CN102007211B - 布丘氏菌属物种植酸酶变体 - Google Patents

Abstract

本文提供了可用于工业应用的布丘氏菌属物种植酸酶的变体，所述应用包括淀粉液化的方法、醇发酵的方法和增强食品和动物饲料中的磷酸盐消化的方法。

Description

布丘氏菌属物种植酸酶变体

交叉引用 

本申请要求于2008年4月18日提交的美国临时专利申请号61/046,324的权益，其公开内容通过引用全部整合到本文中用于全部目的。 

技术领域

本文提供的技术涉及改善的布丘氏菌属物种(Buttiauxella sp.)植酸酶变体，编码植酸酶的核酸，含有核酸的载体、宿主细胞，以及生产植酸酶的方法。本发明涵盖的植酸酶可用于多种用途，包括例如，淀粉液化的方法、醇发酵的方法和增强食品和动物饲料中的磷酸盐消化的方法。 

背景 

植酸盐是磷在谷类植物和豆科植物中的主要储存形式。然而，单胃动物(例如，猪、家禽和鱼)不能代谢或吸收植酸盐(或植酸)，从而排出并在强家畜生产的区域造成磷污染。此外，在单胃动物中，植酸通过螯合金属物质，例如钙、铜和锌，还发挥抗营养剂的作用。 

为了提供足够的磷酸盐供这类动物的生长和健康，向其饮食中加入无机磷酸盐。此类添加可以是昂贵的且进一步增加了污染问题。 

通过植酸酶的作用，通常水解植酸盐产生较小的肌醇-磷酸盐和无机磷酸盐。植酸酶可用作动物饲料的添加剂，它们改善了动物对有机磷的利用度，并降低了环境的磷酸盐污染(Wodzinski R J，Ullah A H.Adv Appl Microbiol.42，263-302(1996))。 

文献中已描述了多种真菌(Wyss M.等人，Appl.Environ.Microbiol.65(2)，367-373(1999)；Berka R.M.等人，Appl.Environ.Microbiol.64(11)，4423-4427(1998)；Lassen S.等人，Appl.Environ.Microbiol.67(10)， 4701-4707(2001))和细菌(Greiner R.等人，Arch.Biochem.Biophys.303(1)，107-113(1993)；Kerovuo等人，Appl.Environ.Microbiol.64(6)，2079-2085(1998)；Kim H.W.等人，Biotechnol.Lett.25，1231-1234(2003)；Greiner R.等人，Arch.Biochem.Biophys.341(2)，201-206(1997)；Yoon S.J.等人，Enzyme and microbial technol.18，449-454(1996)；Zinin N.V.等人，FEMSMicrobiol.Lett.236，283-290(2004))来源的植酸酶。 

发明概述 

在第一个方面，本公开文本的实施方案提供了这样的植酸酶变体，所述变体具有不同于野生型布丘氏菌属物种植酸酶(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列，并具有一个或多个有利的性质。此类性质包括但不限于有利的：热稳定性、温度/活性谱；pH/活性谱；比活；和pH/蛋白酶-敏感度。 

在其他方面，本公开文本的实施方案涉及这样的植酸酶变体，所述变体包括在选自75、76和374的一个或多个位置上含有取代的植酸酶，其中，各位置对应野生型布丘氏菌属物种植酸酶(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的位置。 

在另一个方面，本公开文本的实施方案提供编码如本文所公开的植酸酶变体的核酸，以及包括此类核酸的载体和宿主细胞。在其他实施方案中，序列用于生产植酸酶变体的方法。 

此外，本公开文本的实施方案通常涉及植酸酶变体的用途，用于从任何植酸酶底物中释放磷，特别是从植酸盐或植酸中释放无机磷酸盐。有利的，本公开文本的植酸酶变体可用于工业用途，包括例如淀粉液化的方法，和增加食品和动物饲料中的磷酸盐消化的方法。有利的，根据本公开文本的实施方案的植酸酶变体是有效的，用于醇发酵工艺和/或生产。 

在其他方面，本公开文本涉及包含如本文所述的植酸酶变体的酶组合物，其中酶组合物用于商业应用，或在商业应用中使用。在一个实施方案中，酶组合物可以是动物饲料组合物。在其它实施方案中，酶组合物可用于淀粉水解(如液化)工艺。在有利的实施方案中，变体和/或酶组合物可 用于醇发酵工艺。在进一步的实施方案中，包含本公开文本中所包括的植酸酶的酶组合物将包含其它的酶，例如葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、果胶酶、支链淀粉酶、葡萄糖氧化酶、β葡糖苷酶、漆酶、氧化酶、角质酶、磷酸酶、其它植酸酶及其组合。 

在其他方面，本公开文本的实施方案涉及在宿主细胞中生产植酸酶变体方法，通过用DNA构建体转化宿主细胞，在合适的培养基中培养转化的宿主细胞以允许所述所述植酸酶的表达和生产植酸酶，其中所述构建体有利的包括在宿主细胞中具有转录活性的启动子。方法还可以包括回收产生的植酸酶。在一个实施方案中，宿主细胞是细菌，或植物细胞，或真菌细胞(例如，木霉属(Trichoderma)细胞，如里氏木霉(T.reesei))或酵母。在本文描述的实施方案中，植酸酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：1享有的最小百分比序列同一性，例如，与SEQ ID NO：1至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％的氨基酸序列同一性。在本公开文本的有利的实施方案中，植酸酶具有SEQ ID NO：2的序列。 

本发明的酶是权利要求和本文中定义的酶。本发明的酶还涵盖了在表达过程中共翻译或翻译后加工的活性多肽，例如通过信号肽切割。翻译后切割还可以发生在C端。因此，在优选的实施方案中，其有效的片段(也称为其功能片段)是通过天然的宿主或合适的适当表达宿主生产的成熟多肽。 

因此，在一个方面，植酸酶的特征是它包括这样的氨基酸序列，所述序列是由全部或部分编码本文定义变体的核苷酸序列表达的或可由全部或部分编码本文定义变体的核苷酸序列表达的。 

通常，在一个方面，提供了植酸酶变体，与野生型布丘氏菌属物种(Buttiauxella sp.)植酸酶(SEQ ID NO：1)相比，所述变体具有至少约5℃的改善的热活性。在一个实施方案中，与植酸酶SEQ ID NO：1相比，植酸酶的改善的热活性是至少约17℃。在另一个实施方案中，改善的热活性的范围是从约17℃至约21℃。在另一个实施方案中，改善的热活性的范 围是从约17.4℃至约20.2℃。 

通常，在其他方面，提供了热稳定的植酸酶变体，其在缓冲液中在pH5.5时暴露在升高的温度下10分钟后，能够保留大于50％的活性，其中，升高的温度比野生型布丘氏菌属物种植酸酶(SEQ ID NO：1)保留大于50％的活性时的温度高至少约5℃。在一个方面，升高的温度是至少约20.5℃或更高。在另一个方面，升高的温度的范围是从约20.5℃至约27℃。在其他方面，升高的温度的范围是从约20.2℃至约26.8℃。 

通常，在另一个方面，提供的植酸酶变体具有植酸酶活性以及不同于野生型布丘氏菌属物种植酸酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列，其中植酸酶变体的氨基酸序列包括在对应SEQ ID NO：1的75、76、77、198、367或374位的一个或多个位置上的变异。在一个实施方案中，植酸酶变体还包括一个或多个其它的变异，其中变异是92A、164E/S、171I/V、192A或256A/E/P。在另一个实施方案中，在75、76、77、198、367或374位上一处或多处的变异分别是75P、76R、77S、198R、367L或374P，且植酸酶变体还包括一个或多个其它的变异，其中变异是92A、164E/S、171V、192A或256A/E/P。在另一个实施方案中，植酸酶变体还包括一个或多个其它的变异，其中一个或多个其它变异的位置是26、37、89、134、160、176、178、188、190、207、209、211、235、261、270、303或318。在另一个实施方案中，在位置26、37、89、134、160、176、178、188、190、207、209、211、235、261、270、303或318上的一个或多个其它变异分别是26E、037Y、089T、134I/V、160R、176K、178P、188N、190E、207E/T、209S、211C、235V、261E、270K、303F或318D。在另一个实施方案中，植酸酶变体还包括一个或多个其它的变异，其中一个或多个其它变异的位置是1、10、11、38、66、71、81、92、109、111、119、120、121、141、142、152、155、193、214、239、245、248、255、268、277、283、285、287、288、293、296、314、337、345、350、364、371、372、396、399、406或413。在另一个实施方案中，在位置1、10、11、38、66、71、81、92、109、111、119、120、121、141、142、152、155、193、214、239、 245、248、255、268、277、283、285、287、288、293、296、314、337、345、350、364、371、372、396、399、406或413上的一个或多个其它变异分别是1S、10I、11I、38S、66E、71K、81A、92E、109Q、111G、119N、120L、121E、141R、142L、152M、155E、193Q、211C、214V、235V、239K、245D、248L、255A、261E、268A/T、270K、277T、283D、285K、287D、288A、293G或296S。 

通常，在另一个方面，提供的植酸酶变体具有植酸酶活性以及不同于野生型布丘氏菌属物种植酸酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列，其中植酸酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：1相比包括至少一个变异，其中植酸酶序列变异包括： 

a)N37Y，S75P，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K198R，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

b)N37Y，G77S，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K198R，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

c)N37Y，S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171I，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

d)N37Y，A89T，D92A，T134I，F164E，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256P，A261E，N270K，A374P 

e)S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171I，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

f)N37Y，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171I，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

g)N37Y，Q76R，A89T，D92A，T134I，F164S，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P 

h)S75P，A89T，D92A，T134I，F164E，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

i)S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，P367L，A374P 

j)N37Y，A89T，D92A，T134I，F164E，T171I，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

k)N37Y，Q76R，A89T，D92A，T134I，F164E，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

l)N37Y，Q76R，A89T，D92A，T134I，F164E，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P 

m)N37Y，S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，F164E，T171V，T176K，A178P，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P 

n)N37Y，S75P，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

o)N37Y，A89T，D92A，T134I，H160R，F164S，T171I，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256E，A261E，N270K，A374P 

p)A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209SA235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

q)N37Y，S75P，A89T，D92A，T134I，H160R，F164S，T171V，T176K，A178P，S188P，K207E，A209S，S248L，Q256H，A261E，N270K，A374P 

r)N37Y，S75P，A89T，D92A，T134I，F164S，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P 

s)S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P；或 

t)N37Y，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164S，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P. 

在一个实施方案中，植酸酶序列变异包括N37Y、S75P、Q76R、A89T、D92A、T134I、H160R、F164E、T171I、T176K、A178P、S188P、G192A、K207E、A209S、A235V、S248L、Q256Y、A261E、N270K、A374P。 

还提供了植酸酶，其与本文公开的植酸酶具有至少最小的百分比序列同一性和/或百分比同源性，其中最小百分比同一性和/或同源性是至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。 

通常，在一个方面，提供了植酸酶变体，其具有植酸酶活性以及不同于野生型布丘氏菌属物种植酸酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列，其中植酸酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：1相比包括至少一个变异，其中变体具有在下列位置中至少任一处的变异：70、193、197、221和407。在一个实施方案中，变体具有至少下列的变异：N70Y、H193R、F197E、S221P和A407P。 

通常，在另一个方面，提供了编码本文公开的任何植酸酶的核酸。在另一个方面，提供了包括编码本文公开的任何植酸酶的核酸的载体。在其他方面，提供了包括本文所述核酸和/或载体的宿主细胞。 

通常，在另一个方面，提供了在宿主细胞中生产植酸酶变体的方法，所述变体是根据本文公开的变体，包括： 

a)用DNA构建体转化宿主细胞，所述DNA构建体包括编码本文公开的任何植酸酶变体的核酸，和 

b)在合适的培养基中培养转化的宿主细胞。 

在一个实施方案中，宿主细胞是真菌细胞、细菌细胞或植物细胞。 

在一个方面，提供了本文公开的方法制备的植酸酶。 

通常，在一个方面，包括本文公开的至少一种植酸酶的酶组合物还包括一种或多种葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精糖基转移酶(cyclodextrin  glycotransferase)、脂肪酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、另一种植酸酶或其任意的组合。在一个实施方案中，组合物还包括α-淀粉酶。 

通常，在另一个方面，提供了如本文所述的植酸酶，或如本文所述的酶组合物在淀粉液化、糖化、发酵或同时糖化-发酵中的用途。在一个实施方案中，淀粉液化、糖化、发酵或同时糖化-发酵是用于生产发酵醇。在另一个实施方案中，醇是乙醇或丁醇。在另一个实施方案中，对底物进行淀粉液化、糖化、发酵或同时糖化-发酵。在一个实施方案中，底物包括淀粉。在另一个实施方案中，底物包括谷物(grain)或谷类(cereal)。在其他实施方案中，谷物或谷类是小麦、大麦、黑麦、燕麦、玉米、高粱、玉米蛋白粉(corn gluten meal)、干酒糟及可溶物(Distillers Dried Grain Solubles，DDGS)、小麦麸、粗小麦粉、碎麦粉、稻、燕麦壳、棕仁、柑桔渣或其组合。在一个实施方案中，稻包括米糠或稻壳。 

通常，在另一个方面，提供了如本文所述的至少一种植酸酶作为食品或饲料添加剂的用途。在另一个方面，至少一种如本文公开的植酸酶作为含有干酒糟及可溶物(DDGS)的食品或饲料添加剂的用途。 

通常，在其他方面，提供了生产食品或动物饲料的方法，包括将至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物，与另一种食品或饲料成分混合，形成所述食品或动物饲料的步骤。 

通常，提供了生产食品或动物饲料的方法，包括将液体形式的至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物喷雾到所述食品或动物饲料上的步骤。在一个方面，生产食品或动物饲料的方法包括将作为干产物的至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物与所述食品或动物饲料混合的步骤。 

在另一个方面，提供了生产动物饲料的方法，包括将至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物，与另一种食品或饲料成分混合，形成所述动物饲料的步骤。在其他方面，提供了生产动物饲料的方法，包括将液体形式的至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物喷雾到所述动物饲料上的步骤。在另一个方面，提供了生产动物饲料的方 法，包括将作为干产物的至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物与所述动物饲料混合的步骤。 

通常，在另一个方面，提供了食品或动物饲料的组合物，包括i)至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物，和/或ii)通过如本文公开的方法生产的食品或动物饲料。在其他方面，提供了动物饲料组合物，包括i)至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物，和/或ii)通过如本文公开的方法生产的食品或动物饲料。 

在一个方面，提供了至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物在食品或动物饲料中的用途。在另一个方面，提供了至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物在动物饲料中的用途。 

通常，在另一个方面，提供了降低动物粪便中的磷水平的方法，特征是所述动物是用至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物，或通过本文公开的方法制备的饲料，或如本文公开的组合物喂养，其中所述植酸酶的量可有效地转化所述动物饲料中含有的植酸盐。 

通常，在一个方面，提供了至少一种如本文公开的植酸酶，或如本文公开的酶组合物，或用通过本文公开的方法制备的饲料，或如本文公开的组合物的用途，用于生产动物饲料，降低用所述植酸酶多肽喂养的动物粪便中的磷水平。 

附图简述 

图1显示了野生型布丘氏菌属物种P1-29植酸酶(“BP-WT”)的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)  。 

图2显示了根据本公开文本的一种有利变体的氨基酸序列(SEQ IDNO：2)。 

图3显示了野生型布丘氏菌属物种P1-29的核酸序列(SEQ ID NO：3)。 

图4显示了图2所示的根据本公开文本的有利变体的核酸序列(SEQID NO：4)。 

图5代表根据本发明的三种酶(BP 110、BP-111和BP-112)的氨基 酸序列，以及BP-17的序列和wt序列。 

图6显示了源自布丘氏菌属的植酸酶、变体BP-17、BP 110、BP-111和BP-112、以及Phyzyme XP、Natuphos和Ronozyme P对增加的胃蛋白酶浓度的抗性。数据相对于在不含胃蛋白酶的条件下在pH 2孵育。A：所有的数据点；B：相同的数据但只显示超过70％的回收。 

图7显示了实施例11中使用的饲料加工设备(饲料制粒(pelleting))的示意图。 

图8显示了数据图。 

图9显示了数据图。 

图10显示了数据图。 

图11显示了数据图。 

图12显示了数据图。 

图13显示了数据图。 

图14显示了数据图。 

图15显示了HPLC数据图。 

图16显示了HPLC数据图。 

发明的详细描述 

本文公开了布丘氏菌属物种植酸酶的变体，所述变体可用于工业应用，包括淀粉液化的方法、醇发酵和增加食品和动物饲料中的磷酸盐消化。特别地，根据本公开文本的植酸酶变体可非常有效的用于燃料乙醇生产工艺的淀粉液化步骤中的植酸盐降解。本公开文本的变体包括在野生型布丘氏菌属物种植酸酶(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列上的一个或多个变异(包括取代、插入和缺失)。在有利的实施方案中，变体的氨基酸序列包括与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相比至少一个变异，所述至少一个变异是位于选自75、76和374位的1个、2个或3个位置上，其中各个位置对应于SEQID NO：1的氨基酸序列的位置。 

例如，在根据本公开文本的实施方案的植酸酶变体中的变异有利地选 自对应于SEQ ID NO：1的S75、Q76和A374。 

在本公开文本的有利的实施方案中，植酸酶变体的变异是取代，所述取代可选自S75P、Q76R和A374P，其中各个位置对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的位置。 

在其他有利的实施方案中，根据本公开文本的植酸酶变体包括其它的变异，位于选自：N37、G77、H160、F164、、T171、S188、G192、K198、A235、Q256和/或P367的一个或多个位置上，其中各个位置对应于SEQ IDNO：1的氨基酸序列的位置。 

在其他有利的实施方案中，根据本公开文本的植酸酶变体的变异是取代，所述取代可位于选自：N37Y、G77S、H160R、F164E、F164S、T171V、T171I、S188P、G192A、K198R、A235V、Q256P、Q256A、Q256E和/或P367L的一个或多个位置上。 

在其他有利的实施方案中，根据本公开文本的植酸酶变体包括其它的变异，位于选自：A89、D92、T134、F164、T176、A178、K207、A209、S248、Q256、A26E和/或N270的一个或多个位置上。 

此外，在其他有利的实施方案中，根据本公开文本的植酸酶变体包括其它的变异，位于选自：A89T、D92A、T134I、F164S、T176K、A178P、K207E、A209S、S248L、Q256Y、A261E和/或N270K的一个或多个位置上。 

在其他有利的实施方案中，根据本公开文本的植酸酶变体包括SEQ IDNO：2的序列。 

根据本公开文本的有利的植酸酶变体包括含有变异的序列，所述变异选自：   

a)N37Y，S75P，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K198R，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

b)N37Y，G77S，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K198R，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

c)N37Y，S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171I，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

d)N37Y，A89T，D92A，T134I，F164E，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256P，A261E，N270K，A374P 

e)S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171I，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

f)N37Y，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171I，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

g)N37Y，Q76R，A89T，D92A，T134I，F164S，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P 

h)S75P，A89T，D92A，T134I，F164E，T171V，T176K，A178P，S 188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

i)S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，P367L，A374P 

j)N37Y，A89T，D92A，T134I，F164E，T171I，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

k)N37Y，Q76R，A89T，D92A，T134I，F164E，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

l)N37Y，Q76R，A89T，D92A，T134I，F164E，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P 

m)N37Y，S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，F164E，T171V，T176K，A178P，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P 

n)N37Y，S75P，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

o)N37Y，A89T，D92A，T134I，H160R，F164S，T171I，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256E，A261E，N270K，A374P 

p)A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

q)N37Y，S75P，A89T，D92A，T134I，H160R，F164S，T171V，T176K，A178P，S188P，K207E，A209S，S248L，Q256H，A261E，N270K，A374P 

r)N37Y，S75P，A89T，D92A，T134I，F164S，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P 

s)S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P 

t)N37Y，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164S，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P. 

本公开文本的实施方案还包括序列a)至t)所述的任何植酸酶的变体， 其具有植酸酶活性以及这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与序列a)至t)所述的各植酸酶变体相比，具有至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的百分比序列同一性和/或百分比同源性。 

本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写指代氨基酸。下表提供了标准氨基酸及其缩写的列表。 

丙氨酸	A	Ala
			半胱氨酸	C	Cys
天冬氨酸	D	Asp
			谷氨酸	E	Glu
苯丙氨酸	F	Phe
			甘氨酸	G	Gly
组氨酸	H	His
			异亮氨酸	I	Ile
赖氨酸	K	Lys
			亮氨酸	L	Leu
甲硫氨酸	M	Met
			天冬酰胺	N	Asn
脯氨酸	P	Pro
			谷氨酰胺	Q	Gln
精氨酸	R	Arg
			丝氨酸	S	Ser
苏氨酸	T	Thr
			缬氨酸	V	Val
色氨酸	W	Trp
			酪氨酸	Y	Tyr
半胱氨酸	C	Cys
			天冬氨酸	D	Asp

除了特定的氨基酸变异和编码变异的核酸外，本文提供了变异的保守性氨基酸取代。此类取代是保守的取代，例如，其中变体氨基酸由相同通 用类型的另一种氨基酸替换。根据其侧链，氨基酸可分类为酸性、碱性、中性且极性、或中性且非极性和/或芳香族。变体氨基酸位置的优选的取代包括具有与所述位置的变体氨基酸相同的一个或多个分类的氨基酸。因此，通常，氨基酸Lys、Arg、和His是碱性的；氨基酸天冬氨酸和谷氨酸是酸性的；氨基酸Ser、Thr、Cys、Gln、和Asn是中性极性的；氨基酸Gly、Ala、Val、Ile、和Leu是非极性脂肪族的；和氨基酸Phe、Trp、和Tyr是芳香族的。Gly和Ala是小氨基酸；Val、Ile和Leu是alipathic氨基酸。 

除非在本文中另外定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本公开文本所属领域普通技术人员常规理解的相同含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，20 ED.，John Wiley和Sons，New York(1994)，和Hale & Marham，THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)为技术人员提供了本公开文本使用的多数术语的通用词典。 

本公开文本不限于本文公开的示例性方法和材料，任何与本文所述的相似或等价的方法和材料都可以用于实践或测试本公开文本的实施方案。数值范围包含定义范围的数值。除非另外说明，核酸序列按5’到3’的方向从左至右书写，氨基酸序列分别按氨基到羧基的方向从左至右书写。 

本文提供的标题不是本公开文本的不同方面或实施方案的限制，而可作为说明书整体的参考。相应的，以下定义的术语通过整体参考说明书给出更完整的定义。 

植酸(肌醇六磷酸)  是谷类植物、豆科植物和油料作物中的重要组分。它的盐形式，植酸盐是磷在这些植物中的主要储存形态。 

植酸酶催化植酸的磷酸单酯水解，导致逐步形成肌醇五-、四-、三-、二-和单磷酸以及释放无机磷酸盐。   

术语“植酸酶变体”或“变体”或“修饰的形式”指具有这样的氨基酸序列的植酸酶，所述序列源自亲本植酸酶的氨基酸序列，并具有一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失，统称为“突变”。 

术语“亲本植酸酶”或“亲本酶”指植酸酶变体来源的植酸酶。亲本植酸酶可以是野生型的植酸酶或另一种植酸酶变体。特别地，在本发明中，“亲本植酸酶”可以源自布丘氏菌属物种。合适地，“亲本植酸酶”源自本文所述的布丘氏菌属菌株P1-29，其优选的具有本文所述的氨基酸序列 。 

如本文所述，术语“植酸酶”或“植酸酶活性”指这样的蛋白质或多肽，其能够催化植酸盐水解为(1)肌醇和/或(2)它的单-、二-、三-、四-和/或五-磷酸和(3)无机磷酸盐。例如，具有如酶学委员会EC编号3.1.3.8或EC编号3.1.3.26定义的催化活性的酶 。 

如本文使用的，术语“布丘氏菌属物种植酸酶”指从布丘氏菌属物种获得的植酸酶蛋白质。在一个实施方案中，布丘氏菌属物种植酸酶包含源自以登录号为NCIMB 41248(英国国家工业与海洋细菌保藏中心(National Collections of Industrial Marine and Food Bacteria，Scotland，UK))储藏的菌株的氨基酸序列。在一个有利的实施方案中，布丘氏菌属物种植酸酶包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。   

如本文使用的，术语“对应于布丘氏菌属物种植酸酶”指样的酶，所述酶具有一种或多种与布丘氏菌属物种植酸酶相同或相似的功能特性或序列，但不必获自布丘氏菌属物种来源。 

术语“布丘氏菌属(Buttiauxella)”指肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的革兰氏阴性兼性厌氧菌的一个属，布丘氏菌属物种包括乡间布丘氏菌(B.agrestis)、布里纳氏布丘氏菌(B.brennerase)、费拉格布丘氏菌(B.ferragutiae)、伽瓦尼布丘氏菌(B.gaviniae)、伊查德氏布丘氏菌(B.izardii)、诺基亚布丘氏菌(B.noackiae)和瓦姆波德布丘氏菌(B.warmboldiae)。布丘氏菌属物种的菌株可以是例如获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)和DSMZ，德国国家生物材料资源中心。 

术语“野生型植酸酶”或“野生型”指具有自然界中发现的氨基酸序列的酶。特别地，野生型植酸酶是如SEQ ID NO：1所示的。 

如本文使用的，术语“布丘氏菌属物种植酸酶”的“变体”或“植酸酶变体”意指这样的植酸酶，所述植酸酶具有与SEQ ID NO：1的植酸酶的 氨基酸序列相比，有至少一个氨基酸取代、插入和/或缺失的差异的氨基酸序列。如本文使用的，术语“变体”或“变异”仅意指植酸酶变体的氨基酸序列和SEQ ID NO：1的氨基酸序列之间存在差异，并不表示以任何方式将SEQ ID NO：1的氨基酸序列或核苷酸序列或任何其他的植酸酶作为起始材料，和/或对其进行物理的改变、突变、修饰或其它变化，来产生变体。简而言之，可以通过任何方法制备本公开文本的植酸酶变体(包括其氨基酸和核苷酸序列)，本领域技术人员可以方便地熟悉多种用于产生植酸酶变体的方法，其中一些描述在本文中。 

如本文使用的，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。 

术语“等同于......的氨基酸残基”、“对应于......的氨基酸”及其语法上的等价说法，在本文中都用于指与特定蛋白质的特定氨基酸序列中所示的那些具有相似位置和作用的蛋白质的氨基酸残基。本领域技术人员可以认识到在可比较的植酸酶蛋白质中特定残基的等价性。 

关于两个氨基酸或多核苷酸序列的“百分比序列同一性”，是指当序列最佳比对时，两条序列中相同的残基的百分比。因此，80％氨基酸序列同一性意指在两条最佳比对的多肽序列中，80％的氨基酸是相同的。例如，通过直接比较两个分子的序列信息可以确定百分比同一性，所述比较是通过比对序列，计数两条比对序列间匹配的准确数目，除以较短序列的长度，并将结果乘以100。易于获得的计算机程序可以用于辅助分析，例如ALIGN、Dayhoff，M.O.在“Atlas of Protein Sequence and Structure”，M.O.Dayhoff等，Suppl.3：353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，DC中，其改编了Smith和Waterman(1981)Advances in Appl.Math.2：482-489的局部同源性算法用于肽分析。用于确定核苷酸序列同一性的程序可获得自Wisconsin Sequence Analysis Package，第8版(可获自Genetics Computer Group，Madison，WI)，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，其也是基于Smith和Waterman算法。这些程序可容易的根据生产商推荐的默认参数5和上述Wisconsin Sequence Analysis Package所描述的进行使用。适合确定序列相似性的算 法的实例是BLAST算法，描述在AItschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中。实施BLAST分析的软件是可通过国立生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得的。同样，也可以方便的获得用于确定百分比同源性的计算机程序。 

如本文使用的，术语“特性”或其语法上的等价说法，在多肽的上下文中，指多肽的可以选择或检测的任何特征或属性。这些特性包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、温度和/或pH活性谱、饲料加工稳定性和被分泌能力。 

术语“增强的稳定性”，在特性(如在高温、低pH等的稳定性)的上下文中，指随着时间推移，与另一种已鉴别的植酸酶(如SEQ ID NO：1的植酸酶)相比更高地保留酶活性。除非特别地定义了另一种植酸酶，否则当在本文中使用术语“增强的稳定性”时，指与SEQ ID NO：1的植酸酶相比，随着时间推移更高地保留酶活性。 

术语“热稳定的”指本公开文本中的植酸酶在暴露于升高的温度后能保持特定量的酶活性。如果在pH5.5在缓冲液中暴露于特定温度下10分钟后，酶保留了大于50％的活性，则认为根据本公开文本的植酸酶变体在特定温度下是热稳定的。 

当术语“改善的热活性”适应于本公开文本的植酸酶变体时，意指与另一种定义的植酸酶(如，SEQ ID NO：1)的植酸酶活性相比，所述植酸酶变体在升高的温度下表现出相同的或增加量的植酸酶活性。除非特别地定义了另一种植酸酶，否则当在本文中使用时，术语“改善的热活性”指本公开文本的植酸酶变体与SEQ ID NO：1的植酸酶的热活性相比的热活性。  下文在实施例6中提供了关于热活性的进一步讨论。 

术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换的使用，指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这些术语包括但不限于单-、双-或三-链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基、或其他天然的、化学的、生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。 

如本文中使用的，术语“基因”指这样的多核苷酸(例如，DNA区段)，所述多核苷酸编码多肽并包括在编码区之前和之后的区域，以及在单个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。 

如本文中使用的，术语“DNA构建体”、“转化DNA”和“表达载体”是可互换使用的，指用于将序列导入宿主细胞或生物体的DNA。DNA可以在体外由PCR或任何本领域已知的其他合适的技术产生。DNA构建体、转化DNA或重组表达盒可以被掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。一般而言，表达载体、DNA构建体或转化DNA的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子，以及其它序列。在优选的实施方案中，表达载体具有掺入到宿主细胞中，并表达异源DNA片段的能力。 

如本文中使用的，术语“载体”指设计为向一种或多种细胞类型导入核酸的多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒等。 

如本文中使用的，在将核酸序列导入细胞的上下文中，术语“导入”指任何适合将核酸序列转移到细胞内的方法。此类导入方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、接合和转导，并包括提到的将核酸序列掺入到真核或原核细胞中，其中所述核酸序列可以被掺入到细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转化为自主复制子，或者瞬时表达(例如，转染的mRNA)。 

术语“最佳比对”指产生最高百分比同一性分值的比对。 

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中是可互换使用的。在本公开文本和权利要求中，使用常规的单字母和三字母代码表示氨基酸残基。所定义的氨基酸的三字母代码符合IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature；JCBN)的规定。还可以理解，因为遗传密码子的简并性，多肽可以由多于一个的核苷酸序列编码。 

按照下述命名法描述本公开文本中的变体：【SEQ.ID NO：1的原始氨基酸残基/SEQ.ID NO：1的原始氨基酸残基的位置/替代的氨基酸残 基】。例如，在SEQ ID NO：2中，苏氨酸(T)取代SEQ.ID NO：1的89位的原始丙氨酸(A)表示为A89T。当文中鉴定了一个适合取代的位置而未给出具体取代氨基酸的建议时，理解为任何氨基酸残基都可以取代在位置上出现的氨基酸残基。当与其它植酸酶相比，植酸酶变体包含缺失时，则用“^＊”表示缺失。例如，SEQ.ID NO：1的A89位的缺失表示为A89^＊。缺失两个或多个连续的氨基酸表示为例如(89-91)^＊。 

术语“信号序列”或“信号肽”指任何可参与蛋白质成熟或前体形式蛋白质的分泌的核苷酸序列和/或氨基酸序列。该信号序列的定义是功能性的，意在包括所有参与完成蛋白质分泌的蛋白质基因的N端部分编码的氨基酸序列。信号序列通常是但并非全部都结合于蛋白质的N端部分或前体蛋白的N端部分。 

“宿主菌株”或“宿主细胞”指包含本公开文本的DNA的表达载体的合适宿主。 

术语“衍生自”和“获得自”不仅指由或可由所讨论的生物体的菌株产生的植酸酶，也指由分离自此类菌株的DNA序列编码的和在包含此类DNA序列的宿主生物体中产生的植酸酶。另外，术语也指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码的植酸酶，且所述植酸酶具有所讨论的植酸酶的已鉴别特征。因此，“衍生自”和“获得自”另一种植酸酶的植酸酶不必然意指所述植酸酶是从第二种植酸酶物理性衍生的或物理性获得的，而是可以表示所讨论的植酸酶是使用第二种植酸酶的知识或源自所述知识设想而制备的。 

“功能性片段”意指保留了所述多肽特征性性质的多肽片段。在本发明的上下文中，植酸酶的功能性片段是保留了完整蛋白质的植酸酶切割能力的片段。 

术语“分离的”、“回收的”或“纯化的”指从其原始的环境中移出的物质。术语“基本纯化的”意指该物质已经被纯化到至少基本的程度。 

在一个方面，核苷酸或氨基酸序列优选的处于分离的形态。术语“分离的”意指序列至少基本不含至少一种其它组分，所述组分是序列在自然 界天然相关的，并可见于自然界。 

在一个方面，核苷酸或氨基酸序列优选的处于纯化的形态。术语“纯化的”意指序列处于相对纯的状态，至少1％、5％纯，或10％纯，更优选的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％纯。在优选的实施方案中，当指代多肽时，上述定义的纯度是通过SDS-PAGE电泳与其它多肽纯化的方面来确定的。在优选的实施方案中，当指代多核苷酸时，上述定义的纯度是通过与其它多核苷酸纯化的方面来确定的。 

如本发明所使用的，术语“表达(expression)”、“表达(expresses)”、“表达的(expressed)”和“可表达的(expressable)”分别与术语“转录(transcription)”、“转录(transcribes)”、“转录的(transcribed)”和“可转录的(transcribable)”同义。 

如本发明所使用的，术语“转化”和“转染”指将核酸序列导入到宿主、宿主细胞、组织或器官中的方法。 

如本发明所使用的，术语“产生(produce)”、“产生了(producing)”、“产生的(produced)”“可产生的(produceable)”、“产生(production)”分别与术语“制备(prepare)”、“制备了(preparing)”、“制备的(prepared)”、“制备(preparation)”“生成的(generated)”、“生成(generation)”和“可制备的(preparable)”同义。 

“饲料”和“食品”分别意指任何天然或人工的饮食、膳食等，或分别用于或适用于被动物(饲料)和人(食品)食用、摄入、消化的此类膳食的组分。 

“食品或饲料添加剂”是用于或适用于添加到食品或饲料中的化合物或多组分组合物。其可以但不必须包含一种或多种化合物，例如维生素、矿物质或饲料增强酶和合适的载体和/或赋形剂，并且其通常以适合添加到动物饲料中的形式提供。 

术语“淀粉液化”指淀粉转化为较短链和较少粘性的糊精的过程。 

术语“底物”指这样的物质，所述物质是或者包括至少一种可以被本发明的酶作用的实体。此类实体的实例包括：植酸盐和植酸盐降解的中间 产物，如肌醇-五磷酸、-四磷酸、-三磷酸、-二磷酸和-单磷酸。包含所述实体的底物的实例包括谷物、谷类植物和其它植物材料，或用于以下用途的基于碳水化合物的材料，所述用途例如饲料成分、液化、糖化、发酵、同时糖化/发酵和/或用于生产例如发酵醇(例如，乙醇或丁醇)或用于发酵生产醇(例如，乙醇或丁醇)的糖或用于制造其它产物(例如，非醇类产物)的糖的单步骤工艺。 

术语“醇发酵”指微生物(例如，酵母)将底物转化为分类为醇的代谢物(例如，乙醇或丁醇)的发酵工艺。 

“启动子”是参与结合RNA聚合酶以起始基因转录的调控序列。 

“在转录控制下”是本领域普遍已知的术语，表示多核苷酸序列(通常是DNA序列)的转录依赖于它有效连接了这样的元件，所述元件有助于起始或促进转录。 

“在翻译调控下”是本领域普遍已知的术语，表示在mRNA形成后发生的调控过程。 

如本文中使用的，当描述蛋白质及其编码基因时，基因的术语用斜体表示(例如，编码布丘氏菌属植酸酶的基因)。蛋白质的术语通常不是斜体的，且首字母通常是大写的。 

术语“有效连接的”指元件位于允许它们功能相关的排列的并列关系。例如，如果启动子控制序列的转录，则所述启动子与编码序列是有效连接的。 

术语“选择性标记”指能够在宿主中表达的基因，所述基因允许方便地选择那些含有导入的核酸或载体的宿主。选择性标记的实例包括但不限于：抗微生物剂(例如，潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予代谢优势的基因，例如宿主细胞的营养优势。 

涉及多核苷酸或蛋白质时，术语“异源的”指在宿主细胞中不是天然存在的多核苷酸或蛋白质。 

涉及多核苷酸或蛋白质时，术语“内源的”指在宿主细胞中天然存在的多核苷酸或蛋白质。 

如本文中使用的，术语“回收的”、“分离的”和“分开的”指从与其天然相关的至少一个组分中移出的化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。 

如本文中使用的，涉及细胞时使用的术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”意指细胞具有非天然的(例如，异源的)核酸序列，所述核酸序列被整合到其基因组中，或作为附加型质粒保留多个世代。 

如本文中使用的，术语“表达”指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。所述过程包括转录和翻译。 

虽然在实践或测试本发明时可以使用任何与本文所述的相似或等价的方法和材料，现在仍描述示例性的和有利的方法和材料。所有本文所提及的出版物都通过引用整合到本文中，其程度足以公开和描述与所引用出版物的公开内容相关的方法和/或材料。 

其他术语的定义可以在说明书全文中出现。在更详细的描述示例性实施方案之前，可以理解本发明不限于所描述的特定实施方案，当然也可以不同。还可以理解，本文中使用的术语的目的仅仅是描述特定的实施方案，并非意在限制范围，因为本发明的保护范围仅以附加的权利要求为限。 

在提供数值范围之处，可以理解，除非上下文另外明确指出，则也明确公开了范围的上限和下限之间的每个居中值(保留下限的两位数(to the tenth of the unit of the lower limit))。本发明涵盖了在所述范围中的任何公开数值或居中值与所述范围中的任何其它公开数值或居中值之间的各个较小的范围。这些较小范围可以独立的包括或排除所述范围的上下限，本发明也涵盖了各个这样的范围，即在所述较小范围中只包含上限或下限之一、不包含上下限或同时包含上下限，同时在公开的范围内具有任何明确排除的端值。若所述范围包含一个或两个端值，则在包含端值的范围内排除两端值之一或两端值的范围也包含在本发明中。 

应该注意，如本文和所附权利要求中使用的，除非上下文中另外清楚的指示，单数形式包含了复数的讨论对象。因此，例如，谈及的“基因”包括复数个此类候选物质，谈及的“该细胞”包括一个或多个细胞和本领 域技术人员已知的它的等价物等。 

本文讨论的出版物仅是在本申请的申请日之前公开的出版物。本文中没有内容被视为承认此类出版物构成了本文附加的权利要求的现有技术。 

作为亲本或前体酶使用的植酸酶包括布丘氏菌属物种植酸酶和对应于布丘氏菌属物种植酸酶的酶。在一些实施方案中，亲本布丘氏菌属物种植酸酶包含源自以登录号为NCIMB 41248储藏的布丘氏菌属物种菌株的氨基酸序列。在一些实施方案中，亲本布丘氏菌属物种植酸酶包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列。 在一些实施方案中，亲本布丘氏菌属物种植酸酶衍生自乡间布丘氏菌、布里纳氏布丘氏菌、费拉格布丘氏菌、伽瓦尼布丘氏菌、伊查德氏布丘氏菌、诺基亚布丘氏菌和瓦姆波德布丘氏菌。参考文献参照WO2006/043178，通过引用明确整合到本文中，描述了可从亲本布丘氏菌属物种和对应于布丘氏菌属物种植酸酶的植酸酶获得的或衍生的植酸酶。在一些实施方案中，野生型布丘氏菌属物种植酸酶变体与SEQ ID NO：1的多肽具有至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的氨基酸序列同一性。 

本发明的实施方案涉及植酸酶变体(例如，布丘氏菌属物种植酸酶变体)。特别是，WO2006/043178描述了野生型植酸酶的诱变，所述野生型植酸酶具有其中公开的序列，如SEQ ID NO：3。WO 2006/043178中教导了许多优选的突变。植酸酶变体可包含至少一个氨基酸取代、缺失或插入，通常有利的是氨基酸的取代。氨基酸取代、插入或缺失可以发生在植酸酶肽的任意残基处。本发明的植酸酶变体是不具有与本文的SEQ ID NO：1的氨基酸序列相同的氨基酸序列的变体。 

本发明的有利的实施方案中，变体可包括在布丘氏菌属物种植酸酶中的取代，更特别的是对应于SEQ ID NO：1中所述等价位置。在一些实施方案中，取代包括任意的对应于A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y的其余19种氨基酸。然而，还可以使用合成的和其他的氨基酸。 

可以在编码植酸酶蛋白质的DNA中，通过核苷酸的随机诱变、位点饱和诱变和位点特异性诱变制备变体，使用本领域已知的盒或PCR诱变或其它技术生产变体，其随后在细胞培养物中生产。参考Morinaga等人，(1984)Biotechnology 2：646-649；Nelson和Long，(1989)Analytical Biochem.，180：147-151和Sarkar和Sommer(1999)Biotechniques 8：404-407。还可以通过利用已确立技术的体外合成，制备变体植酸酶蛋白质片段。 

通过下述方法获得多核苷酸：通过本领域已知的标准方法，从例如，克隆DNA(例如，DNA“文库”)、通过化学合成、通过cDNA克隆、通过PCR(USP 4,683,202或Saiki等人，Science 239：487-491(1988))、通过合成建立的方法(Beucage等人，(1981)Tetrahedron Letters 22：1859-1869，和Matthes等人，EMBO J.3：801-895(1984))或通过基因组DNA或其片段的克隆、从想要的细胞中基本纯化，例如布丘氏菌属物种(参见例如，Sambrook等人，2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Glover，DM和Hames，BD(编著)，1995，DNA Cloning 1：A Practical Approach and DNA Cloning 2：A Practical Approach，Oxford University Press，Oxford)。从基因组DNA及其衍生物中衍生的核酸序列除编码区域外还可以包含调控区域。 

为了表达多肽，可以使用标准的重组DNA表达方法(参见例如，Goeddel；Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))。例如，可以将编码目标多肽的DNA插入到表达载体中，然后将其转染到合适的宿主细胞中。可以理解，表达载体的设计，包括调控序列的选择，受以下因素的影响，例如宿主细胞的选择、目标蛋白质的表达水平和表达是否是组成型或诱导型的。 

可以使用标准技术将表达载体转染到宿主细胞中，例如电穿孔、磷酸钙沉淀和DEAE-葡聚糖转染。 

本文中用于克隆或表达载体中的DNA的合适的宿主细胞是原核细胞、 酵母或更高等的真核细胞，如上述植物细胞。除了原核细胞外，真核微生物(如丝状真菌或酵母)是根据本发明的植酸酶变体的合适的克隆或表达宿主。 

可以用上述表达或克隆载体转化宿主细胞用于蛋白质生产，并在经改良适合诱导启动子、选择转化子或扩增编码目标序列的基因的常规营养培养基中培养。培养条件，例如温度、pH等是选择用于表达的宿主细胞先前使用的，并对本领域普通技术人员是显而易见的。 

可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析纯化从细胞制备的多肽。 

在一些实施方案中，根据本发明的变体植酸酶可具有改变的性质。有利的，根据本发明的实施方案的变体与SEQ ID NO：1的野生型植酸酶相比，可具有改善的性质。在一些实施方案中，改变的(如，改善的)性质可以是热稳定性、热活性、饲料加工稳定性和/或比活(参见图2)。 

在一些实施方案中，本发明涵盖的变体可具有与本领域已知的布丘氏菌属物种植酸酶(例如，根据SEQ ID NO：1的布丘氏菌属物种植酸酶)相比增加的热稳定性。在一些实施方案中，变体可具有与BP-WT相比至少21.9℃、至少22.4℃、至少22.6℃、至少22.9℃、至少23.2℃、至少23.4℃、至少23.5℃、至少23.5℃、至少23.7℃、至少24.1℃、至少24.2℃、至少24.4℃、至少24.9℃、至少25.0℃、至少25.9℃、至少26.5℃和至少26.8℃的热稳定性差异(TD)。 

在一些实施方案中，本发明涵盖的变体与SEQ ID NO：1的野生型植酸酶相比，可以在升高的温度下表现出增加的稳定性。在一些实施方案中，植酸酶变体可以在约65℃、约70℃、约75℃、约80℃或更高温度下是热稳定的。如上文讨论的，如果根据本发明的植酸酶在pH 5.5中暴露在特定温度下10分钟后，能够保留大于50％的活性，则认为所述酶是热稳定的。 

在一些实施方案中，变体可以具有较高的热活性。在一些实施方案中，本发明涵盖的变体与BP-WT相比，可具有至少17.4℃、至少17.5℃、至 少17.6℃、至少17.8℃、至少17.9℃、至少18.4℃、至少18.7℃、至少18.8℃、至少18.9℃、至少19.0℃、至少19.3℃、至少19.5℃、至少20.0℃、至少20.1℃和至少20.2℃的热活性差异(TAD)。 

在一些实施方案中，根据本发明的变体植酸酶可具有至少1000U/mg、至少1200U/mg、至少1400U/mg、至少1600U/mg、至少1800U/mg、至少2000U/mg、至少2200U/mg、至少2300U/mg、至少2400U/mg和至少2500U/mg的比活，其中比活是通过如本发明的实施例3所述，将植酸酶在含有10mM植酸酶、1mM CaC1₂的溶液中在200mM醋酸钠缓冲液中，在pH5.5和67℃下孵育来确定的。 

在一些实施方案中，根据本发明的变体植酸酶可具有至少800U/mg、至少1000U/mg、至少1200U/mg、至少1400U/mg、至少1600U/mg、至少1800U/mg、至少2000U/mg、至少2200U/mg、至少2300U/mg、至少2400U/mg、至少2500U/mg和至少2600U/mg的比活，其中比活是通过如本发明的实施例3所述，将植酸酶在含有10mM植酸盐、1mM CaC1₂的溶液中在200mM醋酸钠缓冲液中，在pH5.5和80℃下孵育来确定的。 

在一些实施方案中，根据本发明的变体植酸酶在80℃是热稳定的，即，在pH 5.5暴露于80℃下10分钟后保留了50％的活性，同时在80℃下具有至少2500U/mg的比活以及在67℃下具有至少2300U/mg的比活，其中比活是通过如本发明的实施例3所述，将植酸酶在含有10mM植酸盐、1mMCaC1₂的溶液中在200mM醋酸钠缓冲液中，在pH5.5下孵育来确定的。 

在一些实施方案中，本发明涵盖的变体可用于生产磷酸盐化合物的方法，包括用本发明涵盖的变体植酸酶(例如，SEQ ID NO：2的变体)处理植酸盐。植酸盐可以是肌醇二-、三-、四-和/或五-磷酸。其它合适的有机磷酸盐包括肌醇-四磷酸和肌醇-寡磷酸。 

在一些实施方案中，本发明涵盖的变体可以保留与BP-WT实质相同水平的比活，但在较高温度、较高pH和/或较低pH下，比BP-WT具有增加的稳定性。 

在一些实施方案中，本发明涵盖的变体可以保留与BP-WT实质相同 水平的比活，但具有改善的热活性。 

在一些实施方案中，本发明提供了生产具有如本文所述的植酸酶活性的酶的方法，包括(a)提供用表达载体转化的宿主细胞，所述载体包括编码本文所述的植酸酶变体的多核苷酸，(b)在适合宿主细胞生产植酸酶变体的条件下培养转化的宿主细胞，和(c)回收植酸酶变体。 

在一些实施方案中，表达载体可以包括编码含这样的氨基酸序列的植酸酶的多核苷酸，所述氨基酸序列在对应图2所示位置上具有氨基酸残基的取代。 

在本发明的一些实施方案中，通常改造宿主细胞，使其表达异源植酸酶或具有根据本发明的植酸酶活性的变体。 

可用于生产本发明涵盖的植酸酶的宿主细胞包括细菌细胞、真菌细胞和植物细胞。宿主细胞包括细胞和细胞的后代和从细胞产生的原生质体，可用于生产根据本发明的变体植酸酶。 

有效的载体和转化宿主细胞的方法是本领域普遍已知的，并可以使用标准技术和方法，所述载体包括这样的DNA构建体，所述构建体包括编码本发明的植酸酶的多核苷酸。 

根据本发明，构建这样的DNA构建体，从而在宿主细胞中转移和/或表达变体，所述构建体包括编码本发明涵盖的变体植酸酶的核酸。在一个实施方案中，通过表达载体将DNA构建体转移到宿主细胞，所述表达载体包括与变体植酸酶编码序列有效连接的调控序列(例如，启动子、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、增强子、IS激活子序列、细胞特异性表达序列、信号序列和/或终止子)。 

包含DNA构建体的表达载体可以是任意载体，能够在给定的真菌宿主生物体中自主复制或能够整合入宿主DNA，其中所述构建体具有编码变体植酸酶的多核苷酸。在一些实施方案中，表达载体是质粒或噬茵体。在一些实施方案中，表达载体是预组装的，且包含高水平转录所需的序列和选择性标记。在一些实施方案中，将变体植酸酶基因的编码区或其部分插入到该通用表达载体中，使其处于表达构建体的启动子和终止子序列的转 录调控之下。在一些实施方案中，基因或其部分插入到cbh1强启动子的下游。 

简而言之，在真菌宿主细胞中产生植酸酶可以参考Sambrook等人(1989)，见上文；Ausubel(1987)，见上文；van den Hondel等人(1991)，在Bennett和Lasure(编著)MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press(1991)，第70-76和396-428页；Nunberg等人，(1984)Mol.Cell BioI.4：2306-2315；Boel等人，(1984) 30 EMBO J.3：1581-1585；Finkelstein in BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI，Finkelstein等人编著，Butterworth-Heinemann，Boston，MA(1992)，第6章；Kinghorn等人，(1992)APPLIED MOLECULAR GENETICS OFFILAMENTOUS FUNGI，Blackie Academic and Professional，Chapman 和Hall，London；Kelley等人，(1985)EMBO J.4：475-479；Penttila等人，(1987)Gene 61：155-164；和美国专利号5,874,276。合适载体的列表可见于Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains(FGSC，www at fgsc.net)。合适的载体包括例如可从Invitrogen Life Technologies和Promega获得的载体。适合在真茵宿主细胞中应用的特定载体包括载体例如pFB6、pBR322、pUCl8、pUCl00、pDON^TM201、pDONR^TM221、pENTR^TM、 

3Z和 

4Z。 

在一些实施方案中，载体可以是当导入真菌宿主细胞时整合入宿主细胞基因组并复制的任意载体。Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains(FGSC，<www at fgsc.net)提供了这类载体的一些非限制性例子。其它一些合适的表达载体和/或整合载体的实例提供在Sambrook等人(1989)见上文；Ausubel(1987)见上文；van den Hondel等(1991)在Bennett和Lasure(编著)，MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press.396-428；和美国专利号5,874,276中。特别有效的载体包括pTREX、pFB6、pBR322、PUCI8、pUCI00和pENTR/D。用于细菌细胞中的合适的质粒包括允许在大肠杆菌中复制的pBR322和pUCl9，和例如允许在芽孢杆菌属中复制的pEl94。 

在一些实施方案中，编码本发明涵盖的植酸酶变体的核酸有效连接至合适的启动子，所述启动子在宿主细胞中显示出转录活性。通常，植酸酶变体的表达可在任意本领域已知的或随后发现的合适启动子下完成。在一些实施方案中，植酸酶变体在宿主天然的启动子下表达。在一些实施方案中，植酸酶变体在异源启动子下表达，该启动子在宿主细胞中有活性。例如，如果使用木霉属细胞作为宿主细胞，有利地，启动子是在木霉属宿主细胞中有活性的。 

在一些实施方案中，启动子是组成型或诱导型启动子。“组成型启动子”是在多数环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”或“可抑制型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。在一些实施方案中，启动子是由于环境因素的改变而可诱导的或可抑制的，环境因素包括但不限于碳、氮或其他养分的利用度、温度、pH、渗透性、重金属的存在，抑制剂的浓度、胁迫或上述因素的组合，这是本领域已知的。在一些实施方案中，诱导型或可抑制型启动子可由代谢因子诱导或抑制，例如一些碳源的水平、一些能源的水平、一些分解代谢物的水平或上述因素的组合，这是本领域已知的。在一个实施方案中，启动子是宿主细胞天然的启动子，例如，当里氏木霉是宿主时，启动子是里氏木霉天然的启动子，例如cbh1启动子，其以登录号D86235储存在GenBank中。 

启动子的合适的非限制性例子包括：cbh1、cbh2、egll、egl2、egl3、egl4、egl5、xyn1和xyn2，产黄青霉(P.chrysogenus)的可抑制型酸性磷酸酶基因(phoA)的启动子(参见例如，Graessle等人，(1997)Appl.Environ.Microbiol.，63：753-756)，葡萄糖可抑制型PCK1启动子(参见例如，Leuker等人，(1997)，Gene，192：235-240)，麦芽糖可诱导型、葡萄糖可抑制型MET3启动子(参见，Liu等人，(2006)，Eukary.Cell，5：638-649)、pKi启动子和cpcl启动子。其它有效的启动子的实例包括：来自泡盛曲霉(A.awamori)和黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶基因的启动子(参见例如，Nunberg等人，(1984)Mol.Cell Biol.154：2306-2315；和Boel等人，(1984)EMBO J.3：1581-1585)。里氏木霉xln1基因的启动子也是有效的(参见 例如，EPA 137280A1)。 

在一些实施方案中，表达载体也包括在结构基因下游的转录终止序列，以提供有效终止。在一些实施方案中，终止序列和启动子序列源自相同的来源。在其它实施方案中，终止序列和宿主细胞是同源的。一个特别合适的终止子序列是衍生自木霉属菌株的cbh1，特别是衍生自里氏木霉的cbh1。其他有效的真菌终止子包括来自黑曲霉或泡盛曲霉的葡糖淀粉酶基因的终止子(参见例如，Nunberg等人，(1984)，见上文；和Boel等人，(1984)，见上文)。 

用于连接包含编码植酸酶变体的多核苷酸的DNA构建体、启动子、终止子和其他序列，并将它们插入到合适载体中的方法是本领域已知的。通常通过在方便的限制性位点处连接而完成连接。如果不存在此类位点，则根据常规实践，使用合成的寡核苷酸接头(参见例如，Sambrook(1989)见上文；以及Bennett和Lasure，MORE GENE MANIPULATIONS INFUNGI，Academic Press，San Diego(1991)，第70-76页)。此外，可以使用已知的重组技术构建载体(例如，Invitrogen Life Technologies，Gateway Technology)。 

宿主细胞的转化、表达和培养

将DNA构建体或载体导入宿主细胞包括如下技术，如转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染(例如，脂转染介导的转染和DEAE-葡聚糖介导的转染)；与磷酸钙孵育；DNA沉淀；用DNA包被的微粒高速轰击；和原生质体融合。 

转化曲霉属和木霉属的方法描述在例如，Yelton等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474；Berka等人，(1991)，在Applications of Enzyme Biotechnology，编著Kelly和Baldwin，Plenum Press(NY)；Cao等人，(2000)Sci.9：991-1001；Campbell等人，(1989)Curro Genet.16：53-56；Pentilla等人，(1987) Gene 61：155-164)；de Groot等人，(1998)Nat.Biotechnol.16：839-842；USP 6,022,725；USP 6,268,328和EP 238 023中。在木霉属中表达异源蛋白质描述在USP 6,022,725；USP 6,268,328； Harkki等人，(1991)，Enzyme Microb.Technol.13：227-233；Harkki等人，(1989)Bio Technol.7：596-603；EP 244,234；EP 215,594；和Nevalainen等人，″The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes″，inMOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY，编著Leong和Berka，Marcel Dekker Inc.，NY(1992)，第129-148页中。还可以参考W096100787和Bajar等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8202-28212关于镰孢属菌株的转化。 

产生用于转化植物的DNA构建体的方法和植物转化的方法也是已知的。这些方法的一些例子包括：根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaeiens)介导的基因转移；微粒轰击，PEG介导的原生质体转化、电穿孔等。可参考例如USP 5,780,708；USP 6,803,499；USP 6,777,589；Fromm等人，(1990)Biotechnol.8：833-839；Potrykus等人，(1985)Mol.Gen.Genet.199：169-177；Brisson等人，(1984)Nature 310：511514；Takamatsu等人，(1987)EMBO J 6：307-311；Coruzzi等人，(1984)EMBO J 3：1671-1680；Broglie等人，(1984)Science 224：838-843；Winter J和Sinibaldi RM(1991)Results Probl Cell Differ 17：85-105；Hobbs S或Murry LE(1992)in McGraw HillYearbook of Science and Technology，McGraw Hill，New York，N.Y.，第191-196页；以及Weissbach和Weissbach(1988)Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，New York，N.Y.，第421-463页。转化细胞可以在合适的条件下，使用标准技术进行摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵和补料分批发酵)，使用含有生理盐和营养物的合适培养基(参见例如，Pourquie，J.等人，BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION，编著Aubert，J.P.等人，Academic Press，第71-86页，1988；以及Ilmen，M.等人，(1997)Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306)。普通的商业制备的培养基(例如，Yeast Malt Extract(YM)培养基、Luria Bertani(LB)培养基和Sabouraud Dextrose(SD)培养基)可用于本发明。丝状真菌细 胞的优选培养条件是本领域已知的，并可见于科学文献和/或真菌来源，例如美国典型培养物收藏中心和真菌遗传学原种中心(Fungal Genetics Stock Center)。 

在一些实施方案中，用载体系统构建了遗传稳定的转化体，其中编码植酸酶变体的核酸稳定地整合入宿主菌株的染色体中。然后，用已知的技术纯化转化体。 

为了评估细胞系对具有植酸酶活性的植酸酶变体的表达，可以在蛋白质水平、RNA水平进行测定，或通过使用特定的植酸酶活性和/或生产的功能性生物测定法进行测定，所述细胞系转化了具有本发明涵盖的植酸酶活性的植酸酶变体的编码异源多核苷酸。通常，使用的测定包括：Northern印迹、斑点印迹(DNA或RNA分析)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链反应)，或使用适当标记的探针(基于核酸编码序列)的原位杂交，和常规的Southern印迹和放射自显影。 

另外，可以在样品中直接测量具有植酸酶活性的植酸酶变体的产生和/或表达，例如，通过无机磷酸盐的释放直接测量植酸酶活性(FTU)的测定法。无机磷酸盐和酸性钒酸盐-钼酸盐试剂形成黄色复合体，黄色复合体在分光光度计中于415nm波长处测量，并用磷酸盐标准曲线定量所释放的无机磷酸盐。一个单位的植酸酶(FTU)是每分钟从植酸盐中释放1微摩尔无机磷酸盐(Pi)的酶量。 

另外，可以通过免疫学方法评估基因表达，例如细胞、组织切片的免疫组织化学染色或组织培养基的免疫测定法，例如，通过Western印迹或ELISA。此类免疫测定法可以用于定性和定量评估植酸酶的表达。此类方法的细节是本领域技术人员已知的，用于实践此类方法的许多试剂是可商购的。 

植酸酶活性的测定法是本领域普遍已知的，一个实例是由Fiske和SubbaRow，Journal of Biological Chemistry 66：375-392(1925)开发的释放无机磷酸盐的经典测定法。该方法的改变可见于Mitchell等人，Microbiol.143：245-252(1997)中。替代的方法描述在FOOD CHEMICALS CODEX， 第4版，Committee on Food Chemicals Codex，Institute of Medicine，National Academy Press，Washington，DC，1996的第809-810页中。上述参考文献均整合到本文中。在多种此类测定中，随后使用分光光度计进行比色并与对照比较，所述对照是已知浓度的无机磷酸盐(Pi)和/或用具有已知植酸酶活性的酶反应产生的对照。将在定义的反应条件下，每分钟从植酸盐中释放1μmol Pi所需要的酶样品量定义为1单位活性。还可参考USP 6,221,644和USP 6,139,902。 

在本发明的一些实施方案中，由木霉属或曲霉属宿主表达的具有植酸酶活性的植酸酶变体可以大于1克蛋白质/升培养基(g/l)、大于2g/l、大于5g/l、大于10g/l、大于20g/l、大于25g/l、大于30g/l、大于50g/l和大于100g/l。 

可以从细胞培养的发酵物中回收或分离本发明的核酸序列表达后产生的多肽，并且可以用根据本领域已建立的技术的多种方法大量纯化。本领域技术人员能够选择最适当的分离和纯化技术。可以从培养基或宿主细胞裂解物中回收本发明的植酸酶。如果蛋白质是膜结合的，则可以使用适合的去污剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶裂解，从膜中释放出来。可以通过各种物理或化学的方法破坏表达植酸酶所用的细胞，例如冻融循环、超声处理、机械破碎或细胞裂解剂。可能希望从重组细胞蛋白质或多肽中纯化植酸酶。下列方法是适合的纯化方法的例子：通过离子交换柱分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；二氧化硅色谱或阳离子交换树脂色谱法如DEAE；色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用凝胶过滤如SephadexG-75；蛋白A琼脂糖柱去除污染物；和金属螯合物柱结合表位标记形式的植酸酶。可使用多种蛋白质纯化方法，此类方法是本领域已知的，描述在例如Deutscher，METHODS IN ENZYMOLOGY，182(1990)；Scopes，PROTEIN PURIFICATION：PRINCIPLES AND PRACTICE，Springer-Verlag，New York(1982)中。选定的纯化步骤取决于例如所使用的生产工艺的本质和产生的植酸酶的特定形式。 

通常，细胞培养产生的植酸酶或植酸酶变体(包括根据SEQ ID NO：1 的植酸酶)分泌到培养基中，并可以纯化或分离，例如，通过去除细胞培养基中不需要的成分。在一些情况下，可以以细胞形式产生植酸酶变体，使得必需从细胞裂解物中回收。在此类情况下，使用本领域技术人员常规使用的技术从产生酶的细胞中纯化所述酶。实例包括但不限于：亲和层析(参见例如，Tilbeurgh等人，(1984)FEBS Lett.16：215)；离子交换色谱法(参见例如，Goyal等人，(1991)Biores.Technol.36：37；Fliess等人，(1983)Eur.J Appl.Microbiol.Biotechnol.17：314；Bhikhabhai等人，(1984)J Appl.Biochem.6：336；和Ellouz等人，(1987)Chromatography 396：307)，包括使用高分辨能力材料的离子交换(参见例如，Medve等人，(1998) JChromatography A 808：153)；疏水相互作用色谱(参见例如，Tomaz和Queiroz，(1999)J Chromatography A 865：123)；二相分配(参见例如，Brumbauer等人，(1999)Bioseparation 7：287)；乙醇沉淀；反相HPLC；二氧化硅色谱或阳离子交换树脂色谱法如DEAE；色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；和/或凝胶过滤如使用Sephadex G-75。 

在本发明的一些实施方案中，表达异源植酸酶变体的真菌细胞生长在分批或连续发酵条件下。典型的分批发酵是封闭的系统，其中，培养基的组成是在发酵开始时设定的，并且在发酵过程中不进行人为修改。因此，在发酵开始时用目的生物体接种培养基。在该方法中，允许在不向系统添加任何成分的条件下进行发酵。一般，分批发酵称为“分批”在于添加碳源，和经常尝试控制pH和氧浓度等因素。分批系统的代谢物和生物量组成在不断变化，直到发酵结束。在分批培养中，细胞经历静态延滞期到高生长对数期，并且最终到稳定期，在稳定期生长速率减小或停止。如果不进行处理，稳定期的细胞最后会死亡。通常，对数生长期的细胞生产大量终产物。 

标准分批系统的变化形式是“补料分批发酵”系统，该系统也可用于本发明。在这种典型分批系统的变化形式中，随发酵的进行递增的加入底物。当分解代谢物阻抑倾向于抑制细胞代谢时，以及需要限制培养基中的底物的量时，补料分批系统是有效的。在补料分批系统中难以测量真实的 底物浓度，因此，基于可测量因素(例如，pH、溶解氧和废气如CO₂分压，)的变化进行估计。分批发酵和补料分批发酵是常用的和本领域熟知的。 

连续发酵是开放的系统，其中，将确定的发酵培养基连续的加入生物反应器中，同时移出等量的条件培养基用于处理。连续发酵通常使培养物保持衡定的高密度，细胞主要处于对数生长期。 

连续发酵允许调节影响细胞生长和/或终产物物浓度的一个因子或任何数量的因子。例如，在一个实施方案中，将限制性营养成分(如碳源或氮源)维持在固定速率，而允许调节所有其他参数。在其他系统中，可以连续改变许多影响生长的因子，而保持通过培养基浊度测量的细胞浓度恒定。连续系统力争保持稳态生长条件。因此，在发酵中，细胞的生长速率必须平衡由于取出培养基而引起的细胞损失。调节连续发酵过程的营养和生长因子的方法，以及使产物形成速率最大化的技术是工业微生物领域熟知的。 

在本发明的实施方案中，提供了包含至少一种本发明的植酸酶的酶组合物。本发明的组合物可以按照本领域已知的方法制备，并且可以是液体或干组合物的形式。 

液体组合物不需要含有植酸酶以外的其它物质，通常可以是基本纯化的或至少部分纯化的形式，尽管基本纯化的形式通常是有利的。通常可以加入稳定剂，如甘油、山梨醇或单体丙二醇。液体组合物也可以包含一种或多种其他添加剂，如盐、糖、防腐剂、pH调节剂(即，缓冲剂)、蛋白质或植酸盐(植酸酶底物)。典型的液体组合物是含水的或基于油的浆液。 

干的组合物可以是喷雾干燥组合物，在这种情况下，组合物无需包含干燥形式的酶以外的任何物质。然而，通常，干燥组合物是所谓的颗粒，可以容易的与例如食品或饲料成分混合，或者更优选的，形成预混合物的组分。酶颗粒的颗粒大小优选的是与混合物中的其他组分协调的。 

在一些实施方案中，包括本发明涵盖的植酸酶变体的酶组合物可以任选地用于与任一以下酶或以下酶的组合进行组合：葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环 糊精糖基转移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶(cutinase)、果胶酶、葡萄糖氧化酶、β葡糖苷酶、磷酸酶、β-淀粉酶、水解酶、转移酶、其他植酸酶及其组合。 

在一些实施方案中，植酸酶组合物是食品或动物饲料组合物。食品或动物饲料组合物可以包含浓度为10至15,000U/kg饲料或食品(例如，100-5,000U/kg，200-2,000U/kg，和500-1000U/kg)的植酸酶。植酸酶组合物可用作添加剂，其在家畜和家养动物的消化道内具有活性，例如，家禽、猪、羊驼、美洲野牛、骆驼、牛、栗鼠(chinchilla)、鹿、驴、鸭、鱼、蛙、山羊、鹅、鸡(fowl)、马、美洲驼(llama)、貂、骡、鸵鸟、鸽子、驯鹿(reindeer)、绵羊、火鸡、牦牛、水牛、猫、黑猩猩、狗、雪貂(ferret)、沙鼠(gerbil)、金鱼、豚鼠、仓鼠、猴、鹦鹉、爬行动物和啮齿类动物，以及包括鱼和甲壳动物(例如虾)在内的水生养殖动物。与SEQ ID NO：1的野生型植酸酶相比，本发明的植酸酶变体可以提供对此类动物中可见的蛋白酶的改善的抗性，或者还可以提供在此类动物的消化道中延长的活性。本发明考虑了产生食品或动物饲料的方法，特征是将本发明的植酸酶与所述食品或用于任意此类动物的动物饲料混合。液体组合物可以在其任选的制粒过程后添加到食品或饲料中。在一些实施方案中，动物饲料可包含一种或多种下述组分：a)谷类，例如小粒谷类(如，小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷类，如玉米或高粱；b)谷类的副产品，如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(Distillers Dried Grain Solubles；DDGS)、小麦麸、粗小麦粉、碎麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕仁和柑桔渣；c)获得自例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉油菜(canola)、鱼粉、干燥的血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉(copra)、芝麻来源的蛋白质；d)获得自蔬菜和动物源的油和脂肪；e)矿物质和维生素；f)补充物，如酶、甜菜碱、香料、精油、抗生素生长促进物质、抑制球虫药、益生菌剂和益生素。 

也提供了减少动物粪便中的磷水平的方法，特征是给动物饲喂含有本发明的植酸酶变体的动物饲料，所述植酸酶变体的量可有效转化所述动物 饲料中含有的植酸盐。 

另外，本发明涵盖的植酸酶组合物可用于淀粉水解的方法。可以在淀粉液化步骤、糖化步骤和/或发酵步骤期间添加植酸酶组合物。α-淀粉酶用于在工业淀粉水解工艺的过程中分解淀粉1-4连接键，所述工艺是使用弄碎的植物材料(例如，研磨的谷类)作为原料(例如，发酵工艺、酿造和烘焙)。淀粉酶是分解淀粉必需的，获得足够活性的这些酶有时是有问题的。一段时间以来已知植酸盐对淀粉酶具有抑制作用。因此，包含本发明植酸酶的酶组合物可以用于淀粉水解工艺，减少植酸盐对α-淀粉酶的抑制作用(EP 0 813607B1)。 

植酸酶、植酸盐和较小的磷酸植酸盐衍生物有多种其他用途，用于个人护理产品、医药产品、食品和营养产品，以及多种工业应用，特别是在清洁、纺织、平板印刷和化学领域中。有利的，例如根据本发明的实施方案的植酸酶变体可用于醇发酵，例如用于生产生物燃料。 

植酸酶的用途

如上文所述，本发明还涉及生产如本文所述的植酸酶。 

特别地，本发明还涉及本文公开的氨基酸序列的用途，用于生产有机和无机的磷酸盐化合物。 

因此，本发明还涉及编码植酸酶的核苷酸序列的用途，用于产生表达载体或表达植酸酶的系统。 

此外，本发明涉及此类表达载体或系统的用途，用于生成表达植酸酶的宿主细胞。 

本发明还涉及修饰的宿主细胞的用途，用于生成有机和无机磷酸盐化合物的前体，或生成特定的有机磷酸盐化合物。 

合适的有机和无机磷酸盐化合物包括肌醇五-、四-、三-、二-和单-磷酸。 

合适地，本发明因此提供了生产有机磷酸盐化合物的方法，包括用本发明的植酸酶处理植酸盐。合适地，有机磷酸盐是植酸盐或所有可能的肌 醇二-、三-、四-和五-磷酸的立体异构体。其它合适的有机磷酸盐包括肌醇-四磷酸和肌醇-寡磷酸。在优选的实施方案中，方法是体内的生物技术方法。 

用于生产有机磷酸盐化合物的此类方法可适当的包括以下步骤： 

a)提供包含可表达的转基因的宿主细胞，所述转基因包括本发明的植酸酶； 

b)在适合转基因表达的条件下培养转基因生物；和 

c)从培养物中回收有机磷酸盐化合物。 

化合物可用于多种用途，包括测定植酸酶的特性。一些磷酸肌醇参与作为胞内调控的信号分子，并可用作研究用化学品。 

在另一个方面，提供了生产食品或动物饲料的方法。通常在饲料粉碎机(feed mill)中生产动物饲料，其中，首先将原材料研磨成合适的颗粒大小，然后与适当的添加剂混合。然后，饲料可以作为糊状物或粒状物生产；后续工艺通常涉及这样的方法，其中将温度升高到目标水平，然后将饲料通过模具产生特定大小的粒状物。随后可以添加液体添加剂，例如脂肪和酶。粒状物允许在运输前冷却。生产动物饲料还可以涉及其他步骤，包括在制粒前的挤压或膨胀——特别是通过合适的技术，至少包括使用蒸汽。 

相应的，本发明还提供了编码植酸酶的氨基酸序列的用途，或表达植酸酶的宿主细胞的用途，用于产生在食品或饲料产品生产中使用的植酸酶。在一个方面，提供了如本文所述的氨基酸序列在生产食品或饲料产品的用途。在另一个方面，提供了根据发明的宿主细胞在生产食品或饲料产品的用途。在另一个方面，提供了根据发明的表达载体或系统在生产食品或饲料产品的用途。 

本发明还包括了使用酶作为饲料组分与其它组分组合，向动物递送。 

与其它组分的组合

本发明的酶可用于与其它组分或载体组合。本文已提供了其它组分的 实例。现在讨论各种其它组分。 

用于饲料酶的合适载体包括小麦(粗糙研磨的)。此外，有多种封装技术，包括基于脂肪/蜡包被、添加植物树胶等。 

其它组分的实例包括一种或多种的：增稠剂、胶凝剂、乳化剂、粘合剂、晶体修饰剂、甜味剂(包括人工甜味剂)、流变修饰剂、稳定剂、抗氧化剂、染料、酶、载体、运载体(vehicle)、赋形剂、稀释剂、润滑剂、增香剂、着色物质、悬浮剂、分解剂、颗粒粘合剂等。这些其它组分可以是天然的。可以通过使用化学和/或酶促技术制备这些其它组分。 

如本文使用的，术语“增稠剂或胶凝剂”在本文中用于指通过减慢或阻止不可混合的液体小滴、气体或不可溶固体的颗粒的移动，而防止产品分离的产品。 

如本文使用的，术语“稳定剂”定义为保持产品(例如，食物产品)不随试剂改变的成分或成分的组合。 

如本文使用的，术语“乳化剂”指防止乳液分离的成分(例如，食物产品成分)。 

如本文使用的，术语“粘合剂”指通过物理或化学反应，将产物结合在一起的成分(例如，食品成分)。 

如本文使用的，术语“晶体修饰剂”指影响脂肪或水结晶的成分(例如，食品成分)。 

“载体”或“运载体”意指适合化合物施用的材料，包括本领域已知的任何此类材料，例如任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂等，所述材料是无毒的，且不以有害的方式与组合物的任何组分反应。 

营养学上可接受的载体的实例包括例如：谷物、水、盐溶液、醇、二氧化硅、蜡、石油胶(petroleum jelly)、蔬菜油等。 

赋形剂的实例包括一种或多种微晶纤维素和其它纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、甘氨酸、淀粉、乳糖和高分子量的聚乙二醇。 

分解剂的实例包括一种或多种的：淀粉(优选的是玉米淀粉、土豆淀粉或木薯淀粉)、淀粉羟乙酸钠、交联羧甲基纤维素纳和一些复杂的硅酸 盐。 

颗粒粘合剂的实例包括一种或多种的：聚乙烯吡咯烷酮、羟丙甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、麦芽糖、明胶和阿拉伯树胶(acacia)。 

润滑剂的实例包括一种或多种的：硬脂酸镁、硬脂酸、甘油山嵛酸甘油酯和滑石。 

稀释剂的实例包括一种或多种的：水、乙醇、丙二醇和丙三醇，及其组合。 

其它组分可以同时(例如，当其混合在一起时，或甚至当其通过不同途径递送时)或顺序(例如，可以通过不同的途径递送)的使用。 

如本文中使用的，术语“适合动物或人消费的组分”意指作为或可以作为补充物加入到本发明的组合物中的化合物，所述化合物可以具有营养价值、纤维替代物或对消费者具有普遍的有益效果。 

通过举例，组分可以是益生素(prebiotics)，例如藻酸盐、黄原胶、果胶、豆角胶(locust bean gum，LBG)、菊粉、瓜尔豆胶、半乳寡糖(GOS)、果寡糖(FOS)、乳蔗糖、大豆寡糖、帕拉金糖(palatinose)、异麦芽寡糖、葡糖寡糖和木寡糖。 

食品或饲料物质

化合物可用作食品或饲料，或用于制备食品或饲料物质。在此，术语“食品”使用的是广义含义，覆盖了人类的食品或食物产品，以及动物的食品(即，饲料)。术语“饲料”用于指在家畜饲养中饲喂给动物的产品。在优选的方面，食品或饲料是给单胃动物消费的，例如猪、家禽和鱼。 

食品或饲料可以是溶液或固体的形式——取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。 

食品和饲料成分和补充物

化合物可用作食品或饲料成分。 

如本文中使用的，术语“食品或饲料成分”包括添加到或可以添加到食品和粮食中的制品，也包括可以在广泛多种产品中低水平使用的制品。 

食品成分可以是溶液或固体的形式——取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。 

化合物可以是食品补充物，或者可以添加到食品补充物中。 

食品和饲料组合物

单胃动物的饲料组合物通常包括含植物产物的组合物，所述植物产物含植酸盐。此类组合物包括玉米粉(cornmeal)、大豆粉、菜籽粉(rapeseed meal)、棉籽粉(cottonseed meal)，以及基于玉米、小麦、大麦和高梁的饲料。 

本文描述的植酸酶可以是食品或饲料物质和组合物，或者可以添加到食品或饲料物质和组合物中。 

本发明还提供了制备食品或饲料成分或补充物的方法，方法包括将本发明的方法生产的植酸酶或根据本发明的组合物与另一种食品成分混合。用于制备食品成分的方法也是本发明的另一个方面。上文提出了制备动物饲料的方法。还可以以固体制品的形式添加酶，或者将酶作为饲料添加剂，例如预混合(pre-mix)。通常在混合步骤之前或过程中添加固体形式；而通常在制粒步骤之后添加液体形式。 

形式(form)

可以以任何合适的形式使用本发明的产品和/或化合物，不论其是单独存在的或存在于组合物中。同样地，可以以任何合适的形式使用根据本发明生产的植酸酶(即，成分——例如食品成分、功能性食品成分或药品成分)。 

形式的合适实例包括一种或多种的：片剂、丸剂、胶囊剂、ovules、溶液剂或悬浮剂，其可以含有增香剂或着色剂，用于迅速、延缓、修饰、持续、脉冲或受控释放的应用。 

作为举例，如果产品和/或组合物用作片剂形式——例如用作为功能性 成分——片剂还可以含有一种或多种的赋形剂、分解剂、颗粒粘合剂或润滑剂。 

用于制备形式的营养学可接受的载体的实例包括例如，水、盐溶液、醇、二氧化硅、蜡、石油胶等。 

用于形式的优选的赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milk sugar)或高分子量的聚乙二醇。 

对于含水悬浮液和/或酏剂，植酸酶切割化合物可以与多种甜味剂或增香剂、着色物质或染料；与乳化剂和/或悬浮剂；与稀释剂(例如水、醇、丙二醇和甘油)及其组合相组合。 

形式还可以包括明胶胶囊、纤维胶囊、纤维片剂等。 

提供下列实施例仅出于示例的目的，并非意在以任何方式限制本发明的范围。 

方法和实施例

实施例中使用的酶的命名

植酸酶BP-17(有时称为BP 17)是至少在PCT申请WO 2008/097619中描述的植酸酶，可以从Danisco A/S获得。氨基酸序列在本文中描述为SEQ ID NO：5。 

BP-110(有时称为BP 17变体110，或有时称为BP17-110或BP17 110)是根据本发明的植酸酶，可以从Danisco A/S获得。氨基酸序列在本文中描述为SEQ ID NO：6。 

BP-111(有时称为BP 17变体111，或有时称为BP17-111或BP17 111)是根据本发明的植酸酶，可以从Danisco A/S获得。氨基酸序列在本文中描述为SEQ ID NO：7。 

BP-112(有时称为BP 17变体112，或有时称为BP17-112或BP17 112)是根据本发明的植酸酶，可以从Danisco A/S获得。氨基酸序列在本文中描述为SEQ ID NO：2。 

图5中显示了BP-17(SEQ ID NO：5)、BP-110(SEQ ID NO：6)、BP-111(SEQ ID NO：7)和BP-112(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列。图2 中也显示了BP-112的氨基酸序列。图4中显示了BP-112的核酸序列，为SEQ ID NO：4。 

Phyzyme XP——是来自Danisco A/S的植酸酶。 

Natuphos——是来自BASF的植酸酶。 

Ronozyme P——是来自Novozymes的植酸酶。 

A部分 

实施例1.植酸酶的纯化 

使用N-端与植酸酶融合的6His-标记，来实施植酸酶的纯化。用编码6His-标记的植酸酶的质粒转化的枯草芽孢杆菌，使用添加了20mg/l新霉素的标准LB培养基在37℃和160rpm下摇瓶培养。在该阶段，培养基积累了显著量的植酸酶活性。将约2L培养基调节至pH 8.0，过滤并用于装填了10ml Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen)的柱子。用50mM Tris-HCl缓冲液、300mM NaCl、pH 8.0洗涤柱子，直到OD280跌至0.05以下。然后，用含有250mM咪唑盐酸盐的相同缓冲液洗脱结合的植酸酶。在50mM醋酸钠缓冲液pH 5.0中透析洗脱液，并储存在4℃。然后，将酶溶液施于用20mM醋酸钠缓冲液pH5.0平衡的Resource S柱上，用超过10倍柱体积的0-1M NaCl盐梯度进行洗脱。任选的，在20mM醋酸钠缓冲液pH 5.0中透析洗脱液，之后储存在4℃。 

实施例2.植酸酶活性测定 

在微滴度板中进行植酸酶测定。反应总体积为100微升，含如下所述的缓冲液：10mM植酸盐、1mM氯化钙和0.05％(w/v)Pluronic F68。允许反应在给定温度下进行30分钟，例如在37℃和90℃之间。 

通过将等分试样(通常为5μl)的样品在总体积50μl的磷酸盐检测测定中37℃孵育1h，将从植酸盐中磷酸盐释放作为植酸酶活性的测量进行测定。测定含有给定终浓度的下列化合物：pH 7.0的1M Tris/HCl，0.01％(v/v)Triton X-100，0.025mM ADHP(MoBiTec， 

Germany)，0.2U/ml麦芽糖磷酸化酶，0.25mM麦芽糖，1.25U/ml葡糖氧化酶，0.25U/ml辣根过氧化物酶，1mM EDTA，0.35mg/ml BSA。通过加入30μl的2700U/ml 水中的过氧化氢酶水溶液终止反应。然后，在595nm测量荧光，使用535nm作为激发波长。使用已知浓度的磷酸盐溶液的校准曲线确定磷酸盐的量。一个酶单位定义为每分钟释放1微摩尔磷酸盐。 

为了测定不同pH值下的植酸酶活性，使用下列缓冲液：从pH 2.0至pH 3.5的200mM甘氨酸/HCl，和从pH 4.0至pH 5.5的100mM醋酸钠/醋酸。 

实施例3.比活 

使用根据实施例1纯化的酶评估BP-WT和变体植酸酶的比活。 

使用酶联测定在微滴度板中确定植酸酶活性：在稀释缓冲液(50mM醋酸钠，0.05％Pluronic F-68，1mg/ml BSA)中稀释酶制品。在总体积为80μl的植酸盐测定中孵育等分体积的酶溶液，通常是5μl至10μl。测定含有给定终浓度的以下缓冲液、底物和盐：pH 5.5的200mM醋酸钠，10mM植酸盐，1mM CaCl₂，0.05％(w/v)Pluronic F-68。在BP-WT植酸酶的情况下，测定在37℃孵育30分钟，在变体植酸酶的情况下，在67℃或80℃孵育30分钟。 

通过将等分试样(通常为5μl)的各样品在总体积50μl的磷酸盐检测测定中37℃孵育1h，将从植酸盐中的磷酸盐释放作为植酸酶活性的测量进行测定。测定含有给定终浓度的下列化合物：pH 7.0的1M Tris/HCl，0.01％(v/v)Triton X-100，0.025mM ADHP(MoBiTec， 

Germany)，0.2U/ml麦芽糖磷酸化酶，0.25mM麦芽糖，1.25U/ml葡糖氧化酶，0.25U/ml辣根过氧化物酶，1mM EDTA，0.35mg/ml BSA。通过加入30μl的2700U/ml水中的过氧化氢酶终止反应。然后，在595nm测量荧光，使用535nm作为激发波长。使用已知浓度的磷酸盐溶液的校准曲线确定磷酸盐的量。一个酶单位定义为每分钟释放1微摩尔磷酸盐。 

根据制品在280nm的吸光度和各植酸酶变体各自的消光系数来计算植酸酶浓度。根据Gill和von Hippel，Analytical Biochemistry182：319-326(1989)提供的方法，基于蛋白质的氨基酸组成计算消光系数。 

表1：根据BP-WT，Seq ID No.1的植酸酶变体的比活。如上述，在 67℃和80℃确定植酸酶变体的比活。在上述条件下，BP-WT酶在37℃具有1021U/mg的比活。 

实施例4.植酸酶变体的生成和表征 

使用用于诱变编码植酸酶蛋白质样盒的DNA的不同方法，或PCR诱变，或其他本领域普遍已知的方法，来产生植酸酶变体。这些方法包括上文列举的方法，例如在Morinaga等人，Biotechnology 2：646-649(1984)中；在Nelson和Long，Analytical Biochemistry 180：147-151(1989)中公开的方法；或在WO 92/18645中描述的误差阈值诱变(Error Threshold Mutagenesis)方法。关于诱变PCR，Cadwell和Joyce，PCR Methods Appl.3：136-140(1994)描述了另一种合适的方法。 

在下列一种或多种表达宿主中异源的表达植酸酶变体：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)。 

实施例5.热稳定性 

通过植酸酶变体的失活温度来表征酶变体的热稳定性。通过在pH 5.5，不同温度下孵育10分钟，然后在37℃孵育60分钟后剩余的植酸酶活性，确定失活温度。在pH 3.5和37℃下测量植酸酶活性60分钟，确定剩余的活性。失活温度定义为与在相同条件和室温下，孵育相同的持续时间后的剩余活性相比，剩余活性为50％的温度。为了确定对应于50％剩余活性的温度，根据需要进行从活性数据的外推法和插值法。通过将两个酶的失活 温度相减，以[℃]计算热稳定性差异(TD)。 

表2：根据BP-WT，Seq ID No.1的植酸酶变体的热稳定性。热稳定性的改善表示为变体和野生型(BP-WT)植酸酶之间的热稳定性差异TD，即，TD＝(变体植酸酶的失活温度)-(BP-WT的失活温度)。 

实施例6：热活性 

通过植酸酶变体的温度-活性谱，表征它们的热活性。作为温度-活性谱的测量，定义了T50值，它是与在基本相同条件但处于植酸酶变体的最佳温度下进行的反应中的总酶促底物转化相比，总酶促底物转化为50％时的温度。通过将植酸酶在pH 5.5和不同温度下，在实施例2进一步描述的条件下孵育，来确定温度-活性谱。根据实验数据通过适当的外推法和插值法确定T50值。通过将两个酶的T50值相减，以[℃]计算热活性差异(TAD)。 

表3：根据BP-WT，Seq ID No.1的植酸酶变体的热活性差异(TAD)。热活性的改善表示为变体和野生型(BP-WT)植酸酶之间的T50差异，即，TAD＝T50(变体植酸酶)-T50(BP-WT)。 

实施例7：植酸酶变体的性质综述 

1)表4概况了在之前实施例3、5和6中显示的植酸酶变体的性质：比活、热稳定性和热活性。 

表4：根据BP-WT，Seq ID No.1的不同植酸酶变体的比活、热稳定性和热活性。如实施例3、实施例5和实施例6中分别描述的，获得比活、热稳定性(TD)和热活性差异(TAD)的值。 

B部分 

实施例8：简介 

本发明的优势是提供了具有使其作为饲料酶特别有益和有效的性质的新植酸酶。特别地是，发明涉及本文所述的分离和/或纯化的新型植酸酶多肽，或其功能片段，或其变体或修饰形态，或其修饰形态。发明还提供了编码所述植酸酶的核酸序列。 

为了有效的作为食品或动物饲料的酶添加剂，植酸酶必须组合多种不同的性质。为了能够在动物胃的酸性环境中降解植酸，它在低pH，优选的在宽范围的pH值下必须是有活性的。此外，为了使蛋白质能够耐受在制备饲料(如颗粒饲料)中通常使用的高温，所述蛋白质必须具有高比活，并且优选的具有高热稳定性。 

酶具有广的底物特异性也是重要的，使酶不仅可以水解植酸盐，而且还可以水解植酸盐降解的中间产物，例如肌醇-五磷酸、-四磷酸和-三磷酸。对猪中植酸盐降解的研究显示，这些肌醇寡磷酸另外在小肠和大肠中大部 分不可溶存在，从而不能被动物和肠道微生物产生的碱性磷酸酶接触。已经鉴别了不同酶的底物特异性谱的改变。例如，来自枯草芽孢杆菌的植酸酶产生的肌醇三磷酸基本耐受该酶的进一步水解。 

这些变体适当的表现出对下列任一项的改善的特性：温度稳定性、pH范围、胃蛋白酶稳定性、比活、底物特异性和较宽的底物特异性。本文公开了确定这些特性的合适的方法。 

特别的是，植酸酶特性的改善是针对在食品和饲料加工条件下的酶稳定性，针对在胃的转移过程中的酶稳定性，针对在人或动物的胃和/或肠道中的酶活性和稳定性，使改善的变体特别适合作为饲料补充物使用。因此，此类改善除其它参数外，还包括在升高的温度下稳定性的增加，优选的在高于65℃的温度下，抗蛋白水解消化的稳定性的增加，优选的是消化道的蛋白酶(如，胃蛋白酶)；在低pH下催化活性的增加，优选的在低于pH5.5下的催化活性；以及从植酸盐中释放磷酸基的普遍效率，优选的也从肌醇磷酸盐中释放。 

根据本发明的植酸酶特性的改善是针对在食品和饲料加工中的用途，以及作为食品和饲料产品的添加剂的用途。特别的是，改善是针对在食品和饲料加工条件下的稳定性，针对在胃的转移过程中的稳定性，以及针对在人或动物的胃和/或肠道中的活性和稳定性。此类改善除其它参数外，还包括在升高的温度下稳定性的增加，优选的在高于65℃的温度下；抗蛋白水解消化的稳定性的增加，优选的是消化道的蛋白酶；在低pH下催化活性的增加，优选的在低于pH5.5下的催化活性；以及从植酸盐中释放磷酸基的普遍效率。 

通过酶的失活温度定量在升高温度下的稳定性的增加。失活温度定义为这样的温度，植酸酶在所述温度下孵育一定时期，然后冷却到室温后的剩余活性，是相同植酸酶在相同条件下在室温孵育相同时间的剩余活性的50％。热稳定性差异是两种酶的失活温度之间的℃的差异。 

实施例9：胃蛋白酶稳定性

与Phyzyme XP、Natuphos和Ronozyme P相比，来自布丘氏菌属的植酸酶、变体BP-17、BP-110、BP-111和BP-112在pH2下的胃蛋白酶抗性 

材料和方法 

缓冲液：

胃蛋白酶孵育缓冲液：0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.0，3mg/ml BSA，2.9mg无水氯化钠/mL，0.73mg氯化钙/mL。对于胃蛋白酶溶液，制备的孵育缓冲液分别含有500、1000、3000、6000或10000U/ml的胃蛋白酶(SigmaP-7000，10000U/mg对应27mg/ml)。一个胃蛋白酶单位定义为可以在pH 2.0和37℃下每分钟产生0.001的ΔOD₂₈₀的酶量，使用血红蛋白(Food Chemical Codex)作为底物，测量为TCA-可溶性产物。 

植酸酶测定缓冲液：醋酸缓冲液250mM，pH 5.5。 

含BSA的植酸酶测定缓冲液：醋酸缓冲液250mM，pH 5.5，含3mg/mlBSA。 

对增加的胃蛋白酶浓度的抗性：

所有酶的装配都是相同的：制备六种含酶的样品(一式两份)：4种样品的缓冲液中具有增加量的胃蛋白酶(pH2)，一种样品在孵育缓冲液中不含胃蛋白酶(pH2)，而一种阳性对照样品在含BSA的测定缓冲液中含有酶(pH5.5)。 

对于每个样品，将900μl含有或不含增量的胃蛋白酶的孵育缓冲液或900μl测定缓冲液与100μl酶溶液混合，然后在40℃孵育。在孵育120分钟后，取出100μl，并与900μl测定缓冲液混合。立即按ISO起草的国际标准ISO/DIS 30024所述，根据磷酸盐标准曲线，在pH 5.5分析样品的植酸酶。 

结果

胃蛋白酶抗性

布丘氏菌属变体都表现出在pH 2下针对胃蛋白酶的优秀稳定性。相反，Natuphos的活性在500U/ml的胃蛋白酶浓度下已经显著降低，在胃 蛋白酶浓度为3000U/ml时具有进一步下降的活性，具有约45％回收的平稳状态。Ronozyme P的回收甚至更低，在仅500U/mg的胃蛋白酶浓度下有回收低于20％的降低(图6A&表4)。 

图6显示了源自布丘氏菌属的植酸酶、变体BP-17、BP-110、BP-111和BP-112，以及Phyzyme XP、Natuphos和Ronozyme P对增加浓度的胃蛋白酶的抗性。数据是相对于在不含胃蛋白酶的pH2下孵育。A：所有的数据点，B：相同的数据，但仅显示了多于70％的回收。 

胃蛋白酶水平

BP-17

BP-17 v.110

BP-17 v.111

BP-17 v.112

Phyzyme XP

Natuphos

Ronozyme P，新

0

100％

100％

100％

100％

100％

100％

100％

500

87％

96％

98％

85％

61％

19％

1000

81％

98％

96％

85％

51％

16％

3000

82％

96％

94％

84％

93％

44％

17％

6000

82％

92％

89％

80％

89％

45％

18％

10000

86％

95％

94％

79％

98％

46％

21％

表5：图6中显示的相同的数据 

在布丘氏菌属变体之间存在轻微的差别，其中变体BP-17 var.110表现出最佳的稳定性，在最高胃蛋白酶浓度10000U/mL孵育2小时后，保留了95％活性(图6B)。相比，BP-17在孵育2小时后，显示出约85％的回收。 

布丘氏菌属植酸酶也表现出优秀的酸稳定性。在pH2或pH5.5下孵育2小时后，在pH 5.5下测量活性，比较上述活性显示所有四种布丘氏菌属植酸酶在pH2孵育2小时的过程中没有丧失活性，而Phyzyme XP、Natuphos和新Ronozyme P都表现出轻微至显著的活性降低(表6)。 

BP-17

BP-17 v.110

BP-17 v.111

BP-17 v.112

Phyzyme XP

Natuphos

Ronozyme P，新

测定缓冲液

100％

100％

100％

100％

100％

100％

100％

pH 2，无蛋白酶

101％

102％

106％

120％

83％

90％

67％

表6：在pH2或pH5.5下在缓冲液中孵育2小时后，在pH 5.5下测量的活性。数值是相对于在pH 5.5下孵育的样品的活性。 

数据总结

根据本发明的布丘氏菌属植酸酶变体在pH2、37℃和10000U/ml的胃蛋白酶下孵育2小时后，表现出超过75％的回收，这是与在不含胃蛋白酶的相同条件下孵育的样品的活性相比。   

实施例10：酶活性的回收

评估酶活性的回收 

材料和方法

在此，我们评估了小麦配方的酶制粒后的酶活性回收。将酶喷雾在颗粒状小麦上，并在与饲料混合前干燥，然后进行制粒工艺。 

将液体酶配制在全研磨的小麦上，干燥成干物质含量约90％。使用Technological Institute in Kolding的制粒装置，测试在制粒工艺的热压力过程中酶的失活(图示于图7中)。将测试样品添加到10kg预混物中，混合10分钟。然后，在预处理(conditionng)/蒸之前，将10kg的预混物添加到150kg饲料中(大卧式搅拌机)，混合15分钟。在制粒前，在90℃/95℃处理饲料30秒。在阶式搅拌机的出口处测量温度。在脱离制粒压力后立即将颗粒冷却至室温。 

根据实施例10陈述的方法测量植酸酶活性。 

在制粒前，每克糊状饲料中的植酸酶活性是5单位。 

结果

结果显示在图8-10中。 

在图8中，公开了根据本发明的三种植酸酶B变体制粒实验的结果。将酶配制到全研磨的小麦上，干燥至约10％水含量。此处，在90℃下BP 17var 111制粒后回收的植酸酶活性是90％，相比BP 17在90℃下回收为19％。 

作为参照的是Phyzyme XP，配制在全研磨小麦上的一种大肠杆菌植酸酶。结果显示在图9中。此处，从三批在全研磨小麦上配制的PhyzymeXP，在90℃下制粒后回收的植酸酶活性是47％。 

还测试了Ronozyme。产品以包被的形式出售，保护所述酶免受制粒 过程中的热。在该实验中，从包被的产品中提取了植酸酶，配置在全研磨小麦(whole grounded wheat)上，以研究没有保护的植酸酶分子的热稳定性。结果显示在图10中。 

数据总结

配制在小麦上的本发明的布丘氏菌属植酸酶变体，在90℃下制粒后，显示了大于70％的回收。   

实施例11.植酸的降解 

植酸酶降解植酸的研究结果 

溶液

在孵育中使用了三种不同的缓冲液。如下： 

250mM醋酸，pH 5.5； 

250mM醋酸M pH 3.5；和 

250mM HCl甘氨酸，pH 2.5。 

在测定缓冲液中稀释孵育中使用的所有植酸酶，至酶水平为1U/ml。 

在孵育中使用的植酸盐底物溶液为1％植酸盐(1g/100ml缓冲液)。 

在用于稀释植酸酶的相同缓冲液中制备底物，保持反应中pH水平恒定。 

由1M HCl终止反应。 

孵育

孵育体积是：1.5或3.0ml植酸盐+0.25ml酶+3.25或1.75ml缓冲液，37℃，总体积5.0ml。 

在不同的时间点(0、30、60和90分钟)取0.5ml的二级样品(sub-sample)。 

在二级取样前，对于各个二级样品，在eppendorf管中制备0.2ml 1MHCl。通过，将孵育的二级样品与HCl混合，终止酶反应。将0.7ml的各个二级样品储存在4℃，直到HPLC分析。 

HPLC方法

通过高性能离子色谱(HPIC)分析植酸盐和肌醇异构体。该方法描述在Skoglund和Carlsson等人，(J.Agric.Food Chem.，45(1997)，451-436 5.J.Agric.Food Chem.，46(1998)，1877-1882；和J.Agric.Food Chem.，49(2001)，11695-1701)中。使用的柱子是Dionex的强阴离子交换柱(4x250mm)，具有4x50mm的预柱。溶剂A：MilliQ水；溶剂B：在水中制备的1N HCl。梯度是在30分钟内从2.5％至49％B，然后是3分钟50％的等度和2分钟2.5％的等度，流量为0.8ml/min。各运行35分钟。由于植酸酶不产生太多理论上可能的IP异构体，可以将运行降低至共计25分钟。洗脱物是串联衍生的，含0.1％Fe(NO₃)₃·9HO₂和2％高氯酸(HClO₄)的水溶液，流量为0.4ml/min。在290nm检测植酸盐和IP异构体为阳性峰。这是由于植酸盐-Fe³⁺-ClO₄ ^-复合体的形成。60％的高氯酸溶液购自Sigma。 

结果

结果显示在图11-14中。 

数据总结

所有本发明的酶都表现出有利的性质。 

本发明的植酸酶在所有的测试pH水平下都可以分解植酸盐。 

本发明的酶在pH5.5下活性很高。 

BP 110和BP 111在pH 2.5和3.5下表现出相似的活性。 

在pH 2.5和pH3.5下90分钟后，BP 110和BP 111分解加入到孵育中的所有植酸盐。 

在pH 2.5和3.5下90分钟后，BP 112分解75％的加入到孵育中的植酸盐。 

本发明的酶在pH 2.5表现出比Ronozyme和Natuphos更好的特性(参见至少图14)(酶浓度高于图11-13中可见的，因此，布丘氏菌属BP 17在此作为对照)。 

实施例12.植酸在液化中的水解 

确定植酸： 

植酸含量：通过调节5％糊浆(如果其为干燥样品)的pH至pH 10从样品中提取植酸，然后通过使用离子交换柱的HPLC方法确定。使用NaOH梯度系统从柱上洗脱植酸。然后，通过与植酸标准比较，计算液体中的植酸含量。 

结果 

研究了温度对不同的热稳定的BP变体植酸酶(即，BP110、BP111和BP112)水解全研磨玉米液化物(liquefact)的植酸的影响，所述液化物来自传统的干磨液化工艺(来源：Illinois River Energy，Monroe，Illinois)。将32％ds(“干固体”)的全研磨玉米ds玉米液化物的pH调节到pH5.0，置于维持在85℃和89℃的水浴中。在温度平衡后，按FTU/g ds.玉米添加BP-植酸酶。然后，在20分钟取样，通过添加10mM氢氧化钠(稀释1-10倍)终止酶反应。然后过滤稀释的样品，通过HPLC分析它们的植酸盐衍生物谱(IP1至IP6)。图15和16中的HPLC色谱清楚地显示所有3种变体的植酸酶在大于85℃的温度下都催化植酸的水解。全研磨玉米液化物中的植酸含量(植酸(IP6)和中间物IP1至IP5)是约1.7％ds.玉米，图15中的数据显示，在目前的液化条件下，超过95％的植酸被热稳定的植酸酶水解。显著地，在89℃孵育的样品的HPLC谱显示，BP-111植酸酶变体表现出比其它两种变体的植酸酶更高的热稳定性  (参见图16；BP-110和BP-112)。 

概述方面

现在通过编号的段落描述本发明的概述方面。 

1、植酸酶变体，具有植酸酶活性以及不同于野生型布丘氏菌属物种植酸酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列，其中植酸酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：1相比，包括至少一个变异，且其中至少一个变异发生在选自SEQ ID NO：1的75、76和374位的位置上，且其中每个所述至少一个变异可以是相同的或不同的，并可以包括取代、缺失或插入。 

2、第1段的植酸酶，其中至少一个变异包括一个、两个或全部三个位置的变异，所述位置选自：S75、Q76和A374。 

3、第2段的植酸酶，其中至少一个变异包括选自以下的变异：S75P、Q76R和A374P。 

4、第1-3段的植酸酶，其中至少一个变异还包括在一个或多个选自以下位置的变异：N37、G77、H160、F164、T171、S188、G192、K198、A235、Q256和/或P367。 

5、第4段的植酸酶，其中至少一个变异包括选自以下的变异：N37Y、G77S、H160R、F164E、F164S、T171V、T171I、S188P、G192A、K198R、A235V、Q256P、Q256A、Q256E和/或P367L。 

6、第1-5段的植酸酶，其中至少一个变异还包括在一个或多个选自以下位置上的变异：A89、D92、T134、F164、T176、A178、K207、A209、S248、Q256、A261和/或N270。 

7、第6段的植酸酶，其中至少一个变异包括在一个或多个选自以下位置上的变异：A89T、D92A、T134I、F164S、T176K、A178P、K207E、A209S、S248L、Q256Y、A261E和/或N270K。 

8、第7段的植酸酶，其中所述植酸酶包括SEQ ID NO：2的序列。 

9、第1-8段任一段的植酸酶，其中所述植酸酶包括含有选自以下的变异的序列： 

a)N37Y，S75P，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K198R，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

b)N37Y，G77S，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K198R，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

c)N37Y，S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171I，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

d)N37Y，A89T，D92A，T134I，F164E，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256P，A261E，N270K，A374P 

e)S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171I，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

f)N37Y，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171I，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

g)N37Y，Q76R，A89T，D92A，T134I，F164S，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P 

h)S75P，A89T，D92A，T134I，F164E，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

i)S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，P367L，A374P 

j)N37Y，A89T，D92A，T134I，F164E，T171I，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

k)N37Y，Q76R，A89T，D92A，T134I，F164E，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

l)N37Y，Q76R，A89T，D92A，T134I，F164E，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P 

m)N37Y，S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，F164E，T171V，T176K，A178P，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P 

n)N37Y，S75P，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

o)N37Y，A89T，D92A，T134I，H160R，F164S，T171I，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256E，A261E，N270K，A374P 

p)A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

q)N37Y，S75P，A89T，D92A，T134I，H160R，F164S，T171V，T176K，A178P，S188P，K207E，A209S，S248L，Q256H，A261E，N270K，A374P 

r)N37Y，S75P，A89T，D92A，T134I，F164S，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P 

s)S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P；和 

t)N37Y，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164S，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

10、植酸酶，其与第1-9段的任一项的植酸酶具有至少最小百分比的序列同一性和/或百分比同源性，其中最小百分比同一性和/或同源性选自至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％。 

11、第1-10段的任一项的植酸酶，与SEQ ID NO：1的植酸酶相比，具有至少一种改善的性质，其中改善的性质选自：增加的比活；对一种或多种蛋白酶的降低的敏感度；增加的热活性；增加的热稳定性；在酸性pH 中增加的稳定性；在碱性pH中增强的稳定性；增加的饲料加工稳定性。 

12、第10段的植酸酶，其中至少一种改善的性质是对一种或多种在动物中发现的蛋白酶的降低的敏感度，所述动物选自：人、羊驼、美洲野牛、骆驼、牛、鸡、家禽、栗鼠、鹿、驴、鸭、鱼、蛙、山羊、鹅、鸡(fowl)、马、美洲驼、貂、骡、鸵鸟、鸽子、驯鹿、绵羊、甲壳动物、猪、火鸡、牦牛、水牛、猫、黑猩猩、狗、雪貂、沙鼠、金鱼、豚鼠、仓鼠、猴、鹦鹉、爬行动物和啮齿类动物。 

13、第1-11段任一项的植酸酶，其与SEQ ID NO：1的植酸酶相比，在动物的消化道中具有延长的活性，所述动物选自：人、羊驼、美洲野牛、骆驼、牛、鸡、家禽、栗鼠、鹿、驴、鸭、鱼、蛙、山羊、鹅、鸡(fowl)、马、美洲驼、貂、骡、鸵鸟、鸽子、驯鹿、绵羊、甲壳动物、猪、火鸡、牦牛、水牛、猫、黑猩猩、狗、雪貂、沙鼠、金鱼、豚鼠、仓鼠、猴、鹦鹉、爬行动物和啮齿类动物。 

14、编码第1-13段的任一项植酸酶的核酸。 

15、包括第14段的核酸的载体。 

16、包括第14段的核酸的宿主细胞。 

17、包括第1-13段任一项的至少一种植酸酶的酶组合物。 

18、包括第1-13段任一项的至少一种植酸酶的酶组合物，其中所述组合物可用于淀粉液化。 

19、在宿主细胞中生产第1-13段任一项的植酸酶变体的方法，包括： 

a)用DNA构建体转化宿主细胞，所述DNA构建体包括编码第1-13段任一项植酸酶的核酸，和 

b)在合适的培养基中培养转化的宿主细胞。 

20、第19段的方法，其中宿主细胞选自真菌细胞、细菌细胞或植物细胞。 

21、植酸酶变体，具有植酸酶活性以及不同于野生型布丘氏菌属物种植酸酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列，其中植酸酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：1相比，包括至少一个变异，且其中变体在至少一 个或多个下列位置上具有变异：70、193、197、221和407。优选的，变体在至少两个或多个下列位置上具有变异：70、193、197、221和407。优选的，变体在至少三个或多个下列位置上具有变异：70、193、197、221和407。优选的，变体在至少四个或多个下列位置上具有变异：70、193、197、221和407。优选的，变体至少在下列位置上具有变异：70、193、197、221和407。 

22、第21段的植酸酶，其中变体至少具有下列变异：N70Y、H193R、F197E、S221P和A407P。 

23、生产食品或动物饲料的方法，包括将第1-13或21-22段的任一项的多肽，或者根据第17或第18段的酶组合物，或者通过第19或20段的方法制备的酶组合物，与另一种食品或饲料成分混合，形成所述食品或动物饲料的步骤。 

24、生产食品或动物饲料的方法，包括将第1-13或21-22段的任一项的多肽，或者根据第17或第18段的酶组合物，或者通过第19或20段的方法制备的酶组合物，以液体形式喷雾到所述食品或动物饲料上的步骤。 

25、生产食品或动物饲料的方法，包括将第1-13或21-22段的任一项的多肽，或者根据第17或第18段的酶组合物，或者通过第19或20段的方法制备的酶组合物，作为干产物与所述食品或动物饲料混合的步骤。 

26、生产动物饲料的方法，包括将第1-13或21-22段的任一项的多肽，或者根据第17或第18段的酶组合物，或者通过第19或20段的方法制备的酶组合物，与另一种食品或饲料成分混合，形成所述动物饲料的步骤。 

27、生产动物饲料的方法，包括将第1-13或21-22段的任一项的多肽，或者根据第17或第18段的酶组合物，或者通过第19或20段的方法制备的酶组合物，以液体形式喷雾到所述动物饲料上的步骤。 

28、生产动物饲料的方法，包括将第1-13或21-22段的任一项的多肽，或者根据第17或第18段的酶组合物，或者通过第19或20段的方法制备的酶组合物，作为干产物与所述动物饲料混合的步骤。 

29、食品或动物饲料的组合物，包括i)根据第1-13或21-22段的任 一项的植酸酶，或根据第17或第18段的酶组合物，或者通过第19或20段的方法制备的酶组合物，和/或ii)通过根据第23-28段的任一项方法生产的食品或动物饲料。 

30、动物饲料组合物，包括i)根据第1-13或21-22段的任一项的植酸酶，或根据第17或第18段的酶组合物，或者通过第19或20段的方法制备的酶组合物，和/或ii)通过根据第23-28段的任一项方法生产的动物饲料。 

31、根据第1-13或21-22段的任一项的植酸酶多肽，或根据第17或第18段的酶组合物，或者通过第19或20段的方法制备的酶组合物，在食品或动物饲料中的用途。 

32、根据第1-13或21-22段的任一项的植酸酶多肽，或根据第17或第18段的酶组合物，或者通过第19或20段的方法制备的酶组合物，在动物饲料中的用途。 

33、降低动物粪便中的磷水平的方法，特征是用根据第1-13或21-22段的任一项的植酸酶多肽，或根据第17或第18段的酶组合物，或者通过第19或20段的方法制备的酶组合物，或用根据第29或30段的饲料喂养动物，其中所述植酸酶的量可有效地转化所述动物饲料中含有的植酸盐。 

34、根据第1-13或21-22段的任一项的植酸酶多肽，或根据第17或第18段的酶组合物，或者通过第19或20段的方法制备的酶组合物，或根据第29或30段的饲料的用途，所述用途是制备动物饲料，以降低用所述植酸酶多肽喂养的动物粪便中的磷水平。 

上文说明书提及的所有出版物，和在所述出版物中引用的参考资料，都通过引用整合到本文中。在不脱离本发明的范围和精神的条件下，本发明描述的方法和系统的多种修饰和变化对本领域技术人员都是显而易见的。虽然结合了特定的优选实施方案描述本发明，但是应该理解要求保护的发明不应过度的限制于此类特定的实施方案。实际上，预期已描述的用于执行发明的方式的多种修饰都落入下列权利要求的范围，所述修饰对分子生物学或相关领域的技术人员是显而易见的。 

Claims (33)

1.植酸酶变体，其具有植酸酶活性以及不同于由SEQ ID NO：1所示的野生型布丘氏菌属物种植酸酶氨基酸序列的氨基酸序列，其中植酸酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：1相比包括变异，且其中植酸酶序列变异选自： 

a)N37Y，S75P，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K198R，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

b)N37Y，S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171I，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

c)S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171I，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

d)S75P，A89T，D92A，T134I，F164E，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

e)S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，P367L，A374P 

f)N37Y，S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，F164E，T171V，T176K，A178P，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P 

g)N37Y，S75P，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，K207E，A209S，A235V，S248L，Q256Y，A261E，N270K，A374P 

h)N37Y，S75P，A89T，D92A，T134I，H160R，F164S，T171V，T176K，A178P， 

S188P，K207E，A209S，S248L，Q256H，A261E，N270K，A374P 

i)N37Y，S75P，A89T，D92A，T134I，F164S，T171V，T176K，A178P，S188P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P或 

j)S75P，Q76R，A89T，D92A，T134I，H160R，F164E，T171V，T176K，A178P，G192A，K207E，A209S，S248L，Q256A，A261E，N270K，A374P。 

2.根据权利要求1的植酸酶变体，其中植酸酶变体具有的失活温度比野生型布丘氏菌属物种植酸酶的失活温度高至少22.4℃，其中失活温度是这样的温度，在该温度下，植酸酶在pH5.5，37℃孵育10分钟后的剩余活 性达到在其孵育前的植酸酶活性的50％。 

3.编码权利要求1或2的植酸酶变体的核酸。 

4.包括权利要求3的核酸的载体。 

5.包括权利要求3的核酸或权利要求4的载体的宿主细胞。 

6.在宿主细胞中产生权利要求1或2的植酸酶变体的方法，其包括： 

a)用DNA构建体转化宿主细胞，所述DNA构建体包含编码权利要求1或2的植酸酶变体的核酸，和 

b)在合适的培养基中培养转化的宿主细胞。 

7.权利要求6的方法，其中宿主细胞是真菌细胞、细菌细胞或植物细胞。 

8.根据权利要求6或权利要求7的方法制备的植酸酶变体。 

9.酶组合物，其包括权利要求1、2和8的任一项的至少一种植酸酶变体，另外包括一种或多种葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精糖基转移酶、脂肪酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、另一种植酸酶或其任意的组合。 

10.权利要求9的酶组合物，其中包括α-淀粉酶。 

11.根据权利要求1、2和8的任一项的植酸酶变体，或权利要求9或权利要求10的酶组合物在淀粉液化、糖化、发酵或同时糖化-发酵中的用途。 

12.权利要求11的用途，其中淀粉液化、糖化、发酵或同时糖化-发酵是用于生产发酵醇。 

13.权利要求12的用途，其中醇是乙醇或丁醇。 

14.权利要求11、12和13中任一项的用途，其中对底物进行淀粉液化、糖化、发酵或同时糖化-发酵。 

15.权利要求14的用途，其中底物包括淀粉。 

16.权利要求14的用途，其中底物包括谷物或谷类。 

17.权利要求15的用途，其中底物包括谷物或谷类。

18.权利要求16或17的用途，其中谷物或谷类是小麦、大麦、黑麦、 燕麦、玉米、高粱、玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)、小麦麸、粗小麦粉、碎麦粉、稻、燕麦壳、棕仁、柑桔渣或其组合。 

19.权利要求18的用途，其中稻包括米糠或稻壳。 

20.根据权利要求1、2和8的任一项的至少一种植酸酶变体作为食品或饲料添加剂的用途。 

21.根据权利要求1、2和8的任一项的至少一种植酸酶变体作为含有干酒糟及可溶物(DDGS)的食品或饲料添加剂的用途。 

22.生产食品或动物饲料的方法，包括将根据权利要求1、2和8的任一项的至少一种植酸酶变体，或根据权利要求9或权利要求10的酶组合物，与另一种食品或饲料成分混合，形成所述食品或动物饲料的步骤。 

23.生产食品或动物饲料的方法，包括将液体形式的根据权利要求1、2和8的任一项的至少一种植酸酶变体，或根据权利要求9或权利要求10的酶组合物喷雾到所述食品或动物饲料上的步骤。 

24.生产食品或动物饲料的方法，包括将作为干产物的根据权利要求1、2和8的任一项的至少一种植酸酶变体，或根据权利要求9或权利要求10的酶组合物与所述食品或动物饲料混合的步骤。 

25.生产动物饲料的方法，包括将根据权利要求1、2和8的任一项的至少一种植酸酶变体，或根据权利要求9或权利要求10的酶组合物，与另一种食品或饲料成分混合，形成所述动物饲料的步骤。 

26.生产动物饲料的方法，包括将液体形式的根据权利要求1、2和8的任一项的至少一种植酸酶变体，或根据权利要求9或权利要求10的酶组合物喷雾到所述动物饲料上的步骤。 

27.生产动物饲料的方法，包括将作为干产物的根据权利要求1、2和8的任一项的至少一种植酸酶变体，或根据权利要求9或权利要求10的酶组合物与所述动物饲料混合的步骤。 

28.食品或动物饲料的组合物，其包括i)根据权利要求1、2和8的任一项的至少一种植酸酶变体，或根据权利要求9或权利要求10的酶组合物，和/或ii)通过根据权利要求22-27的任一项的方法生产的食品或动物 饲料。 

29.动物饲料组合物，其包括i)根据权利要求1、2和8的任一项的至少一种植酸酶变体，或根据权利要求9或权利要求10的酶组合物，和/或ii)通过根据权利要求22-27的任一项的方法生产的食品或动物饲料。 

30.根据权利要求1、2和8的任一项的至少一种植酸酶变体，或根据权利要求9或权利要求10的酶组合物在食品或动物饲料中的用途。 

31.根据权利要求1、2和8的任一项的至少一种植酸酶变体，或根据权利要求9或权利要求10的酶组合物在动物饲料中的用途。 

32.降低动物粪便中的磷水平的方法，特征是用根据权利要求1、2和8的任一项的至少一种植酸酶变体，或根据权利要求9或权利要求10的酶组合物，或根据权利要求22-27的任一项的方法制备的饲料，或根据权利要求28或29的组合物喂养动物，其中所述植酸酶的量有效地转化所述动物饲料中含有的植酸盐。 

33.根据权利要求1、2和8的任一项的至少一种植酸酶变体，或根据权利要求9或权利要求10的酶组合物，或根据权利要求22-27的任一项的方法制备的饲料，或根据权利要求28或29的组合物的用途，用于制备动物饲料，以降低用所述植酸酶多肽喂养的动物粪便中的磷水平。 

Images