提到的人工合成的核酸可以单独、作为另一种核酸的一部分、作为载体的一部分或如上所述作为转基因植物的一部分提供于本文的实施方式中。
在一个实施方式中，该转基因植物可以来源于玉米、黑麦、柳枝稷、芒、甘蔗或高粱之一。该转基因植物可以使用含有上面所列核酸序列的载体通过农杆菌介导的转化而制备。
在一个实施方式中，提供了提高来自谷物的可发酵糖的生产的方法。该方法可以包括将来自本文所述的任一转基因植物的谷物与来自不同植物的谷物混合，以形成混合谷物。该不同植物可以为非转基因植物。该不同植物可以为工程植物，该工程植物包括编码至少一种水解酶的人工合成的核酸。该水解酶可以是但不限于木聚糖酶、淀粉酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、糖化酶、内含肽修饰的淀粉酶、内含肽修饰的木聚糖酶、内含肽修饰的内切葡聚糖酶、内含肽修饰的外切葡聚糖酶、内含肽修饰的阿魏酸酯酶、蛋白酶、内含肽修饰的蛋白酶、植酸酶，或内含肽修饰的植酸酶。该方法可以包括加工混合谷物。该加工可以包括一种或多种选自由收获、打包(baling)、碾磨、磨粉、切削、粒径减小、压碎、制粒、从混合谷物中提取组分、纯化组分或部分混合谷物、提取或纯化淀粉、多糖水解成寡糖或单糖、饲料青贮、与青贮饲料或其他生物质混合并青贮、发酵、化学转化和化学催化所组成的组中的操作。该生物质可以是但不限于干草(hay)、稻草、秣草(stover)、青贮饲料、压缩和颗粒饲料、大豆、发芽的谷物、豆类、饲料谷物、玉米、水稻、大麦或小麦籽粒。该生物质可以为任何来自农业废料的生物质。该方法可以包括将可发酵糖转化为生化产品。该生化产品可以是但不限于乙醇、丁醇、乳酸、柠檬酸和乙酸。
在一个实施方式中，提供了降低谷物混合物粘度的方法。该方法可以包括将来自本文所述的任一转基因植物的谷物与来自不同植物的谷物混合，以形成混合谷物。可以在混合谷物中添加水以形成谷物混合物。在包括本文所述的任一葡聚糖酶时，该谷物混合物的粘度可以较低。该粘度可以为肠道粘度，肠道粘度通常对来自安乐死后的禽类或猪的肠道样本进行测量。在这种方法中，将食糜样本离心，并使用粘度计对上清液的粘度进行分析。例如，如Lee et al.所述，将回肠食糜在3,500×重力下离心10分钟，并将0.5ml上清液放入一个配置有CPE-40轴的布氏锥板粘度计(Brookfield Cone and Plate Viscometer)1中。见Lee,J.T.,C.A.Bailey,and A.L.Cartwright.2003.-Mannanase amelioratesviscosity-associated depression of growth in broiler chickens fed guar germand hull fractions.Poult.Sci.82:1925-1931，通过引用将其全部并入本文。样本在40℃和5rpm下分析30秒，确定厘泊(单位cP)的读数。cP越高，样本的粘度越高。
该不同植物可以为非转基因植物。该不同植物可以为工程植物，该工程植物包括编码至少一种水解酶的人工合成的核酸。该水解酶可以是但不限于木聚糖酶、淀粉酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、糖化酶、内含肽修饰的淀粉酶、内含肽修饰的木聚糖酶、内含肽修饰的内切葡聚糖酶、内含肽修饰的外切葡聚糖酶、内含肽修饰的阿魏酸酯酶、蛋白酶、内含肽修饰的蛋白酶、植酸酶，或内含肽修饰的植酸酶。该方法可以包括加工谷物混合物。该加工可以包括一种或多种选自由收获、碾磨、磨粉、粒径减小、压碎、加热、胶化(gelotinzing)、液化、从混合谷物中提取组分、纯化组分或部分混合谷物、提取或纯化淀粉、多糖水解成寡糖或单糖、糖化、发酵、化学转化和化学催化所组成的组中的操作。
在一个实施方式中，提供了提高从谷物中生产乙醇的方法。该方法包括实施任一提高本文中所述可发酵糖生产的方法。
以下列表包括本发明的具体实施方式。但该列表不受限制，并且不排除本领域技术人员所了解的可选的实施方式。
实施方式
1、一种包括编码葡聚糖酶的人工合成的核酸的转基因植物，其中，所述葡聚糖酶包括与选自SEQ ID NOS:4–6所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且能够降解一种或多种多糖。
2、根据实施方式1所述的转基因植物，其中，所述一种或多种多糖选自由β-葡聚糖、纤维素、纤维二糖、pNP-D-吡喃葡萄糖苷和木聚糖所组成的组中。
3、根据前述实施方式中任意一项或两项所述的转基因植物，其中，所述葡聚糖酶在植物中表达并且暴露于4.0到10.0的pH范围内时具有活性。
4、根据前述实施方式中任意一项或多项所述的转基因植物，其中，所述葡聚糖酶在植物中表达并且暴露于25℃到130℃的温度范围内时具有活性。
5、根据前述实施方式中任意一项或多项所述的转基因植物，其中，在植物中表达的所述葡聚糖酶的活性与在细菌细胞中表达的具有相同氨基酸序列的葡聚糖酶的活性相比稳定性提高。
6、根据前述实施方式中任意一项或多项所述的转基因植物，其中，所述植物选自由小麦、玉米、大麦、水稻和高粱所组成的组中。
7、一种转基因植物，所述转基因植物包括一种人工合成的核酸，所述人工合成的核酸包括与选自由SEQ ID NOS:1–3所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性的序列，其中，该葡聚糖酶能够降解一种或多种多糖。
8、根据实施方式7所述的转基因植物，其中，所述一种或多种多糖选自由β-葡聚糖、纤维素、纤维二糖、pNP-D-吡喃葡萄糖苷和木聚糖所组成的组中。
9、根据实施方式7-8中任意一项或多项所述的转基因植物，其中，所述葡聚糖酶在植物中表达并且暴露于4.0到10.0的pH范围内时具有活性。
10、根据实施方式7-9中任意一项或多项所述的转基因植物，其中，该葡聚糖酶在植物中表达并且暴露于25℃到130℃的温度范围内时具有活性。
11、根据实施方式7-10中任意一项或多项所述的转基因植物，其中，在植物中表达的葡聚糖酶的活性与在细菌细胞中表达的具有相同氨基酸序列的葡聚糖酶的活性相比稳定性提高。
12、根据实施方式7-11中任意一项或多项所述的转基因植物，其中，所述转基因植物选自由小麦、玉米、大麦、水稻和高粱所组成的组中。
13、根据实施方式7-12中任意一项或多项所述的转基因植物，其中，所述转基因植物包括SEQ ID NO:1的核酸序列，并且对诊断事件4588.259、4588.757或4588.652产生扩增子。
14、一种人工合成的核酸，其包括与选自由SEQ ID NOS:1–3所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性的序列，其中，所述葡聚糖酶能够降解一种或多种多糖。
15、根据实施方式14所述的人工合成的核酸，其中，所述一种或多种多糖选自由β-葡聚糖、纤维素、纤维二糖、pNP-D-吡喃葡萄糖苷和木聚糖所组成的组中。
16、一种人工合成的多核苷酸，其包括与选自由SEQ ID NO:7–19所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性的序列，其中，该人工合成的多核苷酸包括编码葡聚糖酶的人工合成的核酸，所述葡聚糖酶能够降解一种或多种多糖。
17、根据实施方式16所述的合成多核苷酸，其中，所述一种或多种多糖选自由β-葡聚糖、纤维素、纤维二糖、pNP-D-吡喃葡萄糖苷和木聚糖所组成的组中。
18、一种载体，包括实施方式17的人工合成的多核苷酸或人工合成的多核苷酸的片段。
19、一种制备转基因植物的方法，该转基因植物包括葡聚糖酶，该方法包括：
用人工合成的核酸与植物细胞接触，该人工合成的核酸编码与选自由SEQ IDNOS:1–3所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中，所述葡聚糖酶能够降解一种或多种多糖；
由该转基因植物细胞再生转基因植物；并且
选择表达葡聚糖酶的转基因植物，其中，所述葡聚糖酶暴露于从25℃到130℃的温度范围内时具有活性和热稳定。
20、根据实施方式19所述的方法，其中，该一种或多种多糖选自由β-葡聚糖、纤维素、纤维二糖、pNP-D-吡喃葡萄糖苷和木聚糖所组成的组中。
21、根据实施方式19-20中任意一项或多项所述的方法，其中，该人工合成的核酸是实施方式13的载体的一部分。
22、一种动物饲料，其含有实施方式1–13中任意一项或多项所述的转基因植物或其部分、实施方式19–21中任意一项或多项所述的产物，或实施方式51–54中任意一种或多种所述的人工合成的多肽。
23、根据实施方式22所述的动物饲料，其进一步含有饲料补充剂或饲料添加剂。
24、根据实施方式22-23中任意一项或多项所述该动物饲料，其中，该饲料补充剂是植物材料。
25、根据实施方式22-24中任意一项或多项所述该动物饲料，其中，该植物材料是非转基因植物。
26、根据实施方式22-24中任意一项或多项所述该动物饲料，其中，该植物材料是工程植物。
27、根据实施方式22-26中任意一项或多项所述该动物饲料，其中，该饲料补充剂包括一种或多种外源酶。
28、实施方式27所述的该动物饲料，其中，该一种或多种外源酶包括选自由木聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维素酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、内含肽修饰的木聚糖酶、内含肽修饰的内切葡聚糖酶、内含肽修饰的纤维素酶、内含肽修饰的外切葡聚糖酶、内含肽修饰的阿魏酸酯酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、内含肽修饰的淀粉酶、植酸酶、内含肽修饰的植酸酶、蛋白酶和内含肽修饰的蛋白酶所组成的组中的水解酶。
29、根据实施方式22-28中任意一项或多项所述的动物饲料，其中，该植物材料包括至少一种选自由饲料(forage)、生物质、玉米粉、玉米粒、面粉、小麦粒、小麦籽粒、大麦籽粒、大麦粒、大豆粉、大豆饼、青贮饲料、高粱籽粒和高粱粒所组成的组中的组分。
30、根据实施方式23-29中任意一项或多项所述的动物饲料，其中，该饲料补充剂包括至少一种选自由可溶性固形物、脂肪和蛭石、石灰岩(limestone)、普通盐、DL-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、莫能菌素
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维生素预混剂、磷酸氢二钙、硒预混剂、氯化胆碱、氯化钠和矿物质预混剂所组成的组中的组分。
31、一种生产动物饲料的方法，该方法包括：将1)实施方式1-13中任意一项或多项所述的转基因植物或其部分、2)实施方式19-41中任意一项或多项所述的产物，或3)实施方式51-54中任意一项或多项所述的人工合成的多肽与植物材料混合。
32、根据实施方式31所述的方法，其进一步包括将混合物制粒。
33、根据实施方式32所述的方法，其进一步包括向混合物中添加饲料补充剂。
34、根据实施方式33所述的方法，其中，该饲料补充剂包括至少一种外源酶。
35、根据实施方式34所述的方法，其中，该至少一种外源酶包括选自由木聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维素酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、内含肽修饰的木聚糖酶、内含肽修饰的内切葡聚糖酶、内含肽修饰的外切葡聚糖酶、内含肽修饰的纤维素酶、内含肽修饰的阿魏酸酯酶、淀粉酶、内含肽修饰的淀粉酶、甘露聚糖酶、植酸酶和蛋白酶所组成的组中的水解酶。
36、一种提高动物中非淀粉多糖利用率的方法，该方法包括给动物喂食1)包括实施方式1-13中任意一项或多项所述的转基因植物的动物饲料、2)实施方式22-30中任意一项或多项所述的动物饲料、3)通过实施方式31-35中任意一项或多项所述方法生产的动物饲料或4)包括实施方式51-54中任意一项或多项所述的人工合成的核酸的动物饲料。
37、根据实施方式36所述的方法，其进一步包括制备动物饲料。
38、根据实施方式36-37中任意一项或两项所述的方法，其中，该动物是单胃动物或反刍动物。
39、一种提高葡聚糖酶热稳定性的方法，该方法包括生产包括人工合成的核酸的转基因植物，该人工合成的核酸包括、基本上由或由与选自由SEQ ID NOS:4–6所组成的组中的参考序列具有70％同一性的氨基酸序列组成，其中，该序列编码能够降解一种或多种多糖的葡聚糖酶。
40、根据实施方式39所述的方法，其中，该一种或多种多糖选自由β-葡聚糖、纤维素、纤维二糖、pNP-D-吡喃葡萄糖苷和木聚糖所组成的组中。
41、根据实施方式39-40中任意一项或两项所述的方法，其中核酸的表达产生葡聚糖酶，并且该葡聚糖酶在暴露于25℃到130℃的温度范围内时是热稳定的。
42、一种提高谷物中可发酵糖产量的方法，该方法包括：
将来自实施方式1-13中任意一项或多项所述的转基因植物的谷物与来自不同植物的谷物混合，形成混合谷物；并且
加工该混合谷物。
43、根据实施方式42所述的方法，其中，该不同植物是工程植物，该工程植物包括编码至少一种水解酶的人工合成的核酸。
44、根据实施方式42-43中任意一项或两项所述的方法，其中，该至少一种水解酶选自由木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、内含肽修饰的木聚糖酶、内含肽修饰的内切葡聚糖酶、内含肽修饰的外切葡聚糖酶、内含肽修饰的纤维素酶、内含肽修饰的阿魏酸酯酶、淀粉酶、植酸酶和蛋白酶所组成的组中。
45、根据实施方式42-43中任意一项或多项所述的方法，其中，该加工包括至少一种选自由收获、打包、碾磨、磨粉、切削、粒径减小、压碎、制粒、从混合谷物中提取组分、纯化组分或部分混合谷物、提取或纯化淀粉、多糖水解成寡糖或单糖、饲料青贮、发酵、化学转化和化学催化所组成的组中的操作。
46、根据实施方式45所述的方法，其进一步包括生产生化产品。
47、根据实施方式46所述的方法，其中，该生化产品选自由乙醇、丁醇、乳酸、柠檬酸和乙酸所组成的组中。
48、提高谷物来源的乙醇产量的方法，包括实施实施方式42-47中任意一项或多项所述的方法。
49、提高转基因植物来源的乙醇产量方法，包括：
将实施方式1-13中任意一项或多项所述的转基因植物或其部分与不同植物或其部分混合，来形成混合的植物材料；
将混合的植物材料转化成可发酵糖；并且
将可发酵糖加工成乙醇。
50、根据实施方式49所述的方法，其中，该植物材料包括纤维、谷物或其混合物。
51、一种人工合成的多肽，包括与选自由SEQ ID NOS:4-6所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且能够降解一种或多种多糖。
52、根据实施方式51所述的人工合成的多肽，其中，该一种或多种多糖选自由β-葡聚糖、纤维素、纤维二糖、pNP-D-吡喃葡萄糖苷和木聚糖所组成的组中。
53、一种人工合成的多肽，其包括的氨基酸序列包括连续的氨基酸序列，该连续氨基酸序列与具有SEQ ID NOS:4–6的任意序列的葡聚糖酶的50到100、50到150、50到200、50到250、50到300、50到322或50到全部的连续氨基酸残基具有至少90％的同一性，其中该葡聚糖酶能够降解一种或多种多糖。
54、根据实施方式51所述的人工合成的核酸，其中，该一种或多种多糖选自由β-葡聚糖、纤维素、纤维二糖、pNP-D-吡喃葡萄糖苷和木聚糖所组成的组中。
55、一种提高饮食代谢能的方法，该方法包括将转基因植物或其部分与饲料成分混合，其中该转基因植物或其部分包括编码葡聚糖酶的人工合成的核酸，该葡聚糖酶包括与选自由SEQ ID NOS:4-6所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且能够降解一种或多种多糖。
56、根据实施方式55所述的人工合成的多肽，其中该一种或多种多糖选自由β-葡聚糖、纤维素、纤维二糖、pNP-D-吡喃葡萄糖苷和木聚糖所组成的组中。
57、根据实施方式55-56中任意一项多多项所述的方法，其中该人工合成的核酸包括与选自由SEQ ID NOS:1-3所组成的组中的参考序列具有至少70％同一性的序列。
58、根据实施方式55-57中任意一项多多项所述的方法，其中该葡聚糖酶在植物中表达并且暴露于5.0到10.0的pH范围内时具有活性。
59、根据实施方式55-58中任意一项多多项所述的方法，其中该葡聚糖酶在植物中表达并且暴露于25℃到130℃的温度范围内时具有活性。
60、根据实施方式55-59中任意一项或多项所述的方法，其中该饲料成分包括至少一种选自由玉米粉、玉米粒、面粉、小麦粒、小麦籽粒、小麦粗粉(wheat middlings)、大麦籽粒、大麦粒、大豆粉、大豆皮、干酒糟、大豆饼、高粱籽粒和高粱粒所组成的组中的成分。
61、根据实施方式55-60中任意一项多多项所述的方法，其中该饲料成分包括至少一种选自由可溶性固形物、脂肪和蛭石、石灰岩、普通盐、DL-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、莫能菌素
Figure BDA0001467438630000441
维生素预混剂、磷酸氢二钙、硒预混剂、氯化胆碱、氯化钠、矿物质预混剂以及一种或多种外源酶所组成的组中的成分。
62、一种生产动物饲料的方法，包括将实施方式1-13中任意一项或多项所述的转基因植物或其部分与植物材料混合。该方法还包括生产植物的方法，该植物包括实施方式63-68中任意一项或多项所述的葡聚糖酶。
63、一种生产包括葡聚糖酶的植物的方法，该方法包括将植物与包括事件4588.259、4588.757或4588.652的转基因植物杂交，并选择包括事件4588.259、4588.757或4588.652并能够降解一种或多种多糖的第一代子代植物。
64、根据实施方式63所述的方法，其中，该一种或多种多糖选自由β-葡聚糖、纤维素、纤维二糖、pNP-D-吡喃葡萄糖苷和木聚糖所组成的组中。
65、根据实施方式63-64中任意一项或多项所述的方法，进一步包括将第一代子代植物自交并选择包括事件4588.259、4588.757或4588.652并能够降解一种或多种多糖的第二代子代植物。
66、根据实施方式65所述的方法，其中，该第二代子代植物是事件4588.259、4588.757或4588.652的纯合子。
67、根据实施方式65所述的方法，其中该第二代子代植物是事件4588.259、4588.757或4588.652的杂合子。
68、根据实施方式67的所述方法，进一步包括将第二代子代植物自交并选择包括事件4588.259、4588.757或4588.652并能够降解一种或多种多糖的第三代子代植物。
69、一种试剂盒，该试剂盒在样本中识别玉米事件4588.259、4588.757或4588.652，该试剂盒包括第一引物和第二引物，其中该第一引物和第二引物能够扩增特意于玉米事件4588.259、4588.757或4588.652的靶序列。
70、根据实施方式69所述的试剂盒，其中第一引物包括选自由SEQ ID NOS:38、41和47所组成的组中的核酸序列。
71、根据实施方式69-70中任意一项或多项所述的试剂盒，其中该第二引物包括选自由SEQ ID NOS:39、42、43、45和46所组成的组中的核酸序列。
72、根据实施方式69-71中任意一项或多项所述的试剂盒，其中该靶序列包括选自由SEQ ID NOS:51-55所组成的组中的序列。
73、根据实施方式69-72中任意一项或多项所述的试剂盒，其中该靶序列能够在高严格度条件下与包括SEQ ID NOS:40或44的序列的核酸序列杂交。
74、根据实施方式69-73中任意一项或多项所述的试剂盒，其中该样本包括来自实施方式1-13中任意一项或多项所述的转基因植物的植物物质。
75、一种在样本中识别玉米事件4588.259、4588.757或4588.652的方法，包括：
使样本与实施方式69-74中任意一项或多项所述的试剂盒的第一引物和第二引物接触；
在该样本中扩增核酸以获得扩增产物；并且
检测特意于玉米事件4588.259、4588.757或4588.65中靶序列的扩增产物。
76、根据实施方式75所述的方法，其中，该靶序列包括选自由SEQ ID NOS:51-55所组成的组中的序列；该方法可以添加到实施方式63–68中的任意一项或多项中。
77、根据实施方式75所述的方法，其中该靶序列是选自由SEQ ID NOS:22-31所组成的组中至少一种序列。
78、根据实施方式75所述方法，其中检测步骤包括在高严格度条件下将扩增产物与包括序列SEQ ID NOS:40的核酸杂交，并选择特意于玉米事件4588.259的扩增产物。
79、根据实施方式75所述的方法，其中检测步骤包括在高严格度条件下将扩增产物与包括序列SEQ ID NOS:44的核酸杂交，并选择特意于玉米事件4588.652的扩增产物。
80、一种降低谷物混合物粘度的方法，该方法包括将来自实施方式1-13中任意一项或多项所述的转基因植物的谷物、不同的植物和液体结合，以形成谷物混合物。
81、根据实施方式80所述的方法，其中该不同植物是非转基因植物。
82、根据实施方式80所述的方法，其中该不同植物是基因工程植物。
83、根据实施方式80和82所述的方法，其中该基因工程植物包括编码至少一种水解酶的人工合成的核酸。
84、根据实施方式83所述的方法，其中该至少一种水解酶选自由木聚糖酶、淀粉酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、糖化酶、内含肽修饰的淀粉酶、内含肽修饰的木聚糖酶、内含肽修饰的内切葡聚糖酶、内含肽修饰的外切葡聚糖酶、内含肽修饰的阿魏酸酯酶、蛋白酶、内含肽修饰的蛋白酶、植酸酶或内含肽修饰的植酸酶所组成的组中。
85、根据实施方式80-84中任意一项或多项所述的方法，进一步包括加工该谷物混合物。
86、根据实施方式85所述的方法，其中加工步骤包括选自由收获、碾磨、磨粉、粒径减小、压碎、加热、胶化、液化、从混合谷物中提取组分、纯化组分或部分混合谷物、提取或纯化淀粉、多糖水解成寡糖或单糖、糖化、发酵、化学转化和化学催化所组成的组中的一种或多种操作。
本文的进一步实施方式可以通过使用来自本文任意一项或多项其他实施方式的一种或多种要素来补充一项实施方式和/或使用来自本文一项或多项其他实施方式的一种或多种要素来替代来自一项实施方式的一种或多种要素。
实施例
提供了以下非限制性实施例来说明特定实施方式。全部实施方式可以用来自以下一个或多个实施例的一个或多个细节来补充，和/或来自一个实施方式的一种或多种要素可以用来自以下一个或多个实施例的一个或多个细节替代。
实施例1.饲料葡聚糖酶表达载体
合成了在玉米中表达的AGR2314饲料葡聚糖酶的密码子优化的核苷酸序列。为了产生初始植物转化构建载体，将单个AGR2314表达框构建到载体pAG4000(pAG4258)或pAG4500(pAG4588、pAG4597和pAG4708)中。载体pAG4000通过如下方法构建，通过玉米泛素1启动子(包括其自身的第一个内含子)将水稻泛素3启动子替换为第一个内含子，用以驱动编码大肠杆菌(E.coli)磷酸甘露糖异构酶(PMI)的可选标记物基因的表达。载体pAG4500代表pAG4000的进一步改进，并包括三种修改，如1)在第一个玉米泛素内含子后插入9bp的序列(ATCCAGATC)，代表ATG转换为ATC的泛素单体的前三个密码子；2)在9bp序列泛素单体后插入玉米科扎克(Kozak)元件(TAAACC)；3)用新的多克隆位点(MCS)替换旧的MCS，该新MCS通过PCR合成，并且设计为包括一些稀有切酶(cutting enzymes)(NotI、PacI、FseI、SwaI、AscI、AsiSI)的多个位点，以便于在一个T-DNA上克隆高达4-5个表达框。
pAG4500中新MCS的序列(PmeI-KpnI片段)：
GTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAACCTGATCATGAGCGGAGAATTAAGGGAGTCACGTTATGACCCCCGCCGATGACGCGGGACAAGCCGTTTTACGTTTGGAACTGACAGAACCGCAACGTTGAAGGAGCCACTCAGCCTAAGCGGCCGCATTGGACTTAATTAAGTGAGGCCGGCCAAGCGTCGATTTAAATGTACCACATGGCGCGCCAACTATCATGCGATCGCTTCATGTCTAACTCGAGTTACTGGTACGTACCAAATCCATGGAATCAAGGTACC(SEQ ID NO:20)。
图1-4分别表明表达载体pAG4258、pAG4588、pAG4597和pAG4708，携带单个的饲料葡聚糖酶表达单元。载体pAG4258(图1；SEQ ID NO 7)已经通过组装表达框而被克隆，该表达框通过在pAG4000的KpnI-AvrII位点中将玉米Glb1启动子融合到玉米密码子优化的AGR2314序列中而得到。载体pAG4588(图2；SEQ ID NO 8)和pAG4597(图3；SEQ ID NO 9)通过将它们相应的AGR2314表达框组装到pAG4500的KpnI-EcoRI位点中而得到，而载体pAG4708(图4；SEQ ID NO 10)是通过将AGR2314表达框克隆到pAG4500的XmaI-AvrII位点中而得到。图5-6分别表明表达载体pAG4766和pAG4767，携带两个饲料葡聚糖酶表达单元。图7-8分别表明表达载体pAG4770和pAG4771，携带三个饲料葡聚糖酶表达单元。随后使用了在pAG4500的MCS中可获得的独特稀有限制性酶切位点，以便在同一个T-DNA上开发额外的包括双重AGR2314表达单元的表达构建载体，如pAG4766(图5；SEQ ID NO 11)和pAG4767(图6；SEQ ID NO 12)，或三重AGR2314表达单元的表达构建载体，如pAG4770(图7；SEQ ID NO 13)和pAG4771(图8；SEQ ID NO 14)。在植物中表达AGR2314葡聚糖酶的构建载体列于表1。携带表达载体的大肠杆菌(E.coli)菌株被用于与农杆菌结合，并随后转化玉米。
表1.序列描述
Figure BDA0001467438630000491
相关的β葡聚糖酶的表达框，AGR2414和AGR2514，是使用类似策略制备的，并且为这些表达框提供了序列，这些表达框发现在表达载体pAG4257、pAG4692、pAG4693、pAG4705、pAG4706、pAG4766、pAG4257、pAG4692、pAG4693、pAG4705和pAG4706中。
实施例2.饲料葡聚糖酶蛋白提取过程
通过在带有0.5mm或1mm筛的Udy旋风磨碎机或切碎机中磨粉，从约20粒转基因种子中制备面粉。在2ml管中向20mg面粉添加约0.5ml蛋白提取缓冲液(100mM磷酸钠，pH 6.5，0.01％Tween 20)。在某些情况下，在15ml管或250ml瓶中将2g、10g或20g磨碎的样本与10ml、50ml或100ml提取缓冲液混合。可以通过适当地缩放这些量来使用较大的质量和体积。涡旋后，管被放置在位于60℃培养箱中的转台上，并旋转1小时，用于提取蛋白。在台式离心机中于16,000×g离心10分钟后，将20μl上清液加入到380μl蛋白提取缓冲液中使上清液稀释20倍，用于酶活性检测。在某些情况下，如有必要可以使用其他稀释因子。
实施例3.饲料葡聚糖酶活性测量
比色检测。将五十微升稀释的(20倍到360倍)蛋白提取物与450μl的100mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5，0.01％Tween 20以及1片购自Megazyme(Wicklow Ireland)的β-葡聚糖酶(glucazyme)混合，然后在80℃孵育1小时，之后添加1ml的2％Tris碱。3000×g离心10分钟后，将100μl的上清液转移到一个微孔板中，在590nm(A590)下测量吸光度。活性在乘以稀释因子后记录为A590/mg面粉：A590×A×(500/50)/20mg，其中A是蛋白提取稀释因子；500是用于蛋白提取的缓冲液的体积(ml)；50是用在活性检测中的蛋白提取物的体积(ml)。
单位活性测量。该检测涉及还原糖的定量，还原糖释放于购自Megazyme(Wicklow,Ireland)的模式底物(大麦-β-葡聚糖)消化进程期间。
模式底物水解。检测2ml管标有“+”符号，向每个检测管中加入5mg大麦-β-葡聚糖底物(反应)；对照管(对照)中不加入底物。每管(反应和对照)加入四百五十微升的100mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5，并将管置于Thermo振荡器中，温度设置为80℃，振荡速度设置为1000rpm。将管在80℃下1000rpm振荡20分钟，直到底物完全溶解。将装有2ml经稀释的按上述方法提取的谷物蛋白提取物的管放入Thermo振荡器进行预热。
将五十微升预热的样本加入到对照和反应管中。重新开始振动并开始计时。在80℃振动15分钟后，从每个反应和对照样本中取出50μl，在独立的微孔板中与10μl的0.5NHCl混合。重新开始样本的振动，直到取出所有样本并与酸混合。
葡萄糖还原当量的BCA定量。按以下浓度用蛋白提取缓冲液配制葡萄糖标准液：0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM和0.8mM。将试剂A与试剂B按50:1的比率混合制备BCA试剂(来自Thermo Scientific)。为制作葡萄糖标准曲线，将75μl缓冲液加入到微孔板A行的第一个孔(A1)中，然后将75μl每种葡萄糖标准液加入到孔A2到A7。为检测来自饲料葡聚糖酶反应和对照样本的还原糖，将25μl每种反应物按照与大麦-β-葡聚糖孵育时间(例如，行B1-B2：15分钟-30分钟)的顺序加入到微孔板的行中，然后将25μl相应的对照加入到微孔板的另一行(例如，行C1-C2：15分钟-30分钟)。随后，将50μl磷酸钠缓冲液加入到这两行的每个孔(反应和对照)中，并使用多道移液器将175μl BCA试剂加入到每个孔中。通过吹吸进行混合。将该微孔板密封并在加热块中于80℃进行孵育。孵育10分钟后，将该微孔板置于冰上冷却10分钟，并离心甩下冷凝物。随后，在酶标仪中测量每孔在560nm下的吸光度。
计算A560下的饲料葡聚糖酶活性单位。从每个葡萄糖标准液的吸光度值中减去空白试剂的吸光度，并根据它们的葡萄糖浓度绘制由此得到的值。然后用整个数据组的线性回归计算“最适”回归线(line)。为确定葡聚糖酶/大麦-β-葡聚糖反应中的葡萄糖还原当量，对于每一个时间点，从反应样本中减去来自对照样本的吸光度值，并使用由此得到的值通过与葡萄糖标准曲线比较来计算还原糖的浓度。一个单位(U)的葡聚糖酶活性，是使用BCA定量法，在80℃下、pH 5.3时，每分钟从1％大麦-β-葡聚糖中释放1μmol葡萄糖还原当量所需的酶量。
单位活性测量(半高通量法)。正如本文所述，该方法在用葡聚糖酶在80℃下处理40分钟或90分钟后检测模式底物(大麦-β-葡聚糖)释放的还原糖，如葡萄糖。将从谷物或饲料中提取的蛋白进行适当稀释，在反应的40分钟(谷物产品)或90分钟(饲料样本)内检测初始速率。反应在96-孔板(Costar,Cat#3960)或联管(strip tubes)(VWR,Cat#29442-610)中进行。
底物制备：根据反应数称量大麦-β-葡聚糖(低粘度)，例如，10个样本、每个样本4个稀释需要总共40个反应。每个反应需要5mg底物，因此，至少需要40×5＝200mg大麦-β-葡聚糖。在80℃水浴中保温20分钟用提取缓冲液将底物完全溶解，并且每5到10分钟进行涡旋。
使用集束管(cluster tubes)进行饲料样本的90分钟终点活性单位检测。对蛋白提取物进行2倍、6倍、10倍和20倍稀释。
使用稀释100倍的纯化蛋白质作为阳性对照用于检测验证。将纯化的葡聚糖酶蛋白(200,000ppb)在-20℃储存在50mM MES，150mM氯化钠，pH6.3的缓冲液加上40％甘油中。将十微升蛋白与990μl提取缓冲液混合，取50μl用于活性检测。
饲料葡聚糖酶消化大麦-β-葡聚糖在设置为80℃的水浴中进行。在集束管块中，参考表2将450μl底物加入到A2到D12的管中。这些行进行反应。
将四百五十微升提取缓冲液(无底物)加入到E2到H12行的每个对照管中，这些作为空白来修正如表2所述用于每个反应的BCA法检测的蛋白质含量(A2到D12)。
将五十微升稀释的样本提取物，包括阴性对照和阳性对照，首先加入到E2到H12的每个空白管，然后加入到A2到D12的每个反应管，如表2所述。
表2.集束管中饲料样本的酶水解实施例
Figure BDA0001467438630000531
用康宁TM储存垫III(CorningTMStorage Mat III)覆盖管，使用康宁储存垫敷贴器(Corning Storage Mat Applicator)来密封管。以低速来振荡板。将集束管块置于80℃水浴中进行为期90分钟的孵育。向每孔中加入100μl的0.5N HCl来中止反应，并将集束管块置于冰上冷却。
葡萄糖还原当量的BCA定量。按以下浓度用100mM磷酸钠缓冲液，pH6配制葡萄糖标准液：0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM和0.8mM。将试剂A与试剂B按50:1的比率混合制备BCA试剂(来自Thermo Scientific)。为了在微孔板的第1列制作葡萄糖标准曲线，将75μl缓冲液加入到A行的第一个孔(A1)，然后将75μl每种葡萄糖标准液加入到孔A2到A7。为检测来自饲料葡聚糖酶反应和对照样本的还原糖，将25μl每种反应物按照表2显示的顺序加入到微孔板的行中。随后，参考表2，从A2到H12向每个样本孔(反应和空白)中加入50μl提取缓冲液，使总体积到75μl。向每孔中加入一百七十五微升BCA试剂并混匀。将该微孔板密封并在加热块中于80℃进行孵育。孵育10分钟后，将该微孔板置于冰上冷却10分钟，并离心甩下冷凝物。随后，在酶标仪中测量每孔在560nm下的吸光度。
计算A560下的饲料葡聚糖酶活性单位。从每个葡萄糖标准液的吸光度值中减去空白试剂的吸光度值，并根据其葡萄糖浓度绘制由此得到的值。然后用线性回归计算整个数据组的“最适”回归线。为确定葡聚糖酶/大麦-β-葡聚糖反应中的葡萄糖还原当量，从反应样本的吸光度值中减去来自相应对照样本的吸光度值，并将由此得到的值通过与葡萄糖标准曲线比较来计算还原糖的浓度。一个单位(U)的葡聚糖酶活性，是使用BCA定量法，在80℃下，每分钟从1％大麦-β-葡聚糖中释放的1μmol葡萄糖还原当量。
计算阳性对照在A560的单位来验证检测。从每个反应样本(A12、B12、C12、D12)的吸光度值中减去空白样本(E12、F12、G12、H12)的吸光度值。使用葡萄糖标准液的回归方程式来计算葡萄糖含量(μmol)。为确定每分钟产生的还原单位的量(A)，用反应中从大麦-β-葡聚糖释放的葡萄糖的量(μmol)的值除以反应时间，例如90，如果反应时间是90分钟。在检测中，阳性对照的单位值等于稀释倍数(dilution)×(A)/mg蛋白。在本文所述的检测中，稀释因子等于24。稀释因子24通过比较总反应体积与BCA检测中使用的反应部分的比率来确定。在检测中，总反应体积为600μl，包括500μl反应和100μl用于中止反应的HCl。用在BCA检测中的反应部分为25μl。因此，稀释因子24的计算为用600μl除以25μl。
检测中蛋白的量计算如下。阳性对照的浓度为2000ng/ml，用在检测中的阳性对照为50μl(或者，如果用mL计算为50/1000)。以纳克计算的蛋白的量为2000×(50/1000)，或者如果以毫克计算，为2000×(50/1000)/1000000。
实施例4.转基因玉米种子中的葡聚糖酶活性
用来自携带pAG4588构建体的单个转基因玉米植物的花粉对未转化的(野生型)玉米植物的玉米须进行授粉。从获得的谷穗中收获成熟、干燥的种子，并通过比色检测来检测活性。图9表明来自42个独立谷穗的活性范围。在该图中，沿横坐标的数字对应于单个事件标识符。在事件259中观察到了最高活性。在也携带有pAG4588构建体的T0代转基因玉米植物757中，活性约为25A590/mg。来自第一代自交植物的纯合种子的平均活性约为116±15A590/mg。这一代(population)的杂合种子的活性约为59±18A590/mg。
用来自携带pAG4597构建体的单个转基因玉米植物的花粉对未转化的(野生型)玉米植物的玉米须进行授粉。从获得的谷穗中收获成熟、干燥的种子，并通过比色检测来检测活性。图10表明来自15个独立谷穗的活性范围。在该图中，沿横坐标的数字对应于单个事件标识符。在事件460中观察到了最高活性。
实施例5.在转基因事件4588.259、4588.757和4588.652中，T-DNA整合位点侧翼的 玉米基因组序列
事件4588.259：事件4588.259携带两个独立的T-DNA整合位点，位于玉米染色体4和8。通过BLASTN搜索确定T-DNA整合位点的染色体定位，其中包括在分离自位于T-DNA左右边界的T-DNA插入位点的OB-2880、OB-2832和OB-3252序列中的玉米基因组DNA序列被用作查询筛选公开可用的玉米B73基因组序列数据库，如：玉米遗传学和基因组学数据库(MaizeGenetics and Genome Database)http://www.maizegdb.org/(2016年5月8日访问)。也见Andorf,CM,Cannon,EK,Portwood,JL,Gardiner,JM,Harper,LC,Schaeffer,ML,Braun,BL,Campbell,DA,Vinnakota,AG,Sribalusu,VV,Huerta,M,Cho,KT,Wimalanathan,K,Richter,JD,Mauch,ED,Rao,BS,Birkett,SM,Richter,JD,Sen,TZ,Lawrence,CJ.(2015)MaizeGDB2015:New tools,data,and interface for the maize model organismdatabase.Nucleic Acids Research doi:10.1093/nar/gkv1007；Lawrence,CJ,Seigfried,TE,and Brendel,V.(2005)The Maize Genetics and Genomics Database.Thecommunity resource for access to diverse maize data.Plant Physiology 138:55-58；Lawrence,CJ,Dong,Q,Polacco,ML,Seigfried,TE,and Brendel,V.(2004)MaizeGDB,the community database for maize genetics and genomics.Nucleic Acids Research32:D393-D397，通过引用将其全部并入本文。因为这两个位点独立分离，所以对携带两个位点以及每个单独位点的植物进行了评估。
在下列提供的侧翼OB-2880、OB-2832和OB-3252中，玉米基因组DNA以大写字母显示，而pAG4588载体序列用小写字母表示并加下划线显示。
玉米染色体4上的整合位点：
位于玉米染色体4上的T-DNA整合位点的特点是795bp的T-DNA右边界侧翼序列OB-2880，它包括677bp的玉米基因组。分离的677bp的玉米基因组DNA侧翼与来自玉米染色体4的反义DNA链的序列具有99.3％的序列同一性(核苷酸坐标56612593-56612026)。
>OB-2880
CTTAGATTAGAGAATGAAAATTTGATTGCTAAGGCCCAAGATTTTGATGTTTGCAAAGATACAATTACCGATCTTAGAGATAAGAATGATATACTTCGTGCTAAGATTGTTGAACTTACACCACAACCTTCTATGCCTTCTGTGACATTAACATTACGTCACAAACAATAGTATTTTTGTCATACCTTACATGTTGGTGACGTGATTGTGACGAAAATCACATCGTCACAGAAGGTGCGTGTTAAATGGTGTACTATGACGAATAACAAAAAAACGTCATAATAGTTTATGACGCAAACTACAAACGTCACTAATCTATGACACTCGAATTCGTCACTAATTATGTCTAAATACGTCACAATTCATGTAGTCGTGCCTTGCCACGTGGCTGATTACGTGGCGAGATGACATGGCAGTTGACGTGGCAGGTGATGTGGCGAAAATGTTGTGACGAGTTCATTCGTCACAGATGTTATGACGTGGCATGCCACATGGCAGATGATGTGGCAAAATTATGTGACAAAAATATTTGTCATAAATATCAATGAGGTGGCAATATATGTGTGACGAAATTTTTCATCACAAAGTACGATGACGTTGCAATATATTTATGACGAATTGTTCATCATAAGGCGTGATGAATTCATAGCGTCATGGAATATTATGAAATCACATGCtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaacctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgtt atgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttgg(SEQ ID NO:22)
玉米染色体8上的整合位点：
位于染色体8上的T-DNA插入位点的特点是存在于整合到该位点的T-DNA的相应左右侧翼的序列OB-2832和OB-3252。
1211bp的OB-2832序列包括864bp的玉米基因组DNA。分离出的864bp的玉米基因组DNA侧翼与带有核苷酸坐标100613054-100613915的来自玉米染色体8的序列具有99.65％的序列同一性。
>OB-2832
tcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatca tataattt ctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggttt ttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaatt atcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattggcgagctcgaattaattcagtacattaaaaacgtcc gcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatatatACTAAAAAAACTCAAGGATCTGTCTCCAGAAAGGCCTTGCAGGGTTTGGCCACGCCCACGGACATTCCATCTCAGAGCCATGATTAGAACGAAAAACACATGAGAGCCGTCGTTGCTAGGAGTCGGTTTCATATGTTCGCTAAAACAAGAGATTTGTTTTTTTTCTCTCTCGTACATACACGAGTCAGCCCTTTTAATCTCAGGTTGACGTGCAATGTCGCTCGTCTAAGCAGAACATTTTGAGAACAAATGTGTTGTACATGAGAGTTTTGTGTACATGGTACGTACATTAAAACATCATCATTTATCTTAGATCTAACATCTCTACTTGCTTGTTATATATTTTTTTTGTAAAATAACATCTTTCACCACTTTAT ATGGTGTTGTTTGCAAAATATACAGAGCAATTAGAGACGTTAGATTTGAGATGGACGGTGATAATTTAATACATGCATAATGTACAAGAAAATCCTAACTGCACTAGATATGTTGTCAAACATTTTACCTTTGTTACAAAAAGAAATGAATAGATGTTGAACGGTTGTCTTTCAAGCCTGTTCGCTGCGGCTTTAATTCACCAACTGCAATGAACAACCTGAAAGGTGATCGTTGCCGAACACATGCTGTTTGGCAAAGCTAGTAGTACCTTTTTTGTCTGTCACCTGGAATGATGAGAAAGGAGACAAGAGGAGAGGGCTGGCCATTGTTTATATATATACGTATTTCCATTGCTTTGTGGCATGCAACAGTTCAAGGGTCCAAACTGGCAGGTTTTCAGCCCCGACAAATATAATAAAAAAACTACAAAAAAAAAAGGTCCGTTTACATTCCTTTTTTGACAACGCTAGTCCGTGCGGAGCGAGC(SEQ ID NO:23)
696bp的OB-3252序列含有95bp的玉米基因组DNA。OB-3252不含有T-DNA左边界序列。该分离出的95bp的侧翼与带有核苷酸坐标100613034-100612940的来自玉米染色体8反义DNA链的序列具有100％的序列同一性。
>OB-3252
Ggtgaaacaaggtgcagaactggacttcccgattccagtggatgattttgccttctcgctgcatgacc ttagtgataaagaaaccaccattagccagcagagtgccgccattttgttctgcgtcgaaggcgatgcaacgttgtg gaaaggttctcagcagttacagcttaaaccgggtgaatcagcgtttattgccgccaacgaatcaccggtgactgtc aaaggccacggccgtttagcgcgtgtttacaacaagctgtaagagcttactgaaaaaattaacatctcttgctaag ctgggagctctagatccccgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgt tgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatg acgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatat agcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcgggaattggcgagctcgaatta aTTCAAGTGTCTTCGTACAAACTGGGGGATGGGGCAGACCGCCAGGTTCAAACCGTTTGACTAGATGCGGCTGGCAGGCTACTTTGCAGTGCATGC(SEQ ID NO:24)
序列OB-2832和OB-3252中的玉米基因组DNA侧翼由玉米染色体8上的20个核苷酸进行分离，这表明在T-DNA整合期间，20bp的原始玉米基因组DNA序列被插入的T-DNA序列取代。
在259事件中也有OB-2861序列和OB-2868序列。970bp的OB-2861序列由重组(rearranged)pAG4588序列组成，包括：223bp的部分Nos终止子序列(大写字母，pAG4588中的核苷酸3290-3512)；73bp的靠近T-DNA左边界的序列，带有经加工的T-DNA左边界序列的前3bp(斜体小写字母，核苷酸3513-3585)；299bp的靠近T-DNA右边界的序列，带有经加工的T-DNA右边界序列的5bp和带有多克隆位点的多聚接头序列(小写字母，核苷酸9647-9945)；359bp的水稻谷蛋白启动子prGTL-03的5’序列(大写字母，核苷酸9946-10304)。下划线部分是18bp的重复序列，其产生于T-DNA整合过程期间。OB-2861序列如下：
GAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTGgcgagctcgaattaattcagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgttatcaagttgtctaagcgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaacctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagcctaagcggccgcattggacttaattaagtgaggccggccaagcgtcgatttaaatgtaccacatggcgcgccaactatcatgcgatcgcttcatgtctaactcgagttactggtacgtaccaaatccatggaatcaaggtaccTCCATGCTGTCCTACTACTTGCTTCATCCCCTTCTACATTTTGTTCTGGTTTTTGGCCTGCATTTCGGATCATGATGTATGTGATTTCCAATCTGCTGCAATATaAATGGAGACTCTGTGCTAACCATCAACAACATGAAATGCTTATGAGGCCTTTGCTGAGCAGCCAATCTTGCCTGTGTTTATGTCTTCACAGGCCGAATTCCTCTGTTTTGTTTTTCACCCTCAATATTTGGAAACATTTATCTAGGTTGTTTGTGTCCAGGCCTATAAATCATACATGATGTTGTCGTATTGGATGTGAATGTGGTGGCGTGTTCAGTGCCTTGGaTTTGAGTTTGATGAGAGTTGCTTCTGGG(SEQ ID NO:25)
1127bp的OB-2868序列由重组pAG4588序列组成，包括：595bp的PMI标记基因的3’序列(大写字母，pAG4588中的核苷酸2594-3188)；PMI和Nos终止子之间48bp的序列(小写字母，核苷酸3189-3236)；276bp的Nos终止子序列(大写字母，核苷酸3237-3512)；73bp的靠近T-DNA左边界的序列，带有经加工的T-DNA左边界序列的前3bp(斜体小写字母，核苷酸3513-3585)；119bp的靠近T-DNA右边界的序列，带有经加工的T-DNA右边界序列的5bp和部分多聚接头序列(小写字母，核苷酸9647-9765)。下划线部分是18bp的重复序列，其产生于T-DNA整合过程期间。OB-2868序列如下：
AAAATCCCGCGCGCTGGCGATTTTAAAATCGGCCCTCGATAGCCAGCAGGGTGAACCGTGGCAAACGATTCGTTTAATTTCTGAATTTTACCCGGAAGACAGCGGTCTGTTCTCCCCGCTATTGCTGAATGTGGTGAAATTGAACCCTGGCGAAGCGATGTTCCTGTTCGCTGAAACACCGCACGCTTACCTGCAAGGCGTGGCGCTGGAAGTGATGGCAAACTCCGATAACGTGCTGCGTGCGGGTCTGACGCCTAAATACATTGATATTCCGGAACTGGTTGCCAATGTGAAATTCGAAGCCAAACCGGCTAACCAGTTGTTGACCCAGCCGGTGAAACAAGGTGCAGAACTGGACTTCCCGATTCCAGTGGATGATTTTGCCTTCTCGCTGCATGACCTTAGTGATAAAGAAACCACCATTAGCCAGCAGAGTGCCGCCATTTTGTTCTGCGTCGAAGGCGATGCAACGTTGTGGAAAGGTTCTCAGCAGTTACAGCTCAAACCGGGTGAATCAGCGTTTATTGCCGCCAACGAATCACCGGTGACTGTCAAAGGCCACGGCCGTTTAGCGCGTGTTTACAACAAGCTGTAAgagcttactgaaaaaattaacatctcttgctaagctgggagctctagaTCCCCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTGgcgagctcgaattaattcagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaag cgtcaatttgttatcaagttgtctaagcgtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaacctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttgg(SEQID NO:26)
事件4588.757：事件4588.757携带一个位于玉米染色体8上的T-DNA整合位点。
T-DNA整合位点在染色体上的位置是通过BLASTN搜索确定的，其中，包括于相应地分离自T-DNA左右边界的T-DNA插入位点的OB-3170和OB-3237序列中的玉米基因组DNA序列被用作查询筛选公开可用的玉米B73基因组序列数据库，如http://www.maizegdb.org/。也见Andorf,CM et al.(2015)Nucleic Acids Research doi:10.1093/nar/gkv1007；Lawrence,CJ et al.(2005)Plant Physiology 138:55-58；Lawrence,CJ et al.,(2004)Nucleic Acids Research 32:D393-D397，通过引用将其全部并入本文。
在下面提供的侧翼OB-3170和OB-3237中，玉米基因组DNA以大写字母显示，而pAG4588载体序列用小写字母表示并加下划线表示。
1303bp的OB-3170的T-DNA右边界侧翼序列包括975bp的玉米基因组DNA，伴随着328bp近T-DNA右边界位点的pAG4588载体无边界序列。该分离出的975bp的玉米基因组DNA侧翼与带有核苷酸坐标62661042-62662016的来自玉米基因组8的序列具有99.38％的序列同一性。
OB-3170序列如下：
TTGGGGTTCCTTATCCTGTTGTCGGAGTTGTGCCATTATCCTTTCCATGGTTGACCTGAGCTTTAGCCTGTACACTGTAGACTCTACTAGAGGTTTACCTGAGGCTGAATTCCCGCTGCTAAGATGTGATGTTCCCGGCCATAAGCAAAGATGCAGGTTGTCTTTGCTTTGTAAAGATGAAGGTTGTCTTTGTTTTGTAATCGAAAAAAAAACCCTCCGACTTCGATAGCAATCCATTTCTTGAAACGATATAGCTATAAGCTGCAGCCACACCTTGCGTTGATGATGCCAAAGCTTTCTTTCGAGTGCGATGCATGCACTGGCCTGTTGAGATCTTATCAATATGGCAAACAGTAACCTAACGTATATGACTACATGGTCTTCATGCTTTTGAGAGGTGCCTCATAGGAAACAGTCAGGCCAATGATTTTAGGGAATACAATATATTTTTGCTGTTTTTTTTTTGCAAATTGTCCATATTATTACAAAAAAAACTAAACATGCCCAAAGGCAATAGCTTTCTAAATAAAAATGAATAACGGTCCACTTATATATGTTGGCCAGTAATCAATTCTGAGGCCTGACAAACCATGCATATATTAACAGTAGGTTAATGGCCGTGCGTGAAAAAATTTCAATACAACAAGAGATTGAAAAAAAAGAGTGTCTTACCAATATGTTATTTTATAAGTACCAAATGTGTAGGAAACTTGCATTCATTTTTTCCCTGAGAATGGAAAAAAACAAGACATACTCATTTTCAAGTTGAATTGTCATAGCAACACACATGTTGTATCTGCCGGTTCATGCAATTGTGCCAACCAAAATATCTAAATGAGATATTCAAGACTCAACAGAATTAAAGTATGGAATAGGGTGTATATACACTCAACCATTATTAAATGGTATAATCATCTATCTATATCACTATAAAATCTACCAGTTTAAACTTCACAAAACTCATCTAGCTAATGGaggcg ggaaacgacaacctgatcatgagcggagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagcc gttttacgtttggaactgacagaaccgcaacgttgaaggagccactcagcctaagcggccgcattggacttaatta agtgaggccggccaagcgtcgatttaaatgtaccacatggcgcgccaactatcatgcgatcgcttcatgtctaact cgagttactggtacgtaccaaatccatggaatcaaggtacctccatgctgtcctactacttgcttcatccccttct acattttgttctggttttg(SEQ ID NO:27)
960bp的OB-3237的T-DNA左边界侧翼序列包括620bp的玉米基因组DNA，伴随着340bp的pAG4588载体序列(pAG4588中的核苷酸3260-3599)，该载体序列包括253bp的Nos终止子序列和70bp位于17bp经加工的T-DNA左边界序列上游的序列。该分离出的620bp玉米基因组DNA侧翼与带有核苷酸坐标62662037-62662642的来自玉米染色体8的序列具有100％的序列同一性。
OB-3237序列如下：
Aaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataat ttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgat tagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgc gcggtgtcatctatgttactagatcgggaattggcgagctcgaattaattcagtacattaaaaacgtccgcaatgt gttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatataAAATCTACCTGTTCGCTGATAAGCCGTTAGGTTGACTATGTGACTGTTGGGCGGCAAAATGACCACGCGGACGGTCTAGCCCCAAAGCCGGACGGTCCGCGGTCCAGACAGTCTGCACTGGTGGTGTCGGCGTTTCGACCCCGGGGGGTCCCTGGACCGACGAGTAAATTGTCGCTGCGTGTCCCAGCCCAGATGGGTCCGCGCGAGACGGAACGCGAAGATGGGAAAACAGCAAAGGGGAACCCGCGGCCTTCGTGTTGTCCTGCGCCCAGGTCGGGTGCGCTTGCAGTAGGGGGTTACAACCGTTCGCGTGGGAGAGACAGAGAGAGAGCGAGAGCCTTATGCGTCGGCCCGTTCTCCCGCGCGGCCAACCCTCTCGTACGAGAGCCCTGGACCTTCCTTTTATAGACGTAAGGAGAGGGCCCAGGTGTACAATGGGGGGTGTAGCAGAGTGCTAACGTGTCTAGCAGAGAGGAGCCGGAGCCCTAAGTACATGTCGTCGTGGCTGTCGGAGAGGTTTTGGCGCCCTGTTCATGTGATGTCGTGGCCGTCGGAGGAGCGCTTGAGCCCCGTGGAAGTACAGCTGTCGGGGCTGTCGGATCCTTGCTGACGTCTCCTTG(SEQ ID NO:28)
序列OB-3170和OB-3237中的玉米基因组DNA侧翼由玉米染色体8上的21个核苷酸分离，这表明在T-DNA整合期间，21bp的原始玉米基因组DNA序列被插入的T-DNA序列取代。
事件4588.652：图11阐明了显示4588.652中表征的侧翼序列的位置的图表。
在4588.652中的T-DNA插入位点处分离的序列。事件4588.652中的T-DNA已被整合入BxA基因型的玉米基因组的染色体7中，被用于使用pAG4588构建体进行玉米转化。该T-DNA插入发生于公开可用的参考B73玉米基因组的核苷酸141683320-141683357之间。该T-DNA整合在该位点取代了38bp的天然玉米基因组序列。在如下所示的T-DNA插入序列中，该38bp的DNA加下划线，而pAG4588的序列加下划线并粗体显示。图11所表明的图表描述了在4588.652的基因座中序列的位置。使用PCR为基础的染色体步移(genome walking)技术将左右边界T-DNA侧翼序列，分别是OB-4451和OB-4448，从多个4588.652子代中分离出来。位于左右边界侧翼之间的整个基因组区域被分离出来，并且序列表征于WT基因型BxA、I9545(E)、I5009(G)以及无效的(nulls)BC2ES2_512x和BC1GS2_518x。以下野生型玉米基因组DNA序列用作参考：WT_BxA(OB-4541；SEQ ID NO:32)、WT_E序列(OB-4545、OB-4546；SEQ ID NO:33)、WT_G序列(OB-4547、OB-4548；SEQ ID NO:34)、Null_BC2ES2_512x序列(OB-4578到OB-4580；SEQ ID NO:35)、Null_BC1GS2_518x序列(OB-4582到OB-4584；SEQ ID NO:36)以及WT_B73Chr7_141681606-141685147参考序列(SEQ ID NO:37)。此外，额外分离出左右边界侧翼并从更进一步的(more advanced)4588_652转基因子代BC2ES2_472x进行整体测序。包括左右边界侧翼序列的4044bp的整个BxA基因组序列，具有与玉米B73基因组中染色体7上的两个核苷酸位置141681606-141682538和141682550-141685147有高度BLASTN同一性的条目(hits)。
T-DNA左边界侧翼中的核苷酸序列分析
T-DNA左边界侧翼OB-4451与玉米B73基因组中染色体7上的核苷酸141683358-141685147具有98.66％的BLASTN序列同一性。对来自野生型基因型B73、BxA、I9545(E)、I5009(G)、无效的BC2ES2_512x和BC1GS2_518x，及4588_652转基因子代116_F1G和BC2ES2_472x，以及B73基因组参考公共序列的左边界特定序列的多序列比对显示，这些1.8kb的序列在所有基因型之间几乎100％一致。
T-DNA右边界侧翼中的核苷酸序列分析
2218bp的右边界侧翼OB-4448与玉米B73基因组中染色体7上的两个核苷酸位置141681606-141682538和141682550-141683319有高度的BLASTN序列同一性。对来自4588_652转基因子代116_F1G和BC2ES2_472x的右边界特定序列以及BxA的WT序列的多序列比对显示，这三个2.2kb的序列几乎100％一致。
特异于T-DNA右边界侧翼的521bp“独特”序列源于基因型BxA，基因型BxA被用于使用pAG4588构建体进行转化。在参考B73基因组中的T-DNA整合位点处，没有识别出该序列的BLASTN序列同一性条目。另一方面，该521bp的序列在玉米B73基因组中的其他染色体上有多个BLASTN同一性条目，表明这一序列高度重复。该521bp的序列以斜体小写字母显示。
4588_652T-DNA整合位点处表征的序列。OB-4448序列(在从4588_652的F1G分离出的4588_652中延长右边界侧翼)如下：
CACCCTCGCTGTTGGTAAACGTGCGCCTTGGGTATGTCCTCACCTGCATGATACGACATGTTGAAAAAGGTACATGGCTGGGCGGATTTAAACAGTAGAATGAAAAGGTGCCACAAGAAAACTCGTCAAAGAATTGACTACGCGTCAATGTTCCATAGTTAAAAAGACTTGAACTCTGGATCAGGGACTTTCAAACAAGGATAGCTGCCTGGTCACCAGTCATTAACTGTAATGTAATGGCCATAGATGATGCATGAGTACAATAATAAAAAAACACCATCCAGCCAAATATATACTCCCTGTCACAAATGAAAATTCGTTTTAGATAATTAGTGGATTCATACAATATTTGTTGTATGTGTTTTATGTGTCTAGATTCATCATCCTCTATTTGAATATAGACAGAAAAATCATAACTAAAACGAATACTATTTGGGAACGGAGGGAGTACTACTTTGGCAGAATGCCCCCAGGAAAGTACCAGTTTCAGGGGTAGTTTGGAAGGCTAAACCTAGGGAGGGAAAACCCCCCACATGTAACTAAATATCTTATTCAAATGTTACCCCTAGGGATTACTCACCCTGGGAAATGAGAAGGGTCCCAAGGGGATTTCGGTTTCTATTATTTTTTCTGCAAACCATTTCAGAGCAATGATATGAAACCAAGCTAACTACTTATAACATTTCTTAAGAATATCAGACATAGGAAAGTGATGGCCTGGAACCAAAGTAAGACTGGTAGATAAATAGATCACTAGAATAAACCCTGACAGTTCATAGCCTTCATAGAAGCAAAAGGAAACACTACGGGAGCAATTGGTTGCTTGCACTAGCAATTCACTGCATTGGGTCTAATGCAGGATAGACTAAGCCAGCATAAGTGTGCGCAATGTGTTTGTGTTTGGTTGCCATGTTATAAGTAAGTTGCATTTGCTAATATctttctcctgactctaatgagtccacttttgctgactggtgggcgaaagtaagtaagcaagtgcacaaatccaaaagaagaggctttaacagtatcatcatcttgggggcttggtgtttatggcttcatcgtaataaggtggtttttgatggtgtcagtccttcaattattggcataaaggcaatttttttggatgaagttgaattctggaggcttgccggtgctaggcatcttgaggctttggttcctggtgctggaatttttaggtcaagggttcttttgggtgattagtgaagagcaggtgtgtgtggtctgctcgcactttttgttgttcgttctcctattgcgtgctgttgtttccaggcgcatttatggaggctgcagttttgtgcgcagcagaagttggtggttttgtgttttgtgttttgcctattttggcattgtactttggtccattttggactgttttcttctcttaatttaatgatgtgcagctctcctgcgcgtttaagaaaaaaaaaAGTTGGCTGTTTTGTATTTCTTGTGATCACCCATGCTTGTTGTGGTCAGATTAAACTCTCACGTTTAATGCTACAGAAGCATCCATGAGACAATGAAACACCGCTCAAAAGCCACGTAGTAGCATACCCTGACTTATGAATAAAGCAACTCGATCTGATTTATTTGAGAAAACAGGAAACTGACAAGTTATTTTTAACACAAAATTTCATTAAAAACGAATGGTAGACAATTACCAATCTGTAGGTCCCTGGCTTGCAAGTCCTCCCAATGTCTAAGAAATCAAATAGGAACTGCAGGCAAGCCAGCAAGAAAGTATTAATCACTGGATATAAAATATAAAGAAAAAAGAAGGAAAGACGGCTACTCGGCTAGCATATGTTTTTGTTAGGGGTGAAAATGGATACTTATTCAGAAATCATTTTTGATCTTTTTTCTTTAATTAGGAATAAATAGGATATAGAATATGCTAAGCAAATTCATATTCTTGTTCTTAGCATTGGGCTTGTAAAGATTCATAAAAGGTAAATCTCAAATTTATCATATATCTTAAATGGTAGATATAAAATTCAGATACAAATATTTTTCAACTTTTTTGTTGTAGGGAACAAATTATATTAAAAAAAATTATGCACAATTCTATTCTTATTTGTAATAATGTGCTTGATAACATAATAAAAGATTACCATCAAATTTCACACACACCCACCCACCCACCCACCCCTGCACGCACGCGCGCGCACACACACTATATGTGTGTtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaacctgatcatgagcg gagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttggaactgacagaac cgcaacgttgaaggagccactcagcctaagcggccgcattggacttaattaagtgaggccggccaagcgtcgattt aaatgtaccacatggcgcgccaactatcatgcgatcgcttcatgtctaactcgagttactggtacgtaccaaatcc atggaatcaaggtacctccatgctgtcctactacttgcttcatccccttctacattttgttctggtttttggcctg catttcggatcatgatgtatgtgatttccaatctgctgcaatatgaatggagactctgtgctaaccatcaacaaca tgaaatgcttatgaggcctttgctgagcagccaatcttgcctgtgtttatgtcttcacaggccgaattcctctgtt ttgtttttcaccctcaatatttggaaacatttatctaggttgttttgtgtccaggcctataaatcataaatgatgt tgtcgtattggatgtgaatgtggtggcgtgttcagtgccttggatttgagt(SEQ ID NO:29)
RB_BC2ES2_472x序列(从4588_652的进一步子代分离出的延长的RB侧翼)如下：
CACCCTCGCTGTTGGTAAACGTGCGCCTTGGGTATGTCCTCACCTGCATGATACGACATGTTGAAAAAGGTACAAGGCTGGGCGGATTTAAACAGTAGAATGAAAAGGTGCCACAAGAAAACTCGTCAAAGAATTGACTACGCGTCAATGTTCCATAGTTAAAAAGACTTGAACTCTGGATCAGGGACTTTCAAACAAGGATAGCTGCCTGGTCACCAGTCATTAACTGTAATGTAATGGCCATAGATGATGCATGAGTACAATAATAAAAAAACACCATCCAGCCAAATATATACTCCCTGTCACAAATGAAAATTCGTTTTAGATAATTAGTGGATTCATACAATATTTGTTGTATGTGTTTTATGTGTCTAGATTCATCATCCTCTATTTGAATATAGACAGAAAAATCATAACTAAAACGAATACTATTTGGGAACGGAGGGAGTACTACTTTGGCAGAATGCCCCCAGGAAAGTACCAGTTTCAGGGGTAGTTTGGAAGGCTAAACCTAGGGAGGGAAAACCCCCCACATGTAACTAAATATCTTATTCAAATGTTACCCCTAGGGATTACTCACCCTGGGAAATGAGAAGGGTCCCAAGGGGATTTCGGTTTCTATTATTTTTTCTGCAAACCATTTCAGAGCAATGATATGAAACCAAGCTAACTACTTATAACATTTCTTAAGAATATCAGACATAGGAAAGTGATGGCCTGGAACCAAAGTAAGACTGGTAGATAAATAGATCACTAGAATAAACCCTGACAGTTCATAGCCTTCATAGAAGCAAAAGGAAACACTACGGGAGCAATTGGTTGCTTGCACTAGCAATTCACTGCATTGGGTCTAATGCAGGATAGACTAAGCCAGCATAAGTGTGCGCAATGTGTTTGTGTTTGGTTGCCATGTTATAAGTAAGTTGCATTTGCTAATATctttctcctgactctaatgagtccacttttgctgactggtgggcgaaagtaagtaagcaagtgcacaaatccaaaagaagaggctttaacagtatcatcatcttgggggcttggtgtttatggcttcatcgtaataaggtggtttttgatggtgtcagtccttcaattattggcataaaggcaatttttttggatgaagttgaattctggaggcttgccggtgctaggcatcttgaggctttggttcctggtgctggaatttttaggtcaagggttcttttgggtgattagtgaagagcaggtgtgtgtggtctgctcgcactttttgttgttcgttctcctattgcgtgctgttgtttccaggcgcatttatggaggctgcagttttgtgcgcagcagaagttggtggttttgtgttttgtgttttgcctattttggcattgtactttggtccattttggactgttttcttctcttaatttaatgatgtgcagctctcctgcgcgtttaagaaaaaaaaaAGTTGGCTGTTTTGTATTTCTTGTGATCACCCATGCTTGTTGTGGTCAGATTAAACTCTCACGTTTAATGCTACAGAAGCATCCATGAGACAATGAAACACCGCTCAAAAGCCACGTAGTAGCATACCCTGACTTATGAATAAAGCAACTCGATCTGATTTATTTGAGAAAACAGGAAACTGACAAGTTATTTTTAACACAAAATTTCATTAAAAACGAATGGTAGACAATTACCAATCTGTAGGTCCCTGGCTTGCAAGTCCTCCCAATGTCTAAGAAATCAAATAGGAACTGCAGGCAAGCCAGCAAGAAAGTATTAATCACTGGATATAAAATATAAAGAAAAAAGAAGGAAAGACGGCTACTCGGCTAGCATATGTTTTTGTTAGGGGTGAAAATGGATACTTATTCAGAAATCATTTTTGATCTTTTTTCTTTAATTAGGAATAAATAGGATATAGAATATGCTAAGCAAATTCATATTCTTGTTCTTAGCATTGGGCTTGTAAAGATTCATAAAAGGTAAATCTCGAATTTATCATATATCTTAAATGGTAGATATAAAATTCAGATACAAATATTTTTCAACTTTTTTGTTGTAGGGAACAAATTATATTAAAAAAAATTATGCACAATTCTATTCTTATTTGTAATAATGTGCTTGATAACATAATAAAAGATTACCATCAAATTTCACACACACCCACCCACCCACCCACCCCTGCACGCACGCGCGCGCACACACACTATATGTGTGTtcaaacactgatagtttaaactgaaggcgggaaacgacaacctgatcatgagcg gagaattaagggagtcacgttatgacccccgccgatgacgcgggacaagccgttttacgtttgg(SEQ ID NO:30)
OB-4451序列(4588_652中延长的左边界侧翼)如下：
gggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtTACCCACTTTCATCCCTAGTTTTTGTTCTGGATTCAAGCATCTCAAAATTGTTTACCTGAAGTTTATCAGTTTTGAGAAAGCGGCGCCCCTGTCGACTACCATCAGGCATTCGGACTACAACTGTCACAGCACCCTCTGCGTCTGGAGACGGTTCCGGTGGTAATGATGCTTGCTTCGAAGTGAGACTGGACTCTAGCTCCTATTTAATCAAAACATCAGGGACAACATGACAAATAGTAGTCAAATATCCAGGCAAGAAAAAAAAACCATAAACAATGAAAATACTGATCAAAAGTCCTGTTTGGATCTCCTAAGAAAAATGAGAATGAGATCCAAACAATTGGATTCTAGAATCCAGCTATCTATCCCAAACCCATTATTTGGCGAGATTTTCACTATGCAGAGGCAATGATCACTATAAGAATAAGATTCAAACACCCACTTATTATTTTTTTAATCCAGAAACCAGATTCTACATTCACTATAGAATCCAGAACTTCAATATGGGAATGAGATCCAAATAGACCCTAAGCCAAAATGAAATTGGTGAGATGAAGTGGCTAGTTGTCATAACCTCCTGTAAAGAAGACAGCGGTTTACAGTCCCAACACCCAAATAAACATGACATTAATATAATGACTACAACTCACAACCTAAACCTAAACCAATATACATCCAAACATAAGACAAAAGGAGAACTGAGTTTTATATGATCACACTGATGAACTGATGCTGTAGTCTAGCATTCAAGTGTTTAAGATAGTTGACTATAAACCCTTCACCTTGCAGATTACATGTGACAGAAAGATACCTCTTCCTCAAGTTGTTTTTTACGCCTTTCCTCCTCCTCTTGCTTCTGTTTCTCAAGAACAGCTTCTCTCGCAGCTGTTTCTTCAAGGCGACGGAGCTCAGCCTCCTGTAGGGCCTTTAACTCCTTTTCTTGATCAGCTTGTAGCGATGCAAGGTACTCATCGTCCTACAAATTTAAAATTTATAAAAGTGCTCACCCATAGTGGCAATTATGAACAATGGATAAATCTTAGACCTCAAACCTGCTGCTCTCGTAATAACCGCTGTTCAGTTAATGCTGGTGATGGAGAATGAGATATTGGGGGATAATAAGTAGAGGTTCTGTGAGAAGGCATAGAGAAAGGATATGTTGGTCCACCAAACATTGCAGCCTCAAGCATAACAGCTTCATCATGTTCCTCAGAAGAAATGCCACCCCACTTTATTGTAAAAAAAGACGTCAGAAATTAAACAAATCCATCTAATGTCTTAGCGCACATTGGAACCACAGATTATAATACCTCAGATGGGAAATCATCTCCATTATACTGGTGATTGTTCAGAACAGGGCTAGCACCTGGGTGCACTATTTTTGGTAATTCATTGTCCTCAGAAGGGGCACGCCGAGAACGACGCCTAACTAACGGCTGTTCTTCTACATCTTCAGCCTCCTCCTGGAAGCTCTCGTCATCTATTGGTTGCCTAGATGTTCCAGCCTTTCCTGAAGCTAGTCCTTGCCTCCAAAAGGAAATTGCATGTATAAGGAATCAAATGATACTGTAGTAGGGTAGCCTGAGTGAAGAGGTGGGTAGTAAAGTTAACATTCACCTCTCAACTATTCCATTTGCGGTTTCCATGCCTGCTTTATCAGAAGAATGGTCCCTCAAATTCACTTCCTCTTGATGCTGGCCTCCTTGCTCGACTATCTGATGATTATTGAAAAATTAGAGATGACATCAAGATAGGTTCAAGTAAGCATGTTGGGGA(SEQ ID NO:31)
实施例6.在后代(subsequentgeneration)中饲料葡聚糖酶的表达
种植来自初代“T0”转基因玉米植物的多个“T1”子代，单个谷穗进行自花授粉或用来自野生型玉米植物的花粉授粉。然后通过比色检测对来自获得的谷穗的成熟种子进行饲料葡聚糖酶的活性检测。图12表明在T1事件中观察到的葡聚糖酶活性。在该图中，沿横坐标的数字对应于衍生出子代的初代T0植物的事件标识符。最高活性在来自4597_69事件的T1植物种子中观察到。
实施例7.饲料葡聚糖酶在多代半合子、纯合子和杂交种子中的表达
种植来自初代“T0”转基因玉米植物的子代，并回交(用来自野生型玉米亲代的花粉授粉，或给野生型亲代授粉)4代(在玉米自交系E(BC4E)中，或在玉米自交系G(BC4G)中)。在每一代中，一些单个谷穗进行自花授粉。PCR法被用于选择纯合子植物，如实施例8中所述。杂交谷穗通过用转基因系E植物对转基因系G植物异花授粉制备，或反之。
图13表明在事件4588.259的半合子、纯合子和杂交谷穗中的葡聚糖酶活性。纯合子和杂交谷穗包括190单位/g的平均活性，这大约是半合子植物的谷穗的两倍。
实施例8.用于识别和确认葡聚糖酶事件4588.259、4588.652和4588.757的接合性 的PCR检测
玉米葡聚糖酶事件4588.259、4588.652和4588.757携带的转基因使得葡聚糖酶在种子中特异性表达。事件4588.259最初在独立分隔开的基因座携带两个T-DNA插入，但随后选择单个基因座位以用于繁殖和发育。事件4588.652和4588.757在单个基因座位上携带两个或多个T-DNA。可以使用标准PCR分析(对PCR产物在凝胶电泳和染色中的终点进行视觉评分)或实时定量PCR完成对这些基因的分子识别和跟踪。除了确定植物是否携带转基因外，这些PCR检测中的一些也能够确定植物是否为半合子(携带一个插入拷贝)或纯合子(携带两个插入拷贝)。
图24表明一般实时PCR检测设计，其用于确定T-DNA基因座的存在(标准和实时定量PCR)和接合性(仅实时定量PCR)。
在图14中，用于每个T-DNA基因座的标准和实时定量PCR检测包括，一条结合紧邻T-DNA插入位置的玉米基因组区域的引物(引物A)，和结合T-DNA中靠近引物A的区域的另一条引物(引物B)。为确定实时定量PCR检测中的接合性，对第二参考基因(GWD，葡聚糖水二激酶(dikinase))沿着基因座引物进行扩增(X和Y引物)。来自引物A+B产物的实时定量PCR扩增能够表明T-DNA基因座的存在，并且其荧光与来自引物X+Y的扩增产物的GWD参考(ref)荧光相比较，能够确定它是否为半合子(一个拷贝)或纯合子(两个拷贝)。
如上所述，标准多重PCR检测包括引物A和B，但也包括另一引物(引物C)，该引物结合T-DNA另一侧的玉米基因组区域，与引物A相对，并且如果不存在T-DNA插入，如野生型(WT)中的基因座，则靠近引物A。图15表明了一般标准PCR检测设计，其用于确定T-DNA基因座的存在和接合性。当T-DNA插入存在时，引物A和引物C之间的距离对于在我们的PCR扩增条件下扩增产物来说将会太大，因此该扩增产物的不存在被用于确定接合性。来自引物A+B和引物A+C的产物的PCR扩增表明T-DNA基因座存在并且是半合子(一个拷贝)。存在来自引物A+B的产物的PCR扩增，但不存在来自引物A+C的产物的PCR扩增，表明T-DNA基因座存在并且是纯合子(两个拷贝)。仅存在来自引物A+C的产物的PCR扩增，表明不存在T-DNA，该植物在该基因座是WT。所有这些检测的引物和探针列于表3和4中。
表3.，用于确定4588.259、4588.652和4588.757事件的T-DNA基因座的存在以及接合性的标准和实时定量(RT)PCR的引物和探针
Figure BDA0001467438630000731
Figure BDA0001467438630000741
*Fluor＝荧光基团。
表4. 4588.259、4588.652和4588.757事件-特异性PCR引物组合和PCR产物大小
Figure BDA0001467438630000742
使用引物X(371)和Y(525)的PCR检测识别ZmGWDref基因座(SEQ ID NO:56)。
DNA提取
这些PCR检测可以结合任何能够用PCR进行扩增的产生DNA的提取法。本实施例中使用的标准DNA提取法(10×TE+肌氨酸)如下：叶片组织(标准1cm打孔)取样到96孔深孔板中，加入金属珠，然后将深孔板在-80℃冷冻至少30分钟。然后将深孔板在Kleco粉碎机中粉碎45秒，以4,000RPM离心3分钟，打开盖子，加入300μl的10×TE+肌氨酸，释放深孔板，并将深孔板在室温下混合10-20分钟。孵育后，将深孔板以4,000RPM离心5分钟，吸取165μl上层水相并加入到96孔PCR板中，将该PCR板密封，并将该板在90℃孵育30分钟。孵育后，在96孔板中将20μl提取物加入到180μl无菌水中(1:10稀释)，来制成最终用于PCR的DNA样本。
PCR
事件4588.259、4588.652和4588.757标准和实时定量PCR引物列于表3中，而具有预期PCR产物大小的标准PCR引物组合列于表4中。
对于每个事件，在含有2μl DNA提取物和GoTaq(Promega)或Kapa3G(KapaBiosystems)PCR Mix的30μl反应体积中进行标准PCR，包括以下成分和条件：
事件4588.259标准PCR：
成分(终浓度)如下：带缓冲液的PCR Mix、MgCl2、核苷酸和酶(1×)；引物509(400nM)和引物516(400nM)。条件如下：95℃，3分钟；33个循环(95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，30秒)；72℃，8分钟。
事件4588.652标准PCR：
成分(终浓度)如下：带缓冲液的PCR Mix、MgCl2、核苷酸和酶(1×)、引物749(400nM)、引物750(400nM)和引物751(400nM)。条件如下：95℃，3分钟；33个循环(95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，30秒)；72℃，8分钟。
事件4588.757标准PCR：
成分(终浓度)如下：带缓冲液的PCR Mix、MgCl2、核苷酸和酶(1×)、引物513(400nM)、引物608(400nM)和引物609(400nM)。条件如下：95℃，3分钟；33个循环(95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，30秒)；72℃，8分钟。
通过在95V下将约15μl PCR产物在3％琼脂糖凝胶中电泳30分钟对标准PCR进行分析。4588.652自交分离植物的标准PCR分析的结果如图16所示。参考该图，在用溴化乙锭染色的3％琼脂糖凝胶中对来自10个独立植物的10个PCR反应进行了分离。预期的基因座和接合性条带大小显示在图像右侧。
基因座存在和接合性通过每一泳道中的可视化特异条带进行评分。
对于每个事件，在含有2μl DNA提取物的20μl反应体积中进行实时定量PCR，包括以下成分和条件：
事件4588.259实时定量PCR：
成分(终浓度)如下：带缓冲液的PCR Mix、MgCl2、核苷酸和酶(1×)、引物509(400nM)，引物516(400nM)、引物371(400nM)、引物525(400nM)、探针PB5(200nM)和探针PB2(200nM)。条件如下：95℃，4分钟；40个循环(95℃，5秒；60℃，45秒)
事件4588.652实时定量PCR：
成分(终浓度)如下：带缓冲液的PCR Mix、MgCl2、核苷酸和酶(1×)、引物750(400nM)、引物751(400nM)、引物371(400nM)、引物525(400nM)、探针PB17(200nM)和探针PB2(200nM)。条件如下：95℃，4分钟；40个循环(95℃，5秒；60℃，45秒)
事件4588.259实时定量PCR。实时定量PCR能够用任何实时定量PCR仪和能够进行四通道荧光检测的软件进行分析。Bio-Rad CFX96实时定量PCR仪和CFX管理软件被用于运行对4588.259植物的自交分离群体进行4588.259实时定量PCR检测的实例。图17表明了4588.259的实时定量PCR数据的实例，来确定基因座的存在和接合性。在该图中，“RFU”是指相对荧光单位；“ntc”是指无对象对照(target control)。4588.259基因座的存在和接合性通过图上数据点的聚类来评分。
实施例9.来自独立表达饲料葡聚糖酶的转基因植物种子的萌发率
用独立的转基因植物的花粉对野生型植物的玉米须授粉(WT×转基因)，或用野生型植物的花粉对转基因植物的玉米须授粉(转基因×WT)。从获得的谷穗中收集成熟、干燥的种子并种入土中。在1-2周的孵育后，计算萌发率。在某些情况下，重复该试验，进行第二代的种植和授粉(T2)。此类萌发率试验结果的实例如表5所示。
表5.表达β-葡聚糖酶的种子的萌发率
Figure BDA0001467438630000771
Figure BDA0001467438630000781
观察到，事件4597_54、4597_56、4588_161、4588_252、4588_259、4597_101和/或4597_104的T1和/或T2代的萌发率为100％。
实施例10.在家禽饲料制粒的制备期间存留的饲料葡聚糖酶活性
将来自表达饲料葡聚糖酶的转基因植物的粉碎谷粒与为肉鸡定制的开食和生长玉米-大豆饮食混合。用于开食肉鸡的基础玉米-大豆饮食组成如下：54.89％玉米08-2012、32.81％大豆饼、5.00％干酒糟颗粒加可溶性固形物、2.00％蛭石、1.99％磷酸氢二钙、1.00％家禽脂肪、0.81％细石灰岩、0.50％普通盐(NaCl)、0.20％DL-甲硫氨酸、0.20％氯化胆碱60、0.20％矿物质预混剂、0.13％L-赖氨酸、0.12％L-苏氨酸、0.05％维生素预混剂、0.05％莫能菌素和0.05％硒预混剂。用于生长肉鸡的基础玉米-大豆饮食组成如下：58.53％玉米、26.63％大豆饼、8.00％干酒糟颗粒加可溶性固形物、2.00％蛭石、1.69％磷酸氢钙、1.00％家禽脂肪、0.76％细石灰石、0.50％普通盐(NaCl)、0.20％矿物质预混剂、0.20％氯化胆碱60、0.13％DL-甲硫氨酸、0.13％L-赖氨酸、0.08％L-苏氨酸、0.05％维生素预混剂、0.05％莫能菌素和0.05％硒预混剂。
使用锤磨筛对上等玉米(fine corn)进行粉碎：4/4号开食饮食，6/6号生长和肥育饮食(grower and finisher diets)。粗玉米(玉米总量的5％)用0/100隙孔(gap opening)的滚筒碾粉机粉碎。
四种用于制粒试验的饮食制定如下：饮食A为基础饮食，饮食D为混合对照酶的基础饮食，饮食E为混合含有高水平葡聚糖酶的粉碎的转基因玉米粒的基础饮食，饮食F为混合含有低水平葡聚糖酶的粉碎转基因玉米粒的基础饮食。
来自表达饲料葡聚糖酶的转基因植物的粉碎谷粒与基础饮食混合，比例约为每2000lb基础饮食混合物中含有1lb转基因谷物。对于低剂量饮食，转基因谷物先与非转基因谷物以1:4的重量比(每4克非转基因谷物含1克转基因谷物)混合，以便在将该成分添加到基础饮食之前，稀释酶浓度。
所有饲料饮食在175-180℉都制粒为4.4mm颗粒，而开食饮食进行粉碎。
图18A和18B表明生长饮食(图18A)和开食饮食(图18B)中制粒前后的葡聚糖酶活性。然后参照这些图，在饲料制粒前后，取出来自得到的混合物的样本。然后通过比色法葡聚糖酶检测检测这些样本，来确定该酶在制粒过程中是否存留。如图18A和18B所示，各种饮食的一致性如下：A，基础对照饮食(无外部酶)；D，阳性对照饮食(添加市售酶)；F，低剂量饮食(包括来自表达饲料葡聚糖酶的植物的粉碎谷粒)；E，高剂量饮食(包括来自表达饲料葡聚糖酶的植物的粉碎谷粒)。据观察，对于开食饮食和生长饮食，在高剂量饮食中葡聚糖酶活性高，并且在制粒过程中存留。
实施例11.谷物表达的饲料葡聚糖酶的热稳定性
饲料葡聚糖酶通过微生物表达和纯化制备，并在SEC缓冲液(100mM MES，300mMNaCl，pH6.3)中悬浮。将5微升该制剂与20mg来自野生型玉米的粉碎谷粒混合。同时，将5μl的SEC缓冲液与20mg来自表达饲料葡聚糖酶的转基因植物的粉碎谷粒混合。来自这两组样本中每个的重复在94℃或～130℃下孵育不同的时间段，然后冷却至室温。随后，通过比色检测对残余葡聚糖酶活性进行测定。图19A和19B表明热处理后的葡聚糖酶活性。图19A表明130℃处理后的葡聚糖酶活性。图19B表明94℃处理后的葡聚糖酶活性。在这些实验中，当谷物本身产生饲料葡聚糖酶时比将饲料葡聚糖酶外源性添加到谷物中时会存留更多的活性。这一发现表明，酶在谷物中的有效表达与积累，与微生物产生的同一酶相比，为酶提供额外的热稳定性。在这个特殊的例子中，谷物表达和微生物表达的酶具有相同的初级氨基酸序列。因此，在来自转基因谷物的面粉中观察到的提高的热稳定性是表达宿主的作用。
实施例12.多种pH值下微生物生产的AGR2314的活性
AGR2314的活性在3到8.5之间的几个pH值下进行了检测。每一检测(500μL)包括Britton-Robinson多缓冲液(polybuffer)(40mM磷酸钠，40mM硼酸钠和40mM乙酸钠)、0.01％(v/v)Tween 20、一片β-葡聚糖酶片(Megazyme,Wicklow,Ireland)和20nM AGR2314，加入到2mL Eppendorf管中。样本在37℃或80℃孵育1小时。加入1mL 2％(w/v)Tris碱来中止反应。样本在15,000×g离心10分钟，然后将100μL每种上清液(37℃检测)或5μL上清液加100μL水(80℃检测)转移到平底96-孔微孔板中。在590nm读取吸光度。每个pH值下的检测做三个平行。每个pH下进行单独空白检测(不包括酶)，并从含酶的检测值中减去这些吸光度值。
图20和21表明在37℃(图20)和80℃(图21)下检测到的AGR2314活性的最佳pH。参照图20，37℃下的最佳pH被确定为7-7.5。图21表明，80℃下的最佳pH被确定为6。
图22显示了转基因面粉生产的饲料葡聚糖酶的最佳pH的实例。
为确定检测条件的pH与来自转基因谷物的酶的活性之间的关系，5ml含有0.2％Tween-20的水与200mg来自转基因种子的面粉在旋转平台上在60℃下混合1小时。在临床离心机中以1500×g离心20分钟后，将上清液转移到15mL Eppendorf管中。该样本在台式离心机中以1500×g离心10分钟。该蛋白提取物的等分(aliquots)在检测中稀释20倍来检测每个pH条件，通过将50μl提取物与950μl已在pH 2-10制备好的Britton-Robinson多缓冲液(40mM磷酸钠、40mM硼酸钠和40mM乙酸钠)混合。使用pH试纸检查每一反应混合物的pH。从每种混合物中取500微升转移到96孔深孔板中用于检测。向每孔中加入一片β-葡聚糖酶片，轻柔涡旋混匀，将深孔板密封，并在80℃下孵育1小时。向每孔加入1mL 2％(w/v)Tris碱来中止反应。该96孔板在临床离心机中以3000×g离心10分钟，然后将来自每个样本的100μL上清液转移到平底微孔板的孔中，在酶标仪中确定590nm的吸光度。如图22所示，种子产生的酶的最佳pH在pH6和pH7之间，但在pH值高达10的情况下，仍保留了很大一部分活性。
实施例13.微生物产生的AGR2314和AGR2414对多种底物的活性
所有反应在200mM磷酸钠、0.01％(v/v)Tween 20、pH 6.5环境中使用5nM指示浓度下的AGR2314、AGR2414或5μL对照酶。反应在37℃或80℃下进行一小时，并如前述方法终止。
β-葡聚糖酶检测：底物为1mM pNP-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma Chemical Co.目录号N7006)，阳性对照酶为埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)β-葡聚糖酶(Prozomix，目录号PRO-E0110；315.9单位/mL)。反应体积为500μL；通过加入500μL 2％(w/v)Tris碱来中止反应。在以3000×g离心10分钟后，将100μL上清液转移到微孔板中，并在405nm记录吸光度。
内源纤维素酶检测：每一检测包括溶于500μL缓冲液中的一片纤维素酶C底物(Megazyme，目录号T-CCZ)。通过加入1mL 2％Tris碱来中止反应。将样本以15,000×g离心10分钟，并将100μL上清液转移到微孔板中，记录590nm的吸光度。
外源纤维素酶(纤维二糖水解酶)检测：底物为1mM pNP-D-纤维二糖苷(Sigma，目录号N5759)，阳性对照酶为来自绿色木霉(Trichoderma longibrachiatum)的CBHI(Megazyme，目录号E-CBHI；0.5单位/μL)。反应条件如上述β-葡聚糖酶检测的条件。
淀粉酶检测：底物为红色淀粉(Red Starch)(Megazyme，目录号S-RTAR；按照制造商指导制备)，阳性对照酶为来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的α-淀粉酶(Megazyme，目录号E-BLAAM；3000单位/mL)。245μL缓冲液、5μL酶和125μL的红色淀粉试剂按照如上所述进行混合和孵育。加入625μL乙醇来中止反应。在室温孵育10分钟后，将样本以3000×g离心10分钟，并将100μL上清液转移到微孔板中；记录510nm的吸光度。
内源木聚糖酶检测：每一检测包括一片木聚糖酶AX底物(Megazyme，目录号No.XAX-1000)，阳性对照酶为溶于检测缓冲液的100mg/mL的细毛嗜热菌(Thermomyceslanuginosis)木聚糖酶(Sigma，目录号X2753)。反应按照如上所述的内源纤维素酶检测的条件进行。
果胶酶检测：底物为溶于检测缓冲液的25mg/mL的果胶(Sigma，目录号P7536)，阳性对照酶为溶于检测缓冲液的来自黑曲霉(Aspergillus niger)的果胶酶(Sigma，目录号17389)，浓度为100mg/mL。将5μL酶加入到35μL果胶溶液中，并如上所述进行孵育。95℃加热15分钟后，加入60μL DNS终止/试剂溶液来中止反应(Wicher et al.[2001],Appl.Microbiol.Biotechnol.55,p.578)。将样本以3000×g离心10分钟，将20μL上清液与100μL水在微孔板中混合，记录550的吸光度。
1,3-β-葡聚糖酶检测：每一检测包括一片1,3-β-葡聚糖酶HS底物(Megazyme，目录号ET-CUR200)，阳性对照酶为木霉菌(Trichoderma sp.)的1,3-β-D-葡聚糖酶(Megazyme，目录号E-LAMSE；50单位/mL)。反应按照如上所述的内源纤维素酶检测的条件进行。
1,4-β-葡聚糖酶检测：每一检测包括一片β-葡聚糖酶底物(Megazyme，目录号TBGZ-1000T)。反应按照如上所述的内源纤维素酶检测的条件进行，除了将5μL上清液与100μL水在微孔板中混合用于记录吸光度之外。
图23A和23B表明了在37℃(图23A)和80℃(图23B)下水解淀粉、纤维二糖(pNP-D-纤维二糖苷)、木聚糖(Xylazyme AX)、HE-纤维素(Cellazyme C)、大麦-B-葡聚糖(Beta-glucazyme)、果胶和PNP-D-吡喃葡萄糖苷(PNP-D-gluopyranoside)的葡聚糖酶活性。参照这些图，据观察，AGR2314和AGR2414酶在37℃和80℃水解纤维二糖和HE-纤维素是高活性的。
实施例14.种子纤维中的葡聚糖酶活性
从未处理的种子纤维中释放的葡萄糖。用5μM AGR2314蛋白在pH5.0下消化20mg种子纤维，55℃消化72小时。在满负荷(FCT)下使用商业酶混合物作为阳性对照。酶水解后，通过121℃下酸水解将反应上清液中的可溶性糖水解成单体。图24A和24B表明种子纤维经酶水解后单糖的释放。图24A显示了葡萄糖的产生，图24B显示了木糖的产生。将预酸水解的糖(浅灰色条)和总糖(深灰色条)分离，并通过HPLC使用Bio-Rad Aminex HPX-87-P离子排斥色谱柱来定量。AGR2314不从未处理的种子纤维中释放单体葡萄糖或木糖。然而，这种酶能够将未处理的种子纤维溶解成低聚糖，其约占由市售纤维素酶的酶混合物释放的总糖的80％。
从稀酸预处理种子纤维释放的葡萄糖。将20mg种子纤维置于0.5％H2SO4中于80℃下预处理16小时，然后中和到pH 5.0。经预处理的种子纤维用2μM AGR2314以及一系列葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和β-葡聚糖酶(所有酶负荷为2μM)在pH 5.0以及55℃下消化72小时。在满负荷(FCT)下使用商业酶混合物(Accellerase XY，Genencor)作为阳性对照。酶水解后，在121℃下将反应上清液中的可溶性糖水解成单体。图25A和25B表明种子纤维经酶水解后单糖的释放。图25A显示了葡萄糖的产量，图25B显示了木糖的产量。将预酸水解的糖(浅灰色条)和总糖(深灰色条)分开，并通过HPLC使用Bio-Rad Aminex HPX-87-P离子排斥色谱柱来定量。
在比预处理本身更高的水平下，AGR2314不从预处理的种子纤维中释放糖。当与其他细胞壁降解酶结合时，与市售纤维素酶的酶混合物相比，约释放了总糖的90％。
实施例15.葡聚糖酶在肉鸡生活性能中的使用
动物饮食中包括的化学能，及其对吃该饮食的动物的有效性(availability)，是影响任何饮食营养价值的关键特征。富含能量的饮食与缺乏能量的饮食相比，能够提供充足营养并促进快速生长到更高水平。因此，确定饮食中的能量，并通过使用葡聚糖酶以改变能量有效性，提供了提高动物营养并因此提高动物性能的一组重要工具。
为证明肉鸡生产中葡聚糖酶的用途、代谢能和营养消化率，用含或不含补充葡聚糖酶的替代饲料成分(小麦、大麦和低脂肪DDGS)饲喂公肉鸡。确定肉鸡体重增加量、饲料消耗和饲料转化率，并评估饲料葡聚糖酶。
饮食处理和程过程
日龄公肉鸡从商业孵化场获得，随机分配于64个多层笼中，每个笼子10只。从0到28日龄饲喂实验饮食。获得初始组体重并在处理期间均衡。每周(7、14、21和28日龄)测量饲料消耗(feed disappearance)和体重来计算生活性能参数(饲料消耗(feedconsumption)、体重增加量和饲料转化率)。此外，在14和29日龄收集两次排泄物来确定饮食的表观代谢能(AME)。
饮食处理以4×2因子设计的方式饲喂，并进一步描述如下。饲喂四种不同饮食(玉米/大豆粉为基础的、玉米/小麦为基础的、玉米/大麦为基础的以及玉米/LF-DDGS为基础的)和两个水平的葡聚糖酶(含或不含)。饮食配制成等热量，并且除了能量外全部营养都配制成符合或超过营养要求。酶处理除饮食外(on top of the diet)还添加酶。此外，二氧化钛作为消化标记物被添加到饮食中，来确定AME和营养消化性。表6描述了饮食处理。
表6.处理描述
处理 饮食 酶
1 玉米-大豆粉 -
2 玉米-大豆粉 +
3 玉米-大豆粉-小麦 -
4 玉米-大豆粉-小麦 +
5 玉米-大豆粉-LF-DDGS -
6 玉米-大豆粉-LF-DDGS +
7 玉米-大豆粉-大麦 -
8 玉米-大豆粉-大麦 +
总计 640只公肉鸡
需要的总公鸡数：8个处理×8个重复×10只/笼＝640只公肉鸡+60只用于均衡＝700只公肉鸡
温度
多层笼：从放置到4天，92℉，从5到9天，90℉，从10到15天，84℉，从16到24天，80℉，从25到29天，78℉。
房间设置
在放置鸡之前，多层笼房间中的光照和温度提前48小时进行设置。将金属线底部(Wire bottoms)添加到多层笼，直到0到4天。除非在清单中注明的收集期间，排泄物盘定期抛弃处理，以避免任何虫害和气味问题。
光照方案
从放置到7日龄实施23小时光照：1小时黑暗，照明强度为3.0ft2。从8-21日龄实施23小时光照：1小时黑暗的光照计划，照明强度为1.0ft烛光。从22-28日龄实施23小时光照：1小时黑暗的光照计划，照明强度为0.3ft烛光。
特别说明
在实验开始前将金属线底部放入所有多层笼，否则日龄鸡会掉到地板上。在7天拆掉金属线底部。此外，笼门被修改以适应从0到7日龄的较小的鸡。
任何死亡均没有替换。
所有饮食均以糊状形式饲喂。混合表是现成的(forthcoming)。
为避免酶的交叉污染，需要单独的料铲。表7描述实验的时间线。
表7.食谱处理的时间线
Figure BDA0001467438630000861
Figure BDA0001467438630000871
图26表明在28天的家禽饲喂试验期间的体重增加量(BWG)。参照图26，检测了四种不同饮食，玉米/大豆粉为基础的、玉米/大麦为基础的、玉米/小麦为基础的和玉米/LF-DDGS为基础的，含(+)或不含(-)葡聚糖酶。仍参照图26，显示了四种饮食中含或不含葡聚糖酶的BWG均值。据观察，饲喂包括葡聚糖酶的饮食的鸡平均体重增加更高。
图27表明，在28天饲喂试验期间的每个时间间隔的家禽BWG变化。参照图27，获得了初始组体重并在处理期间均衡。每周(7、14、21和28日龄)测量饲喂含(+)或不含(-)葡聚糖酶的玉米/LF-DDGS饮食的肉鸡的BWG。仍参照图27，据观察，贯穿所有处理，饲喂包括葡聚糖酶的饮食的鸡的体重增加比饲喂不含葡聚糖酶的饮食的鸡要高。
图28表明在28天的家禽饲喂试验期间使用含(+)或不含(-)葡聚糖酶的两种不同饮食(玉米/大麦为基础的和玉米/LF-DDGS为基础的)的饲料消耗。参照图28，发现含有葡聚糖酶的饮食的饲料消耗更高。
图29表明在28天家禽饲喂试验期间使用含(+)或不含(-)葡聚糖酶的两种不同饮食(玉米/大麦为基础的饮食和玉米/LF-DDGS为基础的饮食)的饲料转化率(FCR)。饲料转化率是指，对于被测动物，为了增加体重所需的饲料消耗。FCR的计算是通过将饲料消耗值除以体重增加量值。参照图29，据观察，包括葡聚糖酶的饮食的FCR更低。这些数据表明，包括葡聚糖酶的饮食在被测动物中促进消化和饲料消耗。
实施例16.葡聚糖酶在肉鸡生活性能中的使用
为确定葡聚糖酶在肉鸡生产中的作用，在17天的多层笼试验中，对936只公肉鸡饲喂多种葡聚糖酶浓度。在17天对鸡进行称重。饲料成分包括玉米、大豆粉和脂肪(大豆油)。表8描述了17天的多层笼试验的实验细节。
表8.实验处理：(在17天中饲喂的饮食)-总共9个处理(TRT)
处理编号 描述 剂量
1 阳性对照(PC) --
2 阴性对照(NC，比PC少50-60kcal/lb) --
3 NC+行业标准酶_1* 0.25b/ton
4 NC+行业标准酶_2** 0.2b/ton
5 NC+葡聚糖酶 5
6 NC+葡聚糖酶 50
7 NC+葡聚糖酶 100
8 NC+葡聚糖酶 250
9 NC+葡聚糖酶 500
*行业标准酶_1是指ENSPIRATM(JBS United)
**行业标准酶_2是指
Figure BDA0001467438630000881
(Huvepharma)
处理数 9 每个重复的肉鸡数 8
每个处理的重复数 13 每个处理的肉鸡数 104
总重复数 117 肉鸡总数 936
参照图30，与包括引入商业NSPase的阳性对照(PC)、阴性对照(NC)以及处理3(Trt_3)和处理4(Trt_4)相比，在处理7(Trt_7)和处理8(Trt_8)中引入β-葡聚糖酶显著(p-值<0.05)增加体重增加量。在处理5(Trt_5)、处理6(Trt_6)和处理9(Trt_9)中引入葡聚糖酶产生了中间结果。
参考文献
Leeson,S.and L.Caston.2000.Commercial enzyme and their influence onbroilers fed wheat or barley.J.Appl.Poult.Res.9:242-251.
Yu,B.and T.K.Chung.2004.Effects of multiple-enzyme mixtures on growthperformance of broilers fed corn-soybean meal diets.J.Appl.Poult.Res.13:178-182.
在本申请中引用的参考文献适用于本文所有明显目的，而文献本身正如每篇文献完全记载的。为便于陈述，在本文的特定位置引用了这些参考文献中具体的文献。在某一特定位置引用的参考文献表明参考文献的学说被合并进来的方式。然而，在某一特定位置引用的参考文献不限制引用文献的所有学说为所有目的合并进来的方式。
因此应理解，本发明不限于公开的特定实施例，但旨在涵盖在本发明的精神和范围内的所有修改，如附加要求；上述描述；和/或显示于附图的定义。
***
序列表
<110> 谷万达公司
<120> 葡聚糖酶的生产和使用其的方法
<130> P47605VOL
<150> US62/161,482
<151> 2015-05-14
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 966
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ggcgtggacc cgttcgagag gaacaagatc ctgggcaggg gcatcaacat cggcaacgcc 60
ctggaggccc cgaacgaggg cgactggggc gtggtgatca aggacgagtt cttcgacatc 120
atcaaggagg ccggcttcag ccacgtgaga atcccgatca ggtggagcac ccacgcccag 180
gccttcccgc cgtacaagat cgagccgagc ttcttcaaga gggtggacga ggtgatcaac 240
ggcgccctga agaggggcct ggccgtggtg atcaacatcc accactacga ggagctgatg 300
aacgacccgg aggagcacaa ggagaggttc ctggccctgt ggaagcagat cgccgacagg 360
tacaaggact acccggagac cctgttcttc gagatcctga acgagccgca cggcaacctg 420
accccggaga agtggaacga gctgctggag gaggccctga aggtgatcag gagcatcgac 480
aagaagcaca ccgtgatcat cggcaccgcc gagtggggcg gcatcagcgc cctggagaag 540
ctgagggtgc cgaagtggga gaagaacgcc atcgtgacca tccactacta caacccgttc 600
gagttcaccc accagggcgc cgagtgggtg ccgggcagcg agaagtggct gggcaggaag 660
tggggcagcc cggacgacca gaagcacctg atcgaggagt tcaacttcat cgaggagtgg 720
agcaagaaga acaagaggcc gatctacatc ggcgagttcg gcgcctacag gaaggccgac 780
ctggagagca ggatcaagtg gaccagcttc gtggtgaggg aggccgagaa gaggggctgg 840
agctgggcct actgggagtt ctgcagcggc ttcggcgtgt acgacccgct gaggaagcag 900
tggaacaagg acctgctgga ggccctgatc ggcggcgaca gcatcgagag cgagaaggac 960
gagctg 966
<210> 2
<211> 948
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggcgtggacc cgttcgagag gaacaagatc ctgggcaggg gcatcaacat cggcaacgcc 60
ctggaggccc cgaacgaggg cgactggggc gtggtgatca aggacgagtt cttcgacatc 120
atcaaggagg ccggcttcag ccacgtgaga atcccgatca ggtggagcac ccacgcctac 180
gccttcccgc cgtacaagat catggacagg ttcttcaaga gggtggacga ggtgatcaac 240
ggcgccctga agaggggcct ggccgtggtg atcaacatcc accactacga ggagctgatg 300
aacgacccgg aggagcacaa ggagaggttc ctggccctgt ggaagcagat cgccgacagg 360
tacaaggact acccggagac cctgttcttc gagatcctga acgagccgca cggcaacctg 420
accccggaga agtggaacga gctgctggag gaggccctga aggtgatcag gagcatcgac 480
aagaagcaca ccatcatcat cggcaccgcc gagtggggcg gcatcagcgc cctggagaag 540
ctgagcgtgc cgaagtggga gaagaactcc atcgtgacca tccactacta caacccgttc 600
gagttcaccc accagggcgc cgagtgggtg gagggcagcg agaagtggct gggcaggaag 660
tggggcagcc cggacgacca gaagcacctg atcgaggagt tcaacttcat cgaggagtgg 720
agcaagaaga acaagaggcc gatctacatc ggcgagttcg gcgcctacag gaaggccgac 780
ctggagagca ggatcaagtg gaccagcttc gtggtgaggg agatggagaa gaggcgctgg 840
agctgggcct actgggagtt ctgcagcggc ttcggcgtgt acgacaccct gaggaagacc 900
tggaacaagg acctgctgga ggccctgatc ggcggcgaca gcatcgag 948
<210> 3
<211> 951
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
agcggcgtgg acccgttcga gaggaacaag atcctgggca ggggcatcaa catcggcaac 60
gccctggagg ccccgaacga gggcgactgg ggcgtggtga tcaaggacga gtacttcgac 120
atcatcaagg aggccggctt cagccacgtg agaatcccga tcaggtggag cacccacgcc 180
caggccttcc cgccgtacaa gatcgaggac aggttcttca agagggtgga cgaggtgatc 240
aacggcgccc tgaagagggg cctggccgtg gtgatcaacc agcaccacta cgaggagctg 300
atgaacgacc cggaggagca caaggagagg ttcctggccc tgtggaagca gatcgccgac 360
aggtacaagg actacccgga gaccctgttc ttcgagatcc tgaacgagcc gcacggcaac 420
ctgaccccgg agaagtggaa cgagctgctg gaggaggccc tgaaggtgat caggagcatc 480
gacaagaagc acaccatcat catcggcacc gccgagtggg gcggcatcag cgccctggag 540
aagctgaggg tgccgaagtg ggagaagaac gccatcgtga ccatccacta ctacaacccg 600
ttcgagttca cccaccaggg cgccgagtgg gtggagggca gcgagaagtg gctgggcagg 660
aagtggggca gcccggacga ccagaagcac ctgatcgagg agttcaactt catcgaggag 720
tggagcaaga agaacaagag gccgatctac atcggcgagt tcggcgccta caggaaggcc 780
gacctggaga gcaggatcaa gtggaccagc ttcgtggtga gggaggccga gaagaggagg 840
tggagctggg cctactggga gttctgcagc ggcttcggcg tgtacgacac cctgaggaag 900
acctggaaca aggacctgct ggaggccctg atcggcggcg acagcatcga g 951
<210> 4
<211> 322
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys Ile Leu Gly Arg Gly Ile Asn
1 5 10 15
Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala Pro Asn Glu Gly Asp Trp Gly Val Val
20 25 30
Ile Lys Asp Glu Phe Phe Asp Ile Ile Lys Glu Ala Gly Phe Ser His
35 40 45
Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp Ser Thr His Ala Gln Ala Phe Pro Pro
50 55 60
Tyr Lys Ile Glu Pro Ser Phe Phe Lys Arg Val Asp Glu Val Ile Asn
65 70 75 80
Gly Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Val Val Ile Asn Ile His His Tyr
85 90 95
Glu Glu Leu Met Asn Asp Pro Glu Glu His Lys Glu Arg Phe Leu Ala
100 105 110
Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asp Arg Tyr Lys Asp Tyr Pro Glu Thr Leu
115 120 125
Phe Phe Glu Ile Leu Asn Glu Pro His Gly Asn Leu Thr Pro Glu Lys
130 135 140
Trp Asn Glu Leu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Val Ile Arg Ser Ile Asp
145 150 155 160
Lys Lys His Thr Val Ile Ile Gly Thr Ala Glu Trp Gly Gly Ile Ser
165 170 175
Ala Leu Glu Lys Leu Arg Val Pro Lys Trp Glu Lys Asn Ala Ile Val
180 185 190
Thr Ile His Tyr Tyr Asn Pro Phe Glu Phe Thr His Gln Gly Ala Glu
195 200 205
Trp Val Pro Gly Ser Glu Lys Trp Leu Gly Arg Lys Trp Gly Ser Pro
210 215 220
Asp Asp Gln Lys His Leu Ile Glu Glu Phe Asn Phe Ile Glu Glu Trp
225 230 235 240
Ser Lys Lys Asn Lys Arg Pro Ile Tyr Ile Gly Glu Phe Gly Ala Tyr
245 250 255
Arg Lys Ala Asp Leu Glu Ser Arg Ile Lys Trp Thr Ser Phe Val Val
260 265 270
Arg Glu Ala Glu Lys Arg Gly Trp Ser Trp Ala Tyr Trp Glu Phe Cys
275 280 285
Ser Gly Phe Gly Val Tyr Asp Pro Leu Arg Lys Gln Trp Asn Lys Asp
290 295 300
Leu Leu Glu Ala Leu Ile Gly Gly Asp Ser Ile Glu Ser Glu Lys Asp
305 310 315 320
Glu Leu
<210> 5
<211> 316
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys Ile Leu Gly Arg Gly Ile Asn
1 5 10 15
Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala Pro Asn Glu Gly Asp Trp Gly Val Val
20 25 30
Ile Lys Asp Glu Phe Phe Asp Ile Ile Lys Glu Ala Gly Phe Ser His
35 40 45
Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp Ser Thr His Ala Tyr Ala Phe Pro Pro
50 55 60
Tyr Lys Ile Met Asp Arg Phe Phe Lys Arg Val Asp Glu Val Ile Asn
65 70 75 80
Gly Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Val Val Ile Asn Ile His His Tyr
85 90 95
Glu Glu Leu Met Asn Asp Pro Glu Glu His Lys Glu Arg Phe Leu Ala
100 105 110
Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asp Arg Tyr Lys Asp Tyr Pro Glu Thr Leu
115 120 125
Phe Phe Glu Ile Leu Asn Glu Pro His Gly Asn Leu Thr Pro Glu Lys
130 135 140
Trp Asn Glu Leu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Val Ile Arg Ser Ile Asp
145 150 155 160
Lys Lys His Thr Ile Ile Ile Gly Thr Ala Glu Trp Gly Gly Ile Ser
165 170 175
Ala Leu Glu Lys Leu Ser Val Pro Lys Trp Glu Lys Asn Ser Ile Val
180 185 190
Thr Ile His Tyr Tyr Asn Pro Phe Glu Phe Thr His Gln Gly Ala Glu
195 200 205
Trp Val Glu Gly Ser Glu Lys Trp Leu Gly Arg Lys Trp Gly Ser Pro
210 215 220
Asp Asp Gln Lys His Leu Ile Glu Glu Phe Asn Phe Ile Glu Glu Trp
225 230 235 240
Ser Lys Lys Asn Lys Arg Pro Ile Tyr Ile Gly Glu Phe Gly Ala Tyr
245 250 255
Arg Lys Ala Asp Leu Glu Ser Arg Ile Lys Trp Thr Ser Phe Val Val
260 265 270
Arg Glu Met Glu Lys Arg Arg Trp Ser Trp Ala Tyr Trp Glu Phe Cys
275 280 285
Ser Gly Phe Gly Val Tyr Asp Thr Leu Arg Lys Thr Trp Asn Lys Asp
290 295 300
Leu Leu Glu Ala Leu Ile Gly Gly Asp Ser Ile Glu
305 310 315
<210> 6
<211> 317
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Ser Gly Val Asp Pro Phe Glu Arg Asn Lys Ile Leu Gly Arg Gly Ile
1 5 10 15
Asn Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala Pro Asn Glu Gly Asp Trp Gly Val
20 25 30
Val Ile Lys Asp Glu Tyr Phe Asp Ile Ile Lys Glu Ala Gly Phe Ser
35 40 45
His Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp Ser Thr His Ala Gln Ala Phe Pro
50 55 60
Pro Tyr Lys Ile Glu Asp Arg Phe Phe Lys Arg Val Asp Glu Val Ile
65 70 75 80
Asn Gly Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Val Val Ile Asn Gln His His
85 90 95
Tyr Glu Glu Leu Met Asn Asp Pro Glu Glu His Lys Glu Arg Phe Leu
100 105 110
Ala Leu Trp Lys Gln Ile Ala Asp Arg Tyr Lys Asp Tyr Pro Glu Thr
115 120 125
Leu Phe Phe Glu Ile Leu Asn Glu Pro His Gly Asn Leu Thr Pro Glu
130 135 140
Lys Trp Asn Glu Leu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Val Ile Arg Ser Ile
145 150 155 160
Asp Lys Lys His Thr Ile Ile Ile Gly Thr Ala Glu Trp Gly Gly Ile
165 170 175
Ser Ala Leu Glu Lys Leu Arg Val Pro Lys Trp Glu Lys Asn Ala Ile
180 185 190
Val Thr Ile His Tyr Tyr Asn Pro Phe Glu Phe Thr His Gln Gly Ala
195 200 205
Glu Trp Val Glu Gly Ser Glu Lys Trp Leu Gly Arg Lys Trp Gly Ser
210 215 220
Pro Asp Asp Gln Lys His Leu Ile Glu Glu Phe Asn Phe Ile Glu Glu
225 230 235 240
Trp Ser Lys Lys Asn Lys Arg Pro Ile Tyr Ile Gly Glu Phe Gly Ala
245 250 255
Tyr Arg Lys Ala Asp Leu Glu Ser Arg Ile Lys Trp Thr Ser Phe Val
260 265 270
Val Arg Glu Ala Glu Lys Arg Arg Trp Ser Trp Ala Tyr Trp Glu Phe
275 280 285
Cys Ser Gly Phe Gly Val Tyr Asp Thr Leu Arg Lys Thr Trp Asn Lys
290 295 300
Asp Leu Leu Glu Ala Leu Ile Gly Gly Asp Ser Ile Glu
305 310 315
<210> 7
<211> 3004
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cggtatgaat ttggaaacaa attcagtact tttaaaaaaa tttgttgtag ggagcaaata 60
atacataaaa taatttatgc attattttat tttttatttg taataatatg cttgaaacga 120
taattcagta tgcatgttgt gccagtgtac tacacgggcg gggggagggg attgagtggg 180
ccagcgcggt gcgtagggta gatgggctga aattgataac tcaagtccga ctaggttctc 240
tttttatttc ccttcctttt ctattttcct ttcttttaat tttcatgctt tcaaactaaa 300
ttcaaattcg agttttgaat ttcagcttct aaattgtaca ctaaaattat atgataaggt 360
aacccctact attactttta atttttttat tctaccccat attgtttact taggggagaa 420
taattgactt aatcacattc ttccttaggt ttcaattctc aatctttcaa atccacattt 480
ttagatttct attttgaatt taaataccag tttggattta gagttcaatt tcaaaataca 540
caaccaaaat accagcatga atgcaaatat attttatgtt tatgtattta cttttctttt 600
atactttgct caaaatagtt attttcatgt atgaaactca ataagcaagg aactcacgtt 660
attatataac ctaataggaa taatttaggt aacataattt atcatcctct tgatttaaaa 720
gagatatgcc tccagaataa gacacatact aaaaataact ctaatattga ataactaaag 780
tcgtacaaat ctctactatt attcctataa aataataaag aactagctac aacttcttta 840
aggcattatt cagggtttac agcttgagag gcatgaaccc atcctgtata ctcctggact 900
tggaagacaa aatgtcaacc aaagtgaaag gttttcttat ggttgctgct aagagataga 960
ttgaacacta gatctctcct aagacgtcag ggcatgcgtt tagactccta cacatgcgaa 1020
aactgcatct tacagttgga agaaactata tctcaccact tcctgcggtg taactttgcc 1080
caaagatgtt ggctcactgt tggaatcact ccgccccgaa ctttggatct aacgcttgca 1140
gtgctacata ttagagcaag actaacaatg ccgtggagaa tggaaggtat tataaccatg 1200
tcatggtgca tatggaaatg tcgaaataac tggatattcg aaaacatacc gccaacggtg 1260
gcggcctgca aggaaatgtt caagactgaa atgaactaca tctgctacca agttaagctc 1320
gagacaggag ctaaaagtag aaactggata caacactttg taacatagtg acactcccct 1380
tttcctttct tttaccttag aactatacat acaatccaca ttcaataaaa atttgtaggt 1440
acgccataca cactaccgga atccggctct ttgccgagtg tgaggcgctt tgtcgagtgc 1500
tttttgtcca gcactcggca aaaaagtctt tgccatgtgc cgcactcggc aaagtcctgc 1560
tctcggtaac gaccgcgttt accgagagca ggactctcga cacagaaata cactcgacaa 1620
agaaatcttt gccgagagcc aaacactcgg cgaacggcag cgctcggcaa agggtcgtca 1680
gccgccgtct aaagctgacg gtcgttatct ttgtcgagtg ccccctcgtc cgacactcag 1740
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tattttgcca accaaacttt ttgtggtatg ttcctacact atgtagatct acatgtacca 1860
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gagcacgctt cccaaactgt taaactctgt gttttttgcc aaaaaaaaat gcataggaaa 900
gttgctttta aaaaatcata tcaatccatt ttttaagtta tagctaatac ttaattaatc 960
atgcgctaat aagtcactct gtttttcgta ctagagagat tgttttgaac cagcactcaa 1020
gaacacagcc ttaacccagc caaataatgc tacaacctac cagtccacac ctcttgtaaa 1080
gcatttgttg catggaaaag ctaagatgac agcaacctgt tcaggaaaac aactgacaag 1140
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taatgaaaga agatgtggtg ttagaaaagg aaacaatatc atgagtaatg tgtgggcatt 1380
atgggaccac gaaataaaaa gaacattttg atgagtcgtg tatcctcgat gagcctcaaa 1440
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acataatgca aaataagata tcatcgatga catagcaact catgcatcat atcatgcctc 1560
tctcaaccta ttcattccta ctcatctaca taagtatctt cagctaaatg ttagaacata 1620
aacccataag tcacgtttga tgagtattag gcgtgacaca tgacaaatca cagactcaag 1680
caagataaag caaaatgatg tgtacataaa actccagagc tatatgtcat attgcaaaaa 1740
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<210> 17
<211> 2584
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<400> 19
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aaatcgatta actcctaaag ttcaagccga gactacagac acatgagcta cataaatgag 120
ccaaggactc gagcaaagac aaatcgacac agacattata attcaagtca ttctagaaga 180
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Ile Gly Asn Ala Leu Glu Ala Pro Asn Glu Gly Asp Trp Gly Val Val
20 25 30
Ile Lys Asp Glu Phe Phe Asp Ile Ile Lys Glu Ala Gly Phe Ser His
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Val Arg Ile Pro Ile Arg Trp Ser Thr His Ala Ala Phe Pro Pro Tyr
50 55 60
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Ala Leu Lys Arg Gly Leu Ala Val Val Ile Asn Ile His His Tyr Glu
85 90 95
Glu Leu Met Asn Asp Pro Glu Glu His Lys Glu Arg Phe Leu Ala Leu
100 105 110
Trp Lys Gln Ile Ala Asp Arg Tyr Lys Asp Tyr Pro Glu Thr Leu Phe
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Lys His Thr Val Ile Ile Gly Thr Ala Glu Trp Gly Gly Ile Ser Ala
165 170 175
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195 200 205
Val Pro Gly Ser Glu Lys Trp Leu Gly Arg Lys Trp Gly Ser Pro Asp
210 215 220
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225 230 235 240
Lys Lys Asn Lys Arg Pro Ile Tyr Ile Gly Glu Phe Gly Ala Tyr Arg
245 250 255
Lys Ala Asp Leu Glu Ser Arg Ile Lys Trp Thr Ser Phe Val Val Arg
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<212> DNA
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attcatgtag tcgtgccttg ccacgtggct gattacgtgg cgagatgaca tggcagttga 420
cgtggcaggt gatgtggcga aaatgttgtg acgagttcat tcgtcacaga tgttatgacg 480
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat 60
gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat 120
gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc 180
gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat 240
gttactagat cgggaattgg cgagctcgaa ttaattcagt acattaaaaa cgtccgcaat 300
gtgttattaa gttgtctaag cgtcaatttg tttacaccac aatatatact aaaaaaactc 360
aaggatctgt ctccagaaag gccttgcagg gtttggccac gcccacggac attccatctc 420
agagccatga ttagaacgaa aaacacatga gagccgtcgt tgctaggagt cggtttcata 480
tgttcgctaa aacaagagat ttgttttttt tctctctcgt acatacacga gtcagccctt 540
ttaatctcag gttgacgtgc aatgtcgctc gtctaagcag aacattttga gaacaaatgt 600
gttgtacatg agagttttgt gtacatggta cgtacattaa aacatcatca tttatcttag 660
atctaacatc tctacttgct tgttatatat tttttttgta aaataacatc tttcaccact 720
ttatatggtg ttgtttgcaa aatatacaga gcaattagag acgttagatt tgagatggac 780
ggtgataatt taatacatgc ataatgtaca agaaaatcct aactgcacta gatatgttgt 840
caaacatttt acctttgtta caaaaagaaa tgaatagatg ttgaacggtt gtctttcaag 900
cctgttcgct gcggctttaa ttcaccaact gcaatgaaca acctgaaagg tgatcgttgc 960
cgaacacatg ctgtttggca aagctagtag tacctttttt gtctgtcacc tggaatgatg 1020
agaaaggaga caagaggaga gggctggcca ttgtttatat atatacgtat ttccattgct 1080
ttgtggcatg caacagttca agggtccaaa ctggcaggtt ttcagccccg acaaatataa 1140
taaaaaaact acaaaaaaaa aaggtccgtt tacattcctt ttttgacaac gctagtccgt 1200
gcggagcgag c 1211
<210> 24
<211> 696
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
ggtgaaacaa ggtgcagaac tggacttccc gattccagtg gatgattttg ccttctcgct 60
gcatgacctt agtgataaag aaaccaccat tagccagcag agtgccgcca ttttgttctg 120
cgtcgaaggc gatgcaacgt tgtggaaagg ttctcagcag ttacagctta aaccgggtga 180
atcagcgttt attgccgcca acgaatcacc ggtgactgtc aaaggccacg gccgtttagc 240
gcgtgtttac aacaagctgt aagagcttac tgaaaaaatt aacatctctt gctaagctgg 300
gagctctaga tccccgaatt tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag 360
attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa 420
gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag 480
agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga 540
taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gaattggcga gctcgaatta 600
attcaagtgt cttcgtacaa actgggggat ggggcagacc gccaggttca aaccgtttga 660
ctagatgcgg ctggcaggct actttgcagt gcatgc 696
<210> 25
<211> 970
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca 60
tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt 120
cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa 180
attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa ttggcgagct cgaattaatt 240
cagtacatta aaaacgtccg caatgtgtta ttaagttgtc taagcgtcaa tttgttatca 300
agttgtctaa gcgtcaaaca ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacga caacctgatc 360
atgagcggag aattaaggga gtcacgttat gacccccgcc gatgacgcgg gacaagccgt 420
tttacgtttg gaactgacag aaccgcaacg ttgaaggagc cactcagcct aagcggccgc 480
attggactta attaagtgag gccggccaag cgtcgattta aatgtaccac atggcgcgcc 540
aactatcatg cgatcgcttc atgtctaact cgagttactg gtacgtacca aatccatgga 600
atcaaggtac ctccatgctg tcctactact tgcttcatcc ccttctacat tttgttctgg 660
tttttggcct gcatttcgga tcatgatgta tgtgatttcc aatctgctgc aatataaatg 720
gagactctgt gctaaccatc aacaacatga aatgcttatg aggcctttgc tgagcagcca 780
atcttgcctg tgtttatgtc ttcacaggcc gaattcctct gttttgtttt tcaccctcaa 840
tatttggaaa catttatcta ggttgtttgt gtccaggcct ataaatcata catgatgttg 900
tcgtattgga tgtgaatgtg gtggcgtgtt cagtgccttg gatttgagtt tgatgagagt 960
tgcttctggg 970
<210> 26
<211> 1127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
aaaatcccgc gcgctggcga ttttaaaatc ggccctcgat agccagcagg gtgaaccgtg 60
gcaaacgatt cgtttaattt ctgaatttta cccggaagac agcggtctgt tctccccgct 120
attgctgaat gtggtgaaat tgaaccctgg cgaagcgatg ttcctgttcg ctgaaacacc 180
gcacgcttac ctgcaaggcg tggcgctgga agtgatggca aactccgata acgtgctgcg 240
tgcgggtctg acgcctaaat acattgatat tccggaactg gttgccaatg tgaaattcga 300
agccaaaccg gctaaccagt tgttgaccca gccggtgaaa caaggtgcag aactggactt 360
cccgattcca gtggatgatt ttgccttctc gctgcatgac cttagtgata aagaaaccac 420
cattagccag cagagtgccg ccattttgtt ctgcgtcgaa ggcgatgcaa cgttgtggaa 480
aggttctcag cagttacagc tcaaaccggg tgaatcagcg tttattgccg ccaacgaatc 540
accggtgact gtcaaaggcc acggccgttt agcgcgtgtt tacaacaagc tgtaagagct 600
tactgaaaaa attaacatct cttgctaagc tgggagctct agatccccga atttccccga 660
tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat 720
gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat 780
gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc 840
gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat 900
gttactagat cgggaattgg cgagctcgaa ttaattcagt acattaaaaa cgtccgcaat 960
gtgttattaa gttgtctaag cgtcaatttg ttatcaagtt gtctaagcgt caaacactga 1020
tagtttaaac tgaaggcggg aaacgacaac ctgatcatga gcggagaatt aagggagtca 1080
cgttatgacc cccgccgatg acgcgggaca agccgtttta cgtttgg 1127
<210> 27
<211> 1303
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
ttggggttcc ttatcctgtt gtcggagttg tgccattatc ctttccatgg ttgacctgag 60
ctttagcctg tacactgtag actctactag aggtttacct gaggctgaat tcccgctgct 120
aagatgtgat gttcccggcc ataagcaaag atgcaggttg tctttgcttt gtaaagatga 180
aggttgtctt tgttttgtaa tcgaaaaaaa aaccctccga cttcgatagc aatccatttc 240
ttgaaacgat atagctataa gctgcagcca caccttgcgt tgatgatgcc aaagctttct 300
ttcgagtgcg atgcatgcac tggcctgttg agatcttatc aatatggcaa acagtaacct 360
aacgtatatg actacatggt cttcatgctt ttgagaggtg cctcatagga aacagtcagg 420
ccaatgattt tagggaatac aatatatttt tgctgttttt tttttgcaaa ttgtccatat 480
tattacaaaa aaaactaaac atgcccaaag gcaatagctt tctaaataaa aatgaataac 540
ggtccactta tatatgttgg ccagtaatca attctgaggc ctgacaaacc atgcatatat 600
taacagtagg ttaatggccg tgcgtgaaaa aatttcaata caacaagaga ttgaaaaaaa 660
agagtgtctt accaatatgt tattttataa gtaccaaatg tgtaggaaac ttgcattcat 720
tttttccctg agaatggaaa aaaacaagac atactcattt tcaagttgaa ttgtcatagc 780
aacacacatg ttgtatctgc cggttcatgc aattgtgcca accaaaatat ctaaatgaga 840
tattcaagac tcaacagaat taaagtatgg aatagggtgt atatacactc aaccattatt 900
aaatggtata atcatctatc tatatcacta taaaatctac cagtttaaac ttcacaaaac 960
tcatctagct aatggaggcg ggaaacgaca acctgatcat gagcggagaa ttaagggagt 1020
cacgttatga cccccgccga tgacgcggga caagccgttt tacgtttgga actgacagaa 1080
ccgcaacgtt gaaggagcca ctcagcctaa gcggccgcat tggacttaat taagtgaggc 1140
cggccaagcg tcgatttaaa tgtaccacat ggcgcgccaa ctatcatgcg atcgcttcat 1200
gtctaactcg agttactggt acgtaccaaa tccatggaat caaggtacct ccatgctgtc 1260
ctactacttg cttcatcccc ttctacattt tgttctggtt ttg 1303
<210> 28
<211> 960
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat 60
catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt 120
atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga 180
aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact 240
agatcgggaa ttggcgagct cgaattaatt cagtacatta aaaacgtccg caatgtgtta 300
ttaagttgtc taagcgtcaa tttgtttaca ccacaatata aaatctacct gttcgctgat 360
aagccgttag gttgactatg tgactgttgg gcggcaaaat gaccacgcgg acggtctagc 420
cccaaagccg gacggtccgc ggtccagaca gtctgcactg gtggtgtcgg cgtttcgacc 480
ccggggggtc cctggaccga cgagtaaatt gtcgctgcgt gtcccagccc agatgggtcc 540
gcgcgagacg gaacgcgaag atgggaaaac agcaaagggg aacccgcggc cttcgtgttg 600
tcctgcgccc aggtcgggtg cgcttgcagt agggggttac aaccgttcgc gtgggagaga 660
cagagagaga gcgagagcct tatgcgtcgg cccgttctcc cgcgcggcca accctctcgt 720
acgagagccc tggaccttcc ttttatagac gtaaggagag ggcccaggtg tacaatgggg 780
ggtgtagcag agtgctaacg tgtctagcag agaggagccg gagccctaag tacatgtcgt 840
cgtggctgtc ggagaggttt tggcgccctg ttcatgtgat gtcgtggccg tcggaggagc 900
gcttgagccc cgtggaagta cagctgtcgg ggctgtcgga tccttgctga cgtctccttg 960
<210> 29
<211> 2855
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
caccctcgct gttggtaaac gtgcgccttg ggtatgtcct cacctgcatg atacgacatg 60
ttgaaaaagg tacatggctg ggcggattta aacagtagaa tgaaaaggtg ccacaagaaa 120
actcgtcaaa gaattgacta cgcgtcaatg ttccatagtt aaaaagactt gaactctgga 180
tcagggactt tcaaacaagg atagctgcct ggtcaccagt cattaactgt aatgtaatgg 240
ccatagatga tgcatgagta caataataaa aaaacaccat ccagccaaat atatactccc 300
tgtcacaaat gaaaattcgt tttagataat tagtggattc atacaatatt tgttgtatgt 360
gttttatgtg tctagattca tcatcctcta tttgaatata gacagaaaaa tcataactaa 420
aacgaatact atttgggaac ggagggagta ctactttggc agaatgcccc caggaaagta 480
ccagtttcag gggtagtttg gaaggctaaa cctagggagg gaaaaccccc cacatgtaac 540
taaatatctt attcaaatgt tacccctagg gattactcac cctgggaaat gagaagggtc 600
ccaaggggat ttcggtttct attatttttt ctgcaaacca tttcagagca atgatatgaa 660
accaagctaa ctacttataa catttcttaa gaatatcaga cataggaaag tgatggcctg 720
gaaccaaagt aagactggta gataaataga tcactagaat aaaccctgac agttcatagc 780
cttcatagaa gcaaaaggaa acactacggg agcaattggt tgcttgcact agcaattcac 840
tgcattgggt ctaatgcagg atagactaag ccagcataag tgtgcgcaat gtgtttgtgt 900
ttggttgcca tgttataagt aagttgcatt tgctaatatc tttctcctga ctctaatgag 960
tccacttttg ctgactggtg ggcgaaagta agtaagcaag tgcacaaatc caaaagaaga 1020
ggctttaaca gtatcatcat cttgggggct tggtgtttat ggcttcatcg taataaggtg 1080
gtttttgatg gtgtcagtcc ttcaattatt ggcataaagg caattttttt ggatgaagtt 1140
gaattctgga ggcttgccgg tgctaggcat cttgaggctt tggttcctgg tgctggaatt 1200
tttaggtcaa gggttctttt gggtgattag tgaagagcag gtgtgtgtgg tctgctcgca 1260
ctttttgttg ttcgttctcc tattgcgtgc tgttgtttcc aggcgcattt atggaggctg 1320
cagttttgtg cgcagcagaa gttggtggtt ttgtgttttg tgttttgcct attttggcat 1380
tgtactttgg tccattttgg actgttttct tctcttaatt taatgatgtg cagctctcct 1440
gcgcgtttaa gaaaaaaaaa agttggctgt tttgtatttc ttgtgatcac ccatgcttgt 1500
tgtggtcaga ttaaactctc acgtttaatg ctacagaagc atccatgaga caatgaaaca 1560
ccgctcaaaa gccacgtagt agcataccct gacttatgaa taaagcaact cgatctgatt 1620
tatttgagaa aacaggaaac tgacaagtta tttttaacac aaaatttcat taaaaacgaa 1680
tggtagacaa ttaccaatct gtaggtccct ggcttgcaag tcctcccaat gtctaagaaa 1740
tcaaatagga actgcaggca agccagcaag aaagtattaa tcactggata taaaatataa 1800
agaaaaaaga aggaaagacg gctactcggc tagcatatgt ttttgttagg ggtgaaaatg 1860
gatacttatt cagaaatcat ttttgatctt ttttctttaa ttaggaataa ataggatata 1920
gaatatgcta agcaaattca tattcttgtt cttagcattg ggcttgtaaa gattcataaa 1980
aggtaaatct caaatttatc atatatctta aatggtagat ataaaattca gatacaaata 2040
tttttcaact tttttgttgt agggaacaaa ttatattaaa aaaaattatg cacaattcta 2100
ttcttatttg taataatgtg cttgataaca taataaaaga ttaccatcaa atttcacaca 2160
cacccaccca cccacccacc cctgcacgca cgcgcgcgca cacacactat atgtgtgttc 2220
aaacactgat agtttaaact gaaggcggga aacgacaacc tgatcatgag cggagaatta 2280
agggagtcac gttatgaccc ccgccgatga cgcgggacaa gccgttttac gtttggaact 2340
gacagaaccg caacgttgaa ggagccactc agcctaagcg gccgcattgg acttaattaa 2400
gtgaggccgg ccaagcgtcg atttaaatgt accacatggc gcgccaacta tcatgcgatc 2460
gcttcatgtc taactcgagt tactggtacg taccaaatcc atggaatcaa ggtacctcca 2520
tgctgtccta ctacttgctt catccccttc tacattttgt tctggttttt ggcctgcatt 2580
tcggatcatg atgtatgtga tttccaatct gctgcaatat gaatggagac tctgtgctaa 2640
ccatcaacaa catgaaatgc ttatgaggcc tttgctgagc agccaatctt gcctgtgttt 2700
atgtcttcac aggccgaatt cctctgtttt gtttttcacc ctcaatattt ggaaacattt 2760
atctaggttg ttttgtgtcc aggcctataa atcataaatg atgttgtcgt attggatgtg 2820
aatgtggtgg cgtgttcagt gccttggatt tgagt 2855
<210> 30
<211> 2336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
caccctcgct gttggtaaac gtgcgccttg ggtatgtcct cacctgcatg atacgacatg 60
ttgaaaaagg tacaaggctg ggcggattta aacagtagaa tgaaaaggtg ccacaagaaa 120
actcgtcaaa gaattgacta cgcgtcaatg ttccatagtt aaaaagactt gaactctgga 180
tcagggactt tcaaacaagg atagctgcct ggtcaccagt cattaactgt aatgtaatgg 240
ccatagatga tgcatgagta caataataaa aaaacaccat ccagccaaat atatactccc 300
tgtcacaaat gaaaattcgt tttagataat tagtggattc atacaatatt tgttgtatgt 360
gttttatgtg tctagattca tcatcctcta tttgaatata gacagaaaaa tcataactaa 420
aacgaatact atttgggaac ggagggagta ctactttggc agaatgcccc caggaaagta 480
ccagtttcag gggtagtttg gaaggctaaa cctagggagg gaaaaccccc cacatgtaac 540
taaatatctt attcaaatgt tacccctagg gattactcac cctgggaaat gagaagggtc 600
ccaaggggat ttcggtttct attatttttt ctgcaaacca tttcagagca atgatatgaa 660
accaagctaa ctacttataa catttcttaa gaatatcaga cataggaaag tgatggcctg 720
gaaccaaagt aagactggta gataaataga tcactagaat aaaccctgac agttcatagc 780
cttcatagaa gcaaaaggaa acactacggg agcaattggt tgcttgcact agcaattcac 840
tgcattgggt ctaatgcagg atagactaag ccagcataag tgtgcgcaat gtgtttgtgt 900
ttggttgcca tgttataagt aagttgcatt tgctaatatc tttctcctga ctctaatgag 960
tccacttttg ctgactggtg ggcgaaagta agtaagcaag tgcacaaatc caaaagaaga 1020
ggctttaaca gtatcatcat cttgggggct tggtgtttat ggcttcatcg taataaggtg 1080
gtttttgatg gtgtcagtcc ttcaattatt ggcataaagg caattttttt ggatgaagtt 1140
gaattctgga ggcttgccgg tgctaggcat cttgaggctt tggttcctgg tgctggaatt 1200
tttaggtcaa gggttctttt gggtgattag tgaagagcag gtgtgtgtgg tctgctcgca 1260
ctttttgttg ttcgttctcc tattgcgtgc tgttgtttcc aggcgcattt atggaggctg 1320
cagttttgtg cgcagcagaa gttggtggtt ttgtgttttg tgttttgcct attttggcat 1380
tgtactttgg tccattttgg actgttttct tctcttaatt taatgatgtg cagctctcct 1440
gcgcgtttaa gaaaaaaaaa agttggctgt tttgtatttc ttgtgatcac ccatgcttgt 1500
tgtggtcaga ttaaactctc acgtttaatg ctacagaagc atccatgaga caatgaaaca 1560
ccgctcaaaa gccacgtagt agcataccct gacttatgaa taaagcaact cgatctgatt 1620
tatttgagaa aacaggaaac tgacaagtta tttttaacac aaaatttcat taaaaacgaa 1680
tggtagacaa ttaccaatct gtaggtccct ggcttgcaag tcctcccaat gtctaagaaa 1740
tcaaatagga actgcaggca agccagcaag aaagtattaa tcactggata taaaatataa 1800
agaaaaaaga aggaaagacg gctactcggc tagcatatgt ttttgttagg ggtgaaaatg 1860
gatacttatt cagaaatcat ttttgatctt ttttctttaa ttaggaataa ataggatata 1920
gaatatgcta agcaaattca tattcttgtt cttagcattg ggcttgtaaa gattcataaa 1980
aggtaaatct cgaatttatc atatatctta aatggtagat ataaaattca gatacaaata 2040
tttttcaact tttttgttgt agggaacaaa ttatattaaa aaaaattatg cacaattcta 2100
ttcttatttg taataatgtg cttgataaca taataaaaga ttaccatcaa atttcacaca 2160
cacccaccca cccacccacc cctgcacgca cgcgcgcgca cacacactat atgtgtgttc 2220
aaacactgat agtttaaact gaaggcggga aacgacaacc tgatcatgag cggagaatta 2280
agggagtcac gttatgaccc ccgccgatga cgcgggacaa gccgttttac gtttgg 2336
<210> 31
<211> 2127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg 60
tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg attgctaact 120
tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg atggctctag ccgttccgca gacgggatcg 180
atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca 240
atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt 300
gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct agatcggagt agaattctgt tacccacttt 360
catccctagt ttttgttctg gattcaagca tctcaaaatt gtttacctga agtttatcag 420
ttttgagaaa gcggcgcccc tgtcgactac catcaggcat tcggactaca actgtcacag 480
caccctctgc gtctggagac ggttccggtg gtaatgatgc ttgcttcgaa gtgagactgg 540
actctagctc ctatttaatc aaaacatcag ggacaacatg acaaatagta gtcaaatatc 600
caggcaagaa aaaaaaacca taaacaatga aaatactgat caaaagtcct gtttggatct 660
cctaagaaaa atgagaatga gatccaaaca attggattct agaatccagc tatctatccc 720
aaacccatta tttggcgaga ttttcactat gcagaggcaa tgatcactat aagaataaga 780
ttcaaacacc cacttattat ttttttaatc cagaaaccag attctacatt cactatagaa 840
tccagaactt caatatggga atgagatcca aatagaccct aagccaaaat gaaattggtg 900
agatgaagtg gctagttgtc ataacctcct gtaaagaaga cagcggttta cagtcccaac 960
acccaaataa acatgacatt aatataatga ctacaactca caacctaaac ctaaaccaat 1020
atacatccaa acataagaca aaaggagaac tgagttttat atgatcacac tgatgaactg 1080
atgctgtagt ctagcattca agtgtttaag atagttgact ataaaccctt caccttgcag 1140
attacatgtg acagaaagat acctcttcct caagttgttt tttacgcctt tcctcctcct 1200
cttgcttctg tttctcaaga acagcttctc tcgcagctgt ttcttcaagg cgacggagct 1260
cagcctcctg tagggccttt aactcctttt cttgatcagc ttgtagcgat gcaaggtact 1320
catcgtccta caaatttaaa atttataaaa gtgctcaccc atagtggcaa ttatgaacaa 1380
tggataaatc ttagacctca aacctgctgc tctcgtaata accgctgttc agttaatgct 1440
ggtgatggag aatgagatat tgggggataa taagtagagg ttctgtgaga aggcatagag 1500
aaaggatatg ttggtccacc aaacattgca gcctcaagca taacagcttc atcatgttcc 1560
tcagaagaaa tgccacccca ctttattgta aaaaaagacg tcagaaatta aacaaatcca 1620
tctaatgtct tagcgcacat tggaaccaca gattataata cctcagatgg gaaatcatct 1680
ccattatact ggtgattgtt cagaacaggg ctagcacctg ggtgcactat ttttggtaat 1740
tcattgtcct cagaaggggc acgccgagaa cgacgcctaa ctaacggctg ttcttctaca 1800
tcttcagcct cctcctggaa gctctcgtca tctattggtt gcctagatgt tccagccttt 1860
cctgaagcta gtccttgcct ccaaaaggaa attgcatgta taaggaatca aatgatactg 1920
tagtagggta gcctgagtga agaggtgggt agtaaagtta acattcacct ctcaactatt 1980
ccatttgcgg tttccatgcc tgctttatca gaagaatggt ccctcaaatt cacttcctct 2040
tgatgctggc ctccttgctc gactatctga tgattattga aaaattagag atgacatcaa 2100
gataggttca agtaagcatg ttgggga 2127
<210> 32
<211> 4044
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
caccctcgct gttggtaaac gtgcgccttg ggtatgtcct cacctgcatg atacgacatg 60
ttgaaaaagg tacaaggctg ggcggattta aacagtagaa tgaaaaggtg ccacaagaaa 120
actcgtcaaa gaattgacta cgcgtcaatg ttccatagtt aaaaagactt gaactctgga 180
tcagggactt tcaaacaagg atagctgcct ggtcaccagt cattaactgt aatgtaatgg 240
ccatagatga tgcatgagta caataataaa aaaacaccat ccagccaaat atatactccc 300
tgtcacaaat gaaaattcgt tttagataat tagtggattc atacaatatt tgttgtatgt 360
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<210> 36
<211> 3542
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
caccctcgct gttggtaaac gtgcgccttg ggtatgtcct cacctgcatg atacgaaatg 60
ttgaaaaagg tacaaggctg ggcggattta aacagtagaa tgaaaaggtg ccacaagaaa 120
actcgtcaaa gaattgacta cgcgtcaatg ttccatagtt aaaaagactt gaactctgga 180
tcagggactt tcaaacaagg atagctgcct ggtcaccagt cattaactgt aatgtaatgg 240
ccatagatga tgcatgagta caataataaa aaaacaccat ccagccaaat atatactccc 300
tgtcacaaat gaaaattcgt tttagataat tagtggattc atacaatatt tgttttatgg 360
gtgtctagat tcatcatcct ccatttgaat atagaaagaa aaatcataac taaaacgaat 420
actatttggg aacggaggga gttactattt tgcccgaatg ctcccaggaa agcacgagtt 480
tcagggctag tttggaaggc taaacctagg gagggaaaac cccccacatg taactaaata 540
tcttattcaa atgttacccc tagggattac tcaccctggg aaatgagaag ggtcccaagg 600
ggatttcggt ttctattatt ttttctgcaa accatttcag agcaatgata tgaaaccaac 660
ctaactactt ataacatttc ttaagaatat cagacatagg aaagtgatgg cctggaagca 720
aagtaagact gatagataaa tagatcacta gaataaaccc tgacagttca tagccttcat 780
agaagcaaaa ggaaacacta cgggagcaat tggttgcttg cactagcaat tcactgcatt 840
gggtctaatg caggatagac taagccagca taagtgtgca caatgtgttt gtgtttggtt 900
gccatgttat aagtaagttg catttgctaa tataatgttt ggttagttgg ctgttttgta 960
tttcttgtga tcacccatgc ttgttgtggt gagattaaac tctcacgttt aatgctacag 1020
aagcatccat gagacaatga aacatcgctc aaaagccacg tagtagcata ccctgactta 1080
tgaataaagc aactcgatct gatttatttg agaaaacagg aaactgacaa gttattttta 1140
acacaaaatt tcattaaaaa cgaatggtag acaattacca atctgtaggt ccctggcttg 1200
caagtcctcc caatgtctaa gaaatcaaat aggaactgca ggcaagccag caagaaagta 1260
ttaatcactg gatataaaat ataaagaaaa aagaaggaaa gacggctact cggctagcat 1320
atgtttttgt taggggtgaa aatggatact tattcagaaa tcattttttg atcttttttc 1380
tttaattagg aataaatagg atatagaata tgctaagcaa attcatattc ttgttcttag 1440
cattgggctt gtaaagattc ataaaaggta aatctcaaat ttatcatata tcttaaatgg 1500
tagatataaa attcagatac aaatattttt caactttttt gctgtaggga acaaataata 1560
taaaaaaatt tatgcacaat tctattctta tttgtaataa tgtgcttgat aacataataa 1620
aagattacca tcaaatttca cacacacaca cacacacaca cccacccccc cccacacccc 1680
cacgcacgag cgcacacaca cactatatgt gtgtatatat attaaatatt gaatttatcc 1740
taacaatttg gatacccact ttcatcccta gtttttgttc tggattcaag catctcaaaa 1800
ttgtttacct gaagtttatc agttttgaga aagcggcgcc cctgtcgact accatcaggc 1860
attcggacta caactgtcac agcaccctct gcgtctggag acggttccgg tggtaatgat 1920
gcttgcttcg aagtgagact ggactctagt tcctatttaa tcaaaacatc agggacaaca 1980
tgacaaatag tagtcaaata tccaggcaag aaaaaaaacc ataaacaatg aaaatactga 2040
tcaaaagtcc tgtttggatc tcctaagaaa aatgagaatg agatccaaac aattggattc 2100
tagaatccag ctatctatcc caaacccatt atttggcgag attttcacta tgcagaggca 2160
atgatcacta taagaataag attcaaacac ccacttatta tttttttaat ccagaaacca 2220
gattctacat tcactataga atccagaact tcaatatggg aatgagatcc aaatagaccc 2280
taagccaaaa tgaaattggt gagatgaagt ggctagttgt cataacctcc tgtaaagaag 2340
acagcggttt acagtcccaa ctcccaaata aacatatgac attaatataa tgactacaac 2400
tcacaaccta aacctaaacc aatatacatc caaacataag acaaaaggag aactgagttt 2460
tatatgatca cactgatgaa ctgatgctgt agtctagcat tccagtgttt aagatagttg 2520
actataaacc cttcaccttg cagattacat gtgacagaaa gatacctctt cctcaagttg 2580
ttttttacgc ctttcctcct cctcttgctt ctgtttctca agaacagctt ctctcgcagc 2640
tgtttcttca aggcgacgga gctcagcctc ctgtagggcc tttaactcct tttcttgatc 2700
agcttgtagc gatgcaaggt actcatcgtc ctacaaattt aaaatttata aaagtgctca 2760
cccatagtgg caattatgag caatggataa atcttagacc tcaaacctgc tgctctcgta 2820
ataaccgctg ttcagttaat gctggtgatg gagaatgaga tattggggga taataagtag 2880
aggttctgtg agaaggcata gagaaaggat atgttggtcc ttcaggaact ccaccaaaca 2940
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ttgtaaaaag acgtcagaaa ttaaacaaat ccatctaatg tcttagcgca cattggaacc 3060
acagattata taatacctca gatgggaaat catctccatt atactggtga ttgttcagaa 3120
cagggctagc acctgggtgc actatttttg gtaattcatt gtcctcagaa ggggcacgcc 3180
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cgtcatctat tggttgccta gatgttccag ccttttctga agctagtcct tgcctccaaa 3300
aggaaattgc atgtataagg aatcaaatga tactgtagta gggtagcctg agtgaagagg 3360
tgggtagtaa agttaacatt cacctctcaa ctattccatt tgcggtttcc atgcctgctt 3420
tatcagaaga atggtccctc aaattcactt cctcttgatg ctggcctcct tgctcgacta 3480
tctgatgatt attgaaaaat tagagatgac atcaagatag gttcaagtaa gcatgttggg 3540
ga 3542
<210> 37
<211> 3542
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 37
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tcagggctag tttggaaggc taaacctagg gagggaaaac cccccacatg taactaaata 540
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ctaactactt ataacatttc ttaagaatat cagacatagg aaagtgatgg cctggaagca 720
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ga 3542
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
gaattgttca tcataaggcg tga 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 50
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gctcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aacctgatca tgagcggaga 120
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<211> 107
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 52
ttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc 60
tgttacccac tttcatccct agtttttgtt ctggattcaa gcatctc 107
<210> 53
<211> 174
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 53
gattaccatc aaatttcaca cacacacaca cacacacacc cacccccccc cacaccccca 60
cgcacgagcg cacacacaca ctatatgtgt gtatatatat taaatattga atttatccta 120
acaatttgga tacccacttt catccctagt ttttgttctg gattcaagca tctc 174
<210> 54
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 54
aaacgtccgc aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat ttgtttacac cacaatataa 60
aatctacctg ttcgctgata agccgttagg ttgactatgt 100
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<211> 218
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 55
tcatgcaatt gtgccaacca aaatatctaa atgagatatt caagactcaa cagaattaaa 60
gtatggaata gggtgtatat acactcaacc attattaaat ggtataatca tctatctata 120
tcactataaa atctaccagt ttaaacttca caaaactcat ctagctaatg gagtagaggt 180
agcatggcct agctgataag ccgttaggtt gactatgt 218
<210> 56
<211> 208
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 56
ggttataagc ccggttgaag tatcaggtta tgtggttgtg gttgatgagt tacttgctgt 60
ccagaacaaa tcttatgata aaccaaccat ccttgtggca aagagtgtca agggagagga 120
agaaatacca gatggagtag ttggtgtaat tacacctgat atgccagatg ttctgtctca 180
tgtgtcagtc cgagcaagga atagcaag 208

Claims (24)

1.一种识别样本中玉米事件4588.757的方法，该方法包括：
将样本与第一引物和第二引物接触；
扩增样本中的核酸，以获得扩增产物；并且
检测玉米事件4588.757中特异于靶序列的扩增产物；
其中，所述玉米事件4588.757包含具有SEQ ID NOS:27和28的多核酸的靶序列，以及包含SEQ ID NO:8所示序列的人工合成的核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一引物包括SEQ ID NO:47所示的核酸序列，所述第二引物包括SEQ ID NO:45所示的核酸序列，并且所述扩增产物包含特异于事件4588.757的靶序列的核酸序列SEQ ID NO:54。
3.一种动物饲料，该动物饲料包括含有编码葡聚糖酶的人工合成的核酸的玉米植物或其部分，其中，所述玉米植物或其部分为：
玉米事件4588.757，包含具有SEQ ID NOS:27和28的多核酸的靶序列，以及包含SEQ IDNO:8所示序列的人工合成的核酸。
4.根据权利要求3所述的动物饲料，其中，所述动物饲料进一步包括饲料补充剂。
5.根据权利要求4所述的动物饲料，其中，所述饲料补充剂为植物材料。
6.根据权利要求5所述的动物饲料，其中，所述植物材料为非转基因植物或工程植物。
7.根据权利要求4所述的动物饲料，其中，所述饲料补充剂包括一种或多种外源酶。
8.根据权利要求7所述的动物饲料，其中，所述一种或多种外源酶包括选自由木聚糖酶、内源葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、植酸酶、淀粉酶和甘露聚糖酶所组成的组中的水解酶。
9.根据权利要求5所述的动物饲料，其中，所述植物材料包括至少一种选自由玉米粉、玉米粒、小麦粉、小麦粒、小麦谷粒、大麦谷粒、大麦粒、大豆粉、大豆饼、高粱谷粒和高粱粒所组成的组中的成分。
10.根据权利要求4所述的动物饲料，其中，所述饲料补充剂包括至少一种选自由可溶性固形物、脂肪和蛭石、石灰岩、普通盐、DL-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、莫能菌素、维生素预混剂、磷酸氢二钙、硒预混剂、氯化胆碱、氯化钠和矿物质预混剂所组成的组中的成分。
11.一种生产动物饲料的方法，该方法包括将玉米植物或其部分与植物材料混合以形成混合物，其中，所述玉米植物或其部分为：
玉米事件4588.757，包含具有SEQ ID NOS:27和28的多核酸的靶序列，以及包含SEQ IDNO:8所示序列的人工合成的核酸。
12.根据权利要求11所述的方法，该方法进一步包括将混合物制粒。
13.根据权利要求12所述的方法，该方法进一步包括向混合物中添加饲料补充剂。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述饲料补充剂包括至少一种外源酶。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述至少一种外源酶是选自由木聚糖酶、甘露聚糖酶、 蛋白酶、植酸酶和纤维素酶所组成的组中的水解酶。
16.一种提高饮食代谢能的方法，该方法包括将玉米植物或其部分与饲料成分混合，其中，所述玉米植物或其部分为：
玉米事件4588.757，包含具有SEQ ID NOS:27和28的多核酸的靶序列，以及包含SEQ IDNO:8所示序列的人工合成的核酸。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述饲料成分包括至少一种选自由玉米粉、玉米粒、小麦粉、小麦粒、小麦谷粒、小麦粗粉、大麦谷粒、大麦粒、大豆粉、大豆皮、干酒糟、大豆饼、高粱谷粒和高粱粒所组成的组中的成分。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述饲料成分包括至少一种选自由可溶性固形物、脂肪和蛭石、石灰岩、普通盐、DL-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、莫能菌素、维生素预混剂、磷酸氢二钙、硒预混剂、氯化胆碱、氯化钠、矿物质预混剂和一种或多种外源酶所组成的组中的成分。
19.一种提高来自谷物的可发酵糖产量的方法，该方法包括：
将来自玉米植物的谷物与来自不同植物的谷物混合以形成混合谷物，其中，所述玉米植物为：
玉米事件4588.757，包含具有SEQ ID NOS:27和28的多核酸的靶序列，以及包含SEQ IDNO:8所示序列的人工合成的核酸；并且
加工所述混合谷物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述不同植物为包括编码至少一种水解酶的人工合成的核酸的工程植物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中该至少一种水解酶选自由木聚糖酶、内源葡聚糖酶、外源葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、内含肽修饰的木聚糖酶、内含肽修饰的内源葡聚糖酶、内含肽修饰的外源葡聚糖酶和内含肽修饰的阿魏酸酯酶、植酸酶和蛋白酶所组成的组中。
22.根据权利要求19所述的方法，其中，所述加工包括至少一种选自由收获、打包、碾磨、磨粉、切削、粒径减小、压碎、制粒、从混合谷物中提取组分、纯化组分或部分混合谷物、提取或纯化淀粉、多糖水解成寡糖或单糖、饲料青贮、发酵、化学转化和化学催化所组成的组中的操作。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，该方法进一步包括生产生化产品。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述生化产品选自由乙醇、丁醇、乳酸、柠檬酸和乙酸所组成的组中。
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