JP5273686B2 - バティアクセラ属フィターゼの変異体 - Google Patents
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Description
本願は、2008年4月18日出願の米国仮出願第61/046,324号に基づく優先権を主張し、この仮出願の全てが参照として本願に組み込まれる。
さらに、フィチン酸はカルシウム、銅、亜鉛等の金属とキレートを形成し、単胃動物において非栄養成分として作用する。
ひとつの実施形態では、酵素組成物は飼料用組成物である。別の実施形態では、酵素組成物は、澱粉加水分解(例えば液状化)プロセスに用いられる。好ましい実施形態では、フィターゼ変異体および/または酵素組成物は、アルコール発酵プロセスに用いられる。別の実施形態では、本願に係るフィターゼから成る酵素組成物に、別の酵素が含まれる。このような別の酵素の例は、グルコアミラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-グルコシダーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、ホスファターゼ、別のフィターゼ、及びこれらの組み合わせが含まれる。
ひとつの実施形態では、宿主細胞は細菌、または植物細胞、または菌類細胞(例えばトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei) 等のトリコデルマの細胞)、または酵母である。
この発明の実施形態では、フィターゼ変異体のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列に対し少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90 %、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%の配列同一性を有する。
この発明の好ましい実施形態では、フィターゼはSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を有する。
ひとつの側面では、相対的高温は少なくとも約20.5℃高い温度である。別の側面では、相対的高温は約20.5℃から約27℃高い温度範囲である。また別の側面では、相対的高温は約20.2℃から約26.8℃高い温度範囲である。
ひとつの実施形態では、フィターゼ変異体にはさらに1以上の別の変異が含まれ、この変異は92A, 164E/S, 171I/V, 192A または 256A/E/Pのいずれかである。別の実施形態では、位置75, 76, 77, 198, 367 または374の1以上の位置における変異がそれぞれ75P, 76R, 77S, 198R, 367Lまたは 374Pであり、フィターゼ変異体にはさらに別の変異が含まれ、この変異は92A, 164E/S, 171V, 192Aまたは256A/E/Pである。
また別の実施形態では、フィターゼ変異体には1以上の別の変異が含まれ、1以上の別の変異の位置は、26, 37, 89, 134, 160, 176, 178, 188, 190, 207, 209, 211, 235, 261, 270, 303または318のいずれかである。
また別の実施形態では、26, 37, 89, 134, 160, 176, 178, 188, 190, 207, 209, 211, 235, 261, 270, 303または318の1以上の位置における変異はそれぞれ、26E, 037Y, 089T, 134I/V, 160R, 176K, 178P, 188N, 190E, 207E/T, 209S, 211C, 235V, 261E, 270K, 303Fまたは318Dのいずれかである。
また別の実施形態では、フィターゼ変異体には1以上の別の変異が含まれ、1以上の別の変異の位置は、1, 10, 11, 38, 66, 71, 81, 92, 109, 111, 119, 120, 121, 141, 142, 152, 155, 193, 214, 239, 245, 248, 255, 268, 277, 283, 285, 287, 288, 293, 296, 314, 337, 345, 350, 364, 371, 372, 396, 399, 406または413のいずれかである。
また別の実施形態では、1, 10, 11, 38, 66, 71, 81, 92, 109, 111, 119, 120, 121, 141, 142, 152, 155, 193, 214, 239, 245, 248, 255, 268, 277, 283, 285, 287, 288, 293, 296, 314, 337, 345, 350, 364, 371, 372, 396, 399, 406または413の1以上の位置における変異がそれぞれ、1S, 10I, 11I, 38S, 66E, 71K, 81A, 92E, 109Q, 111G, 119N, 120L, 121E, 141R, 142L, 152M, 155E, 193Q, 211C, 214V, 235V, 239K, 245D, 248L, 255A, 261E, 268A/T, 270K, 277T, 283D, 285K, 287D, 288A, 293Gまたは296Sのいずれかである。
a) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
b) N37Y, G77S, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
c) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
d) N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256P, A261E, N270K, A374P
e) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
f) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
g) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
h) S75P, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
i) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, P367L, A374P
j) N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171I, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
k) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
l) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
m) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
n) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
o) N37Y, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256E, A261E, N270K, A374P
p) A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
q) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, K207E, A209S, S248L, Q256H, A261E, N270K, A374P
r) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
s) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P; または
t) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P.
ひとつの実施形態では、フィターゼ変異体の配列の変異は、N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374Pである。
別の側面では、本願に開示するフィターゼのいずれかをコードする核酸を含むベクターが提供される。
また別の側面では、本願に開示する核酸および/またはベクターを含む宿主細胞が提供される。
a) 本願に開示するフィターゼ変異体のいずれかをコードする核酸を含むDNA構築体で宿主細胞を形質転換する工程、及び
b) 形質転換された宿主細胞を適切な培地において培養する工程を備える。
ひとつの実施形態では、宿主細胞は菌類細胞、細菌細胞、または植物性細胞である。
ひとつの実施形態では、この組成物にはアルファ-アミラーゼが含まれる。
一側面では、食品または飼料を製造する方法が提供され、この方法には、少なくとも1の固体状の本願に開示するフィターゼまたは酵素組成物を、食品または飼料と混合する工程が含まれる。
また別の側面では、飼料を製造する方法が提供され、この方法には、少なくとも1の液体状の本願に開示するフィターゼまたは酵素組成物を、飼料にスプレーする工程が含まれる。
さらに別の側面では、飼料を製造する方法が提供され、この方法には、少なくとも1の固体状の本願に開示するフィターゼまたは酵素組成物を、飼料と混合する工程が含まれる。
また別の側面では飼料組成物が提供され、この飼料組成物には、i) 少なくとも1の本願に開示するフィターゼまたは酵素組成物、および/またはii) 本願に開示する方法で製造された食品または飼料のいずれかが含まれる。
一側面は、少なくとも1の本願に開示するフィターゼまたは酵素組成物の食品または飼料への使用に関する。
別の側面は、少なくとも1の本願に開示するフィターゼまたは酵素組成物の飼料への使用に関する。
a) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
b) N37Y, G77S, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
c) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
d) N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256P, A261E, N270K, A374P
e) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
f) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
g) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
h) S75P, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
i) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, P367L, A374P
j) N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171I, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
k) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
l) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
m) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
n) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
o) N37Y, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256E, A261E, N270K, A374P
p) A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
q) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, K207E, A209S, S248L, Q256H, A261E, N270K, A374P
r) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
s) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
t) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P。
アミノ酸はその側鎖の構造に応じて、酸性、塩基性、中性で極性、中性で非極性および/または芳香性に分類される。変異体アミノ酸位置における好ましい置換基には、その位置におけるアミノ酸変異体の分類と同様の1以上の分類を備える置換基が含まれる。すなわち、Lys, Arg, 及びHisは塩基性アミノ酸であり、アスパラギン酸及びグルタミン酸は酸性アミノ酸であり、Ser, Thr, Cys, Gln, 及びAsnは中性で極性のアミノ酸であり、Gly, Ala, Val, Ile, 及びLeuは非極性の脂肪族アミノ酸であり、Phe, Trp, 及びTyrは芳香族アミノ酸である。Gly及びAlaは小さなアミノ酸であり、Val, Ile及びLeuは脂肪族アミノ酸である。
「変異体」及び「変異」とは、単にフィターゼ変異体のアミノ酸配列とSEQ. ID NO: 1のアミノ酸配列との間に相違点があることを意味する。「変異体」及び「変異」は、出発物質として用いたSEQ. ID NO: 1のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列または他のフィターゼを意味せず、および/または、変異体を得るためにこれらを物理的に改変、突然変異導入、修飾またはその他の変更を加えたこと意味しない。
本願のフィターゼ変異体(アミノ酸配列及びヌクレオチド配列を含む)は任意の方法により産出させることができる。フィターゼ変異体を産出させる様々な方法は当業者にとって公知であり、そのいくつかを本願に示す。
配列同一性パーセントは、例えば2つの分子中の各配列をアライメントさせ、2つ配列の情報を直接比較し、アライメントさせた2つのアミノ酸配列間で一致するアミノ酸数を数え、その配列の長さで割り算した結果に100を掛けて求めることができる。
この分析に、入手が容易なコンピュータプログラムを用いることができる。このようなプログラムには、Smith and Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2:482-489に記載されたペプチド分析用の局所的相同性アルゴリズムが適用された"Atlas of Protein Sequence and Structure", M.O. Dayhoff et., Suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC中のALIGN, Dayhoff, M.O.等がある。
ヌクレオチド配列同一性を求めるプログラムは、Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (販売元Genetics Computer Group社, Madison, WI) 中に含まれており、例えばSmith とWatermanのアルゴリズムを利用したBESTFIT, FASTA 及びGAPプログラムを用いることができる。これらのプログラムは、製造者が推奨し、上記のWisconsin Sequence Analysis Packageにも記載されているように、初期パラメータを5に設定することにより、容易に使用することができる。配列同一性の決定に適したアルゴリズムの例として、Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990) に記載されたBLASTアルゴリズムが挙げられる。BLAST分析を行うためのソフトウエアは、National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) から自由に入手できる。また、相同性パーセントを決定するためのコンピュータプログラムも容易に入手できる。
通常、発現ベクター、DNA構築体、または形質転換DNAの組み換え発現カセット部位は、他の配列に加え、転写される核酸配列とプロモータとを備える。好ましい実施形態では、発現ベクターは宿主細胞中に非相同DNA断片を導入して発現させることができる。
例えばSEQ ID NO: 2では、SEQ ID NO: 1における位置89にあった元のアラニン(A)のスレオニンによる置換はA89Tと表わされる。置換される位置が特定のアミノ酸を示すことなく指定されている場合、任意のアミノ酸がその位置にあるアミノ酸残基により置換されることを意味する。
フィターゼ変異体が、他のフィターゼとの比較において欠失を有する場合、欠失を「*」で表示する。例えばSEQ. ID NO: 1の位置89の欠失は、A89*と表わす。連続した2以上のアミノ酸の欠失は、例えば(89 - 91)* と表記する。
このシグナル配列の定義は機能面に関するものであり、タンパク質遺伝子のN-末端部位によりコードされ、タンパク質の分泌に関与する全てのアミノ酸配列を包含することを意図している。「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、タンパク質のN-末端部位または前駆体タンパク質のN-末端部位に結合していることが多いが、槽でない場合もある。
すなわち、別のフィターゼ「から誘導された」または「から得られた」フィターゼは、そのフィターゼが別のフィターゼから物理的に誘導され物理的に得られたものである必要は無く、対象とするフィターゼが、別のフィターゼに関する知見から得られた知見又はアイデアを用いて産出されたものであってもよい。
選択可能マーカの非限定的例示として、抗生物質耐性の賦与(例えばハイグロマイシン、ブレオマイシン、またはクロラムフェニコール)、および/または、宿主細胞への栄養的選択性の賦与等、代謝選択性を賦与する遺伝子が挙げられる。
いくつかの実施形態では、親バティアクセラ属フィターゼは、B.アグレスティス、B.ブレンネラーゼ、B. フェラグティアエ、B. ガビニアエ、B. イザルディイ、B. ノアキアエ、及びB. ワームボールディアエに由来する。親バティアクセラ属から得られるか、または由来するフィターゼ、及び親バティアクセラ属フィターゼ酵素に相当する酵素を開示しており、本願に参照として組み込まれるWO 2006/043178が参照される。
いくつかの実施形態では、野生型バティアクセラ属フィターゼ変異体は、SEQ ID NO: 1のポリペプチドに対し、アミノ酸配列同一性を少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%有する。
フィターゼ変異体は少なくとも1のアミノ酸置換、欠失、または挿入を有し、通常アミノ酸置換が好ましい。アミノ酸置換、欠失、または挿入は、フィターゼのペプチドの任意の残基において生じる。本願のフィターゼ変異体は、本願に開示するSEQ ID NO: 1のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を備えていない変異体である。
いくつかの実施形態では、本願のフィターゼ変異体は野生型バティアクセラ属フィターゼ(BP-WT)と比較して少なくとも21.9℃、少なくとも22.4℃、少なくとも22.6℃、少なくとも22.9℃、少なくとも23.2℃、少なくとも23.4℃、少なくとも23.5℃、少なくとも23.5℃、少なくとも23.7℃、少なくとも24.1℃、少なくとも24.2℃、少なくとも24.4℃、少なくとも24.9℃、少なくとも25.0℃、少なくとも25.9℃、少なくとも26.5℃及び少なくとも26.8℃改善された熱安定性差(TD)を有する。
ここで、実施例3に詳しく示すように、比活性度は10mMのフィターゼと1mMのCaC12を含むpH 5.5の200 mM酢酸ナトリウム緩衝液を用いて67℃においてフィターゼを培養することにより測定する。
好ましいベクターのリストは、Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, www at fgsc.net)に示されている。
菌類宿主細胞での使用に適したベクターは、pFB6, pBR322, pUC 18, pUC100, pDONTM201, pDONRTM221, pENTRTM, pGEMTM3Z and pGEMTM4Z等のベクターである。
特に好ましいベクターは、pTREX, pFB6, pBR322, PUCI8, pUCI00 及び pENTR/Dである。細菌細胞中での使用に適したプラスミドは、E.coli中で複製可能なpBR322 及びpUC19、または例えばバシラス(Bacillus) 中で複製可能なpE194等である。
これは、公知のように炭素、窒素または他の栄養素の入手可能性、温度、pH、浸透圧、重金属の存在、インヒビターの濃度、ストレス、またはこれらの組合せ等の環境的要因が変化するためである。いくつかの実施形態では、誘導的または抑制的プロモータは、所定の炭素源の濃度、所定のエネルギー源の濃度、所定の異化生成物の濃度、またはこれらの組合せ等の代謝要素によって誘導または抑制される。
ひとつの実施形態では、プロモータは宿主細胞の天然のプロモータである。例えば、T. リーゼイ(reesei)が宿主細胞の場合、プロモータは、例えばGenBankに受託番号D86235で寄託されたcbh1プロモータ等の、天然のT. リーゼイのプロモータである。
他の好ましいプロモータの例として、A. アワモリ(awamori)及びA.ニガー(niger)グルコアミラーゼ遺伝子由来のプロモータが挙げられる(例えばNunberg et al., (1984) Mol. Cell Biol. 15 4:2306-2315 and Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1581-1585参照)。また、T.リーゼイのxln1遺伝子のプロモータを用いることもできる(例えばEPA 137280Al参照)。
DNA構築体またはベクターの宿主細胞中への導入は、形質転換; 電気穿孔; 核ミクロインジェクション; 形質導入; トランスフェクション (例えばリポフェクション媒介及びDEAE-デキストリン媒介トランスフェクション); リン酸カルシウムDNA共沈法による培養; DNA-被覆微粒子の高速ボンバーメント(bombardment); 及び原形質融合等により行うことができる。
トリコデルマ株中での非相同タンパク質の発現は、USP 6,022,725; USP 6,268,328; Harkki et al (1991); Enzyme Microb. Technol. 13:227-233; Harkki et al., (1989) Bio Technol. 7:596-603; EP 244,234; EP 215,594; 及びNevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes", in MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Eds. Leong and Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) pp. 129 - 148)に記載されている。
また、フザリウム(Fusarium)株の形質転換については、W096100787 及びBajar et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8202 -28212が参照される。
例えばUSP 5,780,708; USP 6,803,499; USP 6,777,589; Fromm et al. (1990) Biotechnol. 8:833-839; Potrykus et al. (1985) Mol.Gen. Genet. 199:169 - 177; Brisson et al., (1984) Nature 310:511-514; Takamatsu et al., (1987) EMBO J 6:307-311; Coruzzi et al., (1984) EMBO J 3:1671-1680; Broglie et al. (1984) Science 224:838-843; Winter J and Sinibaldi RM (1991) Results Probl Cell Differ 17:85-105; Hobbs S or Murry LE (1992) in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York, N.Y., pp 191-196; 及び Weissbach and Weissbach (1988) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York, N.Y., pp 421-463が参照される。
形質転換された細胞は、公知の方法を用い、適切な条件下において振蕩フラスコ培養、実験室、または工業用培養槽における小スケールまたは大スケールの培養(連続式、バッチ式、流加培養を含む)により、生理食塩水及び栄養素(例えば Pourquie, J. et al., BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, pp. 71-86,1988及びIlmen, M. et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306参照)を用いて培養することができる。
この発明では、一般的な市販の培地(例えばYeast Malt Extract (YM) ブロス, Luria Bertani (LB) ブロス、及び Sabouraud Dextrose (SD) ブロス)を用いることができる。菌類細胞に適した培養条件は公知であり、科学技術文献や、American Type Culture Collection and Fungal Genetics Stock Center等の菌類の供給元から知得することができる。
通常、このような分析には、ノーザンブロット、ドットブロット(DNAまたはRNA分析)、RT-PCR (逆転写ポリメラーゼ連鎖反応)、または適切にラベルされたプローブ(核酸コード配列に基づく)を用いたin situハイブリッド化、及び公知のサウザンブロッド及びオートラジオグラフィー等が含まれる。
このような評価方法では、分光光度計を用いて比色分析を行い、濃度が既知の無機リン酸塩(Pi)の対照群、またはフィターゼ活性が既知の酵素との反応により調製した対照群と対比する。フィターゼ活性の1単位は、所定の反応条件下でフィチン酸エステルから1分間に1 μmol のPiを放出させるために必要な酵素サンプルの量と定義される。USP 6,221,644及びUSP 6,139,902も参照することができる。
本願のフィターゼ変異体は、培地または宿主細胞の溶解物から回収することができる。膜結合している場合、適切な界面活性剤溶液(例えばTriton-X 100)または酵素分解によって放出させることができる。
フィターゼの発現に用いた細胞は、例えば凍結融解の繰返し、超音波処理、機械的細胞破砕、または細胞溶解試薬等の様々な化学的または物理的方法によって崩壊させることができる。組み換え細胞タンパク質またはポリペプチド由来のフィターゼを精製することが望ましい。
次に示す方法は、適切な精製方法の例示である:イオン交換カラムによる分画;エタノール沈殿法;逆相HPLC; シリカまたはDEAE等の陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー;クロマト分画法;SDS-PAGE法;硫酸アンモニウム沈殿法;例えばephadex G-75を用いたゲル濾過法;Protein Aセファロースカラムによる混入物の除去;金属キレートカラムによるエピトープ標識されたフィターゼの結合。
様々なタンパク質精製方法を使用することができる。このような方法は公知であり、例えばDeutscher, METHODS IN ENZYMOLOGY, 182 (1990); Scopes, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Springer-Verlag, New York (1982)に記載されている。
精製方法は、例えば使用する産出プロセスの性質や、産出されるフィターゼの性質に応じて選択される。
フィターゼ変異体が細胞中で産出され、細胞溶解物からのフィターゼ変異体の回収が必要となる場合もある。このような場合、公知の方法を用いて、フィターゼ変異体が産出された細胞からフィターゼ変異体を精製する。
このような方法の非限定的例示として、アフィニティクロマトグラフィー法 (例えばTilbeurgh et al., (1984) FEBS Lett. 16:215参照);高溶解能の物質を用いるイオン交換法を含む(例えばMedve et al., (1998) J Chromatography A 808: 153参照)イオン交換クロマトグラフィー法 (例えばGoyal et al., (1991) Biores. Technol. 36:37; Fliess et al., (1983) Eur. J Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:314; Bhikhabhai et al. (1984) J Appl. Biochem. 6:336; 及びEllouz et al., (1987) Chromatography 396:307参照);疎水性相互作用クロマトグラフィー法(例えばTomaz and Queiroz, (1999) J Chromatography A 865: 123参照); 二相分配法(例えばBrumbauer, et al., (1999) Bioseparation 7:287参照);エタノール沈殿法;逆相HPLC;シリカまたはDEAE等の陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー;クロマト分画法;SDS-PAGE法;硫酸アンモニウム沈殿法;および/または、Sephadex G-75を用いたゲル濾過法等が挙げられる。
バッチ式発酵法では、発酵を開始するとき培地の各成分を仕込み、発酵中は培地に手を加えない。すなわち、発酵を開始するとき培地に所定の有機体を植菌する。この方法では、系に追加成分を何も添加せずに発酵を行なう。通常、バッチ式発酵は炭素源の添加に関して「バッチ式」であり、通常はpHや酸素濃度等を制御して行われる。バッチ式発酵において、代謝産物及びバイオマス組成物の組成は、発酵を停止させるまで常に変化する。バッチ式発酵の培地内では、細胞は静的誘導期から高成長対数期を経て、成長速度が低下または停止する静止期に至る。なにも処置しない場合、静止期の細胞はやがて死滅する。通常、対数期の細胞が大部分の最終産品の産出に関与する。
連続培養法では、安定な成長状態を維持するように努める。すなわち、培地の抜き出しによる細胞の減少を、発酵による細胞の増加で補う。連続培養法における栄養素と成長因子の調節方法と、製品の産出速度を最大にする方法は分子生物学の分野では公知である。
SEQ. ID NO: 1に示す野生型フィターゼと比較して、この発明のフィターゼ変異体はこれらの動物が有するプロテアーゼに対し改善された耐性を示し、あるいはこれらの動物の消化管において活性を長時間示す。
本願は食品または飼料を製造する方法に関し、本願発明に係るフィターゼ変異体を食品または飼料と混合することを特徴とする。フィターゼ変異体の液状組成物は、食品または飼料をペレット化してから添加することができる。
いくつかの実施形態では、飼料には次に示す成分の1以上が含まれている。a) 小粒穀粒(例えば小麦、大麦、ライ麦、オート麦、及びこれらの組合せ)および/またはトウモロコシ、ソルガム等の大粒穀粒等の穀物;b) トウモロコシグルテン、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣(DDGS)、小麦フスマ、小麦ミドリング粉、小麦ショーツ、米ぬか、米殻、オート麦殻、 パーム核油、果実の搾りかす等の穀物の副産物;c) 大豆、ヒマワリ、ピーナッツ、ルピン、エンドウ、ソラマメ、コットン、キャノーラ、魚粉、乾燥結晶タンパク質、肉骨粉、ポテトタンパク質、ホエー、コプラ、ゴマ等から得られたタンパク質;d) 植物及び動物から得られた油脂;e) ミネラル及びビタミン;f) 酵素、ベタイン、香味料、精油、 抗生物質成長プロモータ、抗コクシジウム剤、プロバイオティクス、及びプレバイオティクス等の補助的成分。
従来、フィチン酸エステルがアミラーゼに対し阻害作用を示すことが知られている。従って、この発明のフィターゼ変異体を含む酵素組成物を澱粉の加水分解プロセスにおいて用いることにより、アルファ-アミラーゼに対するフィチン酸エステルの阻害作用を低減させることができる。
上記のように、この発明はまた、本願に係るフィターゼの産出に関する。
a) 本願のフィターゼ変異体から成る発現可能な導入遺伝子(expressible transgenes)を備える宿主細胞を調製する工程と、
b) 導入遺伝子有機体を、導入遺伝子の発現に適した条件下で培養する工程と、
c) 培地から有機リン酸塩化合物を回収する工程とから成る。
有機リン酸塩化合物は、フィターゼの性質分析等の多数の用途に用いることができる。いくつかのイノシトールホスフェートは細胞内調節のシグナル分子として含有されており、リサーチ化学薬品として使用することができる。
飼料は、マッシュまたはペレットの形態で製造される。ペレットは、温度を目標値まで上げ、次に飼料をダイに通過させて特定のサイズのペレットにする方法により製造される。次に、脂肪や酵素等の液状添加剤を添加する。ペレットは、移送する前に冷却する。飼料の製造工程にはさらに、ペレット化工程の前に、特に少なくともスチームの使用等の適切な方法による膨張工程、または押出工程等の追加工程が含まれる。
一側面では、本願のアミノ酸配列の、食品または飼料の製造における使用が提供される。別の側面では、この発明の宿主細胞の、食品または飼料の製造における使用が提供される。別の側面では、この発明の発現ベクターまたはシステムの、食品または飼料の製造における使用が提供される。
この発明のフィターゼ変異体は、他の成分または単体と組み合わせて用いることができる。他の成分の例は、本願に既に説明した。これらの成分や、さらに別の成分について説明する。
本願に係る物質を食品及び飼料として使用するか、または食品及び飼料の製造に用いることができる。本願では、「食品」を広い意味で用い、ヒト用の食品及び食物製品だけでなく、動物用の食品(すなわち飼料)も意味する。「飼料」という用語は、家畜の飼育において動物に与える製品の意味で用いる。好ましい側面では、食品または飼料をブタ、家禽、魚等の単胃動物に与える。
本願に係る物質を食品または飼料の原材料に用いることができる。
単胃動物用の飼料組成物には、通常、フィチン酸エステルを含む植物性物質を含有する組成物が含まれている。このような組成物には、コーンミール、大豆ミール、菜種ミール、綿実ミール、トウモロコシ、小麦、大麦、及びソルガムベース飼料が含まれる。
またこの発明の別の側面は、食品原材料の製造方法に関する。動物の飼料の製造方法は上記のとおりである。フィターゼ変異体を固体状の配合物、またはプレミックス等の飼料用添加剤の形態で添加することができる。固体状の配合物は、混合工程の前または混合工程中に添加し、液状の場合はペレット化工程の後に添加する。
この発明の産品および/または化合物は、単独で用いられるか組成物として用いられるかにかかわらず、適宜賦形して用いることができる。また、本願により産出されたフィターゼ(すなわち食品原材料、機能性食品原材料または医薬品原材料等の原材料)は、適宜賦形して用いることができる。
<実施例で使用する酵素の命名>
フィターゼBP-17(BP 17と呼ぶことがある)は、例えばPCT出願WO 2008/097619に開示されたフィターゼであり、Danisco A/Sから入手することができる。そのアミノ酸配列をSEQ ID NO:5に示す。
Phyzyme XP − Danisco A/S社製のフィターゼである。
Natuphos − BASF社製のフィターゼである。
Ronozyme P − Novozymes社製のフィターゼである。
<実施例1. フィターゼ酵素の精製>
フィターゼ酵素の精製は、フィターゼ酵素のN-末端に融合した6His-tagを用いて行った。6His-tagフィターゼ酵素をコードするプラスミドで形質転換したB.スブチリスを、ネオマイシン20 mg/lを添加した標準LB培地を用い、振蕩フラスコ中で37℃において160 rpmで撹拌しながら培養した。この段階で、培養培地のフィターゼ活性が顕著に増加した。
約2リットルの培養ブロスのpHを8.0に調整し、濾過した後、Ni-NTAセファロースレジン(Qiagen社)10mlを充填したカラムに通した。このカラムを、OD280が0.05より低くなるまで、pH 8.0の300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl緩衝液で洗浄した。次に、イミダゾールヒドロクロリド250 mMを含む同緩衝液を用いて、結合したフィターゼを流出させた。
流出液をpH 5.0の50 mM酢酸ナトリウムに対し透析し、4℃で保管した。この酵素溶液を、pH 5.0の20 mM酢酸ナトリウム緩衝液で平衡化したResource Sカラムに通し、10カラム容量の0-1 M NaCl塩勾配を用いて溶出させた。任意に、溶出液をpH 5.0の20 mM酢酸ナトリウム緩衝液に対し透析した後、4℃で保管した。
マイクロタイタープレートを用いてフィターゼ活性を評価した。反応液の総容積は100マイクロリットルで、後述する緩衝液、フィターゼ10mM、塩化カルシウム1 mM、及び0.05 % (w/v)のPluronic F68が含まれていた。反応は、所定の温度、例えば37℃から90℃の間の温度で、30分間行った。
この分析液には、次の最終濃度となる化合物が含まれていた:1 M Tris/HCl, pH 7.0, 0.01% (v/v) Triton X-100, 0.025 mM ADHP (MoBiTec社, Gottingen, Germany), 0.2 U/ml マルトースホスホリラーゼ, 0.25 mM マルトース, 1.25 U/ml グルコースオキシダーゼ, 0.25 U/ml ホースラディッシュペルオキシダーゼ, 1 mM EDTA, 0.35 mg/ml BSA。
反応は、2700 U/mlのカタラーゼ水溶液30 μlを添加することにより停止させた。次に535 nmの励起波長を用いて、595 nmの蛍光を測定した。リン酸塩の量は、濃度既知のリン酸塩溶液による検量線を用いて求めた。1酵素単位は、リン酸塩放出量1マイクロモル/分と定義される。
実施例1の方法により精製した酵素を用いて、BP-WTとフィターゼ酵素変異体の比活性度を測定した。
酵素溶液を希釈緩衝液(50 mM 酢酸ナトリウム, 0.05% Pluronic F-68, 1 mg/ml BSA)で希釈した。5 μlから10 μlの酵素溶液のサンプルを含む総容積80 μlのフィチン酸エステル分析溶液を培養した。
分析溶液には以下の最終濃度となる緩衝液、基質、及び塩が含まれていた:200 mM 酢酸ナトリウム, pH 5.5, 10 mM フィチン酸エステル, 1 mM CaCl2, 0.05 % (w/v) Pluronic F-68。
BP-WTフィターゼの分析溶液は37℃で30分間培養し、フィターゼ酵素変異体の分析溶液は67℃または80℃で30分間培養した。
この分析液には、次の最終濃度となる化合物が含まれていた:1 M Tris/HCl, pH 7.0, 0.01% (v/v) Triton X-100, 0.025 mM ADHP (MoBiTec社, Gottingen, Germany), 0.2 U/ml マルトースホスホリラーゼ, 0.25 mM マルトース, 1.25 U/ml グルコースオキシダーゼ, 0.25 U/ml ホースラディッシュペルオキシダーゼ, 1 mM EDTA, 0.35 mg/ml BSA。
反応は、2700 U/mlのカタラーゼ水溶液30 μlを添加することにより停止させた。次に535 nmの励起波長を用いて、595 nmの蛍光を測定した。リン酸塩の量は、濃度既知のリン酸塩溶液による検量線を用いて求めた。1酵素単位は、リン酸塩放出量1マイクロモル/分と定義される。
フィターゼ変異体は、フィターゼタンパク質をコードするDNAの様々な突然変異生成法、例えばカセット、PCR突然変異生成、またはその他の突然変異生成法等の周知の方法を用いて調製した。これらの方法には、例えばMorinaga et al., Biotechnology 2:646-649 (1984); in Nelson and Long, Analytical Biochemistry 180:147-151(1989)、あるいはWO 92/18645に開示されたError Threshold Mutagenesis法等の、上記に示した方法が含まれる。PCR突然変異生成法の他の好ましい方法は、Cadwell and Joyce, PCR Methods Appl. 3:136-140(1994)に開示されている。
フィターゼ変異体の熱安定性は、フィターゼ変異体の不活性化温度により評価した。不活性化温度は、フィターゼ酵素を異なる温度においてpH 5.5で10分間培養し、次に37℃で60分間培養した後の残留活性により評価した。残留活性は、pH 3.5 、37℃において60分間フィターゼ活性を測定して求めた。
不活性化温度は、室温において同一条件下で同一時間培養した後の残留活性と比較して、残留活性が50%になる温度と定義される。活性測定データを外挿または内挿することにより、残留活性が50%になる温度を求めた。異なる2種の酵素の不活性化温度の差を計算することにより、単位℃で表す熱安定性差 (TD)を求めた。
フィターゼの熱活性を、その温度依存性から評価した。フィターゼ熱活性の温度依存性の指標として、T50を設定した。T50とは、そのフィターゼ変異体の最適温度における基質の酵素代謝回転(enzymatic turnover)と比較して、温度を除き同じ条件で反応させたときの基質の総酵素代謝回転が50%になる温度である。
フィターゼ熱活性の温度依存性は、実施例2に示した条件下でpH 5.5及び種々の温度においてフィターゼ酵素を培養することにより測定した。T50の値は、測定データの内挿及び外挿により求めた。異なる2種の酵素のT50値の差を計算することにより、単位℃で表す熱活性差 (TAD)をより求めた。
<実施例8−イントロダクション>
この発明は、特に飼料用酵素として有用で有効な性質を備える新規なフィターゼを提供できるという優れた効果を奏する。特に、この発明は本願に開示する単離および/または精製された新規なフィターゼポリペプチド、または機能性断片、またはこれらの変異体または修飾された形態、またはこれらの修飾された形態に関する。この発明はまた、本願のフィターゼをコードする核酸配列に関する。
さらに、フィターゼは高い比活性度を有する必要があり、またペレット飼料等の飼料を製造する際に一般的に用いられている高温度に耐えることが可能な、高い熱安定性を有することが好ましい。
<Phyzyme XP, Natuphos,及び Ronozyme Pと比較した、バティアクセラ(Buttiauxella)由来フィターゼ変異体BP-17, BP-110, BP-111, 及びBP-112の、pH 2におけるペプシン耐性>
<使用した材料と方法>
<緩衝液>
ペプシン培養緩衝液: 0.1 Mグリシン-HCl,pH 2.0、BSA 3 mg/ml、 無水塩化ナトリウム 2.9 mg /mL、 塩化カルシウム 0.73 mg/mL。
ペプシン溶液については、ペプシン (Sigma P-7000, 10000 U/mg 、27 mg/mlに相当)を500, 1000, 3000, 6000, または 10000 U/ml含む培養緩衝液をそれぞれ調製した。
1ペプシン単位は、ヘモグロビン(Food Chemical Codex社)を基質に用いたTCA溶解性製品としてpH 2.0で37℃において測定したとき、ΔOD280の増加が毎分0.001となる量の酵素と定義される。
フィターゼ分析用緩衝液:250 mM緩衝酢酸溶液, pH 5.5
BSAを含むフィターゼ分析用緩衝液:BSAを3 mg/ml含む250 mM緩衝酢酸溶液, pH 5.5
全てのフィターゼ酵素は同様にして準備した:フィターゼ酵素を含む6種のサンプルを調製した(各2件):4種のサンプルについては、緩衝液中のペプシン濃度を増加させ (pH 2)、1種のサンプルについては、ペプシン無添加で、培養緩衝液(pH2)のみを用い、1種のポジティブ・コントロールサンプルは、BSAを含む分析用緩衝液中にフィターゼを含有していた(pH 5.5)。
<ペプシン耐性>
全てのバティアクセラ由来の変異体は、pH 2においてペプシンに対し優れた安定性を示した。これに対し、Natuphosの活性は、ペプシン濃度が500 U/mlのとき大幅に低下し、その後さらに活性が低下し、ペプシン濃度3000 U/mlにおいて約45%で一定になることが認められた。
Ronozyme Pの場合はさらに劣っており、ペプシン濃度が500 U/mlのとき20%まで低下した(Fig 6A と Table 4参照)。
A:全ての測定点、 B: 70%以上の値を示した測定点
この発明のバティアクセラ由来のフィターゼは、pH 2、37℃、ペプシン10000 U/mlにおいて2時間培養したとき、ペプシンを含まないサンプルを同一条件下で培養したときの活性と比較して、活性を75%以上保持している。
<酵素活性のリカバリーの測定>
<使用した材料と方法>
酵素が添加された小麦をペレット化した後の、酵素活性のリカバリーを測定した。顆粒化した小麦に酵素をスプレーし、乾燥した後に飼料と混合し、次いでペレット化した。
ペレット化する前の、マッシュ状態の飼料中のフィターゼ活性は、5単位/gである。
結果をFigure 8から10に示す。
Figure 8に、この発明に係る3種のフィターゼ変異体のペレット化試験結果を示す。これらの酵素を全粒小麦粉に添加し、水分が約10%になるまで乾燥させた。ここで、BP 17 var 111のペレット化後のフィターゼ活性のリカバリーは、90℃において90%であり、これに対しBP 17の90℃におけるリカバリーは19%であった。
比較用の、E coli由来フィターゼであるPhyzyme XPを全粒小麦粉に添加した。結果をFigure 9に示す。Phyzyme XPを全粒小麦粉に添加した3バッチに関しては、90℃でペレット化した後のフィターゼ活性のリカバリーは47%である。
全粒小麦粉に添加された本願発明のバティアクセラ由来のフィターゼ変異体は、90℃でのペレット化の後、70%を超えるリカバリーを示した。
<フィターゼによるフィチン酸分解試験結果>
培養には、3種類の緩衝液を用いた。これらの緩衝液は以下の通りである。
250mMアセテート、pH 5.5;
250 mM アセテートM、pH 3.5;
250 mM HCl グリシン、pH 2.5.
培養に用いた全てのフィターゼは、分析用緩衝液により酵素濃度が1 U/mlになるまで希釈した。
培養に用いたフィチン酸エステル基質溶液は、1%フィチン酸エステル溶液(1g/100ml 緩衝液)である。
この基質溶液は、反応中のpHを一定にするため、フィターゼの希釈に用いたものと同じ緩衝液を用いて調製した。
反応は、1M HCl溶液を添加して停止させた。
培養時の容積は、1.5 または 3.0 mlのフィチン酸エステル + 0.25 ml 酵素 + 37℃の3.25 または 1.75 ml 緩衝液、全容積5.0 mlであった。
ここから、異なる時間毎 (0, 30, 60及び90分) に、0.5 mlの少量のサンプルを採取した。
<フィチン酸エステル及びイノシトール異性体の高速イオンクロマトグラフィー(HPIC)による分析>
この測定方法は、SkoglundとCarlssonらにより開示されている(J. Agric. Food Chem., 45(1997), 451-436 5. J. Agric. Food Chem., 46 (1998), 1877-1882; 及び J. Agric. Food Chem., 49(2001), 11695-1701)。使用するカラムは、4 x 50 mmのプレ-カラムを備える、Dionex社の強アニオン交換体(4 x 250mm)である。Solvent AはMilliQ水、Solvent Bは1N HCl 水溶液である。勾配は、30分間2.5%から49% B、次いで流量0.8 ml/分における50%でのアイソクラティック3分間、及び2.5%でのアイソクラティック2分間である。各測定は35分間である。フィターゼは理論的に大量のIP異性体を産出し得ないため、測定時間を25分間に短縮することもできる。
溶出物を、流量が0.4 ml/分で0.1% Fe(NO3)3 . 9HO2及び2% 過塩素酸(HClO4)を含む水溶液を用いて、インラインで誘導体化した。フィチン酸エステル及びIP異性体は、290 nmのポジティブピークにより検出した。これは、フィチン酸エステル-Fe3+-ClO4 - 複合体の形成による。60%過塩素酸は、Sigma社から購入した。
結果をFigure 11〜14に示す。
この発明の全ての酵素は好ましい性質を示した。この発明のフィターゼは、試験した全てのpH値においてフィチン酸エステルを分解した。
この発明の酵素はpH 5.5において高い活性を示す。
BP 110及びBP 111は、pH 2.5及び3.5において同様の活性を示す。
BP 110及びBP 111はpH 2.5及び3.5の両者において、培養中に添加されたフィチン酸エステルを90分後に全て分解する。
BP112はpH 2.5及び3.5の両者において、培養中に添加されたフィチン酸エステルを90分後に75%分解する。
<フィチン酸測定:フィチン酸含有量>
5%スラリー(乾燥サンプルの場合)のpHをpH 10に調整することにより、フィチン酸をサンプルから抽出し、次にイオン交換カラムを用いたHPLCでフィチン酸を測定した。NaOH濃度勾配システムを用いて、フィチン酸をカラムから流出させた。流出液中のフィチン酸濃度を、フィチン酸の検量線と比較して求めた。
異なる熱安定性BP変異体フィターゼ、すなわちBP110, BP111及びBP112による全粒コーン液状化物のフィチン酸の加水分解に及ぼす温度の影響を調べた。全粒コーン液状化物は、従来の乾燥粉粒液状化プロセス(供給源: Illinois River Energy社, Monroe, Illinois)による液状化物を用いた。
32 % ds (乾燥固形分)全粒コーンdsコーン液状化物のpHをpH 5.0に調整し、85℃から89℃に保たれた水浴中に入れた。温度が一定になった後、BP-フィターゼを4.0 FTU/gds.コーンとなるように添加した。20分後にサンプルを採取し、10 mM水酸化ナトリウム(1から10倍に希釈)を添加して酵素反応を停止させた。希釈したサンプルを濾過し、HPLCを用いてサンプル中のフィチン酸エステル誘導体の分布(IP1からIP6)を分析した。
Figure 15及び16に示すHPLCクロマトグラムから明らかなように、3種のフィターゼの変異体はいずれも、85℃より高温においてフィチン酸の加水分解を触媒した。
全粒コーン液状化物中のフィチン酸含有量(フィチン酸(IP6) 及び中間体のIP1からIP5)は1.7% ds.コーンであり、Figure 15のデータは、95 %を超えるフィチン酸が、現状の液状化条件下で熱安定性フィターゼにより加水分解されたことを示している。特に、89℃で培養したサンプルのHPLCのデータから、BP-111は他の2種のフィターゼ変異体より高い熱安定性を示すことが分かる(Figure 16のBP-110及びBP-112参照)。
この発明の特徴を、箇条書きにしてまとめた。
1. フィターゼ活性を備えるとともに、野生型バティアクセラ属フィターゼ(SEQ ID NO: 1) とは異なるアミノ酸配列を備えるフィターゼ変異体であって、このフィターゼ変異体のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 1のアミノ酸と比較して少なくとも1の変異を有し、前記少なくとも1の変異がSEQ ID NO: 1の位置75, 76 及び374から選択される位置にあり、前記少なくとも1の変異の各々は同一または異なっており、置換、欠失、または挿入のいずれかである。
2. 前記少なくとも1の変異が、S75, Q76及びA374から成る群から選択される、1,2,または3つの位置における変異である、第1項に記載のフィターゼ変異体。
3. 前記少なくとも1の変異が、S75P, Q76R 及びA374Pから成る群から選択される変異である、第2項に記載のフィターゼ変異体。
4. 前記少なくとも1の変異に、さらにN37, G77, H160, F164, T171, S188, G192, K198, A235, Q256 および/またはP367から成る群から選択される1以上の位置における変異が含まれる、第1項から第3項に記載のフィターゼ変異体。
5. 前記少なくとも1の変異が、N37Y, G77S, H160R, F164E, F164S, T171V, T171I, S188P, G192A, K198R, A235V, Q256P, Q256A, Q256Eおよび/またはP367Lから成る群から選択される少なくとも1の変異から成る、第4項に記載のフィターゼ変異体。
6. 前記少なくとも1の変異に、さらにA89, D92, T134, F164, T176, A178, K207, A209, S248, Q256, A261および/またはN270から成る群から選択される1以上の位置における変異が含まれる、第1項から第5項に記載のフィターゼ変異体。
7. 前記少なくとも1の変異が、A89T, D92A, T134I, F164S, T176K, A178P, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261Eおよび/またはN270Kから成る群から選択される1以上の位置における変異から成る、第6項に記載のフィターゼ変異体。
8. 前記フィターゼ変異体が、SEQ ID NO: 2の配列を備える、第7項に記載のフィターゼ変異体。
9. 前記フィターゼ変異体が、下記のa)〜t)から成る群から選択される変異を含む配列を備える、第1項から第8項に記載のフィターゼ変異体。
a) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
b) N37Y, G77S, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
c) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
d) N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256P, A261E, N270K, A374P
e) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
f) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
g) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
h) S75P, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
i) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, P367L, A374P
j) N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171I, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
k) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
l) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
m) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
n) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
o) N37Y, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256E, A261E, N270K, A374P
p) A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
q) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, K207E, A209S, S248L, Q256H, A261E, N270K, A374P
r) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
s) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P; and
t) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P.
10. 第1項から第9項のいずれかに記載のフィターゼ変異体に対し最小配列同一性パーセントおよび/または最小相同性パーセントを有するフィターゼ変異体であって、前記最小配列同一性パーセントおよび/または最小相同性パーセントが少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも93%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%から成る群から選択されるフィターゼ変異体。
11. SEQ ID NO: 1のフィターゼに対し少なくとも1の改善された性質を有する第1項から第10項のいずれかに記載のフィターゼ変異体であって、前記改善された性質が、改善された比活性度、1以上のプロテーゼに対する感受性の低下、改善された熱活性、改善された熱安定性、改善された酸性pH下での安定性、改善された塩基性pH下での安定性、改善された飼料加工時の安定性から成る群から選択されるフィターゼ変異体。
12. 前記少なくとも1の改善された性質が、ヒト、アルパカ、バイソン、ラクダ、ウシ、ニワトリ、家禽、チンチラ、シカ、ロバ、アヒル、魚、カエル、ヤギ、ガチョウ、家禽、ウマ、ラマ、ミンク、ラバ、ダチョウ、ハト、トナカイ、ヒツジ、 貝、ブタ、七面鳥、ヤク、水牛、ネコ、チンパンジー、イヌ、フェレット、アレチネズミ、金魚、モルモット、ハムスター、サル、インコ、爬虫類、齧歯動物から成る群から選択される動物において見出される1以上のプロテアーゼに対する感受性の低下である、第10項のフィターゼ変異体。
13. SEQ ID NO: 1のフィターゼと比較して、ヒト、アルパカ、バイソン、ラクダ、ウシ、ニワトリ、家禽、チンチラ、シカ、ロバ、アヒル、魚、カエル、ヤギ、ガチョウ、家禽、ウマ、ラマ、ミンク、ラバ、ダチョウ、ハト、トナカイ、ヒツジ、 貝、ブタ、七面鳥、ヤク、水牛、ネコ、チンパンジー、イヌ、フェレット、アレチネズミ、金魚、モルモット、ハムスター、サル、インコ、爬虫類、齧歯動物から成る群から選択される動物の消化管において長期間活性を有する、第1項から第11項のいずれかに記載のフィターゼ変異体。
14. 第1項から第13項のいずれかに記載のフィターゼ変異体をコードする核酸。
15. 第14項に記載の核酸を含むベクター。
16. 第14項に記載の核酸を含む宿主細胞。
17. 第1項から第13項のいずれかに記載のフィターゼ変異体の少なくとも1を含む酵素組成物。
18. 第1項から第13項のいずれかに記載のフィターゼ変異体の少なくとも1を含む酵素組成物であって、澱粉の液状化に有用な酵素組成物。
19. 第1項から第13項のいずれかに記載のフィターゼ変異体を宿主細胞中に産出させる方法であって、
a) 第1項から第13項のいずれかに記載のフィターゼ変異体をコードする核酸を含むDNA構築体で宿主細胞を形質転換する工程、及び
b) 形質転換された宿主細胞を適切な培地において培養する工程を備える方法。
20. 宿主細胞が菌類細胞、細菌細胞、または植物性細胞である、第19項に記載の方法。
21. フィターゼ活性を備えるとともに、野生型バティアクセラ属フィターゼ(SEQ ID NO: 1) のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を備えるフィターゼ変異体であって、このフィターゼ変異体のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 1のアミノ酸と比較して少なくとも1の変異を有し、このフィターゼ変異体は位置70, 193, 197, 221 及び407の内の少なくとも1以上の位置に変異を有する、フィターゼ変異体。好ましくは、このフィターゼ変異体は位置70, 193, 197, 221 及び407の内の少なくとも2以上の位置に変異を有する。好ましくは、このフィターゼ変異体は位置70, 193, 197, 221 及び407の内の少なくとも3以上の位置に変異を有する。好ましくは、このフィターゼ変異体は位置70, 193, 197, 221 及び407の内の少なくとも4以上の位置に変異を有する。好ましくは、このフィターゼ変異体は少なくとも位置70, 193, 197, 221 及び407に変異を有する。
22. フィターゼ変異体が少なくともN70Y, H193R, F197E, S221P及びA407Pの変異を有する、第21項に記載のフィターゼ変異体。
23. 食品または飼料を製造する方法であって、第1項から第13項または第21項または第22項のいずれか1項に記載のポリペプチド、または第17項または第18項に記載の酵素組成物、または第19項または第20項に記載の方法で製造された物と、別の食品または飼料原料とを混合する工程を含む、食品または飼料を製造する方法。
24. 食品または飼料を製造する方法であって、第1項から第13項または第21項または第22項のいずれか1項に記載のポリペプチド、または第17項または第18項に記載の酵素組成物、または第19項または第20項に記載の方法で製造された物を、液体の状態で前記食品または飼料にスプレーする工程を含む、食品または飼料を製造する方法。
25. 食品または飼料を製造する方法であって、第1項から第13項または第21項または第22項のいずれか1項に記載のポリペプチド、または第17項または第18項に記載の酵素組成物、または第19項または第20項に記載の方法で製造された物を、固体の状態で前記食品または飼料と混合する工程を含む、食品または飼料を製造する方法。
26. 飼料を製造する方法であって、第1項から第13項または第21項または第22項のいずれか1項に記載のポリペプチド、または第17項または第18項に記載の酵素組成物、または第19項または第20項に記載の方法で製造された物と、別の食品または飼料原料とを混合する工程を含む、飼料を製造する方法。
27. 飼料を製造する方法であって、第1項から第13項または第21項または第22項のいずれか1項に記載のポリペプチド、または第17項または第18項に記載の酵素組成物、または第19項または第20項に記載の方法で製造された物を、液体の状態で前記飼料にスプレーする工程を含む、飼料を製造する方法。
28. 飼料を製造する方法であって、第1項から第13項または第21項または第22項のいずれか1項に記載のポリペプチド、または第17項または第18項に記載の酵素組成物、または第19項または第20項に記載の方法で製造された物を、固体の状態で前記飼料と混合する工程を含む、飼料を製造する方法。
29. i) 第1項から第13項または第21項または第22項のいずれか1項に記載のフィターゼ、または第17項または第18項に記載の酵素組成物、または第19項または第20項に記載の方法で製造された物、および/またはii) 第23項から第28項記載の方法で製造された食品または飼料の何れかから成る、食品または飼料組成物。
30. 第1項から第13項または第21項または第22項のいずれか1項に記載のフィターゼ、または第17項または第18項に記載の酵素組成物、または第19項または第20項に記載の方法で製造された物、および/またはii) 第23項から第28項記載の方法で製造された飼料の何れかから成る、飼料組成物。
31. 第1項から第13項または第21項または第22項のいずれか1項に記載のフィターゼポリペプチド、または第17項または第18項に記載の酵素組成物、または第19項または第20項に記載の方法で製造された物の、食品または飼料における使用。
32. 第1項から第13項または第21項または第22項のいずれか1項に記載のフィターゼポリペプチド、または第17項または第18項に記載の酵素組成物、または第19項または第20項に記載の方法で製造された物の、飼料における使用。
33. 動物の排泄物中のリンの量を低下させる方法であって、第1項から第13項または第21項または第22項のいずれか1項に記載のフィターゼポリペプチド、または第17項または第18項に記載の酵素組成物、または第19項または第20項に記載の方法で製造された物、または第29項または第30項に記載の飼料を動物に与え、フィターゼの量が飼料中のフィチン酸エステルを分解するために十分な量であることを特徴とする方法。
34. 第1項から第13項または第21項または第22項のいずれか1項に記載のフィターゼポリペプチド、または第17項または第18項に記載の酵素組成物、または第19項または第20項に記載の方法で製造された物、または第29項または第30項に記載の飼料の、前記フィターゼポリペプチドを与えられた動物の排泄物中のリンの量を低下させるための飼料の製造における使用。
Claims (32)
- フィターゼ活性を備えるとともに、野生型バティアクセラ属フィターゼ(SEQ ID NO: 1) のアミノ酸配列に対して、下記のa)〜s)
a) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
b) N37Y, G77S, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
c) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
d) N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256P, A261E, N270K, A374P
e) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
f) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
g) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
h) S75P, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
i) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, P367L, A374P
j) N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171I, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
k) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
l) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
m) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
p) A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P; または
s) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
のいずれかの変異を有するフィターゼ変異体。 - フィターゼ活性を備えるとともに、野生型バティアクセラ属フィターゼ(SEQ ID NO: 1) のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を備えるフィターゼ変異体であって、前記フィターゼ変異体のアミノ酸配列はSEQ ID NO: 1に対し、下記のa)〜s):
a) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
b) N37Y, G77S, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
c) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
d) N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256P, A261E, N270K, A374P
e) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
f) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
g) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
h) S75P, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
i) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, P367L, A374P
j) N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171I, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
k) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P
l) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
m) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
p) A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P; または
s) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P
のいずれかの変異を有するフィターゼ変異体であって、
前記フィターゼ変異体は、野生型バティアクセラ属フィターゼ(SEQ ID NO: 1)に対する最小配列同一性パーセントが少なくとも90%であり(ここで、前記配列同一性パーセントは、2つの配列を適切にアライメントさせたときに、2つの配列間で同一となる残基数のパーセンテージを表し)、
前記フィターゼ変異体の不活性化温度が、野生型バティアクセラ属フィターゼ(SEQ ID NO: 1)の不活性化温度よりも22.4℃以上高い(ここで、前記不活性化温度は、フィターゼ酵素をpH 5.5で10分間培養する温度であって、かつ該培養の後37℃で60分間培養した後の残留活性が50%になる温度である)、フィターゼ変異体。 - 請求項1又は2のいずれか1項に記載のフィターゼ変異体をコードする核酸。
- 請求項3に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項3に記載の核酸、又は、請求項4に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 宿主細胞中で請求項1又は2のいずれか1項に記載のフィターゼ変異体を産出させる方法であって、
a) 請求項1又は2のいずれか1項に記載のフィターゼ変異体をコードする核酸を含むDNA構築体で宿主細胞を形質転換する工程、及び
b) 形質転換された前記宿主細胞を適切な培地において培養する工程を備える方法。 - 前記宿主細胞が菌類細胞、細菌細胞、または植物性細胞である、請求項6に記載の方法。
- 請求項6又は7に記載の方法で産出されたフィターゼ変異体。
- 請求項1、2又は8のいずれか1項に記載のフィターゼ変異体と、
グルコアミラーゼ、アルファ-アミラーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、シクロデキストリングリコトランスフェラーゼ、リパーゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、別のフィターゼ、及びこれらの組み合わせの内の1以上とから成る、酵素組成物。 - アルファ-アミラーゼが含まれる、請求項9に記載の酵素組成物。
- 澱粉液化、澱粉糖化、澱粉発酵または澱粉同時糖化-発酵における、請求項1、2若しくは8のいずれか1項に記載のフィターゼ変異体、又は、請求項9若しくは10に記載の酵素組成物の使用。
- 前記澱粉液化、澱粉糖化、澱粉発酵または澱粉同時糖化-発酵が、発酵アルコールの製造を目的とする、請求項11に記載の使用。
- アルコールがエタノールまたはブタノールである、請求項12に記載の使用。
- 基質を澱粉液化、澱粉糖化、澱粉発酵または澱粉同時糖化-発酵させる、請求項11から13のいずれか1項に記載の使用。
- 前記基質が澱粉から成る、請求項14に記載の使用。
- 前記基質に穀粒または穀物が含まれる、請求項14又は15に記載の使用。
- 前記穀粒または穀物が、小麦、大麦、ライ麦、オート麦、 トウモロコシ、ソルガム、トウモロコシグルテン、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣 (DDGS)、小麦フスマ、小麦ミドリング粉、小麦ショーツ、米、 オート麦殻、 パーム核油、果実の搾りかす、またはこれらの組合せである、請求項16に記載の使用。
- 前記米に米ぬか、または米殻が含まれる、請求項17に記載の使用。
- 請求項1、2又は8のいずれか1項に記載のフィターゼ変異体の、食品または飼料における添加剤としての使用。
- 請求項1、2又は8のいずれか1項に記載のフィターゼ変異体の、食品または可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣(DDGS)を含む飼料における添加剤としての使用。
- 食品または飼料を製造する方法であって、請求項1、2若しくは8のいずれか1項に記載のフィターゼ変異体、又は、請求項9若しくは10に記載の酵素組成物の少なくとも1と、食品または飼料の原料とを混合して、食品または飼料を製造する工程を含む方法。
- 食品または飼料を製造する方法であって、液体状の請求項1、2若しくは8のいずれか1項に記載のフィターゼ変異体、又は、請求項9若しくは10に記載の酵素組成物の少なくとも1を、食品または飼料の原料にスプレーして、食品または飼料を製造する工程を含む方法。
- 食品または飼料を製造する方法であって、固体状の請求項1、2若しくは8のいずれか1項に記載のフィターゼ変異体、又は、請求項9若しくは10に記載の酵素組成物の少なくとも1と、食品または飼料の原料とを混合して、食品または飼料を製造する工程を含む方法。
- 飼料を製造する方法であって、請求項1、2若しくは8のいずれか1項に記載のフィターゼ変異体、又は、請求項9若しくは10に記載の酵素組成物の少なくとも1と、食品または飼料の原料とを混合して、飼料を製造する工程を含む方法。
- 飼料を製造する方法であって、液体状の請求項1、2若しくは8のいずれか1項に記載のフィターゼ変異体、又は、請求項9若しくは10に記載の酵素組成物の少なくとも1を、飼料の原料にスプレーして、飼料を製造する工程を含む方法。
- 飼料を製造する方法であって、固体状の請求項1、2若しくは8のいずれか1項に記載のフィターゼ変異体、又は、請求項9若しくは10に記載の酵素組成物の少なくとも1と、飼料の原料とを混合して、飼料を製造する工程を含む方法。
- 食品用または飼料用の組成物であって、i) 請求項1、2若しくは8のいずれか1項に記載の少なくとも1のフィターゼ変異体、又は、請求項9若しくは10に記載の酵素組成物、および/またはii) 請求項21から26のいずれか1項に記載の方法で製造された食品または飼料のいずれかが含まれる、食品用または飼料用の組成物。
- 飼料用の組成物であって、i) 請求項1、2若しくは8のいずれか1項に記載の少なくとも1のフィターゼ変異体、又は、請求項9若しくは10に記載の酵素組成物、および/またはii) 請求項21から26のいずれか1項に記載の方法で製造された食品または飼料のいずれかが含まれる、飼料用の組成物。
- 請求項1、2若しくは8のいずれか1項に記載の少なくとも1のフィターゼ変異体、又は、請求項9若しくは10に記載の酵素組成物の、食品または飼料における使用。
- 請求項1、2若しくは8のいずれか1項に記載の少なくとも1のフィターゼ変異体、又は、請求項9若しくは10に記載の酵素組成物の、飼料における使用。
- 家畜の排泄物に含まれるリンの濃度を低減させる方法であって、請求項1、2若しくは8のいずれか1項に記載の少なくとも1のフィターゼ変異体、又は、請求項9若しくは10に記載の酵素組成物、または請求項21から26のいずれか1項に記載の方法で製造された飼料、または請求項27または28に記載の組成物を家畜に与え、前記フィターゼの量が前記飼料中に含有されるフィチン酸塩を変換するために必要な量であることを特徴とする方法。
- 前記フィターゼ変異体を与えられた家畜の排泄物中のリン濃度を低下させるための飼料の製造における、請求項1、2若しくは8のいずれか1項に記載の少なくとも1のフィターゼ変異体、又は、請求項9若しくは10に記載の酵素組成物、または請求項21から26のいずれか1項に記載の方法で製造された飼料、または請求項27または28に記載の組成物の使用。
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