CN105992819B - 蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种修饰的GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，其中相较于亲本GH10木聚糖酶，所述修饰的GH10木聚糖酶或其片段具有提高的热稳定性，所述亲本GH10木聚糖酶已在以下位置中的至少两处被修饰：7、33、79、217和298，其中编号基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸编号。具体地讲，根据本发明的所述修饰的木聚糖酶具有以下修饰：N7D；T33V；K79Y、K79V、K79F、K79I、K79L或K79M(优选地K79Y、K79F或K79V，更优选地K79Y)；A217Q、A217E、A217P、A217D或A217M(优选地A217Q、A217E或A217P，更优选地A217Q)；和T298Y、T298F或T298W(优选地T298Y或T298F，更优选地T298Y)。

Description

蛋白质
发明领域
本发明涉及新型的热稳定木聚糖酶；所述木聚糖酶在下列应用中的用途：包括用于饲料原料、酿造或制麦芽、含阿拉伯糖木聚糖的原材料(如基于谷物的材料)的处理中，例如用于生物燃料或其它发酵产品(包括生化物质，例如生物基异戊二烯)的制备中和/或用于小麦面筋-淀粉分离行业中；使用这些木聚糖酶的方法；以及包含所述木聚糖的组合物(诸如饲料添加剂组合物)。
发明背景
多年来，内切-β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)(本文中称为木聚糖酶)一直用于修饰源自植物细胞壁材料的复合碳水化合物。本领域众所周知的是，不同的木聚糖酶(源自不同微生物或植物)的功能差异非常大。木聚糖酶是给予可将直链多糖β-1,4-木聚糖降解成低聚木糖或木糖，因而使半纤维素(植物细胞壁的主要组分之一)分解的酶类型的名称。
基于结构和遗传信息，木聚糖酶被分类为不同糖苷水解酶(GH)家族(Henrissat,(1991)Biochem.J.280,309-316)。
最初所有已知且表征的木聚糖酶属于家族GH10或GH11。然后进一步的工作鉴别了属于家族GH5、GH7、GH8和GH43的多种其它类型的木聚糖酶(Collins等人，(2005)FEMSMicrobiol Rev.,29(1),3-23)。
迄今为止，GH11家族与所有其它GH家族都不同，它是唯一一个仅由木聚糖特异性木聚糖酶组成的家族。GH11木聚糖酶的结构可被描述为β-果冻卷(β-Jelly roll)结构或全β链夹心折叠结构(Himmel等人，1997Appl.Biochem.Biotechnol.63-65,315-325)。GH11酶具有约20kDa的催化结构域。
GH10木聚糖酶具有分子量范围为32-39kDa的催化结构域。GH10木聚糖酶的催化结构域的结构由八重β/α桶状结构组成(Harris等人，1996–Acta.Crystallog.Sec.D 52,393-401)。
已获知大量GH10家族酶的三维结构，首先被解析的是以下酶的三维结构：变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)木聚糖酶A(Derewenda等人，J Biol Chem 1994Aug 19；269(33)20811-4)、粪肥纤维单胞菌(C.fimi)内切聚糖酶Cex(White等人，Biochemistry1994Oct 25；33(42)12546-52)以及日本纤维弧菌(Cellvibrio japonicus)Xyn10A(此前为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)亚种木聚糖酶A)(Harris等人，Structure1994Nov 15；2(11)1107-16.)。作为宗族GHA的成员，它们具有经典的(α/β)8TIM桶状折叠，其中两个关键活性位点谷氨酸位于β链4(酸/碱)和7(亲核体)的C末端(Henrissat等人，Proc Natl Acad Sci U S A 1995Jul 18；92(15)7090-4)。
已在充分表征且纯的底物上开展对木聚糖酶功能进行表征的全面研究(Kormelink等人，1992，“Characterisation and mode of action of xylanases andsome accessory enzymes”，博士论文，Agricultural University Wageningen,Holland(第175页，英语和荷兰语摘要))。这些研究表明，对于阿拉伯木聚糖(AX)的木糖主链的置换而言，不同木聚糖酶具有不同特异性要求。一些木聚糖酶需要三种未置换的木糖残基来水解木糖主链；其它需要仅一种或两种。这些特异性差异的原因被认为归因于催化结构域内的三维结构，这继而取决于木聚糖酶的一级结构，即氨基酸序列。然而，迄今为止尚未记载当木聚糖酶在复杂环境(诸如植物材料，例如饲料原料)中发挥作用时，氨基酸序列中的这些差异会转换为木聚糖酶功能的差异。
植物材料中(例如小麦中)的木聚糖酶底物传统上被划分为两种级分：水不可提取的AX(WU-AX)和水可提取的AX(WE-AX)。对于为什么有两种不同AX级分，已有许多解释。早期文献D’Appolonia和MacArthur(1976,Cereal Chem.53.711-718)以及Montgomery和Smith(1955,J.Am.Chem.Soc.77.3325-332)描述了WE-AX与WU-AX之间的置换度有着极大差异。WE-AX中存在最高置换度。这用于解释为什么一些AX是可提取的。高置换度使聚合物变得可溶，相比之下，较低置换度将在聚合物之间形成氢键，从而导致沉淀。
不同的木聚糖酶的功能差异被认为归因于木聚糖酶特异性的差异，因此它们偏好WU-AX底物或WE-AX底物。
已经报道了来自近100种不同生物体(包括植物、真菌和细菌)的木聚糖酶。木聚糖酶被分类为超过40种糖基水解酶家族中的若干种。糖基水解酶(包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶和其它糖酶)基于诸如氨基酸序列、其三维结构以及其催化位点几何形状等特性来分类(Gilkes等人，1991,Microbiol.Reviews 55:303-315)。
附图简述
图1A示出了本发明木聚糖酶(FveXyn4)的多肽序列(SEQ ID No.26)。加下划线的(小写体)序列部分表示N端信号肽可在酶成熟之被切割。以粗斜体示出的氨基酸也可在酶完全成熟之前通过翻译后修饰被切割。在一些实施方案中，该序列可为主链序列。
图1B示出了本发明木聚糖酶(FveXyn4)的多肽序列(SEQ ID No.27)。以粗斜体示出的氨基酸也可在酶完全成熟之前通过翻译后修饰被切割。在一些实施方案中，该序列可为主链序列。
图1C示出了本文称为FveXyn4的木聚糖酶的多肽序列(SEQ ID No.1)。这是酶的活性形式。在本文中其可被称为酶的成熟形式(在一些实施方案中，该序列为主链序列)。
图2A示出了编码本发明木聚糖酶(FveXyn4)的核苷酸序列(SEQ ID No.24)。加粗的小写体核苷酸示出了内含子序列。编码信号序列的序列以粗体(大写体)显示。
图2B示出了编码本发明木聚糖酶(FveXyn4)的核苷酸序列(SEQ ID No.25)。编码信号序列的序列以粗体(大写体)显示。
图2C示出了编码本文称为FveXyn4的木聚糖酶的核苷酸序列(SEQ ID No.2)。
图3A示出了本发明木聚糖酶(FoxXyn2)的多肽序列(SEQ ID No.28)。加下划线的(小写体)序列部分可表示N端信号肽可在酶成熟之被切割。以粗斜体示出的氨基酸也可在酶完全成熟之前通过翻译后修饰被切割。在一些实施方案中，该序列为主链序列。
图3B示出了本发明木聚糖酶(FoxXyn2)的多肽序列(SEQ ID No.29)。以粗斜体示出的氨基酸也可在酶完全成熟之前通过翻译后修饰被切割。该序列可为蛋白质的活性形式，并且可为蛋白质的一种活性形式。在本文中其可被称为酶的成熟形式。在一些实施方案中，该序列为主链序列。
图3C示出了本文称为FoxXyn2的木聚糖酶的多肽序列(SEQ ID No.3)。这是酶的另一种活性形式。在一些实施方案中，在本文中其可被称为酶的成熟形式。在一些实施方案中，该序列为主链序列。
图4A示出了编码本发明木聚糖酶(FoxXyn2)的核苷酸序列(SEQ ID No.30)。加粗的小写体核苷酸示出了内含子序列。编码信号序列的序列以粗体(大写体)显示。
图4B示出了编码本发明木聚糖酶(FoxXyn2)的核苷酸序列(SEQ ID No.31)。编码信号序列的序列以粗体(大写体)显示。
图4C示出了编码本文称为FoxXyn2的木聚糖酶的核苷酸序列(SEQ ID No.4)。
图5示出了来自镰刀菌(Fusarium)的木聚糖酶的多肽序列(SEQ ID No.5)—镰刀菌比较测序项目(Fusarium Comparative Sequencing Project)，Broad Institute ofHarvard and MIT(http://www.broadinstitute.org/)。在一些实施方案中，该序列为主链序列。
图6A示出了编码本发明所用的来自镰刀菌的木聚糖酶的核苷酸序列(SEQ IDNo.32)—得自镰刀菌比较测序项目(Fusarium Comparative Sequencing Project)，BroadInstitute of Harvard and MIT(http://www.broadinstitute.org/)。加粗的小写体核苷酸示出了内含子序列。编码信号序列的序列以粗体(大写体)显示。与SEQ ID No.24相比的改变用下划线标出。
图6B示出了编码本发明所用的来自镰刀菌的木聚糖酶的核苷酸序列(SEQ IDNo.33)—得自镰刀菌比较测序项目(Fusarium Comparative Sequencing Project)，BroadInstitute of Harvard and MIT(http://www.broadinstitute.org/)。编码信号序列的序列以粗体(大写体)显示。与SEQ ID No.25相比的改变用下划线标出。
图6C示出了编码本发明所用的来自镰刀菌的木聚糖酶的核苷酸序列(SEQ IDNo.6)—得自镰刀菌比较测序项目(Fusarium Comparative Sequencing Project)，BroadInstitute of Harvard and MIT(http://www.broadinstitute.org/)，与SEQ ID No.4相比的改变用下划线标出。
图7示出了FveXyn4(SEQ ID No.1)、FoxXyn2(SEQ ID No.3)以及本文示出为SEQID No.5的木聚糖酶(FVEG_13343T0)的成熟蛋白的比对。
图8示出了根据本发明的变体GH10木聚糖酶的编码序列的核苷酸序列(不含内含子)(SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11)。
图9示出了根据本发明的变体GH10木聚糖酶的编码序列的核苷酸序列(其中内含子以下划线示出)(SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ IDNo.16)。
图10示出了根据本发明的成熟变体GH10木聚糖酶的氨基酸序列(SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20和SEQ ID No.21)。
图11示出了与FveXyn4相比的5种变体A、B、C、D和E的Tm值。Tm值被测量为10分钟温育后得到50％残余活性时的温度。
图12示出了在pH 4.0、5.0和6.0下测得的五种变体的pH曲线，并且所有数据均相对于pH 5.0下的FveXyn4得出。
图13a和图13b示出了来自cDDGS(上图13a)和小麦麸(下图13b)的戊聚糖的溶解随木聚糖酶剂量的变化。
图14示出了在本发明变体作用下实施例1中所教导的“体外动物模型测定法中的粘度降低”中的粘度降低，并且与FveXyn4和基准Econase XT进行比较。该粘度降低是在高粘度小麦上测得的。
图15示出了在90℃和95℃下饲用制丸后的木聚糖酶回收率。活性相对于醪液样品示出。使用提取方法分析含FveXyn4的样品，而使用浆液方法分析含变体A-E的样品，这两种方法均在实施例1的材料和方法中有所描述。
图16示出了pZZH254的质粒图谱。
图17示出了FveXyn4的温度曲线。
图18示出了pZZH135的质粒图谱。
图19示出了FoxXyn2的温度曲线。
图20示出了pEntry-FveXyn4的示意性图谱。
图21示出了目的pTTTpyr2载体以及FveXyn4的表达载体(pTTTpyr2-FveXyn4)和FveXyn4变体的表达载体(pTTTpyr2-FveXyn4_VAR)的示意性图谱。
图22示出了相较于根据本发明的热稳定变体A、B、C、D和E，主链(亲本)酶FveXyn4使基于谷物的材料的粘度降低。Fve Xyn4及其变体以类似方式发挥作用，相较于空白(仅
Figure GDA0003001128500000061
CL)，其显示出55-67％的粘度降低。
发明概述
本发明的开创性发现是GH10木聚糖酶的修饰使得GH10木聚糖酶的热稳定性更强。
本发明人首次鉴别了用于修饰的关键残基，使得GH10木聚糖酶具有热稳定性。
此外，本发明人首次鉴别了关键置换/修饰，使得GH10木聚糖酶具有热稳定性。
具体地讲，本发明涉及鉴别木聚糖酶(例如GH10木聚糖酶)中的特定残基和特定修饰，使其热稳定性更强，同时确保木聚糖酶的其它特性保持不变。
本发明木聚糖酶的其它特性是其分解(溶解)不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)的能力。
具体地讲，本发明的变体木聚糖酶能有效地分解(溶解)来自宽范围的底物的AXinsol，该底物包括玉米、小麦、DDGS等，特别是玉米和基于玉米的底物，特别是小麦(包括基于小麦的)产物和玉米(包括基于玉米的产物)。这与先前已知的酶截然不同，先前已知的酶通常在溶解玉米或基于玉米的底物中的AXinsol方面较差，或在基于小麦或基于玉米的底物中都不太有效。
另外，本发明的变体木聚糖酶不仅在分解(溶解)AXinsol时特别出色，而且在有效分解(或降解)溶解的聚合物时也特别出色。由于能够有效地(快速地)分解(降解)溶解的聚合物(AXinsol溶解所得)，使得粘度(快速)降低或者溶解的聚合物(AXinsol溶解所得)不会促使粘度升高。在一些要求保护的专利申请中，后一效果是至关重要的。
不希望受理论约束，本发明的变体酶主要释放聚合物，这些聚合物对粘度没有贡献，因为所释放的聚合物较短。
通常，常规木聚糖酶可分解AXinsol，但常常会导致混合物的粘度升高。这一升高的粘度在许多应用中是不利的。
不希望受理论约束，虽然一些常规木聚糖酶分解AXinsol，但它们会使高分子量的可溶性降解产物增加，从而导致混合物的粘度升高。
此外或者备选地，同样不希望受理论约束，常规木聚糖酶可分解AXinsol，但由于它们不会足够快地降解高分子量的溶解产物，所以混合物的粘度并不理想。相比之下，通过本发明的方法和用途，相较于常规酶，变体木聚糖酶分解AXinsol而不会使粘度升高和/或同时使粘度快速降低。不希望受理论约束，但据信本发明的酶不会形成高分子量产物。
已发现本发明的酶及本文所述的酶不仅能分解(溶解)来自宽范围的底物的不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)，而且能有效地确保粘度不升高和/或使粘度降低，该底物包括玉米、小麦、DDGS等，特别是玉米和基于玉米的底物，特别是小麦(包括基于小麦的)产物和玉米(包括基于玉米的产物)。不希望受理论约束，但据信本发明的酶不会形成高分子量产物。
因此，本发明涉及这样的酶，其能够溶解戊聚糖，特别是含木聚糖的材料，诸如阿拉伯木聚糖，特别是不溶性阿拉伯木聚糖。具体地讲，该酶在溶解广泛底物(包括基于玉米的底物)中的戊聚糖，特别是含木聚糖的材料(诸如阿拉伯木聚糖)，特别是不溶性阿拉伯木聚糖时特别出色。
本发明还涉及这样的酶，其能够降解AXsol或AXinsol的分解产物，以确保反应混合物中粘度不升高和/或粘度降低。
在饲料原料中用于溶解戊聚糖的许多商业化木聚糖酶是GH11酶。本领域技术人员曾认为，GH10木聚糖酶在溶解戊聚糖、特别是AXinsol时不如GH11木聚糖酶那么强效。令人惊讶的是，已发现本文所公开的新型木聚糖酶(即GH10木聚糖酶)在降解广泛底物(包括基于玉米的底物)中的AXinsol时特别出色。令人惊讶的是，本发明人已发现，本发明的变体GH10木聚糖酶溶解戊聚糖的能力优于商业GH11木聚糖酶。另外，变体GH10木聚糖酶是热稳定的。
本发明的酶能有效地降解来自玉米和基于玉米的底物的AXinsol这一事实相当有利，因为相较于其它谷类诸如小麦和裸麦，玉米保留多得多的不溶性形式的AX。因此，只有可分解AXinsol的木聚糖酶才可对以基于玉米的食料(诸如玉米-大豆食料)为食的动物表现出显著有益效果。
完全意料不到的是，GH10木聚糖酶在降解谷类中、特别是玉米或基于玉米的底物中的AXinsol时如此出色。
本发明的酶能够有效地(并快速地)降解由AXinsol降解所产生的或存在于基于谷物的材料中的聚合物和低聚物。这使得本文所教导的GH10木聚糖酶具有意想不到的优点，因为它们在需保持粘度较低或降低粘度的多种应用中特别出色，例如用于饲料原料中；用于酿造和/或制麦芽中；用于基于谷物的葡萄糖制备中，例如，以便进一步加工成生物燃料和/或生化物质(例如，生物基异戊二烯)；或者用于小麦面筋-淀粉分离工业中，以便例如制备淀粉。
值得注意的是，已发现，相较于GH11酶，本文所测试的GH10酶的降解产物一般更短。这意味着降解产物对粘度的升高没有贡献或不会造成粘度的升高。
基于这些发现，根据本发明的变体木聚糖酶可用于降解含木聚糖的材料、特别是阿拉伯木聚糖、特别是AXinsol。除此之外或备选地，根据本发明的木聚糖酶可用于降解可溶性聚合物(例如低聚物)，该可溶性聚合物由AXinsol降解产生或(天然)存在于基于谷物的材料中。令人惊讶的是，已发现，根据本发明的变体木聚糖酶不仅可用于降解含木聚糖的材料、特别是阿拉伯木聚糖、特别是AXinsol，而且可用于降解由AXinsol降解产生的可溶性聚合物(例如低聚物)。
此类酶可有效应用于许多工业，包括饲料原料、制麦芽和酿造；可有效应用于处理含阿拉伯木聚糖的原材料如基于谷物的材料，本文中基于谷物的材料包括谷物和谷类；可有效应用于小麦面筋-淀粉分离工业；可有效应用于制备源自淀粉的糖浆；可有效应用于生物燃料制备，等等。
如本文所用，术语“变体木聚糖酶”可与“修饰的木聚糖酶”互换使用。
详细描述
在第一方面，本发明提供一种修饰的GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，其中相较于亲本GH10木聚糖酶，所述修饰的GH10木聚糖酶或其片段具有提高的热稳定性，所述亲本GH10木聚糖酶已在以下位置中的至少两处或多处(优选地三处或更多处，更优选地至少所有五处)被修饰：7、33、79、217和298，其中编号基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸编号。
在另一方面，本发明提供编码热稳定性木聚糖酶并包含主链多核苷酸序列(或由其组成)的核酸分子(例如分离的或重组的核酸分子)，所述主链多核苷酸序列包含选自以下项的核苷酸序列(或由其组成)：
a.在本文示出为SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33的核苷酸序列；或
b.与SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33具有至少70％同一性(合适地至少80％，合适地至少90％，合适地至少95％，合适地至少98％，合适地至少99％同一性)的核苷酸序列；或
c.可在高严格条件下杂交至SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33的核苷酸序列；
其中主链多核苷酸序列在所编码多肽中的密码子编码氨基酸的以下位置中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地至少所有五处)被修饰：7、33、79、217和298，其中编号基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸编号。
在另一方面，本发明提供包含主链多核苷酸序列(或由其组成)的载体(例如质粒)或构建体，所述主链多核苷酸序列包含选自以下项的核苷酸序列：
a.在本文示出为SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33的核苷酸序列；或
b.与SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33具有至少70％同一性(合适地至少80％，合适地至少90％，合适地至少95％，合适地至少98％，合适地至少99％同一性)的核苷酸序列；或
c.可在高严格条件下杂交至SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33的核苷酸序列；
其中主链多核苷酸序列在所编码多肽中的密码子编码氨基酸的以下位置中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地至少所有五处)被修饰：7、33、79、217和298，其中编号基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸编号。
本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据本发明的核酸或根据本发明的载体或构建体。
在一个方面，本发明提供了一种用于提高GH10木聚糖酶热稳定性的方法，包括：在以下位置中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地至少所有五处)修饰亲本GH10木聚糖酶：7、33、79、217和298，其中编号基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸编号。
在又一个方面，本发明提供了一种具有木聚糖酶活性的酶，所述酶为GH10木聚糖酶或其片段，所述酶在以下位置中的两处或更多处(合适地三处或更多处，合适地至少所有位置处)被修饰：7、33、79、217和298，其中编号基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸编号，并且相较于除所述修饰之外包含与所述酶相同的氨基酸序列的GH10木聚糖酶，所述酶具有提高的热稳定性。
本发明另外还提供了一种GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，其中所述GH10木聚糖酶包含与GH10木聚糖酶(例如，亲本GH10木聚糖酶)具有至少70％(合适地至少80％、合适地至少90％、合适地至少95％、合适地至少98％、合适地至少99％)同一性的多肽；并且在所指示位置中两处或更多处(合适地三处或更多处，合适地所有位置处)包含以下氨基酸：7D；33V；79Y、79V、79F、79I、79L或79M(优选地79Y、79F或79V，更优选地79Y)；217Q、217E、217P、217D或217M(优选地217Q、217E或217P，更优选地217Q)；以及298Y、298F或298W(优选地298Y或298F，更优选地298Y)，其中编号基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸编号。
在又一个方面，提供了一种GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，其中所述GH10木聚糖酶包含与GH10木聚糖酶(例如，亲本或主链GH10木聚糖酶)具有至少90％(合适地至少95％、合适地至少98％、合适地至少99％)同一性的多肽；并且在所指示位置中的两处或更多处(合适地三处或更多处，合适地所有位置处)包含以下氨基酸：7D；33V；79Y；217Q)；和298Y，其中编号基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸编号。
本发明还提供了一种制备木聚糖酶变体的方法，包括：
a.用根据本发明的核酸分子，或根据本发明的载体或构建体(例如DNA构建体)，或用包含在宿主细胞中具有转录活性且与根据本发明的异源多核苷酸序列有效连接的启动子的DNA构建体，或用包含在宿主细胞中具有转录活性且与异源多核苷酸序列(编码根据本发明的木聚糖酶变体)有效连接的启动子的DNA构建体修饰(例如转化)宿主细胞；
b.在合适的培养基中培养所述修饰(例如转化)的宿主细胞以允许表达木聚糖酶。
在本发明的另一个方面，提供了一种通过本发明的方法制备的发酵物。
本发明的又一个方面是提供一种通过本发明的方法制备的木聚糖酶。
本发明另外还提供了一种酶组合物，该酶组合物包含a)具有木聚糖酶活性的酶，例如根据本发明的GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段；b)根据本发明的发酵物；或者c)它们的组合。
本发明还提供了一种饲料添加剂组合物，该饲料添加剂组合物包含a)具有木聚糖酶活性的酶，例如根据本发明的GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段；b)根据本发明的发酵物；或者c)它们的组合。
在本发明的另一方面，还提供了一种预混物，该预混物包含a)具有木聚糖酶活性的酶，例如根据本发明的GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段；b)根据本发明的发酵物；c)根据本发明的酶组合物；d)根据本发明的饲料添加剂组合物；或者e)它们的组合；以及至少一种维生素和/或至少一种矿物质。
本发明另外还提供了一种饲料(或饲料原料)，该饲料(或饲料原料)包含a)具有木聚糖酶活性的酶，例如根据本发明的GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段；b)根据本发明的发酵物；c)根据本发明的酶组合物；d)根据本发明的饲料添加剂组合物；e)根据本发明的预混物；或者f)它们的组合。
在另一个方面，提供了一种制备饲料原料的方法，该方法包括将饲料组分与a)具有木聚糖酶活性的酶，例如根据本发明的GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段；b)根据本发明的发酵物；c)根据本发明的酶组合物；d)根据本发明的饲料添加剂组合物；e)根据本发明的预混物；或者f)它们的组合混合。
本发明另外还提供了一种用于降解含木聚糖的材料中的含阿拉伯木聚糖的材料的方法，该方法包括将所述含木聚糖的材料与a)具有木聚糖酶活性的酶，例如根据本发明的GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段；b)根据本发明的发酵物；c)根据本发明的酶组合物；d)根据本发明的饲料添加剂组合物；e)根据本发明的预混物；或者f)它们的组合混合。
在另一方面，提供了使用a)具有木聚糖酶活性的酶，例如根据本发明的GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段；b)根据本发明的发酵物；c)根据本发明的酶组合物；d)根据本发明的饲料添加剂组合物；e)根据本发明的预混物；或者f)它们的组合溶解含木聚糖的材料中的阿拉伯木聚糖的用途。
发明详述
除非另外定义，本文所用的所有科技术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的一样。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY第20版，John Wiley and Sons,New York(1994)和Hale&Marham,THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)为技术人员提供了本公开中所用的许多术语的通用词典。
本公开不受本文所公开的示例性方法和材料的限制，与本文所述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用于本公开的实施方案的实践或测试中。数值范围包括限定该范围的数字。除非另外指明，否则分别是，任何核酸序列从左到右以5'至3'取向写出；氨基酸序列从左到右以氨基至羧基取向写出。
本文提供的标题并非对本公开文本的各个方面或实施例的限制，这些方面或实施例可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。相应地，下面就要定义的术语通过将说明书作为一个整体来参考会得到更完全的定义。
本文中使用氨基酸名称、三字母缩写或单个字母缩写来表示氨基酸。
本文所用的术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”是同义的。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求书中，对于氨基酸残基可使用传统单字母和三字母代码。该三字母代码是依照IUPACIUB生化命名联合委员会(JCBN)所定义的氨基酸三字母代码。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一个核苷酸序列编码。
术语的其它定义可在整个本说明书中出现。在更详细地描述示例性的实施方案之前，应理解本公开文本并不限于所描述的具体实施方案，因为这些实施方案当然是可变的。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体的实施方案的目的，并不意在具有限制意义，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限定。
在提供数值范围的情况中，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间数值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)也被具体公开。规定的范围中的任何规定值或中间值与该规定的范围中的任何其它规定值或中间值之间的每个较小范围，被涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中，而且其中任一个、没有一个或两个界限被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本公开中，但依据该规定的范围中的任何被具体排除的界限而定。在规定的范围包括界限中的一个或两个的情况中，排除这些被包括的界限中的任一个或两个的范围，也被包括在本公开中。
必须注意，如本文所用，以及在所附的权利要求书中，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一种酶”的涵义包括多种此类候选试剂，并且“所述饲料”的涵义包括一种或多种饲料的涵义及本领域的技术人员已知的它们的等同物，等等。
本文所述的出版物仅仅是出于参考其在本申请提交日之前的公开内容而提供的。本文中的内容都不应理解为承认该类出版物可作为所附权利要求书中的现有技术。
传统上用作动物饲料中的能源、用作生物燃料制备中的原料、用作酿造或制麦芽中的成分、或用作小麦面筋-淀粉分离工艺中的原料的原材料价格不断上涨，例如已使得这些工业将低成本纤维材料加入起始底物中，特别是将低成本纤维副产物用于动物饲料中。
添加纤维可导致若干不利效应。例如在动物饲料中，添加纤维可导致抗营养效应。动物肠道中存在的未降解的聚合物造成高粘性物质含量并妨碍扩散，从而导致营养吸收减少。另外，聚合物具有高持水性，从而阻碍水的有效重吸收，并且保水性增大消化道内含物的体积，从而缩短肠道通过时间(Englyst&Kingman(1993)，载于Human Nutrition andDietetics，第9版(Garrow J.S.、James W.P.T.编辑，第53页))。
在饲料原料中，半纤维素和纤维素(包括不溶性阿拉伯木聚糖)还形成包封(或截留)营养物质如淀粉和蛋白质的物理屏障，从而阻挡动物获取这些营养物质。
半纤维素和纤维素(包括不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol))本身也是潜在能源，因为它们由C5糖和C6糖组成。C6单糖可被动物用作能源，而C5寡糖可被存在于动物消化道中的微生物菌群转化成短链脂肪酸(van den Broek等人，2008Molecular Nutrition&FoodResearch,52,146-63)，该短链脂肪酸可被动物消化道吸收和消化。
由于物理障碍降解所引起的从饲料原料释放营养物质和水取决于木聚糖酶降解不溶性纤维组分(例如，不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol))的能力。
本发明提供了一种酶，其中所述酶为GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，其中相较于亲本GH10木聚糖酶，所述酶或其片段具有提高的热稳定性，该亲本GH10木聚糖酶已在以下位置中的至少两处被修饰：7、33、79、217和298，其中编号基于FveXyn4(SEQID No.1)的氨基酸编号。
本发明还提供了一种酶，其中所述酶为GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，其中相较于亲本GH10木聚糖酶，所述酶或其片段具有提高的热稳定性，该亲本GH10木聚糖酶已在以下位置中的至少三处被修饰：7、33、79、217和298，其中编号基于FveXyn4(SEQID No.1)的氨基酸编号。
本发明提供了一种酶，其中所述酶为GH10木聚糖酶或其具有木聚糖酶活性的片段，其中相较于亲本GH10木聚糖酶，所述酶或其片段具有提高的热稳定性，该亲本GH10木聚糖酶已在至少以下位置处被修饰：7、33、79、217和298，其中编号基于FveXyn4(SEQ IDNo.1)的氨基酸编号。
在一个实施方案中，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，包含以下修饰中的至少两者(优选地至少三者)：
N7D；
T33V；
K79Y、K79V、K79F、K79I、K79L或K79M；
A217Q、A217E、A217P、A217D或A217M；和
T298Y、T298F或T298W。
在一个实施方案中，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，在所指示位置中的至少两处(优选地至少三处)包含以下氨基酸：
7D；
33V；
79Y、79V、79F、79I、79L或79M；
217Q、217E、217P、217D或217M；和
298Y、298F或298W。
在一个实施方案中，根据本发明的修饰的木聚糖酶包含以下修饰中的至少两者(优选地至少三者)：
N7D；
T33V；
K79Y、K79F或K79V；
A217Q、A217E或A217P；和
T298Y或T298F。
在一个实施方案中，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，在所指示位置中的至少两处(优选地至少三处)包含以下氨基酸：
7D；
33V；
79Y、79F或79V；
217Q、217E或217P；和
298Y或298F。
在一个实施方案中，根据本发明的修饰的木聚糖酶包含以下修饰中的至少两者(优选地至少三者)：
N7D；
T33V；
K79Y；
A217Q；和
T298Y。
在一个实施方案中，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，在所指示位置中的至少两处(优选地至少三处)包含以下氨基酸：
7D；
33V；
79Y；
217Q；和
298Y。
在一个实施方案中，根据本发明的修饰的木聚糖酶至少包含以下修饰：
N7D；
T33V；
K79Y、K79V、K79F、K79I、K79L或K79M；
A217Q、A217E、A217P、A217D或A217M；和
T298Y、T298F或T298W。
在一个实施方案中，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，在所指示位置处包含以下氨基酸：
7D；
33V；
79Y、79V、79F、79I、79L或79M；
217Q、217E、217P、217D或217M；和
298Y、298F或298W。
在一个实施方案中，根据本发明的修饰的木聚糖酶至少包含以下修饰：
N7D；
T33V；
K79Y、K79F或K79V；
A217Q、A217E或A217P；和
T298Y或T298F。
在一个实施方案中，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，在所指示位置处包含以下氨基酸：
7D；
33V；
79Y、79F或79V；
217Q、217E或217P；和
298Y或298F。
在一个实施方案中，根据本发明的修饰的木聚糖酶至少包含以下修饰：
N7D；
T33V；
K79Y；
A217Q；和
T298Y。
在一个实施方案中，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，在所指示位置处包含以下氨基酸：
7D；
33V；
79Y；
217Q；和
298Y。
在一个实施方案中，除了在位置7、33、79、217和298中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地所有位置处)被修饰之外，根据本发明的修饰的木聚糖酶可在以下位置中的一处或更多处被进一步修饰：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219。
在一个实施方案中，除了在位置7、33、79、217和298中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地所有位置处)被修饰之外，根据本发明的修饰的木聚糖酶可在以下位置中的两处或更多处被进一步修饰：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219。
在一个实施方案中，除了在位置7、33、79、217和298中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地所有位置处)被修饰之外，根据本发明的修饰的木聚糖酶可在以下位置中的三处或更多处被进一步修饰：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219。
在一个实施方案中，除了在位置7、33、79、217和298中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地所有位置处)被修饰之外，根据本发明的修饰的木聚糖酶可在以下位置中的四处或更多处被进一步修饰：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219。
在一个实施方案中，除了在位置7、33、79、217和298中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地所有位置处)被修饰之外，根据本发明的修饰的木聚糖酶可在以下位置中的五处或更多处被进一步修饰：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219。
在一个实施方案中，除了在位置7、33、79、217和298中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地所有位置处)被修饰之外，根据本发明的修饰的木聚糖酶可在以下位置中的七处或更多处被进一步修饰：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219。
在一个实施方案中，除了在位置7、33、79、217和298中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地所有位置处)被修饰之外，根据本发明的修饰的木聚糖酶可在以下位置中的九处或更多处被进一步修饰：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219。
当修饰的木聚糖酶在位置25处被进一步修饰时，该修饰可为N25P。换句话讲，在本发明的GH10木聚糖酶的残基25处的氨基酸优选地为P。
当修饰的木聚糖酶在位置57位处被进一步修饰时，该修饰可选自S57Q、S57T或S57V(优选地为S57Q)。换句话讲，在本发明的GH10木聚糖酶的残基57处的氨基酸优选地为Q、T或V(优选地为Q)。
当修饰的木聚糖酶在位置62处被进一步修饰时，该修饰可选自N62T或N62S(优选地为N62T)。换句话讲，在本发明的GH10木聚糖酶的残基62处的氨基酸优选地为T或S(优选地为T)。
当修饰的木聚糖酶在位置64处被进一步修饰时，该修饰可选自G64T或G64S(优选地为G62T)。换句话讲，在本发明的GH10木聚糖酶的残基64处的氨基酸优选地为T或S(优选地为T)。
当修饰的木聚糖酶在位置89处被进一步修饰时，该修饰可选自S89G、S89N、S89Q、S89L或S89M(优选地为S89G或S89Q，更优选地为S89G)。换句话讲，在本发明的GH10木聚糖酶的残基89处的氨基酸优选地为G、N、Q、L或M(优选地为G或Q，更优选地为G)。
当修饰的木聚糖酶在位置103处被进一步修饰时，该修饰可选自T103M或T103K(优选地为T103M)。换句话讲，在本发明的GH10木聚糖酶的残基103处的氨基酸优选地为M或K(优选地为M)。
当修饰的木聚糖酶在位置115处被进一步修饰时，该修饰可选自V115E或V115L(优选地为V115L)。换句话讲，在本发明的GH10木聚糖酶的残基115处的氨基酸优选地为E或L(优选地为L)。
当修饰的木聚糖酶在位置147处被进一步修饰时，该修饰可为N147Q。换句话讲，在本发明的GH10木聚糖酶残基147处的氨基酸优选地为Q。
当修饰的木聚糖酶在位置181处被进一步修饰时，该修饰可选自G181Q、G181A、G181D或G181P(优选地为G181Q)。换句话讲，在本发明的GH10木聚糖酶的残基181处的氨基酸优选地为Q、A、D或P(优选地为Q)。
当修饰的木聚糖酶在位置193处被进一步修饰时，该修饰可选自S193Y或S193N(优选地为S193Y)。换句话讲，在本发明的GH10木聚糖酶的残基193处的氨基酸优选地为193Y或N(优选地为Y)。
当修饰的木聚糖酶在位置219处被进一步修饰时，该修饰可选自G219D或G219P(优选地为G219P)。换句话讲，在本发明的GH10木聚糖酶的残基219处的氨基酸优选地为D或P(优选地为P)。
在一个实施方案中，除了在位置7、33、79、217和298中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地所有位置处)包含修饰之外，根据本发明的修饰的木聚糖酶还包含以下残基中的修饰：25和89(优选地N25P和S89G)。
在一个实施方案中，除了在位置7、33、79、217和298中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地所有位置处)包含修饰之外，根据本发明的修饰的木聚糖酶还包含以下残基中的修饰：57、62、64和89(优选地S57Q、N62T、G64T和S89G)。
在一个实施方案中，除了在位置7、33、79、217和298中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地所有位置处)包含修饰之外，根据本发明的修饰的木聚糖酶还包含以下残基中的修饰：25、57、62、64、103、115、147、181、193和219(优选地N25P、S57Q、N62T、G64T、T103M、V115L、N147Q、G181Q、S193Y和G219P)。
在一个实施方案中，除了在位置7、33、79、217和298中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地所有位置处)包含修饰之外，根据本发明的修饰的木聚糖酶还包含以下残基中的修饰：25、57、62、89、103、115、147、181、193和219(优选地N25P、S57Q、N62T、S89G、T103M、V115L、N147Q、G181Q、S193Y、G219P和T298Y)。
在一个实施方案中，除了在位置7、33、79、217和298中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地所有位置处)包含修饰之外，根据本发明的修饰的木聚糖酶还包含以下残基中的修饰：25、89和64(优选地N25P、S89G、G64T)。
在一个实施方案中，根据本发明的修饰的木聚糖酶(或GH10木聚糖酶)可在所指示位置处包含以下氨基酸：
a.7D、25P、33V、64T、79Y、89G、217Q和298Y；
b.7D、25P、33V、79Y、89G、217Q和298Y；
c.7D、25P、33V、57Q、62T、64T、79Y、103M、115L、147Q、181Q、193Y、217Q、219P和298Y；
d.7D、25P、33V、57Q、62T、79Y、89G、103M、115L、147Q、181Q、193Y、217Q、219P和298Y；
e.7D、33V、57Q、62T、64T、79Y、89G、217Q和298Y；
f.79F_217Q_和298F；
g.7D、_33V、_217Q_和298F；
h.7D、_79F和298F；
i.33V、79F和_217Q；
j.7D、33V和_298Y；
k.33V、_217Q_和298Y；
l.7D、_217Q和_298F；
m.7D、_33V和217Q；
n.79F和298F；
o.7D和79F；
p.33V_和79F；
q.33V和_298Y；
r.7D_和33V；或
s.33V和_A217Q。
在一个实施方案中，根据本发明的修饰的木聚糖酶(或GH10木聚糖酶)可在所指示位置处包含以下氨基酸：
a.7D、25P、33V、64T、79Y、89G、217Q和298Y；
b.7D、25P、33V、79Y、89G、217Q和298Y；
c.7D、25P、33V、57Q、62T、64T、79Y、103M、115L、147Q、181Q、193Y、217Q、219P和298Y；
d.7D、25P、33V、57Q、62T、79Y、89G、103M、115L、147Q、181Q、193Y、217Q、219P和298Y；
e.7D、33V、57Q、62T、64T、79Y、89G、217Q和298Y；
在一个实施方案中，根据本发明的修饰的木聚糖酶(或GH10木聚糖酶)可包含以下修饰：
a.N7D、N25P、T33V、G64T、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；
b.N7D、N25P、T33V、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；
c.N7D、N25P、T33V、S57Q、N62T、G64T、K79Y、T103M、V115L、N147Q、G181Q、S193Y、A217Q、G219P和T298Y；
d.N7D、N25P、T33V、S57Q、N62T、K79Y、S89G、T103M、V115L、N147Q、G181Q、S193Y、A217Q、G219P和T298Y；
e.N7D、T33V、S57Q、N62T、G64T、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；
f.K79F_A217Q_T298F；
g.N7D_T33V_A217Q_T298F；
h.N7D_K79F_T298F；
i.T33V_K79F_A217Q；
j.N7D_T33V_T298Y；
k.T33V_A217Q_T298Y；
l.N7D_A217Q_T298F；
m.N7D_T33V_A217Q；
n.K79F_T298F；
o.N7D_K79F；
p.T33V_K79F；
q.T33V_T298Y；
r.N7D_T33V；或
s.T33V_A217Q。
在一个实施方案中，根据本发明的修饰的木聚糖酶(或GH10木聚糖酶)可包含以下修饰：
a.N7D、N25P、T33V、G64T、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；
b.N7D、N25P、T33V、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；
c.N7D、N25P、T33V、S57Q、N62T、G64T、K79Y、T103M、V115L、N147Q、G181Q、S193Y、A217Q、G219P和T298Y；
d.N7D、N25P、T33V、S57Q、N62T、K79Y、S89G、T103M、V115L、N147Q、G181Q、S193Y、A217Q、G219P和T298Y；
e.N7D、T33V、S57Q、N62T、G64T、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；
在一个实施方案中，根据本发明的木聚糖酶(例如修饰的木聚糖酶)具有主链氨基酸序列(修饰前)，所述主链氨基酸序列包含选自以下的氨基酸序列(或由其组成)：SEQ IDNo.1、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.3、SEQ ID No 28、SEQ ID No.29或SEQ IDNo.5；或者与SEQ ID No.1、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.3、SEQ ID No 28、SEQID No.29或SEQ ID No.5具有至少70％同一性(合适地至少80％，合适地至少90％，合适地至少95％，合适地至少98％，合适地至少99％同一性)的氨基酸序列；或者由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列：该核苷酸序列包含在本文中示出为SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33的核苷酸序列；或者由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列：该核苷酸序列包含与SEQ ID No.2、SEQ ID No.24或SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ IDNo.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33具有至少70％同一性(合适地至少80％，合适地至少90％，合适地至少95％，合适地至少98％，合适地至少99％同一性)的核苷酸序列；或者由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列：该核苷酸序列可在高严格条件下杂交至SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ IDNo.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33；
术语“亲本”意指木聚糖酶，优选地GH10木聚糖酶，对该酶进行改变而产生本发明的修饰的酶。在一个实施方案中，亲本酶为GH10木聚糖酶。合适地，亲本酶可为天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。在一个优选的实施方案中，亲本酶为天然存在的(野生型多肽)。
合适地，根据本发明的修饰的木聚糖酶或GH10木聚糖酶包含这样的氨基酸序列(或基本上由其组成，或由其组成)：除以下位置7、33、79、217和298中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地至少所有五处)的修饰之外与所述亲本酶相同或基本上相同的氨基酸序列，其中编号基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸编号。
在一些实施方案中，根据本发明的修饰的木聚糖酶或GH10木聚糖酶包含这样的氨基酸序列(或基本上由其组成，或由其组成)：除以下位置7、33、79、217和298中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地至少所有五处)以及以下位置25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219中的一处或更多处的修饰之外与所述亲本酶相同或基本上相同的氨基酸序列，其中编号基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸编号。
根据本发明的(以及例如权利要求1中要求保护的)修饰的GH10木聚糖酶或GH10木聚糖酶合适地与亲本酶具有约至少90％的序列同一性(优选地至少93％、合适地至少97％、合适地至少99％的序列同一性)。
如本文所用，术语“主链”意指作为GH10木聚糖酶多肽的多肽序列，其被修饰而在所指示位置中的两处或更多处(优选地至少三处或更多处，更优选地所有位置处)包含以下氨基酸：7D；33V；79Y、79V、79F、79I、79L或79M(优选地79Y、79F或79V，更优选地79Y)；217Q、217E、217P、217D或217M(优选地217Q、217E或217P，更优选地217Q)；以及298Y、298F或298W(优选地298Y或298F，更优选地298Y)，其中编号基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸编号。
本发明的具有木聚糖酶活性的酶例如GH10木聚糖酶(例如，修饰的GH10木聚糖酶)优选地包含与GH10木聚糖酶(例如，亲本或主链GH10木聚糖酶)具有至少70％(合适地至少80％、合适地至少90％、合适地至少95％、合适地至少98％、合适地至少99％)同一性的多肽；并且在所指示位置中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地所有处)包含以下氨基酸：7D；33V；79Y、79V、79F、79I、79L或79M(优选地79Y、79F或79V，更优选地79Y)；217Q、217E、217P、217D或217M(优选地217Q、217E或217P，更优选地217Q)；以及298Y、298F或298W(优选地298Y或298F，更优选地298Y)，其中编号基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸编号。
本发明的具有木聚糖酶活性的酶例如GH10木聚糖酶(例如，修饰的GH10木聚糖酶)优选地包含与GH10木聚糖酶(例如，亲本或主链GH10木聚糖酶)具有至少95％(合适地至少98％、合适地至少99％)同一性的多肽；并且在所指示位置中的两处或更多处(优选地三处或更多处，更优选地所有处)包含以下氨基酸：7D；33V；79Y；217Q)；和298Y，其中编号基于FveXyn4(SEQ ID No.1)的氨基酸编号。
在一个实施方案中，亲本或主链GH10木聚糖酶(修饰前)为：
a.包含选自以下项的氨基酸序列的木聚糖酶：SEQ ID No.1、SEQ ID No.26、SEQID No.27、SEQ ID No.3、SEQ ID No 28、SEQ ID No.29或SEQ ID No.5；或
b.包含与SEQ ID No.1、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.3、SEQ ID No28、SEQ ID No.29或SEQ ID No.5具有至少70％同一性(合适地至少80％，合适地至少90％，合适地至少95％，合适地至少98％，合适地至少99％同一性)的氨基酸序列的木聚糖酶；或
c.由这样的核苷酸序列编码的木聚糖酶：该核苷酸序列包含在本文中示出为SEQID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQID No.6、SEQ ID No32或SEQ ID No.33的核苷酸序列；或
d.由这样的核苷酸序列编码的木聚糖酶：该核苷酸序列包含与SEQ ID No.2、SEQID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQID No 32或SEQ ID No.33具有至少70％同一性(合适地至少80％，合适地至少90％，合适地至少95％，合适地至少98％，合适地至少99％同一性)的核苷酸序列；或
e.由这样的核苷酸序列编码的木聚糖酶：该核苷酸序列可在高严格条件下杂交至SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33；
在一个实施方案中，亲本或主链氨基酸序列与SEQ ID No.1、SEQ ID No.26、SEQID No.27、SEQ ID No.3、SEQ ID No 28、SEQ ID No.29或SEQ ID No.5具有至少80％同一性；
在一个实施方案中，亲本或主链氨基酸序列与SEQ ID No.1、SEQ ID No.26、SEQID No.27、SEQ ID No.3、SEQ ID No 28、SEQ ID No.29或SEQ ID No.5具有至少90％同一性；
在一个实施方案中，亲本或主链氨基酸序列与SEQ ID No.1、SEQ ID No.26、SEQID No.27、SEQ ID No.3、SEQ ID No 28、SEQ ID No.29或SEQ ID No.5具有至少95％同一性；
在一个实施方案中，亲本或主链氨基酸序列与SEQ ID No.1、SEQ ID No.26、SEQID No.27、SEQ ID No.3、SEQ ID No 28、SEQ ID No.29或SEQ ID No.5具有至少98％同一性；
在一个实施方案中，亲本或主链木聚糖酶可由这样的核苷酸序列编码：该核苷酸序列包含与SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33具有至少80％同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，亲本或主链木聚糖酶可由这样的核苷酸序列编码：该核苷酸序列包含与SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33具有至少90％同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，亲本或主链木聚糖酶可由这样的核苷酸序列编码：该核苷酸序列包含与SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33具有至少95％同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，亲本或主链木聚糖酶可由这样的核苷酸序列编码：该核苷酸序列包含与SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33具有至少98％同一性的核苷酸序列。
合适地，亲本或主链GH10木聚糖酶可从镰刀菌生物获得(合适地已获得)。
合适地，亲本或主链木聚糖酶为内切-1,4-β-d-木聚糖酶。
根据本发明的修饰的木聚糖酶或GH10木聚糖酶优选地为内切-1,4-β-d-木聚糖酶。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，具有大于70℃(优选地大于75℃)的Tm值，其中Tm值被测量为在10分钟温育后得到50％残余活性时的温度。
根据本发明的木聚糖酶(例如，修饰的木聚糖酶)的热稳定性可通过“用于测量热稳定性的测定法”来确定(参见下文)。
用于测量热稳定性的测定法
通过以下方式测量FveXyn4变体的热变性曲线：在不同温度(分别为66、66.7、68.2、70.6、73.5、76、76.5、76.8、79.7、81.9、83.5、84.6和85℃)下，将酶样品在25mM MES缓冲液(pH 6.0)中稀释并预温育10分钟，随后通过实施例1中所述的木聚糖酶活性方法测量残余活性。将在未预温育情况下测得的活性设定为100％，并相对于此值计算每种变体在每个温度下的残余活性。根据热变性曲线将Tm值计算为得到50％残余活性时的温度。
在一个实施方案中，根据本发明，如果酶具有大于70℃的Tm值，则认为该酶是热稳定的，其中Tm值为在10分钟温育后得到50％残余活性时的温度。可根据本文所教导的用于测量热稳定性的测定法来测量该Tm值。
在一个实施方案中，根据本发明，如果酶具有大于76℃的Tm值，则认为该酶是热稳定的，其中Tm值为在10分钟温育后得到50％残余活性时的温度。可根据本文所教导的用于测量热稳定性的测定法来测量该Tm值。
在一个实施方案中，根据本发明，如果酶具有大于85℃的Tm值，则认为该酶是热稳定的，其中Tm值为在10分钟温育后得到50％残余活性时的温度。可根据本文所教导的用于测量热稳定性的测定法来测量该Tm值。
优选地，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段(或包含该酶的组合物)，可承受最高约70℃；例如最高75℃、例如最高76℃、例如最高约85℃；例如或最高约95℃的热处理(例如，在制丸工艺期间)。热处理可执行最多约1分钟；最多约5分钟；最多约10分钟；最多约30分钟；最多约60分钟。承受此热处理意指在加热到指定温度之前在添加剂中存在/有活性的酶有至少约50％在其冷却到室温后仍存在/有活性。优选地，在加热到指定温度之前在添加剂中存在和有活性的酶有至少约80％在其冷却到室温后仍存在和有活性。
术语“热稳定性”为酶在相对较高温度下抵抗不可逆失活(通常由变性所致)的能力。这意味着在给定的时间段暴露于指定的温度后，酶保留特定量的酶活性。
有多种测量热稳定性的方式。举例来说，可在比酶稳定较长时间(天)的温度升高的温度下，将酶样品在不含底物的情况下温育限定时间段(例如，10分钟或1至30分钟)。在升高的温度下温育后，测定酶样品在例如30℃(备选地，25-50℃或甚至高达70℃)的许可温度下的残余活性。相对于未在该升高的温度下温育的酶样品，计算残余活性。
热稳定性也可被测量为酶失活随温度的变化。此处将酶样品在不含底物的情况下在各种温度下温育限定时间段(例如，10分钟或1至30分钟)，并在温育后测定在例如30℃(备选地，25-70℃或甚至更高)的许可温度下的残余活性。相对于未在该升高的温度下温育的酶样品，计算每个温度下的残余活性。所得的热变性曲线(温度与残余活性的关系)可用于计算得到50％残余活性时的温度。该值被定义为Tm值。
更进一步地，热稳定性可被测量为酶失活随时间的变化。此处将酶样品在不含底物的情况下在限定升高的温度(例如，76℃)下温育各种时间段(例如，介于10秒与30分钟之间)，并在温育后测定在例如30℃(备选地，25-70℃或甚至更高)的许可温度下的残余活性。相对于未在该升高的温度下温育的酶样品，计算每个温度下的残余活性。所得的失活曲线(时间与残余活性的关系)可用于计算得到50％残余活性时的时间。其通常以T1/2给出。
这些是如何测量热稳定性的示例。还可通过其它方法测量热稳定性。优选地，通过使用本文所教导的“用于测量热稳定性的测定法”来评估热稳定性。
与热稳定性相反，热活性是酶活性随温度的变化。为了测定热活性，可在存在底物的情况下，将酶样品在各种温度下温育(测定)由测定法限定的时间段。在如测定法限定的温育期间或紧接其后得到酶活性(例如，读取OD值，该值反映所生成的反应产物的量)。获得最高活性时的温度为酶在给定测定条件下的最适温度。可相对于在最适温度下得到的活性，计算每个温度下得到的活性。这将提供在给定测定条件下的酶的温度曲线。
在本发明申请中，热稳定性与热活性不相同。
合适地，根据本发明的修饰的木聚糖酶的最适pH在4.6至7的范围内，优选地为约5至6。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的修饰的木聚糖酶包含本文示出为SEQ IDNo.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20或SEQ ID No.21的氨基酸序列之一和/或其具有木聚糖酶活性的片段。
在一个实施方案中，主链多核苷酸序列中的修饰使得所编码的氨基酸序列中具有上文详述的修饰：
本发明的方法适于使得多核苷酸或氨基酸序列中具有上文所教导的修饰。
本发明的宿主细胞可选自细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、丝状真菌细胞和植物细胞。优选地，宿主细胞为细菌或真菌细胞。
在一个优选的实施方案中，回收根据本发明方法制备的根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段。
在一个优选的实施方案中，分离和/或纯化根据本发明方法制备的根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段。
在一些实施方案中，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，可直接用作发酵物而不分离和/或纯化酶。
在一些实施方案中，根据本发明的饲料添加剂组合物或根据本发明的预混物还包含选自如下的一种或多种酶：蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))和/或淀粉酶(包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、G4-形成淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3))。
根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，可用于降解含木聚糖的材料中的含阿拉伯木聚糖的材料的方法中。
合适地，阿拉伯木聚糖可为不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)。
在一个实施方案中，含木聚糖的材料选自如下一者或多者：饲料或饲料原料；饲料组分；基于谷物的材料；醪液；麦芽汁；麦芽；发芽的大麦；辅料、大麦醪液；以及谷类面粉。
在一个优选的实施方案中，在不提高反应介质粘度的情况下溶解阿拉伯木聚糖。
在本发明的一个实施方案中，饲料或饲料原料或饲料组分包含如下物质或由如下物质组成：玉米、DDGS(诸如cDDGS)、小麦、小麦麸或它们的组合。
在一个优选的实施方案中，饲料或饲料原料为基于玉米的饲料原料。
根据本发明，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，可与选自如下的一种或多种酶结合地使用：蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))和/或淀粉酶(包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、G4-形成淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3))。
在一个实施方案中，根据本发明的方法或用途包括给受试者施用根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，或包含根据本发明的所述酶的发酵物，或包含根据本发明的所述木聚糖酶的酶组合物，或包含根据本发明的所述木聚糖酶的饲料添加剂组合物，或包含根据本发明的所述木聚糖酶的预混物，或包含根据本发明的所述木聚糖酶的饲料原料。
在一个实施方案中，本发明的方法或用途为小麦面筋-淀粉分离工艺(或其一部分)。
在另一个实施方案中，本发明的方法或用途为生物燃料(例如，生物乙醇)或生化物质(例如，生物基异戊二烯)制备工艺(或其一部分)。
在另一个实施方案中，本发明的方法或用途为制麦芽或酿造工艺(或其一部分)。
合适地，本发明设想了通过根据本发明的方法制备的发酵饮料，例如啤酒。
在一个实施方案中，本发明的亲本木聚糖酶在本文可称为FveXyn4。
本文所教导的多肽序列和核酸序列优选地均为分离的。
本发明的木聚糖酶优选地为GH10木聚糖酶。换句话讲，木聚糖酶可具有在32-39kDa范围内的分子量，和/或木聚糖酶的催化结构域由八重β/α桶状结构组成(如以下文献中教导：Harris等人，1996–Acta.Crystallog.Sec.D 52,393-401)。
在本发明的一个方面，本发明的木聚糖酶为糖苷水解酶(GH)家族10的木聚糖酶。术语“糖苷水解酶(GH)家族10的”意指所考虑的木聚糖酶被分类为或可被分类为GH家族10。
蛋白质相似性搜索(例如，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD＝Web&PAGE_TYPE＝BlastHome的蛋白质局部序列排比检索基本工具(blast))可确定未知序列是否被归入GH10木聚糖酶家族成员的术语，特别是GH家族可基于关键区域中的序列同源性来分类。除此之外或备选地，为了确定未知蛋白质序列是否为GH10家族的木聚糖酶蛋白质，可不仅针对序列相似性/同源性/同一性，还针对3D结构相似性进行评估。GH家族的分类通常基于3D折叠。可预测未知蛋白质序列的3D折叠的软件是HHpred(http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred)。该软件在蛋白质结构预测方面的能力依赖于鉴别具有已知结构以用作模板的同源序列。这非常奏效，因为结构出现差异的速度比一级序列要慢得多。相同家族的蛋白质可具有非常相似的结构，即使当它们的序列已变得难以识别，也是如此。
在实施过程中，可将未知序列以FASTA格式粘贴到软件中(http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred)。完成之后，可提交搜索。搜索的输出将显示具有已知3D结构的序列的列表。为了确认未知序列确实是GH10木聚糖酶，可在概率>90的同源物列表内找到GH10木聚糖酶。并非所有被鉴别为同源物的蛋白质都将被表征为GH10木聚糖酶，但一些蛋白质会这样。后一类蛋白质是具有将其识别为木聚糖酶的已知结构和生化特征的蛋白质。前者在生化上不被表征为GH10木聚糖酶。若干参考文献描述了该方案，诸如
Figure GDA0003001128500000321
J.(2005)"Protein homology detection by HMM-HMM comparison"-Bioinformatics 21,951-960(doi:10.1093/bioinformatics/bti125)以及
Figure GDA0003001128500000322
J,Biegert A,and LupasAN.(2005)"The HHpred interactive server for protein homology detection andstructure prediction"-Nucleic Acids Research 33,W244--W248(网络服务器专辑)(doi:10.1093/nar/gki40)。
根据Cazy网站(http://www.cazy.org/)，家族10糖苷水解酶可表征如下：
已知活性：内切-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；内切-1,3-β-木聚糖酶(EC3.2.1.32)；番茄苷酶(EC 3.2.1.-)
机理：保留
宗族：GH-A
催化亲核体/碱：Glu(实验)
催化质子供体：Glu(实验)
3D结构状态：(β/α)8
本发明的GH10木聚糖酶可具有分子量在32-39kDa范围内的催化结构域。本发明GH10木聚糖酶的催化结构域的结构由八重β/α桶状结构组成(Harris等人，1996–Acta.Crystallog.Sec.D 52,393-401)。
已获知大量GH10家族酶的三维结构，首先被解析的是以下酶的三维结构：变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)木聚糖酶A(Derewenda等人，J Biol Chem 1994Aug 19；269(33)20811-4)、粪肥纤维单胞菌(C.fimi)内切聚糖酶Cex(White等人，Biochemistry1994Oct 25；33(42)12546-52)以及日本纤维弧菌(Cellvibrio japonicus)Xyn10A(此前为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)亚种木聚糖酶A)(Harris等人，Structure1994Nov 15；2(11)1107-16.)。作为宗族GHA的成员，它们具有经典的(α/β)8TIM桶状折叠，其中两个关键活性位点谷氨酸位于β链4(酸/碱)和7(亲核体)的C末端(Henrissat等人，Proc Natl Acad Sci U S A 1995Jul 18；92(15)7090-4)。
如本文所用，术语“GH10木聚糖酶”意指具有木聚糖酶活性并且具有(α/β)8TIM桶状折叠的多肽，其中两个关键活性位点谷氨酸位于β链4(酸/碱)和7(亲核体)的C-末端。
本文所用的主链(或亲本)木聚糖酶可称为FveXyn4或FoxXyn2(这些术语是指活性蛋白，例如成熟蛋白)。
在一个实施方案中，优选地，木聚糖酶为真菌木聚糖酶。
根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段和/或亲本酶为GH10木聚糖酶。
在一个实施方案中，优选地，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段(和/或亲本木聚糖酶)为真菌GH10木聚糖酶。
在一个实施方案中，优选地，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段(和/或亲本木聚糖酶)为内切木聚糖酶，例如内切-1,4-β-d-木聚糖酶。内切-1,4-β-d-木聚糖酶的分类为E.C.3.2.1.8。
在一些实施方案中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，具有约6的最适pH。
优选地，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，在pH 4与8之间、合适地在pH4.6与7之间保留最大活性的70％以上。
在一些实施方案中，例如在饲料应用中，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，优选地在pH 5.1与7之间保留最大活性的70％以上。
不希望受理论约束，pH还可对酶功效和效率具有重要影响。特别是对于饲料应用而言，本发明木聚糖酶的pH曲线有利于在中性条件下的小肠中的活性。
在一个实施方案中，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，能够降解(或会降解)含木聚糖的材料、特别是阿拉伯木聚糖、特别是不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)。
在另一个实施方案中，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，能够降解(或会降解)可溶性聚合物(例如，低聚物)，该聚合物由AXinsol降解产生或(天然)存在于基于谷物的材料中。
在另一个实施方案中，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，不仅能够降解(或会降解)含木聚糖的材料、特别是阿拉伯木聚糖、特别是AXinsol，还能够降解(或会降解)由AXinsol降解产生的可溶性聚合物(例如，低聚物)。
在一个实施方案中，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，不受小麦木聚糖酶抑制剂(例如小麦中的蛋白质类抑制剂，如TAXI样蛋白质类抑制剂)的影响。现有技术真菌木聚糖酶可被小麦蛋白质类抑制剂抑制多达70-95％。优选地，在小麦应用中，本发明的木聚糖酶仅被抑制最多20-30％。
TAXI是存在于谷类中的普通小麦(Triticum aestivum)木聚糖酶抑制剂。
如本文所用，术语“基本上由...组成”意指可存在未指定的组分，前提条件是要求保护的组合物的特征不因此受到实质性影响。
术语“由...组成”意指特定成分的比例必须总计100％。
本文所用的术语“包含”可在一些实施方案中修改为指基本上由...组成或由...组成(两者都具有比“包含”更具限制性的含义)。
在一个实施方案中，包含不溶性阿拉伯木聚糖的材料不是小麦秸秆。
如本文所用，术语“其片段”意指活性片段。换句话讲，该片段是具有木聚糖酶活性的片段。合适地，该片段可具有与片段所来源的全长修饰的GH10木聚糖酶相同的木聚糖酶活性。备选地，该片段可具有与片段所来源的全长修饰的GH10木聚糖酶相比改变的活性(例如，增强的特异性、比活性、pH或温度曲线)。另外，该片段必须保留作为其片段的修饰的GH10木聚糖酶的热稳定特性。
在一个实施方案中，该片段为片段所来源的修饰的GH10木聚糖酶全长的至少60％。
在一个实施方案中，该片段为片段所来源的修饰的GH10木聚糖酶全长的至少75％。
在一个实施方案中，该片段为片段所来源的修饰的GH10木聚糖酶全长的至少85％。
在一个实施方案中，该片段为片段所来源的修饰的GH10木聚糖酶全长的至少95％。
在一个实施方案中，该片段为片段所来源的修饰的GH10木聚糖酶全长的至少98％。
在一个实施方案中，该片段为选自SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20或SEQ ID No.21的一个或多个序列的片段。
在一个实施方案中，根据本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，a)包含本文示出为SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQID No.19、SEQ ID No.20或SEQ ID No.21的氨基酸序列中的一者，或b)包含与本文示出为SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20或SEQ ID No.21的氨基酸序列具有至少96％、优选地至少98.5％同一性的氨基酸序列，只要位置7、33、79、217和298处的氨基酸与SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20或SEQ ID No.21中所示的那些氨基酸相同即可。
在一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的核酸分子或包含该核酸分子的载体或构建体，其中核苷酸序列选自：SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQID No.16；或与本文示出为SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16的核苷酸序列具有至少96％、优选地98.5％同一性的核苷酸序列，只要成熟蛋白中的密码子编码氨基酸位置7、33、79、217和298与SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQID No.16的那些相同即可。
如本文所用，术语“修饰”意指改变或变更。具体地讲，如本文所用，术语“修饰”意指从天然存在的情形变更。换句话讲，当修饰酶时，即会以一定方式改变酶，使得酶从亲本主链酶变更。优选地，修饰的酶本身不存在于自然界。因此，修饰的酶为非天然存在的酶。
如本文所用，术语“修饰的”意指例如从其天然存在的形式变更。根据本发明的修饰的酶优选地不是天然存在的酶或天然存在的变体。换句话讲，根据本发明的修饰的酶优选地为尚未在自然界发现的修饰的酶。本发明的修饰的酶优选地不自然地存在。
在一些实施方案中，通过对亲本酶或主链酶进行修饰，来制备本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段。然而，在其它实施方案中，在不对亲本酶或主链酶进行修饰的情况下制备本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，例如，可通过合成方式制备。如本文所用，术语“修饰的木聚糖酶”或“修饰的GH10木聚糖酶”并未规定木聚糖酶通过使亲本酶突变来制备。修饰的木聚糖酶可合适地通过其它方式例如通过合成方式制备。
用途
本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，可合适地用于以下应用中的任何一者中：
a)动物饲料原料中的添加剂；和/或
b)动物饲料补充剂；和/或
c)基于谷物的材料(例如，这可为全谷物或谷物的一部分)的分解。分解产物(例如，葡萄糖)可用作任何发酵工艺的原料，诸如用于生物燃料(例如，生物乙醇)制备或用于其它产物诸如生化物质(例如，生物基异戊二烯)的制备。因此，在一个实施方案中，本发明涉及制备生物燃料(例如，生物乙醇)，并且涉及基于谷物的材料在生物燃料工业中增强的利用率；和/或
d)谷类(例如，小麦)面筋-淀粉分离工业。所得产物可为淀粉(例如，纯化的淀粉)和/或面筋和/或纤维和/或水溶物(诸如可溶性戊聚糖)。在一个实施方案中，本发明涉及淀粉和/或面筋的制备；和/或
e)例如通过分解基于谷物的材料(例如，发芽的大麦)，改善制麦芽和酿造；和/或
f)降解AXsol或AXinsol的分解产物，以确保反应混合物粘度不升高和/或粘度降低；
g)例如在生物燃料(例如，生物乙醇)制备工艺中，在降解基于谷物的材料时降低粘度。
在一个实施方案中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，用于饲料原料。优选地，饲料原料包含玉米或为基于玉米的饲料原料。
在一个实施方案中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，用于制麦芽或酿造。
在另一个实施方案中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，用于小麦面筋-淀粉分离。
在又一个实施方案中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，用于基于谷物的材料的分解，并且可为生物燃料(例如，生物乙醇)制备工艺的一部分。
优点
相较于已知的木聚糖酶，本文所教导的具有木聚糖酶活性的新型酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，具有许多优点。
本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，是热稳定的。例如，相较于修饰前的亲本(主链)木聚糖酶，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，明显更稳定。合适地，修饰的木聚糖酶具有大于70℃(优选地大于75℃)的Tm值，其中Tm值被测量为10分钟温育后得到50％残余活性时的温度。
本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，还在溶解戊聚糖时意料不到地出色。
本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，在溶解AXinsol时意料不到地出色。
令人惊讶的是，已发现，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，在降解广泛底物中的含木聚糖的材料诸如阿拉伯木聚糖如AXinsol时特别出色，该底物为玉米、小麦、DDGS等，特别是玉米和基于玉米的底物，特别是小麦(包括基于小麦)产物和玉米(包括基于玉米的产物)。相较于基准木聚糖酶(它们全都是商业生产和出售的木聚糖酶)，本文所教导的新型木聚糖酶能够有效得多地降解，并且相较于出售的木聚糖酶，本文所教导的新型木聚糖酶从更多基于植物的材料(特别是基于玉米的底物)释放戊聚糖。这完全意料不到。这与先前已知的酶截然不同，先前已知的酶通常在溶解玉米或基于玉米的底物中的AXinsol方面较差，或在基于小麦或基于玉米的底物中都不那么有效。
另外，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，不仅在分解(溶解)AXinsol时特别出色，而且在有效地分解(或降解)溶解的聚合物时也特别出色。由于能够有效地(快速地)分解(降解)溶解的聚合物(AXinsol溶解所得)，粘度得以降低。在一些要求保护的专利申请中，后一效果是至关重要的。
通常，常规木聚糖酶可分解AXinsol，但会使聚合物制备产物增加，从而导致混合物的粘度升高。这一升高的粘度在许多应用中是不利的。
已发现本发明及如本文所述的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，不仅能分解(溶解)来自宽泛范围的底物的不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)，而且能有效地分解由此溶解的聚合物，从而确保粘度不升高和/或使粘度降低，该底物包括玉米、小麦、DDGS等，特别是玉米和基于玉米的底物，特别是小麦(包括基于小麦)产物和玉米(包括基于玉米的产物)。
本发明及如本文所述的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，能够降解AXsol或AXinsol的分解产物，以确保反应混合物中粘度不升高和/或粘度降低。
在饲料原料中用于溶解戊聚糖的许多商业化木聚糖酶是GH11酶。本领域技术人员曾认为，GH10木聚糖酶在溶解戊聚糖、特别是AXinsol时不如GH11木聚糖酶那么强效。令人惊讶的是，已发现，本文所公开的新型修饰的木聚糖酶(即GH10木聚糖酶)在溶解广泛底物(包括基于玉米的底物)中的AXinsol时特别出色。令人惊讶的是，本发明人已发现，本发明的(及本文所教导的)修饰的GH10木聚糖酶在溶解戊聚糖的能力方面优于商业GH11木聚糖酶。
本发明的酶能有效地溶解来自玉米和基于玉米的底物的AXinsol这一事实相当有利，因为相较于其它谷类诸如小麦和裸麦，玉米保留多得多的不溶性形式的AX。因此，只有可分解AXinsol的木聚糖酶才可对以例如玉米-大豆食料为食的动物表现出显著有益效果。
完全意料不到的是，GH10木聚糖酶在溶解谷类中、特别是玉米或基于玉米的底物中的AXinsol时如此出色。
本发明的酶能够有效地(并快速地)降解由AXinsol溶解所产生的或存在于基于谷物的材料中的聚合物和/或低聚物。这使得本文所教导的修饰的GH10木聚糖酶具有意想不到的优点，因为它们在需保持粘度较低或降低粘度的多种应用中特别出色，例如用于饲料原料中；用于酿造和/或制麦芽中；用于基于谷物的葡萄糖制备中，例如，以便进一步加工成生物燃料和/或生化物质(例如，生物基异戊二烯)；或者用于小麦面筋-淀粉分离工业中，以便例如制备淀粉。
另外，本发明的修饰的GH10木聚糖酶具有非凡的热稳定性。这在一些应用中提供了显著的优点。具体地讲，在饲料应用中，例如在制丸过程中，酶可经受热处理。因此，在这种加工后必需能够保持酶活性。本发明的修饰的木聚糖酶具有非凡的且意料不到的热稳定性。
此外，改善的热稳定性在淀粉降解期间也非常有利，淀粉的降解是在液化期间升高的温度(约85℃-95℃)下发生的。由于酶具有热稳定性，故允许在该步骤期间添加酶。
值得注意的是，已发现，相较于GH11酶，对于本文所测试的GH10酶而言，由使用修饰的木聚糖酶所得到的降解产物一般更短。这增强了粘度降低的效应。
另外，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段(不同于许多GH11木聚糖酶)的另外一个优点是不受小麦木聚糖酶抑制剂(例如存在于小麦中的TAXI样蛋白质类抑制剂)的影响。
本发明的一个优点是其改善了小麦面筋-淀粉分离。
本发明的酶在增强受试者的性能或改善饲料中的原材料的消化率和/或改善受试者中的饲料效率方面特别有效。
含木聚糖的材料
本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段(或包含本发明的修饰的木聚糖酶的组合物)，可用于降解任何含木聚糖的材料。
在一个实施方案中，含木聚糖的材料为任何包含阿拉伯木聚糖的植物材料。
在一个实施方案中，含木聚糖的材料为任何包含不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)的植物材料。
在一个实施方案中，含木聚糖的材料为饲料原料或饲料组分。
在一个实施方案中，含木聚糖的材料为基于谷物的材料(包括全谷物或部分谷物或发芽的谷物，例如发芽的大麦)。当该方法涉及生物燃料制备(例如，生物乙醇制备)时，则含木聚糖的材料优选地为基于谷物的材料。
在另一个实施方案中，含木聚糖的材料可为大麦麦芽或醪液、或发芽的大麦或它们的组合。
在又一个实施方案中，含木聚糖的材料可为谷类面粉(例如，小麦、燕麦、裸麦或大麦面粉)。当该方法涉及面筋-淀粉分离工艺时，含木聚糖的材料优选地为谷类面粉(例如，小麦、燕麦、裸麦或大麦面粉)。
分解或降解
本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段(或包含该酶的组合物)，可用于分解(降解)AXinsol或AXsol或者AXinsol的降解产物。
术语“分解”或“降解”与水解是同义的。
溶解/降解
本发明涉及降解含木聚糖的材料(优选地含阿拉伯木聚糖的材料、优选地含不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)的材料)以产生可溶性戊聚糖(其可为聚合物、低聚物或单体)的方法。
在本文中，该方法可被描述为戊聚糖溶解或阿拉伯木聚糖溶解或AXinsol溶解或AXinsol降解。
在一个实施方案中，本发明涉及降解(或分解)不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)的方法。这也可称为不溶性阿拉伯木聚糖的溶解和/或戊聚糖的溶解。
在本发明的另一个实施方案中，该方法涉及降解(例如，分解)来源于不溶性阿拉伯木聚糖降解的聚合物。
阿拉伯木聚糖(AX)
如本文所用，术语“阿拉伯木聚糖”(AX)意指由木聚糖主链(1,4-连接的木糖单元)组成的多糖，其中L-阿拉伯呋喃糖(5-原子环状形式的L-阿拉伯糖)在整条链中通过1α→2和/或1α→3键随机地连接到木糖单元。阿拉伯木聚糖是存在于植物初生和次生细胞壁中的半纤维素。阿拉伯木聚糖可存在于谷物(诸如小麦、玉蜀黍(玉米)、裸麦和大麦)的麸皮中。
研究发现阿拉伯木聚糖(AX)与植物细胞壁紧密相连，其充当将植物细胞壁和组织的各种构件连接起来的胶粘物，从而赋予细胞壁结构强度和刚度。
如本文所用，术语“戊聚糖”是在完全水解时生成戊糖的一组碳水化合物中的任何一种。
由于木糖和阿拉伯糖(阿拉伯木聚糖的成分)均是戊糖，阿拉伯木聚糖通常被分类为戊聚糖。
AX是若干种最重要饲料原材料(包括小麦和玉米)中的主要非淀粉多糖(NSP)级分。
其在植物材料内的丰度、位置和分子结构使AX对饲料消化率有着严重的负面影响，从而有效地降低了其所存在的原材料的营养价值。这使AX成为重要的抗营养因素，从而降低动物生产效率。
另外，当例如在诸如酿造、制麦芽、生物燃料制造的工艺中试图分解植物材料时，AX可具有严重的负面影响，从而有效地减少植物原材料中可及底物的量。
AX还可保持大量的水(这可称为其持水性)—进而可使可溶性阿拉伯木聚糖产生(高)粘度—这在许多应用中都是缺点。
如本文所用，术语“半纤维素”意指植物细胞壁中除纤维素之外的多糖组分。如本文所用，术语“半纤维素”可意指植物细胞壁中可通过稀碱性溶液提取的多糖。半纤维素占木本植物组织中碳水化合物的几乎三分之一。半纤维素的化学结构由多种戊糖、己糖及其对应的糖醛酸的长链组成。半纤维素可存在于果实、植物茎和谷物壳中。木聚糖是由具有1β→4键的D-木糖单元组成的戊聚糖的示例。
水不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)
水不溶性阿拉伯木聚糖(AXinsol)，也称为水不可提取的阿拉伯木聚糖(WU-AX)，占植物材料干物质的较大比例。
在小麦中，AXinsol可占干物质的6.3％。在小麦麸和小麦DDGS中，AXinsol可占干物质的约20.8％或13.4％(w/w)。
在裸麦中，AXinsol可占干物质的5.5％。
在玉米中，AXinsol可占干物质的3.5-6％(例如，5.1％)。在玉米DDGS中，AXinsol可占干物质的10-20％(例如，12.6％)。
AXinsol导致饲料中的营养截留。大量易消化的营养物质诸如淀粉和蛋白质保持封闭在细胞壁材料聚簇中或结合于AX的侧链。这些截留的营养物质将不可用于小肠中的消化和后续吸收。
水溶性阿拉伯木聚糖(AXsol)
水溶性阿拉伯木聚糖(AXsol)，也称为水可提取的阿拉伯木聚糖(WE-AX)，可在生物燃料制备、生化物质制备、碳水化合物加工和/或制麦芽和/或酿造中和/或饲料中引起问题，因为它们可因AXsol的水结合力而导致粘度升高。
在饲料中，AXsol可具有抗营养效应，特别是在单胃动物中，因为它们可引起肠内容物粘度的显著升高(由AXsol超强的水结合力引起)。粘度升高可影响饲料消化和营养利用，因为其可防止饲料与消化酶和胆汁盐的适当混合，和/或其减慢营养可用性和吸收，和/或其刺激后肠中的发酵。
在小麦中，AXsol可占干物质的1.8％。在小麦麸和小麦DDGS中，AXsol可占干物质的约1.1％或4.9％(w/w)。
在裸麦中，AXsol可占干物质的3.4％。
在大麦中，AXsol可占干物质的0.4-0.8％。
在玉米中，AXsol可占干物质的0.1-0.4％(例如，0.1％)。在玉米DDGS中，AXinsol可占干物质的0.3-2.5％(例如，0.4％)。
然而，除存在于植物材料中的AXsol的量之外，当木聚糖酶溶解植物材料中的AXinsol时，这可释放戊聚糖和/或低聚物，进而影响植物材料的AXsol含量。
本文所公开的修饰的木聚糖酶的一个显著优点是它们能够溶解AXinsol而不会使粘度升高。目前认为未形成高分子量产物。
AXsol的分解可降低粘度。
AXsol的分解可释放营养物质。
粘度
在AXsol的水结合力会引起粘度的非期望升高的任何工艺中，本发明可用于确保粘度不升高和/或用于降低粘度。
本发明涉及通过分解(降解)AXsol或通过分解(降解)由溶解AXinsol所产生的聚合物和/或低聚物，确保粘度不升高和/或降低粘度。
不希望受理论约束，由于能够有效地(快速地)分解(降解)由溶解AXinsol所得的溶解的聚合物(例如，低聚物)，可避免粘度的非期望升高和/或可使粘度得以降低。如本文所用，术语“有效地”意指酶能够以比AXinsol被降解(或被溶解)的速度更快的速度降解由AXinsol溶解所形成的聚合物(例如，低聚物)。
降低粘度在本文所教导的许多应用中具有优势。
Bedford和Classen(1993Poultry Sci.,72,137-143)最初描述了试图模拟鸡小肠中环境的体外测定法。该测定法由饲料的两步温育组成，首先在低pH下与胃蛋白酶一起温育，然后在中性pH下与胰酶一起温育。公认的是，温育结束后上清液的粘度与肉鸡体内形成的粘度相关联。
如本文针对饲料应用所教导的不使粘度升高和/或粘度降低，意指木聚糖酶的添加将使得通过实施例1中所述方法测得的粘度不变或降低。所谓不变，意指所测值(为三次重复测试的平均值)落在未添加木聚糖酶的小麦样品的所测值的两个标准偏差内。
可使用以下仪器测量粘度：快速粘度分析仪(RVA)(例如，在生物乙醇加工中)和Haake VT550粘度计(Thermofisher公司)(例如，小麦-面筋淀粉加工)。两种仪器都可监测燃料乙醇工艺和小麦淀粉分离工艺的粘度曲线，这些工艺的实验条件分别在实施例6和实施例7中教导。
在本发明中，可通过如下方式计算粘度的降低：将一种包含本发明(或本文所教导)的木聚糖酶的样品与另一种不含本发明(或本文所教导)的木聚糖酶的可比样品进行比较。
将本发明的木聚糖酶的粘度降低曲线与市售基准木聚糖酶的粘度降低曲线进行比较，以此表明酶的性能。目的是使酶的性能相较于市售基准品有所改善。各个应用中使用的基准酶提供于以下实施例中。
用于比较饲料应用中的粘度降低的基准酶可为
Figure GDA0003001128500000441
XT。
用于生物乙醇工业中的木聚糖酶的示例是XylathinTM。
用于小麦面筋-淀粉分离工业中的木聚糖酶的示例是ShearzymeTM。
用于检查热稳定性的基准酶可为亲本(主链)木聚糖酶(例如，修饰之前)。
在本发明的一个实施方案中，本文所教导的木聚糖酶是降粘剂。
一般来讲，首先对小麦(或其它谷类)进行干磨以将麸皮和胚芽与被磨成面粉的胚乳分离。然后通过小麦淀粉分离工艺，将该胚乳面粉进一步分级分离成若干不同商业价值的产物流。主要目的是制备精制级A-淀粉，其由15-40μm的大的椭圆形颗粒组成。第二料流B-淀粉由纯度较低的淀粉颗粒组成，这些淀粉颗粒为球形且较小(1-10μm)。(C.C.Maningat,P.A.Seib,S.D.Bassi,K.S.Woo,G.D.Lasater，来自书籍"Starch"第10章，(2009)441-451,"Wheat starch:production,properties,modification and uses")。分离的小麦淀粉形成用于制备改性淀粉的起始材料，该改性淀粉适用于食品和非食品应用。活性面筋是小麦分离工艺中有附加值的第三产物。分离的小麦面筋的活力由形成面包制作所需粘弹性网络的能力确定。活性面筋包封烘焙期间在生面团制备中形成的二氧化碳，并因此增加面包体积。(Anne van der Borght,Hans Goesaert,Wim S.Veraverbeke,JanA.Delcour,Journal of Cereal Science 41(2005)221-237,"Fractionation of wheatand wheat flour into starch and gluten:overview of the main processes and thefactors involved.")因此，活性面筋通常用于强化面包制作所用的面粉，以实现改善的面包产品。面筋的其它市场包括作为素食、肉、鱼或家禽产品中的添加剂，包括宠物食品行业；谷类早餐；或酱油中的那些。由于其热塑性和良好的成膜特性，面筋还用于非食品市场中作为粘合剂。(L.Day,M.A.Augustin,I.L.Batey,C.W.Wrigley,Trends in Food Science&Technology 17(2006)82-90,“Wheat-gluten uses and industry needs.”)。
本文所教导的修饰的木聚糖酶可用于在将谷类面粉(例如，小麦、燕麦、裸麦或大麦面粉)分离成淀粉和面筋级分的过程中降低粘度(或不使粘度升高)，并可用于通过降解阻碍面筋凝聚的低聚糖而改善分离过程。
酿造和制麦芽中的麦芽汁粘度以及大麦醪液和大麦麦芽的粘度可在酿造和/或制麦芽期间带来显著缺陷。本发明涉及降低麦芽汁、大麦醪液、大麦麦芽或它们的组合的粘度(或不使粘度升高)。
饲料或饲料原料
本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，或本发明的饲料添加剂组合物，可用作饲料或用于制备饲料。
本文所用的术语“饲料”与“饲料原料”是同义的。
优选地，本发明的含阿拉伯木聚糖的材料是饲料原料、或饲料原料的成分、或饲料组分。
取决于用途和/或应用模式和/或施用模式，饲料可呈溶液形式或呈固体形式或半固体形式。
在用作饲料(例如功能饲料)或用于饲料(例如功能饲料)制备时，本发明的酶或组合物可与如下中的一者或多者结合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。
在一个优选的实施方案中，将本发明的酶或饲料添加剂组合物与饲料组分混合以形成饲料原料。
本文所用的术语“饲料组分”是指全部或部分饲料原料。饲料原料的部分可意指饲料原料的一种成分或饲料原料的一种以上(例如2种或3种或4种)成分。在一个实施方案中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物成分。
优选地，饲料为秣料或其预混物，复合饲料或其预混物。在一个实施方案中，可将根据本发明的饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分进行混合，或将根据本发明的饲料添加剂组合物混入复合饲料的预混物或混入秣料、秣料组分、或秣料预混物。
本文所用的术语“秣料”是指提供给动物的任何食物(而不是动物必须自己觅食)。秣料涵盖已被切碎的植物。
术语秣料包括青贮饲料、压制和制丸的饲料、油和混合日粮以及发芽谷物及豆类。
秣料可得自选自以下的一种或多种植物：玉米(玉蜀黍)、苜蓿(紫花苜蓿)、大麦、百脉根、芸苔属植物、Chau moellier、羽衣甘蓝、油菜籽(卡诺拉)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、萝卜、三叶草、杂三叶草、红色三叶草、地三叶草、白色三叶草、羊茅、雀麦草、小米、燕麦、高粱、大豆、树(用于树-干草的截去树梢的树的嫩枝)、小麦和豆类。
术语“复合饲料”是指为粗粉、粒料、饲料块(nut)、饲料饼或碎屑形式的商用饲料。复合饲料可由多种原材料和添加剂混合而成。这些共混物可根据目标动物的特定需求进行配制。
复合饲料可以是提供所有每日所需营养物质的完全饲料、提供日粮(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供额外的微量营养物质(例如矿物质和维生素)的补充剂。
用于复合饲料中的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、小麦、卡诺拉菜籽粕、菜籽粕、羽扇豆、大豆、高粱、燕麦和大麦。
合适的是，本文所提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，所述微量成分为例如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其它必需成分。预混物通常为适合混入商业日粮内的组合物。
本发明的任何饲料原料可包含一种或多种选自如下的饲料材料：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、裸麦、燕麦、黑小麦以及它们的组合)和/或大粒谷物例如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，诸如玉米面筋粉、湿滤饼(特别是基于玉米的湿滤饼)、干酒糟(DDG)(特别是基于玉米的干酒糟(cDDG))、干酒糟及可溶物(DDGS)(特别是基于玉米的干酒糟及可溶物(cDDGS))、小麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)得自诸如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白质、乳清、干椰肉、芝麻之类的来源的蛋白质；d)得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
在一个实施方案中，饲料原料包含如下物质或由如下物质组成：玉米、DDGS(诸如cDDGS)、小麦、小麦麸或它们的组合。
在一个实施方案中，饲料组分可为玉米、DDGS(例如，cDDGS)、小麦、小麦麸或它们的组合。
在一个实施方案中，饲料原料包含如下物质或由如下物质组成：玉米、DDGS(诸如cDDGS)或它们的组合。
在一个实施方案中，饲料组分可为玉米、DDGS(诸如cDDGS)或它们的组合。
本发明的饲料原料可含有至少30重量％、至少40重量％、至少50重量％或至少60重量％的玉米和大豆粉或玉米及全脂大豆、或者小麦粉或向日葵粉。
本发明的饲料原料可包含约5％至约40％玉米DDGS。对于家禽—饲料原料平均可包含约7％至15％玉米DDGS。对于猪(家猪)—饲料原料平均可包含5％至40％玉米DDGS。
本发明的饲料原料可包含玉米作为单种谷物，在这种情况下，饲料原料可包含约35％至约80％玉米。
在包含混合谷物(例如包含玉米和小麦)的饲料原料中，饲料原料可包含至少10％玉米。
另外或备选地，本发明的饲料原料可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物以提供高纤维饲料原料。高纤维饲料材料的示例包括：小麦、大麦、裸麦、燕麦，来自谷类的副产物，诸如玉米面筋粉、玉米面筋饲料、湿滤饼、干酒糟(DDG)、干酒糟及可溶物(DDGS)、小麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣。也可认为一些蛋白质来源富含纤维：例如从诸如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花的来源获得的蛋白质。
在一个实施方案中，本发明的饲料原料包含至少一种高纤维材料和/或所述至少一种高纤维饲料材料的选自如下的至少一种副产物：例如干酒糟及可溶物(DDGS)(特别是cDDGS)、湿滤饼、干酒糟(DDG)(特别是cDDG)、小麦麸和小麦。
在一个实施方案中，本发明的饲料原料包含至少一种高纤维材料和/或所述至少一种高纤维饲料材料的选自如下的至少一种副产物：例如干酒糟及可溶物(DDGS)(特别是cDDGS)、小麦麸和小麦。
在本发明中，饲料可为如下一者或多者：复合饲料和预混物，其包括粒料、饲料块或(家畜用)饼；农作物或农作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、干椰子肉、秸秆、谷壳、甜菜加工废料；鱼粉；肉粉和骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；低聚糖；糖渍饲用植物：青贮饲料；海草；种子和谷物，整体地或通过压碎、碾磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。
在一些实施方案中，本发明中的术语“饲料”涵盖宠物食品。宠物食品是旨在由宠物食用的植物或动物材料，例如狗粮或猫粮。宠物食品(例如狗粮和猫粮)可为干燥形式(例如粗磨狗粮)，或湿罐头形式。猫粮可含有氨基酸牛磺酸。
在一些实施方案中，本发明中的术语“饲料”涵盖鱼食。鱼食通常含有使养殖鱼保持健康所需的常量营养物质、痕量元素和维生素。鱼食可以为薄片状、颗粒或片剂的形式。颗粒形式(其中一些会迅速下沉)通常用于饲喂较大的鱼或底层鱼类。一些鱼食还含有诸如β胡萝卜素或性激素之类的添加剂，以人工增强观赏性鱼的颜色。
在一些实施方案中，本发明中的术语“饲料”涵盖鸟食。鸟食包括用于喂鸟器中以及用于饲喂宠物鸟的食物。通常，鸟食由多种种子组成，但也可涵盖板油(牛或羊脂肪)。
如本文所用，术语“接触”是指将本发明的酶(或包含该酶的组合物)间接或直接施加至产品(例如饲料)。可使用的施加方法的示例包括但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品、通过将饲料添加剂组合物与产品混合而直接施加、将饲料添加剂组合物喷涂至产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物的制剂中。
在一个实施方案中，优选地将本发明的饲料添加剂组合物与产品(如饲料原料)进行混合。备选地，饲料原料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。
对于一些施加而言，重要的是，使组合物在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表面。这使得组合物能赋予如下有利特性中的一者或多者：性能益处。
可施加本发明的修饰的酶(或包含该修饰的酶的组合物)以使产品(例如饲料原料或饲料原料的原始成分)散布、涂布和/或浸渍有控制量的所述酶。
在一个特别优选的实施方案中，将本发明的酶(或包含该酶的组合物)均质化以产生粉末。
在一个备选的优选实施方案中，将本发明的酶(或包含该酶的组合物)配制成如WO2007/044968或WO1997/016076或WO1992/012645中所述的颗粒(称作TPT颗粒)，这些文献以引用方式并入本文中。
在另一个优选的实施方案中，当将饲料添加剂组合物配制成颗粒剂时，颗粒剂包括涂覆在蛋白芯上的水合屏障盐。这类盐涂层的优势在于耐热性改善、贮存稳定性改善并且免于受到其它饲料添加剂对酶造成的不利影响。
优选地，用于盐涂层的盐在20℃下具有大于0.25的水活度，或大于60％的恒定湿度。
优选地，盐涂层包含Na2SO4。
制备本发明的酶(或包含该酶的组合物)的方法还可包括将粉末制丸的另外步骤。粉末可以与本领域已知的其它组分进行混合。可施力使粉末、或包含粉末的混合物强行通过模具，并将所得线料切割成适宜的不同长度的粒料。
任选地，形成粒料之前，制粒步骤可包括蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调理器中，例如带有蒸汽注射的搅拌器。在调理器中将混合物加热至指定温度，例如从60℃至100℃，典型的温度为70℃、80℃、85℃、90℃或95℃。停留时间可从数秒变化至数分钟甚至数小时。例如5秒、10秒、15秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。
应当理解，本发明的酶(或包含该酶的组合物)适于添加至任何适当的饲料材料中。
技术人员会认识到，不同的动物要求不同的饲料原料，甚至同一种动物也可能要求不同的饲料原料，这取决于饲养该动物的目的。
任选地，饲料原料还可含有额外的矿物质(例如钙)和/或额外的维生素。
优选地，饲料原料为玉米大豆粉混合物。
在一个实施方案中，优选地，饲料不是宠物食品。
在另一个方面，提供了制备饲料原料的方法。饲料原料通常在饲料加工厂中制备，在饲料加工厂中首先将原材料研磨至合适粒径大小，然后将研磨后的原材料与合适的添加剂混合。饲料原料随后可以作为糊料或粒料制备；后者通常涉及这样的方法：将温度升高至目标水平，然后使饲料通过模具以制备出特定大小的粒料。使粒料冷却。随后可加入液体添加剂(例如脂肪和酶)。制备饲料原料也可涉及额外的步骤，该步骤包括制粒之前的挤出或膨化，尤其是通过至少可包括使用蒸汽的适宜技术进行的挤出或膨化。
饲料原料可以是用于如下动物的饲料原料：单胃动物诸如家禽(例如肉鸡、蛋鸡、肉种鸡、火鸡、鸭、鹅、水禽)和猪(所有年龄类别)，反刍动物诸如牛(例如，奶牛或公牛(包括小牛))、马、绵羊，宠物(例如狗、猫)，或鱼(例如无胃鱼、有胃鱼、淡水鱼诸如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼如锦鲤鱼，海鱼诸如黑鲈，以及甲壳类动物诸如虾、贻贝和扇贝)。优选地，饲料原料用于家禽。
基于玉米的饲料原料
在一个优选的实施方案中，饲料原料可为基于玉米的饲料原料。如本文所用，术语“基于玉米的饲料原料”意指包含如下物质或由如下物质组成的饲料原料：玉米(玉蜀黍)或玉米的副产物。
优选地，基于玉米的饲料原料包含玉米或玉米的副产物作为主要成分。例如，基于玉米的饲料原料可包含至少35％玉米或玉米的副产物，诸如至少40％玉米或玉米的副产物，诸如至少50％玉米或玉米的副产物，诸如至少60％玉米或玉米的副产物，诸如至少70％玉米或玉米的副产物，诸如至少80％玉米或玉米的副产物，诸如至少90％玉米或玉米的副产物，例如100％玉米或玉米的副产物。
在一些实施方案中，基于玉米的饲料原料可包含玉米或玉米的副产物作为次要成分；在这种情况下，饲料原料可补加玉米或玉米的副产物。仅举个例子，饲料原料可包含例如小麦并补加玉米或玉米的副产物。
当玉米或玉米的副产物为饲料原料的次要成分时，玉米或玉米的副产物占饲料原料的至少5％、优选地至少10％、优选地至少20％、优选地至少30％。
为避免疑惑，如本文所用，术语“玉米”与玉蜀黍，例如玉蜀黍(Zea mays)是同义的。
在一个实施方案中，玉米的副产物可为玉米干酒糟及可溶物(cDDGS)或玉米湿滤饼或玉米干酒糟(DDG)或玉米面筋粉或玉米面筋饲料或它们的组合。
在一个实施方案中，优选地，本发明的含阿拉伯木聚糖的材料包含玉米的副产物，诸如玉米干酒糟及可溶物(cDDGS)或玉米湿滤饼或玉米干酒糟(DDG)或玉米面筋粉或玉米面筋饲料或它们的组合。
基于小麦的饲料原料
在一个优选的实施方案中，饲料原料可为基于小麦的饲料原料。如本文所用，术语“基于小麦的饲料原料”意指包含如下物质或由如下物质组成的饲料原料：小麦或小麦的副产物。
优选地，基于小麦的饲料原料包含小麦或小麦的副产物作为主要成分。例如，基于小麦的饲料原料可包含至少40％小麦或小麦的副产物，诸如至少60％小麦或小麦的副产物，诸如至少80％小麦或小麦的副产物，诸如至少90％小麦或小麦的副产物，例如100％小麦或小麦的副产物。
在一些实施方案中，基于小麦的饲料原料可包含小麦或小麦的副产物作为次要成分；在这种情况下，饲料原料可以补加小麦或小麦的副产物。仅以举例的形式，饲料原料可包含例如小麦并补加小麦或小麦的副产物。
当小麦或小麦的副产物为饲料原料的次要成分时，小麦或小麦的副产物占饲料原料的至少5％、优选地至少10％、优选地至少20％、优选地至少30％。
在一个实施方案中，小麦的副产物可为例如小麦麸、小麦粗粉、小麦纤维。
麸皮是谷物的坚硬外层，并且由组合的糊粉和果皮组成。与胚芽一样，它也是全谷物的组成部分，并且通常作为制备精制谷物时研磨的副产物产生。当从谷物除去麸皮时，谷物丧失一部分营养价值。麸皮存在于任何谷粒中并可由任何谷粒研磨而成，该谷粒包括水稻、玉米(玉蜀黍)、小麦、燕麦、大麦和小米。麸皮特别富含膳食纤维和必需脂肪酸，并且包含大量淀粉、蛋白质、维生素和膳食矿物质。
小麦粗粉是小麦麸的粗颗粒和细颗粒及小麦次粉的细颗粒、小麦胚芽、小麦面粉以及来自“磨坊放水槽”的碎屑。
小麦粗粉是人类食品和动物饲料的廉价副产物中间体。在一个实施方案中，优选地，本发明的含阿拉伯木聚糖的材料包含小麦麸和/或小麦粗粉。
湿滤饼、干酒糟(DDG)和干酒糟及可溶物(DDGS)
湿滤饼、干酒糟和干酒糟及可溶物是通过谷物蒸馏工业中采用的方法从谷物或谷物混合物的酵母发酵物中蒸馏除去乙醇后获得的产物。
蒸馏得到的釜馏物(例如，包含水、剩余谷物、酵母细胞等)被分离成“固体”部分和液体部分。
固体部分被称为“湿滤饼”并且可按原样用作动物饲料。
液体部分被(部分地)蒸发成糖浆(可溶物)。
湿滤饼干燥时，即成为干酒糟(DDG)。
湿滤饼与糖浆(可溶物)一起干燥时，即成为干酒糟及可溶物(DDGS)。
湿滤饼可用于奶制品生产和肉牛饲养场。
干燥的DDGS可用于牲畜(例如，奶牛、肉牛和猪)饲料和家禽饲料。
玉米DDGS是非常好的奶牛蛋白质来源。
玉米面筋粉
在一个方面，玉米的副产物可为玉米面筋粉(CGM)。
CGM是玉米研磨工业的粉状副产物。CGM可以用于例如动物饲料。其可用作饲料诸如宠物食品、牲畜饲料和家禽饲料的廉价蛋白质来源。它是特别好的氨基酸半胱氨酸来源，但必须用其它富含赖氨酸的蛋白质加以平衡。
饲料添加剂组合物
本发明的饲料添加剂组合物和/或包含它们的饲料原料可以任何合适的形式使用。
本发明的饲料添加剂组合物可以固体或液体制剂或其备选形式使用。固体制剂的示例包括散剂、糊剂、大丸剂、胶囊剂、丸剂、片剂、粉剂和颗粒剂，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的示例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液剂、混悬剂和乳剂。
在一些应用中，可将本发明的饲料添加剂组合物与饲料混合或施用于饮用水中。
在一个方面，本发明涉及制备饲料添加剂组合物的方法，该方法包括将如本文所教导的木聚糖酶与饲料可接受载体、稀释剂或赋形剂混合，并且(任选地)进行包装。
预混物
饲料原料和/或饲料添加剂组合物可与至少一种矿物质和/或至少一种维生素组合。由此所得的组合物在本文中可称为预混物。
制麦芽和酿造
本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段(或包含该酶的组合物)，可用于制麦芽和酿造。
大麦谷物包含1.7至4.1％(w/w)水可提取的β-葡聚糖和3.6至6.4％(w/w)总β-葡聚糖(Anderson,M.A.,Cook,J.A.,&Stone,B.A.,Journal of the Institute of Brewing,1978,84,233-239；Henry,J.,Journal of the Science of Food and Agriculture,1985,36,1243)。
小麦谷物包含0.1至0.8％(w/w)水可提取的β-葡聚糖和0.6至1.4％(w/w)总β-葡聚糖(Anderson,M.A.等人，1978年，出处同上)。
阿拉伯木聚糖(AXsol)和β-葡聚糖的有效水解至关重要，因为此类化合物可涉及到制备问题，诸如麦芽汁粘度(Ducroo,P.&Frelon,P.G.,Proceedings of the EuropeanBrewery Convention Congress,Zurich,1989,445；
Figure GDA0003001128500000531
R.J.&Voragen,A.G.J.,Journal of the Institute of Brewing,1993,99,243)以及滤过性和浑浊物形成(Coote,N.&Kirsop,B.H.1976.,Journal of the Institute of Brewing,1976,82,34；Izawa,M.,Kano,Y.&Kanimura,M.1991.Proceedings Aviemore Conference on Malting,brewingand Distillling,1990,427)。
本发明提供了在制麦芽和酿造期间水解阿拉伯木聚糖(例如，AXinsol和AXsol)的方法，其中将小麦谷物、大麦谷物或它们的组合或者小麦和/或大麦谷物的部分与本发明的修饰的木聚糖酶混合。
在一个方面，本发明可涉及食品组合物，该食品组合物为饮料，包括但不限于发酵饮料诸如啤酒和葡萄酒，其包含本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段。
在另一个方面，本发明可涉及食品组合物，该食品组合物为饮料，包括但不限于发酵饮料诸如啤酒和葡萄酒，其包含根据本发明的修饰的木聚糖酶。
在本发明的上下文中，术语“发酵饮料”意在包括任何这样的饮料，该饮料通过包括发酵工艺诸如微生物发酵诸如细菌和/或酵母发酵的方法制得。
在本发明的一个方面，发酵饮料为啤酒。术语“啤酒”意在包括通过含淀粉的植物材料的发酵/酿造制得的任何发酵麦芽汁。通常，啤酒由麦芽或辅料、或作为含淀粉植物材料的麦芽与辅料的任何组合制得。如本文所用，术语“麦芽”被理解为任何发芽的谷类谷粒，如发芽的大麦或小麦。
如本文所用，术语“辅料”是指不是麦芽诸如大麦或小麦麦芽的任何含淀粉和/或糖的植物材料。作为辅料的示例，可以提及可用作淀粉来源的材料，例如普通玉米糁、精制玉米糁、制啤酒用研磨酵母、稻米、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘培谷类、谷类片、裸麦、燕麦、玉米(玉蜀黍)、马铃薯、木薯粉、木薯和糖浆例如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖浆、大麦和/或小麦糖浆等等。
如本文所用，术语“醪液”是指任何含有淀粉和/或糖的植物材料如谷粉(例如包括压碎的大麦麦芽、压碎的大麦)和/或其它辅料或它们的组合的含水浆液，随后与水混合以分离成麦芽汁和废糟。
如本文所用，术语“麦芽汁”是指在淀粉糖化工艺中对谷粉进行提取后未发酵的液体流出物(run-off)。
在另一个方面，本发明涉及制备发酵饮料诸如啤酒的方法，该方法包括将本发明的修饰的木聚糖酶与麦芽或辅料混合。
啤酒的示例包括：全麦芽啤酒、依照《德国啤酒纯净法》(“Reinheitsgebot”)酿造的啤酒、爱尔啤酒、IPA、贮藏啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒(Happoshu)(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、淡啤酒、低度啤酒、低醇啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性黑啤酒、麦芽酒、无醇啤酒、无醇麦芽酒等等，而且包括备选的谷类和麦芽饮料，例如果味麦芽饮料，如柑橘味，如柠檬、橙、酸橙或浆果味麦芽饮料，酒味麦芽饮料，如伏特加、朗姆酒或龙舌兰酒味麦芽酒，或咖啡味麦芽饮料，例如咖啡因味麦芽酒等等。
例如用于生物燃料制备的基于谷物的材料的分解
本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段(或包含该酶的组合物)，可用于在由例如基于谷物的材料的谷物加工期间分解(降解)AXinsol和AXsol。基于谷物的材料可为全谷物(例如，全小麦、大麦、裸麦、黑小麦或玉米谷物或它们的混合物)或全谷物的部分或它们的混合物。
在一个实施方案中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段(或包含该酶的组合物)，可用于分解(降解)基于谷物的材料或全谷物中的AXinsol和AXsol。
为避免疑惑，可机械破坏全谷物。
基于谷物的材料可分解或降解为葡萄糖。葡萄糖可随后用作任何发酵工艺、例如生物燃料(例如，生物乙醇)制备和/或生化物质(例如，生物基异戊二烯)制备的原料。
基于谷物的材料可为生物燃料(例如，生物乙醇)制备工艺的原料。
现今大多数燃料乙醇是由玉米(玉蜀黍)谷物制备的，该谷物经研磨或碾磨，经淀粉酶处理以将淀粉水解为糖，发酵并蒸馏。虽然已在降低乙醇制备成本方面取得实质性进展，但仍然面临重大挑战。仍然需要改进的技术以降低用于乙醇制备的生物燃料原料的成本。例如，在基于谷物的乙醇制备中，阿拉伯木聚糖的降解可提高淀粉的可及性。
本发明提供了用于分解半纤维素例如阿拉伯木聚糖(特别是AXinsol和AXsol)的修饰的木聚糖酶。
仅举个例子，在欧洲燃料乙醇产业中，小粒谷物如小麦、大麦和裸麦是常用原材料，而在美国，主要使用玉米。小麦、大麦和裸麦包含仅次于淀粉的高含量的非淀粉多糖聚合物(NSP)，如纤维素、β-葡聚糖和半纤维素。
对于每种原料而言，不同NSP所占的比率有所差异。下表示出了与一些其它原料相比小麦、大麦和裸麦中不同量的NSP。
表1：存在于不同原料中的非淀粉多糖(g kg-1干物质)
Figure GDA0003001128500000561
1非纤维素多糖：戊聚糖、(阿拉伯)木聚糖及其它半纤维素
NSP可赋予谷物醪液高粘度。高粘度对乙醇制备具有负面影响，因为其会限制可用于淀粉糖化的固体浓度，并且会降低过程的能量效率。另外，存在于整个过程中的残余半纤维素可造成换热器和蒸馏设备中的污垢。当醪液冷却至发酵温度(32℃)时，观察到高粘度的最大影响。这解释了需要在过程的冷却步骤之前的任何时间点降低粘度。
在本发明的一个实施方案中，用于降解基于谷物的材料的方法包括在生物燃料(例如，生物乙醇)制备工艺中尽早地混合如本文所公开的修饰的木聚糖酶，例如优选地在该工艺开始时在基于谷物的材料的混合期间混合。在该工艺的早期阶段添加如本文所公开的修饰的木聚糖酶的一个优点是该酶降低初始粘度。
在本发明的一个实施方案中，用于降解基于谷物的材料的方法包括在液化、糖化、发酵、同步糖化发酵、后发酵或它们的组合之前或期间，混合如本文所公开的修饰的木聚糖酶。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及例如在生物燃料(例如，生物乙醇)制备工艺中，在降解基于谷物的材料时降低粘度。
例如在生物燃料(例如，生物乙醇)制备工艺中使用本发明及本文所教导的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，在降解基于谷物的材料时降低粘度的有益效果是多重的：
·可在该工艺中使用更高干物质醪液
·可获得最终糖浆的更高固形物含量
·热传递更佳，能量需求更低
·蒸发器污垢减少，使得清洁成本降低
·最终乙醇收率提高
·DDGS(副产物)的质量改善
·釜馏物分离期间(蒸馏之后)固体和液体部分之间的分离更佳。较低的粘度提高了分离效率。
本发明的另一个显著优点是在生物燃料制备中使用本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，还可使来自该工艺的(副)产物诸如湿滤饼、干酒糟(DDG)或干酒糟及可溶物(DDGS)得以改善。因此，本发明的一个优点是由于湿滤饼、DDG和DDGS是生物燃料(例如，生物乙醇)制备的(副)产物，使用本发明可使这些(副)产物的质量得以改善。例如，(副)产物中的阿拉伯木聚糖可在生物燃料制备工艺期间已经溶解。
谷类(例如小麦)面筋-淀粉分离
本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段(或本发明或如本文所公开的包含该酶的组合物)，可用于在小麦淀粉和面筋分离期间分解(降解)AXinsol和AXsol。
在将小麦麸和胚芽与胚乳初始分离之后，小麦胚乳面粉分级分离成淀粉和面筋级分，这在工业上大规模应用，以获得高质量A-淀粉及副产物B-淀粉和活性面筋。
本发明中的谷类面粉(例如，小麦面粉)的降解产物为淀粉(高质量A-淀粉)。
另外，还产生了副产物B-淀粉和活性面筋。然后根据市场需求，对每个单独产品进一步加工以补充或修饰食物产品特征。
文献中描述了若干工业用小麦分离工艺。这些工业工艺的主要差异在于提供给分级分离设备(离心机、水力旋流器或筛网)的面粉-水混合物的形式，或初始反应条件如温度和施加的剪切(Abdulvahit Sayaslan,Lebensm.-Wiss.U.-Technol 37(2004)499-515,“Wetmilling of wheat flour:industrial processes and small-sacale testmethods”)。
在用于将谷类面粉(例如，小麦面粉)分离成淀粉和面筋级分的方法中，该方法包括将谷类面粉(例如，小麦面粉)、水和修饰的木聚糖酶混合。谷类面粉、水和修饰的木聚糖酶可同时混合或依序混合。在一些实施方案中，谷类面粉(例如，小麦面粉)和水可在与修饰的木聚糖酶混合之前先混合。
一般来讲，在约20-45℃的温度下将谷类面粉(例如，小麦面粉)混合到生面团或面糊，使得干固形物在35至63％之间变化。然后通过如下任一方式进一步加工该混合物：
1)使混合物静置一段时间(约30分钟)，然后使用筛网、离心机或水力旋流器从混合物中依序洗出淀粉，以将淀粉乳与面筋分离，或
2)向混合物施加剪切力，任选地进一步稀释混合物，然后通过水力旋流器或者2相或3相沉降式离心机分离小麦面粉。
如本文所用，术语“干固形物”意指以干重计的浆液中的总固形物(溶解和未溶解)(单位：％)。
在本发明的一个实施方案中，所要求保护的方法或用途可包括如下步骤：在约20至约45℃的温度下混合小麦面粉，以形成干固形物在35-63％之间的生面团或面糊，以及将淀粉与面筋分离。
本发明的方法还可包括：
a)使混合物静置约30分钟，然后使用筛网、离心机或水力旋流器依序从混合物中洗出淀粉，以将淀粉乳与面筋分离；或
b)向混合物施加剪切力，并任选地进一步稀释混合物，使用水力旋流器或者2相或3相沉降式离心机将淀粉与面筋分离。
本发明通过如下方式改善了淀粉和面筋的分离：在上述用于小麦淀粉分离的各种工艺中，合适地在面粉和水的初始混合步骤期间，添加本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段。通过在初始混合步骤期间添加修饰的木聚糖酶，改善了分离，这是由于粘度降低以及干扰面筋颗粒的AXsol和/或AXinsol发生水解。通过降解这些多糖和低聚糖，增强了面筋凝聚，从而改善了面筋收率。(S.A.Frederix,C.M.Courtin,J.A.Delcour,J.Cereal Sci.40(2004)41-49,“Substrateselectivity and inhibitor sensitivity affect xylanase functionality in wheatflour gluten-starch separation”)。
本发明的一个优点是其得到了更高的A-淀粉收率和/或质量更佳的面筋(例如，质量更佳的活性面筋)。
本发明的一个优点是其改善了小麦面筋-淀粉分离。
评价面筋质量的方式之一是通过监测面筋凝聚。当通过揉捏生面团或混合面糊而施加一定量的摩擦时，面筋颗粒往往会凝聚成更大颗粒，从而形成聚合物网络，称为“活性面筋”。可将“活性面筋”加入到食物产品中，以改善烘焙品的特性，诸如生面团筋力、货架期和面包体积(L.Day,M.A.Augustin,I.L.Batey and C.W.Wrigley；Wheat-gluten uses andindustry needs；Trends in Food Science&Technology 17(2006)82-90)。
在烘焙业中，使用Glutomatic通过ICC标准测定法No.155(AACC 38-12)确定小麦面粉中面筋的质量和数量。在该仪器中，将小麦面粉(10.0克)与少量2％NaCl溶液(4.2-4.8ml)混合而形成生面团。在20秒混合步骤之后，连续揉捏生面团，同时用以约70毫升/分钟的流速泵送通过混合杯的室温(约22℃)2％NaCl溶液洗涤5分钟。在这一洗涤步骤期间，收集含有淀粉的洗涤水，面筋颗粒在Glutomatic筛夹持器内形成面筋球。
通过评估面筋凝聚来测定面筋的质量。这通过在含有小型筛的专用离心机中离心面筋球来完成。称量通过该筛的面筋颗粒(小的面筋)并称量面筋的总量。通过(总的湿面筋-小的湿面筋)/总的湿面筋来计算面筋指数。面筋凝聚改善得越多，小的面筋级分将越小，面筋指数值将越高。较高的面筋指数(其理论最大值为100％)指示较高品质的面筋球。
定量面筋的量的另一个值是干面筋收率(％)。用总的干面筋的克数除以实验所用干面粉的总量来计算该值。回收的干面筋越多，分离得越好。目前在对这种工业测定法进行适应调整，以模拟工业中所用的生面团分离工艺。
剂量
优选地，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，存在于含木聚糖的材料(例如，饲料原料)中的范围为约500XU/kg至约16,000XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)，更优选地约750XU/kg饲料至约8000XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)，优选地约1500XU/kg饲料至约3000XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)，优选地约2000XU/kg饲料至约2500XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)，并且甚至更优选地约1000XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)至约4000XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)。
在一个实施方案中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，存在于含木聚糖的材料(例如，饲料原料)中的量为大于约500XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)，合适地大于约600XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)，合适地大于约700XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)，合适地大于约800XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)，合适地大于约900XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)，合适地大于约1000XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)，合适地大于约2000XU/kg，合适地大于约2500XU/kg，合适地大于约3000XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)。
在一个实施方案中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，以约2000XU/kg至约2500XU/kg的浓度存在于含木聚糖的材料(例如，饲料原料)中。
在一个实施方案中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，存在于含木聚糖的材料(例如，饲料原料)中的量为小于约16,000XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)，合适地小于约8000XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)，合适地小于约7000XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)，合适地小于约6000XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)，合适地小于约5000XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)，合适地小于约4000XU/kg含木聚糖的材料(例如，饲料)。
优选地，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，存在于饲料添加剂组合物中的范围可为约100XU/g至约320,000XU/g组合物，更优选地约300XU/g组合物至约160,000XU/g组合物，并且甚至更优选地约500XU/g组合物至约50,000XU/g组合物，并且甚至更优选地约500XU/g组合物至约40,000XU/g组合物。
在一个实施方案中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，存在于饲料添加剂组合物中的量为大于约100XU/g组合物，合适地大于约200XU/g组合物，合适地大于约300XU/g组合物，合适地大于约400XU/g组合物，合适地大于约500XU/g组合物。
在一个实施方案中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，存在于饲料添加剂组合物中的量为小于约320,000XU/g组合物，合适地小于约160,000XU/g组合物，合适地小于约50,000XU/g组合物，合适地小于约40,000XU/g组合物，合适地小于约30000XU/g组合物。
木聚糖酶活性可表示为木聚糖酶单位(XU)，木聚糖酶单位是使用AZCL-阿拉伯木聚糖(例如天青精交联的小麦阿拉伯木聚糖，Xylazyme片，Megazyme)作为底物在pH 5.0下测定的。通过内切-(1-4)-β-D-木聚糖酶(木聚糖酶)的水解产生水溶性染色片段，其释放速率(590nm下吸光度的增加)可与酶活性直接相关。木聚糖酶单位(XU)相对于酶标准(Danisco木聚糖酶，可得自Danisco Animal Nutrition公司)进行测定，测定在40℃、5分钟反应时间、McIlvaine缓冲液(pH 5.0)的标准反应条件下进行。
通过在pH 5.3和50℃下每分钟从燕麦-斯佩特小麦-木聚糖(oat-spelt-xylan)底物中释放还原糖端基的量来确定标准酶的木聚糖酶活性。还原糖端基与3,5-二硝基水杨酸反应，并且可通过在540nm处吸光度的增加来测量反应产物的生成。根据木糖标准曲线(还原糖当量)来定量酶活性。一个木聚糖酶单位(XU)是在pH 5.3和50℃下每分钟释放0.5μmol还原糖当量的标准酶的量。
在一个实施方案中，合适地，使用上述E.C.分类对酶进行分类，并且E.C.分类指示在本文所教导的测定法中进行测试以测定1XU时具有该活性的酶。
优选地，在小麦淀粉分离工艺的混合步骤中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，存在于生面团或面糊中的范围为约0.01kg/MT DS生面团或面糊至约0.60kg/MT DS，更优选地约0.05kg/MT DS至约0.45kg/MTDS生面团或面糊，并且甚至更优选地约0.10kg/MT DS至约0.25kg/MT DS生面团或面糊。
在一些实施方案中(特别是在小麦淀粉分离实施方案中)，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，可以约0.019g蛋白质/MT DS小麦面粉(其等同于0.019mg/kg DS)至约119g蛋白质/MT DS小麦面粉(其等同于119mg/kg DS)的范围投料，其中DS意指干固形物含量并且MT意指公吨。
在一些实施方案中(特别是在小麦淀粉分离实施方案中)，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，可以约1.19g蛋白质/MT DS小麦面粉(其等同于约1.19mg/kg DS)投料，其中DS意指干固形物含量并且MT意指公吨。
在一些实施方案中(特别是在小麦淀粉分离实施方案中)，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，可以约9至约120000单位/kg小麦面粉，合适地约500-2400单位/kg小麦面粉，合适地约900-1200单位/kg小麦面粉的范围投料(其中1个单位定义为在实施例4的桦木测定条件下每分钟产生1微摩尔的木糖还原糖当量所需的酶的量)。
在一些实施方案中(特别是在降解基于谷物的材料时)，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，可以约0.29g/蛋白质/MTDS小麦(其等同于0.29mg/kg DS)至约0290g/蛋白质/MT DS小麦(其等同于290mg/kg DS)的范围投料。
在一些实施方案中(特别是在降解基于谷物的材料时)，木聚糖酶可以2.9g/蛋白质/MT DS小麦(其等同于2.9mg/kg DS)投料。
在一些实施方案中(特别是在降解基于谷物的材料时)，木聚糖酶可以约22至约285000单位/kg，合适地约1100至约5700单位/kg，合适地约2200至约2850单位/kg的范围投料(其中1个单位定义为在实施例4的桦木测定条件下每分钟产生1微摩尔的木糖还原糖当量所需的酶的量)。
本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段和/或包含根据本发明的酶的组合物，可被设计成一次性投料或可被设计成用于每日使用(例如饲喂)的方式。
将在本发明中使用的本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段和/或包含该酶的组合物的最适量，将取决于待处理的产品和/或将产品与组合物接触的方法和/或其预期用途。
用于组合物中的本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段的量，应当是足以产生效果的量。
用于组合物中的本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段的量，应当是足以产生效果的量，并在例如改善含有所述组合物的动物饲养饲料产品的性能方面保持足够有效。该有效的时间长度应延长最多至至少利用该产品(例如饲料添加剂组合物或含有其的饲料)的时间。
配制
在一个实施方案中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，可配制成液体、干粉或颗粒。
干粉或颗粒可通过本领域技术人员已知的手段，例如，在顶喷式流化床涂布器中、在Wurster型底喷式流化床(buttom spray Wurster)中或通过转鼓制粒(例如高剪切制粒)、挤出、衣锅包衣或在微成分混合器中制备。
对于一些实施方案而言，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，可以是被包被的，例如，被包封的。
在一个实施方案中，涂层保护修饰的酶免受热影响并且可视为防热剂。
在一个实施方案中，将饲料添加剂组合物配制成干粉或颗粒，如WO2007/044968(称为TPT颗粒)或WO1997/016076或WO1992/012645中所述(将参考文献中的每一者以引用方式并入本文中)。
在一个实施方案中，可将饲料添加剂组合物配制成用于饲料组合物的颗粒，其包括：芯；活性剂；和至少一个涂层，在选自如下中的一种或多种的条件后，颗粒的活性剂保留至少50％活性、至少60％活性、至少70％活性、至少80％活性：a)饲料制丸工艺，b)蒸汽加热的饲料预处理工艺，c)储存，d)作为未经制丸混合物中的成分储存，和e)作为包含至少一种选自如下的化合物的饲料基础混合物或饲料预混物中的成分储存：痕量矿物质、有机酸、还原糖、维生素、氯化胆碱以及产生酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混物的化合物。
关于颗粒，至少一个涂层可包含构成颗粒的至少55w/w％的水分水合材料；和/或至少一个涂层可包括两个涂层。该两个涂层可为水分水合涂层和水分屏障涂层。在一些实施方案中，水分水合涂层可为颗粒的25w/w％至60w/w％之间并且水分屏障涂层可为颗粒的2w/w％至15w/w％之间。水分水合涂层可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精而水分屏障涂层可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。
颗粒可使用饲料制丸工艺制备并且饲料预处理工艺可在70℃至95℃之间进行最多数分钟，例如85℃至95℃之间。
在一个实施方案中，可将饲料添加剂组合物配制成用于动物饲料的颗粒，其包括：芯；活性剂，在储存后以及在该颗粒作为成分时颗粒的活性剂在蒸汽加热制丸工艺后保留至少80％活性；水分屏障涂层；以及至少占颗粒25％w/w的水分水合涂层，在蒸汽加热制丸工艺之前该颗粒的水活性小于0.5。
颗粒可具有选自聚合物和树胶的水分屏障涂层并且水分水合材料可为无机盐。水分水合涂层可为颗粒的25w/w％至45w/w％之间并且水分屏障涂层可为颗粒的2w/w％至10w/w％之间。
颗粒可使用蒸汽加热制丸工艺制备，该工艺可在85℃至95℃之间进行最多数分钟。
在一些实施方案中，可使用稀释剂(例如淀粉粉末、石灰石或诸如此类)稀释酶。
在一个实施方案中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段或包含该酶的组合物，是适于饮用的液体制剂，优选地此类液体饮用形式包含一种或多种以下物质：缓冲液、盐、山梨醇和/或甘油。
在另一个实施方案中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段或包含该酶的组合物，可通过如下方式配制：将酶施加(例如，喷雾)到诸如粉碎小麦的载体底物上。
在一个实施方案中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段或包含根据本发明的酶的组合物，可配制成预混物。仅举个例子，该预混物可包含一种或多种饲料组分，例如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。
在一个实施方案中，将用于本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，与至少一种选自如下物质中的至少一者的生理学上可接受的载体一起配制：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。
包装
在一个实施方案中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段和/或根据本发明的包含其的组合物(例如，饲料添加剂组合物)和/或预混物和/或饲料或饲料原料经过包装。
在一个优选的实施方案中，饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料或饲料原料包装在袋(例如纸袋)中。
在一个备选的实施方案中，可将饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料或饲料原料密封于容器中。可使用任何合适的容器。
形式
本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段或本发明的包含该酶的组合物(例如，饲料添加剂组合物)及其它组分和/或包含其的饲料原料，可以任何合适的形式使用。
本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段或本发明的包含其的组合物(例如，饲料添加剂组合物)，可以固体或液体制剂或其替代物的形式使用。固体制剂的示例包括可以是可湿润的、喷雾干燥的或冷冻干燥的粉末、糊剂、大丸剂、胶囊剂、粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、珠剂、溶液剂或混悬剂、粉剂和颗粒剂。液体制剂的示例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液剂、混悬剂和乳剂。
包含本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段的组合物，可包含调味剂或着色剂，用于立即释放、延迟释放、改变释放、持续释放、脉冲释放或控制释放的应用。
举例来说，如果本发明的组合物以固体(例如颗粒化形式)使用，其还可包含一种或多种下述物质：赋形剂诸如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐；制粒粘结剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶；还可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石粉。
用于制备这些形式的营养上可接受的载体的示例包括(例如)水、盐溶液、醇、有机硅(silicone)、蜡、石油凝胶、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、香水油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚(petroethral)脂肪酸酯、羟甲基-纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
上述形式优选的赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milk sugar)、或高分子量聚乙二醇。
对于水性混悬剂和/或酏剂，可将本发明的组合物与不同的甜味剂或调味剂、着色物质或染料进行组合，与乳化剂和/或助悬剂进行组合，以及与稀释剂(例如水、丙二醇和甘油、和它们的组合)进行组合。
受试者
本文所用的术语“受试者”意指待施用或已施用根据本发明的修饰的木聚糖酶或根据本发明的饲料添加剂组合物或包含根据本发明的所述饲料添加剂组合物的饲料原料的动物。
本文所用的术语“受试者”意指动物。
在一个实施方案中，受试者是哺乳动物、鸟、鱼或甲壳类动物，包括(例如)家畜或驯养动物(例如宠物)。
在一个实施方案中，“受试者”是家畜。
如本文所用的术语“家畜”是指任何农场动物。优选地，家畜是一种或多种反刍动物诸如牛(例如奶牛或公牛(包括小牛))，单胃动物诸如家禽(包括肉鸡、小鸡和火鸡)，猪(包括小猪)，鸟，水生动物诸如鱼、无胃鱼、有胃鱼、淡水鱼(诸如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼如锦鲤)、海鱼(诸如黑鲈)和甲壳类动物(诸如虾、贻贝和扇贝)，马(包括赛马)，羊(包括羔羊)。
在另一个实施方案中，“受试者”是驯养动物或宠物或维持于动物园环境中的动物。
本文所用的术语“驯养动物或宠物或维持于动物园环境中的动物”是指任何相关动物，包括犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、啮齿类动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠)、鸟、鱼(包括淡水鱼和海鱼)和马。
性能
本文所用的“动物性能”可通过动物的饲料效率和/或增重和/或通过饲料转化率和/或通过饲料中的营养物质的消化率(例如氨基酸消化率)和/或饲料中的可消化能或代谢能和/或通过氮保留量和/或通过动物避免坏死性肠炎的负面影响的能力和/或通过受试者的免疫应答来测定。
优选地，“动物性能”通过饲料功效和/或动物的增重和/或饲料转化率进行测定。
所谓“改善的动物性能”，其意指与不包含本发明的饲料添加剂组合物的饲料相比，由于使用所述饲料添加剂组合物，受试者中的饲料效率增加和/或增重增加和/或饲料转化率降低和/或饲料中的营养物质或能量的消化率改善和/或氮保留量改善和/或免疫应答改善。
优选地，所谓“改善的动物性能”，其意指饲料效率增加和/或增重增加和/或饲料转化率降低。
本文所用，术语“饲料效率”是指在一段时间期间不限量饲喂动物或对其饲喂指定量的饲料时每单位饲料的增重的量。
所谓“增加的饲料效率”，其意指与在不存在根据本发明的饲料添加剂组合物的情况下饲喂的动物相比，在饲料中使用所述饲料添加剂组合物导致每单位摄入饲料的增重增加。
饲料转化率(FCR)
本文所用的术语“饲料转化率”是指为使动物体重增加特定的量而饲喂给动物的饲料的量。
改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。
所谓“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”，其意指在饲料中使用饲料添加剂组合物导致动物体重增加指定量时所需饲喂给动物的饲料量低于在该饲料不包含所述饲料添加剂组合物时使动物体重增加相同量时所需的饲料量。
营养物质消化率
本文所用的营养物质消化率意指从胃肠道或胃肠道的指定区段(例如小肠)消失的营养物质的分数。营养物质消化率可测量为所施用给受试者的与受试者粪便中所出来的之间的差值、或所施用给受试者的与所保留在胃肠道指定区段(例如回肠)上的消化物中的之间的差值。
如本文所用的营养物质消化率可通过一段时间内营养物质摄取和由总排泄物收集物排出的营养物质之间的差值来测量；或通过使用惰性标记物来测量，其中该惰性标记物不被动物吸收并允许研究者可计算在整个胃肠道或胃肠道的一部分消失的营养物质的量。这种惰性标记可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可表示为饲料中营养物质的百分比、或表示为饲料中每质量单位的营养物质中所含可消化的营养物质的质量单位数。
本文所用的营养物质消化率涵盖淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。
本文所用的能量消化率意指所消耗的饲料总能量减去粪便的总能量，或所消耗的饲料总能量减去动物胃肠道指定区段(例如回肠)上的剩余消化物的总能量。本文所用的代谢能是指表观代谢能，且意指所消耗的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中含有的总能量。可使用与测定营养物质消化率相同的方法，通过总能量的摄入量与粪便排出的总能量之间的差值，或与胃肠道特定区段(例如回肠)中存在的消化物总能量之间的差值来测量能量消化率和代谢能，同时对氮排泄进行适当校正来计算饲料的代谢能。
与其它组分组合
本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，可与其它组分结合地使用。
在一个实施方案中，本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，可与益生菌或直接饲喂性微生物(DFM)如直接饲喂性细菌结合地使用。
本发明的组合包括本发明的具有木聚糖酶活性的酶，例如GH10木聚糖酶(诸如修饰的GH10木聚糖酶)或其片段，或包含木聚糖酶的组合物，例如饲料添加剂组合物，以及另一种组分，该另一种组分适于人或动物服用并且能为服用者提供医学或生理益处。
在一个实施方案中，“另一种组分”可以是一种或多种其它的酶(如其它的饲料酶或酿造或制麦芽酶，或谷物加工酶或小麦面筋-淀粉分离酶)。
用于本发明中的合适的额外酶可为选自如下酶类的一种或多种酶：内切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)；纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)、β-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、纤维素酶(E.C.3.2.1.74)、地衣多糖酶(E.C.3.1.1.73)、脂肪酶(E.C.3.1.1.3)、脂质酰基转移酶(通常被归类为E.C.2.3.1.x)、磷脂酶(E.C.3.1.1.4、E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)、植酸酶(例如6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.3.8)、淀粉酶、α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、其它木聚糖酶(E.C.3.2.1.8、E.C.3.2.1.32、E.C.3.2.1.37、E.C.3.1.1.72、E.C.3.1.1.73)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)、半纤维素酶、蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))、脱支酶、角质酶、酯酶和/或甘露聚糖酶(例如，β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。
在一个实施方案中(尤其是饲料应用的实施方案)，其它组分可以是一种或多种选自以下项的酶：淀粉酶(包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、G4-形成淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3))；和/或蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))和/或植酸酶(例如，6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.38))。
在一个实施方案中(尤其是饲料应用的实施方案)，其它组分可为
淀粉酶(例如，α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1))和蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62))的组合。
在一个实施方案中(尤其是饲料应用的实施方案)，其它组分可为β-葡聚糖酶，例如内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.6)。
在一个实施方案中(尤其是饲料应用的实施方案)，其它组分可为植酸酶(例如，6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.38)。
在一个实施方案中(尤其是饲料应用的实施方案)，其它组分可为甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。
在一个实施方案中(尤其是饲料应用的实施方案)，其它组分可为脂肪酶(E.C.3.1.1.3)、脂质酰基转移酶(通常归类为E.C.2.3.1.x)、或磷脂酶(E.C.3.1.1.4、E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)、合适地为脂肪酶(E.C.3.1.1.3)。
在一个实施方案中(尤其是饲料应用的实施方案)，其它组分可为蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))。
在一个实施方案中，附加组分可为稳定剂、或乳化剂、或粘结剂、或载体、或赋形剂、或稀释剂、或崩解剂。
本文所用的术语“稳定剂”被定义为防止产品(如饲料产品)随时间推移发生变化的成分或成分组合。
本文所用的术语“乳化剂”是指防止乳液分离的成分(例如饲料成分)。乳液是两种不相溶的物质，其中一种以液滴形式存在的物质包含于另一种物质之中。乳液可以由水包油构成，其中小滴或分散相为油而连续相为水；或由油包水构成，其中水变成分散相而连续相为油。也可通过使用乳化剂使泡沫(其是液包气)和混悬液(其为液固混悬液)稳定。
本文所用的术语“粘结剂”是指通过物理或化学反应而将产品粘结到一起的成分(如饲料成分)。例如在“凝胶化”过程中，水被吸收，从而产生粘结效果。然而，粘结剂可吸收其它液体(例如油)，并将其保持在产品之内。在本发明上下文中，粘结剂将通常用于固体或低水分产品(例如烘焙产品：甜点、甜甜圈、面包等等)中。制粒粘结剂的示例包括以下物质中的一者或多者：聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、麦芽糖、明胶和阿拉伯胶。
“载体”是指适用于施用酶的材料，并且包括本领域已知的任何此类材料，例如任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂等，此类材料无毒且不与组合物的任何组分以有害的方式相互作用。
本发明提供用于制备组合物(例如，饲料添加剂组合物)的方法，该方法包括将本发明的酶与至少一种选自如下中的至少一者的生理学上可接受的载体混合：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。
“赋形剂”的示例包括以下物质中的一者或多者：微晶纤维素和其它纤维素、乳糖(lactose)、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、甘氨酸、淀粉、乳糖(milk sugar)和高分子量聚乙二醇。
“崩解剂”的示例包括以下物质中的一者或多者：淀粉(优选地为玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐。
“稀释剂”的示例包括以下物质中的一者或多者：水、乙醇、丙二醇和甘油以及它们的组合。
其它组分可与本发明的木聚糖酶同时使用(例如当它们混合在一起时或者甚至当它们通过不同的途径递送时)或者依序使用(例如它们可通过不同的途径递送)。
优选地，在将本发明的饲料添加剂组合物与另一组分混合时，DFM保持为活的。
在一个实施方案中，优选地，根据本发明的饲料添加剂组合物不包含铬或有机铬。
在一个实施方案中，优选地，根据本发明的饲料添加剂不含有葡聚糖酶。
在一个实施方案中，优选地，根据本发明的饲料添加剂不含有山梨酸。
分离的
在一个方面，优选地，根据本发明的氨基酸序列或核酸或酶是分离的形式。术语“分离的”意指序列或酶或核酸至少实质上不含所述序列、酶或核酸在自然界中天然与之相关联或在自然界中存在的至少一种其它组分。本发明的序列、酶或核酸可以实质上不含所述物质原本可能与之相关联的一种或多种污染物的形式提供。因此，例如，其可基本上不含一种或多种潜在污染性的多肽和/或核酸分子。
纯化的
在一个方面，优选地，根据本发明的序列、酶或核酸是纯化的形式。术语“纯化的”意指给定组分以高水平存在。理想的是该组分为组合物中存在的主要组分。优选地，其以至少约90％、或至少约95％或至少约98％的水平存在，所述水平是相对于所考虑总组合物以干重/干重计来测定的。
核苷酸序列
本发明的范围涵盖编码具有本文所限定的特定性质的蛋白质的核苷酸序列。
本文所用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(诸如其部分)。核苷酸序列可为基因组起源的或者合成或重组起源的，其可以是双链的或单链的而无论是代表有义链还是反义链。
与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选地，其意指DNA，更优选地，意指编码本发明的cDNA序列。
在一个实施方案中，术语“核苷酸序列”意指cDNA。
在一个优选的实施方案中，当与本发明的范围本身有关以及当为本发明的范围本身所涵盖时，核苷酸序列不包括处于其天然环境中时或其连接至其也存在于其/它们的天然环境中的天然结合的序列时的根据本发明的天然核苷酸序列。为了易于指代，我们应该称该优选的实施方案为“非天然核苷酸序列”。就这一点而言，术语“天然核苷酸序列”意指处于其天然环境中并且在可操作地连接至其天然与之相关联的整个启动子时的整个核苷酸序列，该启动子也处于其天然环境中。然而，本发明的范围所涵盖的氨基酸序列可在核苷酸序列在其天然生物体中表达后分离和/或纯化。优选地，然而，本发明的范围所涵盖的氨基酸序列可由核苷酸序列在其天然生物体中表达，但其中该核苷酸序列不处于在该生物体中其与之天然结合的启动子的控制之下。
通常，由本发明的范围所涵盖的核苷酸序列使用重组DNA技术制备(即重组DNA)。然而，在本发明的备选实施方案中，核苷酸序列可用本领域所熟知的化学方法整体或分部分地合成(参见Caruthers MH等人，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等人，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
核苷酸序列的制备
编码具有如本文所限定的特定性质的蛋白质或适于修饰的蛋白质的核苷酸序列可从产生所述蛋白质的任何细胞或生物体鉴别和/或分离和/或纯化。多种方法是核苷酸序列鉴别和/或分离和/或纯化领域所熟知的。举个例子，一旦已鉴别和/或分离和/或纯化合适的序列后即可使用PCR扩增技术来制备更多条序列。
举另一个例子，可用来自产生酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该酶的氨基酸序列是已知的话，可合成标记寡核苷酸探针并用于从由生物体制备的基因组文库鉴别酶编码克隆。备选地，可将含有与另一已知酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针用于鉴别酶编码克隆。在后一种情况下，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。
备选地，酶编码克隆可通过这样来鉴别：将基因组DNA的片段插入表达载体(如质粒)中，用所得的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将转化细菌接种于含有酶底物(即阿拉伯木聚糖)的琼脂板上，从而使得表达该酶的克隆能被鉴别。
在又一个备选方案中，编码该酶的核苷酸序列可以通过已确立的标准方法合成制备，例如由Beucage S.L.等人，(1981)Tetrahedron Letters 22，第1859-1869页所述的亚磷酰胺方法，或Matthes等人，(1984)EMBO J.3，第801-805页所述的方法。在亚磷酰胺方法中，合成寡核苷酸，例如在自动DNA合成仪中，将其纯化、退火、连接并克隆入适当的载体中。
核苷酸序列可以为混合的基因组起源和合成起源、混合的合成起源和cDNA起源或混合的基因组起源和cDNA起源，根据标准技术通过连接合成起源、基因组起源或cDNA起源的片段制备(视情况而定)。每一连接的片段对应于整个核苷酸序列的各个部分。DNA序列还可使用特定引物通过聚合酶链反应(PCR)制备，例如US 4,683,202或Saiki R K等人(Science(1988)239，第487-491页)中所述。
氨基酸序列
本发明的范围还涵盖具有如本文所限定的特定性质的酶的氨基酸序列。
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”是同义的。
氨基酸序列可从合适的来源制备/分离，或者其可通过合成制备或者其可通过利用重组DNA技术制备。
优选地，当与本发明的本身范围有关或当由本发明的本身范围所涵盖时，氨基酸序列不是天然的酶。就这一点而言，术语“天然的酶”意指处于其天然环境中并且在其已由其天然核苷酸序列表达时的整个酶。
序列同一性或序列同源性
本发明还涵盖与具有本文所限定的特定性质的多肽的氨基酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列或编码这种多肽的任何核苷酸序列(下文称为“同源序列”)的用途。在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可等同于“同一性”。
该同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应该提供和/或编码保留该酶的功能活性和/或增强该酶的活性的多肽。
在本说明书的语境中，在一些实施方案中，同源序列意指包括这样的氨基酸或核苷酸序列，其可与主题序列具有至少97.7％同一性、优选地至少98％或99％同一性。
在一些实施方案中，同源序列意指包括这样的氨基酸或核苷酸序列，其可与主题序列具有至少85％同一性、优选地至少90％或95％同一性。
通常，同源物将包含例如与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本发明的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。
在一个实施方案中，同源序列意指包括这样的氨基酸序列或核苷酸序列，其与主题序列相比具有一个或几个添加、缺失和/或置换。
在本说明书的语境中，“主题序列”涉及根据本发明的核苷酸序列或多肽/氨基酸序列。
优选地，关于多肽序列的序列同一性％是使用SEQ ID No.1作为序列比对中的主题序列来确定的。在一个实施方案中，多肽主题序列选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.26、SEQID No.27、SEQ ID No.3、SEQ ID No 28、SEQ ID No.29或SEQ ID No.5。
优选地，关于核苷酸序列的序列同一性％是使用SEQ ID No.2作为序列比对中的主题序列来确定的。在一个实施方案中，核苷酸序列的主题序列可选自SEQ ID No.2、SEQID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQID No 32或SEQ ID No.33。
“亲本核酸”或“亲本氨基酸”分别意指编码亲本多肽的核酸序列或氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及具有本文所示氨基酸序列的蛋白质，或通过如下方式来源于该(亲本)蛋白质并具有亲本蛋白质活性的蛋白质：在亲本蛋白质的氨基酸序列中置换、缺失或添加一个或几个氨基酸，诸如2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸，或更多个氨基酸，诸如10个或大于10个氨基酸。
合适地，关于氨基酸序列的同一性程度是在至少20个连续氨基酸上、优选在至少30个连续氨基酸上、优选在至少40个连续氨基酸上、优选在至少50个连续氨基酸上、优选在至少60个连续氨基酸上、优选在至少100个连续氨基酸上、优选在至少200个连续氨基酸上测定。
在一个实施方案中，本发明涉及一种核酸序列(或基因)，其编码具有本文所示氨基酸序列的蛋白质，或编码通过如下方式来源于该(亲本)蛋白质并具有亲本蛋白质活性的蛋白质：在亲本蛋白质的氨基酸序列中置换、缺失或添加一个或几个氨基酸，诸如2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸，或更多个氨基酸，诸如10个或大于10个氨基酸。
在本说明书的语境中，在一个实施方案中，同源序列或外来序列意指包括这样的核苷酸序列，其可与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)有至少97.7％同一性，优选至少98％或99％同一性。
在另一个实施方案中，同源序列意指包括这样的核苷酸序列，其可与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)有至少85％同一性，优选至少90％或95％同一性。
通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本发明的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。
同源性比较可通过眼来进行，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可计算两条或更多条序列之间的同源性％或同一性％。
同源性％或同一性％可在连续的序列上计算，即将一条序列与另一条序列进行比对，并将一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“不产生空位的”比对。通常，这种不产生空位的比对仅在相对短数目的残基范围内进行。
尽管这是十分简单和可靠的方法，但其未考虑到，例如在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致同源性％或同一性％大为降低。因此，大多数序列比较方法被设计产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失，从而不会不当地减损整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。
然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋给“空位罚分”使得对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多空位的序列比对更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gapcost)”，其对空位的存在征收相对较高的成本，对空位中每一个后续的残基征收较少的罚分。这是最通常使用的空位评分系统。高的空位罚分将当然会产生具有较少空位的最佳比对结果。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。
最大同源性％或同一性％的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。进行这种比对的合适计算机程序是Vector NTI(Invitrogen公司)。可进行序列比较的软件的示例包括但不限于例如：BLAST软件包(参见Ausubel等人，1999ShortProtocols in Molecular Biology，第4版，第18章)、BLAST 2(FEMS Microbiol Lett 1999174(2):247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)、FASTA(Altschul等人，1990J.Mol.Biol.403-410)和AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于离线和在线搜索(参见Ausubel等人，1999，第7-58页至7-60页)，诸如在GenomeQuest搜索工具中(www.genomequest.com)。
尽管最终的同源性％或同一性％也可按同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无(all-or-nothing)的成对比较。相反，通常使用标度化相似性评分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离向每一成对比较赋予分值。常用的这种矩阵的一个示例是BLOSUM62矩阵—BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(更多细节请参见用户手册)。对于一些应用而言，优选的是使用Vector NTI软件包的各默认值。
备选地，同源性百分比可使用Vector NTI(Invitrogen公司)中的多重比对功能计算，该功能是基于类似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988),Gene 73(1),237-244)的算法。
一旦该软件产生了最佳比对，则有可能计算同源性百分数，优选序列同一性百分数。该软件通常进行这种计算作为序列比较的一部分，并产生数值结果。
当测定序列同一性时应该使用空位罚分(Gap Penalties)，然后优选地将如下参数用于成对比对：
对于BLAST
空位开放(GAP OPEN) 9
空位延伸(GAP EXTENSION) 2
Figure GDA0003001128500000771
Figure GDA0003001128500000781
在一个实施方案中，可使用采用上面限定的空位罚分和空位延伸组的CLUSTAL。
合适地，关于核苷酸序列或蛋白质序列的同一性程度是在至少20个连续核苷酸/氨基酸上，优选在至少30个连续核苷酸/氨基酸上，优选在至少40个连续核苷酸/氨基酸上，优选在至少50个连续核苷酸/氨基酸上，优选在至少60个连续核苷酸/氨基酸上，优选在至少100个连续核苷酸/氨基酸上测定。
合适地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少100个连续核苷酸上，优选在至少200个连续核苷酸上，优选在至少300个连续核苷酸上，优选在至少400个连续核苷酸上，优选在至少500个连续核苷酸上，优选在至少600个连续核苷酸上，优选在至少700个连续核苷酸上，优选在至少800个连续核苷酸上测定。
合适地，关于核苷酸序列的同一性程度可在本文教导的整个序列上测定。
合适地，关于核苷酸序列的同一性程度可在本文作为成熟序列教导的整个序列上测定，例如SEQ ID No.2或SEQ ID No.24或SEQ ID No.25或SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33。合适地，关于核苷酸序列的同一性程度可在本文作为SEQ ID No.2教导的整个序列上测定。
合适地，关于蛋白质(氨基酸)序列的同一性程度在至少100个连续氨基酸上、优选在至少200个连续氨基酸上、优选在至少300个连续氨基酸上测定。
合适地，关于氨基酸或蛋白质序列的同一性程度可在本文教导的整个序列上测定。
合适地，关于氨基酸或蛋白质序列的同一性程度可在本文作为成熟序列教导的整个序列上测定，例如SEQ ID No.1、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.29或SEQ ID No.5。合适地，关于氨基酸或蛋白质序列的同一性程度可在本文作为SEQ ID No.1教导的整个序列上测定。
在本说明书的语境中，术语“查询序列”意指同源序列或外来序列，将其与主题序列进行比对，以观察主题序列是否落入本发明的范围内。因此，这样的查询序列可例如是现有技术序列或第三方序列。
在一个优选的实施方案中，序列通过全局比对程序进行比对，通过程序识别的精确匹配数除以主题序列的长度来计算序列同一性。
在一个实施方案中，查询序列和主题序列之间的序列同一性程度通过如下步骤确定：1)通过任何合适的比对程序，使用默认计分矩阵和默认空位罚分，将所述两个序列进行对比，2)识别精确匹配的数量，其中精确匹配是比对程序已于比对过程中在两个受比对序列中的给定位置上识别出相同的氨基酸或核苷酸的情况，以及3)将精确匹配的数量除以主题序列的长度。
在又一个优选的实施方案中，全局比对程序选自CLUSTAL和BLAST(优选BLAST)，通过程序识别的精确匹配数除以主题序列的长度来计算序列同一性。
序列还可具有氨基酸残基的缺失、插入或置换，所述缺失、插入或置换导致功能上等价的物质。可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行有意的氨基酸置换。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有类似亲水性值的含不带电的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
可例如根据下表进行保守置换。第二列中同一区组内的氨基酸，优选第三列中同一行内的氨基酸可彼此置换：
Figure GDA0003001128500000791
Figure GDA0003001128500000801
本发明还涵盖可能出现的同源置换(在本文中，置换和取代都用来指现有的氨基酸残基与备选的残基的交换)，即对等置换，如碱性对碱性，酸性对酸性，极性对极性等。非同源置换也可能出现，即从一类残基置换成另一类残基，或备选地涉及到加入非天然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。
还可用非天然氨基酸进行置换，包括：α*和α-二取代的*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化衍生物(如三氟酪氨酸*、对氯苯丙氨酸*、对溴苯丙氨酸*、对碘苯丙氨酸*)、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、对硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物(如4-甲基-苯丙氨酸*、五甲基-苯丙氨酸*)、L-苯丙氨酸(4-氨基)#、L-酪氨酸(甲基)*、L-苯丙氨酸(4-异丙基)*、L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸#和L-苯丙氨酸(4-苄基)*。为了上面论述的目的(与同源性或非同源性置换相关)，符号*用于指衍生物的疏水性质，而#用于指衍生物的亲水性质，#*指两亲特性。
变体氨基酸序列可包括可在序列的任何两个氨基酸残基之间插入的合适的间隔基团，这些间隔基团除了氨基酸间隔物如甘氨酸或β-丙氨酸残基外还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。变异的另外的形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为了避免疑惑，“类肽”用于指其中α-碳取代基处于残基的氮原子而不是α-碳上的变体氨基酸残基。用于制备类肽形式的肽的工艺是本领域已知的，例如Simon RJ等人，PNAS(1992)89(20),9367-9371和Horwell DC,TrendsBiotechnol.(1995)13(4),132-134。
在一个实施方案中，用于本发明的木聚糖酶可包含具有至少一个氨基酸保守置换的被示出为SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20或SEQ ID No.21的多肽序列。
合适地，可存在至少2个保守置换，诸如至少3个或至少4个或至少5个。
合适地，可存在少于15个保守置换，诸如少于12个、少于10个、或少于8个或少于5个保守置换。
用于本发明的核苷酸序列可在它们中包括合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸作出的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3'和/或5'端添加吖啶或多聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解本文所描述的核苷酸序列可以通过本领域可用的任何方法修饰。可进行这种修饰以便增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涵盖与本文给出的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的用途。如果序列与其片段互补，则该序列可用作探针来鉴别其它生物体中的相似编码序列等等。
不与本发明的序列100％同源但属于本发明的范围之内的多核苷酸可以多种方式获得。本文描述的序列的其它变体可例如通过用探针探测(probing)从一系列个体(例如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获得。此外，可获得其它同源物并且这种同源物及其片段一般将能够选择性杂交至本文所列序列中所示的序列。这种序列可通过这样获得：从其它动物物种制备cDNA文库或基因组DNA文库，在中等至高严格性条件下用包含随附的序列表中的序列中的任一条的全部或部分的探针，探测这些文库。类似的考虑用来获得本发明的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。
变体和株系/物种同源物还可用简并PCR获得，简并PCR将使用被设计来靶向变体和同源物内这样的序列的引物，所述序列编码本发明序列内的保守氨基酸序列。保守序列可例如通过比对来自数种变体/同源物的氨基酸序列来预测。序列比对可以用本领域已知的计算机软件来进行。例如，GCG Wisconsin PileUp程序是广泛使用的。
简并PCR中使用的引物将含有一个或多个简并位置，并将在比用于以单序列引物从已知序列克隆序列的那些严格性条件低的严格性条件下使用。
备选地，这种多核苷酸可通过对已表征的序列进行定点诱变来获得。在例如需要沉默密码子序列改变来优化多核苷酸序列在其中表达的特定宿主细胞的密码子偏好的情形中，这可能是有用的。其它序列改变可能是期望的以便引入限制性酶识别位点，或以改变多核苷酸编码的多肽的性质或功能。
本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于产生引物(例如PCR引物)、备选的扩增反应的引物、探针(例如用放射性或非放射性标记通过常规手段标记上显示标记(revealinglabel)的探针)，或者可将多核苷酸克隆进载体中。这种引物、探针和其它片段的长度将为至少15个，优选至少20个，例如至少25、30或40个核苷酸，并且也为本文所用的术语本发明多核苷酸所涵盖。
根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针可重组产生、合成产生或通过本领域技术人员可用的任何手段产生。它们还可以通过标准技术克隆。
通常，引物将通过合成手段产生，涉及所需核酸序列的逐步制备，一次一个核苷酸。利用自动化技术完成该过程的技术是本领域轻易获得的。
较长的多核苷酸通常将用重组手段产生，例如用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。引物可被设计为含有合适的限制性酶识别位点，使得可将扩增的DNA克隆进合适的克隆载体中。
氨基酸编号
在本发明中，可采用本发明所使用的木聚糖酶中的氨基酸残基位置的特定编号。通过将样品木聚糖酶的氨基酸序列与本发明的木聚糖酶(特别是SEQ ID No.1)进行比对，可能给所述样品木聚糖酶的氨基酸残基位置分配一个数字，该数字与本发明SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的氨基酸残基位置或编号相对应。
杂交
本发明还涵盖与本发明的核酸序列互补的序列或能够杂交至本发明的序列或杂交至与本发明序列互补的序列的序列。
本文所用的术语“杂交”应包括“一条核酸链与互补链通过碱基配对接合的过程”以及在聚合酶链反应(PCR)技术中所进行的扩增过程。
本发明还涵盖能杂交至与本文给出的序列互补的序列的核苷酸序列或其任何片段或衍生物的用途。
术语“变体”还涵盖与能够杂交至本文给出的核苷酸序列的序列互补的序列。
优选地，术语“变体”涵盖与这样的序列互补的序列：所述序列能够在严格条件(例如50℃和0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})下与本文给出的核苷酸序列杂交。
更优选地，术语“变体”涵盖与这样的序列互补的序列：所述序列能够在高严格条件(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠pH 7.0})下与本文给出的核苷酸序列杂交。
本发明还涉及可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的核苷酸序列。
本发明还涉及这样的核苷酸序列，该核苷酸序列与可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的序列互补。
优选地，杂交在本文教导的整个序列上进行分析。
酶的表达
可将用于本发明的核苷酸序列掺入重组体复制型载体中。该载体可用于在相容宿主细胞中和/或从相容宿主细胞复制和表达核苷酸序列(以蛋白质/酶形式)。
可用控制序列，例如调控序列控制表达。
由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列产生的蛋白质可被分泌或者可包含在细胞内，这取决于所使用的序列和/或载体。编码序列可被设计具有信号序列，该信号序列引导编码该物质的序列穿过特定的原核或真核细胞膜分泌。
表达载体
术语“表达载体”意指能够在体内或体外进行表达的构建体。
优选地，将表达载体掺入合适的宿主生物体的基因组中。术语“掺入”优选涵盖稳定的掺入基因组中。
本发明的核苷酸序列可存在于载体中，在该载体中该核苷酸序列有效连接至调控序列，该调控序列能够提供由合适的宿主生物体表达该核苷酸序列。
可将用于本发明的载体转化进如下文所述的合适宿主细胞中以提供本发明的多肽的表达。
载体(例如质粒、粘粒或噬菌体载体)的选择将通常取决于待将其引入的宿主细胞。
用于本发明的载体可含有一种或多种可选标记基因-如赋予抗生素抗性，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。备选地，该选择可通过共转化来完成(如WO91/17243中所描述的)。
载体可在体外用于例如产生RNA，或用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。
因而，在进一步的实施方案中，本发明提供通过如下步骤制备本发明的核苷酸序列的方法：将本发明的核苷酸序列引入复制型载体内，将该载体引入相容的宿主细胞内，并在引起该载体复制的条件下培养该宿主细胞。
该载体可另外包含使得该载体能在所考虑的宿主细胞中复制的核苷酸序列。此类序列的示例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
调控序列
在一些应用中，用于本发明的核苷酸序列有效连接至调控序列，该调控序列能够提供核苷酸序列的表达，例如通过所选择的宿主细胞表达。举个例子，本发明涵盖包含有效连接至这样一种调控序列的本发明核苷酸序列的载体，即该载体是表达载体。
术语“有效连接”是指“邻接”，其中所描述的各组分处于使得它们能以其预期的方式发挥功能的关系。调控序列“有效连接”至编码序列是以使得该编码序列的表达能在与该控制序列相容的条件下实现的方式连接。
术语“调控序列”包括启动子和增强子以及其它表达调节信号。
术语“启动子”是以本领域的标准意义使用，例如RNA聚合酶结合位点。
编码本发明的酶的核苷酸序列的增强表达也可以通过选择异源调控区(例如，启动子、分泌引导区和终止子区)来实现。
优选地，根据本发明的核苷酸序列有效连接至至少一个启动子。
其它启动子还可用于引导本发明的多肽的表达。
适用于引导核苷酸序列在细菌、真菌或酵母宿主中转录的启动子的示例是本领域所熟知的。
启动子可额外包括用于确保或用于增加在合适宿主中的表达的特征物。例如，所述特征物可以是保守区，例如Pribnow盒或TATA盒。
构建体
术语“构建体”(其与诸如“结合物”、“盒”和“杂交体”之类的术语同义)包括直接或间接连接至启动子的用于根据本发明的用途的核苷酸序列。
间接连接的示例是在启动子和本发明的核苷酸序列中间提供合适的间隔基团如内含子序列，例如Sh1-内含子或ADH内含子。与本发明相关的术语“融合的”同样如此，其包括直接或间接连接。在一些情况下，该术语不涵盖这样的编码蛋白质的核苷酸序列的天然组合：其通常与野生型基因启动子相关联并且当它们二者均处于其天然环境中时。
构建体可甚至含有或表达标记，该标记便于该遗传构建体的选择。
对于某些应用，优选的是，本发明的构建体至少包含有效连接至启动子的本发明的核苷酸序列。
宿主细胞
与本发明有关的术语“宿主细胞”包括包含所述核苷酸序列或上述表达载体并用于重组产生具有本文所限定的特定性质的蛋白质的任何细胞。
在一个实施方案中，生物体为表达宿主。
因而，本发明的另一个实施方案提供用表达本发明的蛋白质的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。细胞将选择为与所述载体相容，并且可以例如是原核(例如细菌)、真菌或酵母细胞。
合适的细菌宿主生物体的示例是革兰氏阳性或革兰氏阴性菌物种。
在一个实施方案中，本文教导的木聚糖酶在表达宿主里氏木霉中表达。
在一些实施方案中，本文教导的木聚糖酶的表达宿主可为以下一种或多种真菌表达宿主：镰刀菌属物种(诸如尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum))；曲霉属物种(诸如黑曲霉、米曲霉(A.oryzae)、构巢曲霉(A.nidulans)或泡盛曲霉(A.awamori)或木霉属物种(诸如里氏木霉)。
在一些实施方案中，表达宿主可为以下一种或多种细菌表达宿主：链霉菌属物种(Streptomyces spp.)或芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)(例如，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)。
合适宿主细胞例如酵母和真菌宿主细胞的使用可提供翻译后修饰(例如豆蔻酰化、糖基化、截短、脂质化以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸的磷酸化)，可能需要这些用于给本发明的重组表达产物赋予最佳的生物学活性。
生物体
与本发明有关的术语“生物体”包括任何生物体，其可包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，和/或其中启动子可允许在存在于该生物体中时根据本发明的核苷酸序列表达。
在一个实施方案中，生物体为表达宿主。
合适的生物体可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。
与本发明有关的术语“转基因生物体”包括任何生物体，其包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，和/或其中启动子可允许根据本发明的核苷酸序列在该生物体内表达。优选地，所述核苷酸序列掺入生物体的基因组中。
术语“转基因生物体”不涵盖处于其天然环境中且当它们处于它们的天然启动子(也处于其天然环境中)的控制之下时的天然核苷酸编码序列。
因而，本发明的转基因生物体包括包含如下中的任一种或如下的组合的生物体：编码根据本发明的多肽的核苷酸序列、根据本发明的构建体、根据本发明的载体、根据本发明的质粒、根据本发明的细胞、根据本发明的组织或它们的产物。
例如，转基因生物体可还包含处于异源启动子的控制下的编码本发明的多肽的核苷酸序列。
宿主细胞/生物体的转化
如较早指出的，宿主生物体可以是原核或真核生物体。合适的原核宿主的示例包括大肠杆菌(E.coli)、链霉菌属物种和芽孢杆菌属物种如枯草芽孢杆菌。
有关原核生物宿主的转化的教导在本领域的文献中有充分记载，例如参见Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，1989,Cold SpringHarbor Laboratory出版社)。如果使用原核生物宿主，则该核苷酸序列可能需要适当地进行修饰后再进行转化，例如通过去除内含子来进行修饰。
可用本领域已知的多种方法转化丝状真菌细胞，例如涉及原生质体形成和原生质体转化以及随后的以已知的方式再生细胞壁的方法。使用曲霉菌属作为宿主微生物在EP 0238 023中有所描述。
原核生物、真菌和酵母的转化是本领域技术人员众所周知的。
宿主生物体可以是真菌例如霉菌。合适的这种宿主的示例包括属于以下各属的任何成员：木霉属(例如，里氏木霉)、嗜热真菌属(Thermomyces)、枝顶孢属(Acremonium)、镰刀菌属、曲霉属、青霉属、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)等。
在一个实施方案中，宿主生物体可为真菌。在一个优选的实施方案中，宿主生物体属于木霉属，例如里氏木霉。
培养和生产
用本发明的核苷酸序列转化的宿主细胞可在有利于产生所编码的多肽并且有利于从细胞和/或培养基回收所述多肽的条件下培养。
用于培养细胞的培养基可以是适合于培养所考虑的宿主细胞和获得所述多肽的表达的任何常规培养基。
由重组细胞产生的蛋白质可展示在细胞的表面。
蛋白质可从宿主细胞分泌并且可方便地用熟知的工序从培养基回收。
分泌
通常，期望蛋白质从表达宿主分泌进培养基中，从培养基可更容易回收蛋白质。根据本发明，可根据所需的表达宿主选择分泌引导序列。杂交体信号序列也可用于本发明的该方面。
大规模应用
在本发明的一个优选实施方案中，氨基酸序列用于大规模应用。
优选地，在培养宿主生物体后氨基酸序列以1g/升至约100g/升总细胞培养物体积的量生产。
合适地，在培养宿主生物体后氨基酸序列可以30g/升至约90g/升总细胞培养物体积的量生产。
一般的重组DNA方法技术
除非另外指明，否则本发明采用常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力之内。这些技术在文献中进行了解释。参见例如J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第二版，第1-3册，Cold Spring Harbor Laboratory出版社；Ausubel,F.M.等人(1995和定期增刊；Current Protocols in Molecular Biology，第9、13和16章，JohnWiley&Sons,New York,N.Y)；B.Roe、J.Crabtree和A.Kahn，1996,DNA Isolation andSequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；M.J.Gait(编辑)，1984,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,Irl出版社；以及D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992,Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis andPhysical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic出版社。这些一般性文本中的每一个以引用方式并入本文。
现仅以举例的方式参照以下附图和实施例来描述本发明。
实施例
实施例1
材料和方法
质粒和文库构建
通过用attB1和attB2位点延伸的基因特异性引物从基因组DNA扩增包含来自丝状真菌串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)的木聚糖酶4(家族GH10)FveXyn4的编码区的DNA序列，从而使
Figure GDA0003001128500000881
BP重组克隆到pDonor221载体(Invitrogen,USA)中。供应商BaseClear(荷兰)和Geneart有限公司(德国)将如图20所示的pEntry-FveXyn4质粒用作构建组合文库的模板。
以组合文库的形式或通过引入特定突变而生成FveXyn4的变体，并将其设计成包括不同数量和组合的表1中所示的突变。这些变体中包括变体A、B、C、D和E以及实施例12的变体。
用目的载体pTTTpyr2(图21)经由
Figure GDA0003001128500000891
重组技术(Invitrogen,USA)生成组合变体。将表达具有不同突变的Xyn4的所得表达质粒pTTTpyr2-FveXyn4_VAR在大肠杆菌DH5a菌株中扩增，纯化、测序、单独点样于96孔微量滴定板中，并用于进一步所描述的真菌转化。表达载体包含里氏木霉cbh1启动子和终止子区域，从而实现所关注基因的强诱导型表达，并且包含构巢曲霉amdS和里氏木霉pyr2选择标记，使得转化体能在不存在尿苷的情况下在含乙酰胺的基本培养基上生长。由于存在来自里氏木霉的端粒区域，质粒在真菌细胞中自主地维持。使用复制型质粒提高了转化的频率，并规避了整合性真菌转化时观察到的基因座依赖性表达的问题。
通过从头基因合成(GeneArt有限公司，Germany)将特定突变引入串珠镰刀菌木聚糖酶Xyn4的基因组序列中。然后由供应商通过Gateway重组技术(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)将合成变体克隆到目的载体pTTT-pyr2中。
真菌菌株、生长培养基和转化
使用PEG-原生质体方法将表达质粒(5-10μl)转化到缺失了主要纤维素酶和木聚糖酶2的里氏木霉菌株中(Δcbh1Δcbh2Δegl1Δegl2Δegl3Δegl4Δegl5Δegl6Δbgl1Δman1Δxyn2 Prdiv:iRNAxyn1 xyn3:amdS pyr2-)。通过向宿主菌株基因组中引入同时靶向关闭xyn1和xyn3表达的iRNA干扰盒，从而进一步实现内源性木聚糖酶1和3背景的额外下调。使用Biomek机械臂(Beckman Coulter,USA)在24孔微量滴定板格式中机械地执行所有高通量转化。具有变体的质粒来自供应商，这些质粒根据预定布局点样于96孔微量滴定板中。使用200μl的25％PEG溶液处理包含大约1μg DNA和5×106原生质体的总体积为50μl的转化混合物，用1个体积的1.2M山梨醇/10mM Tris(pH7.5)/10mM CaCl2溶液进行稀释，机械地重新排布于24孔微量滴定板中，并且与包含1M山梨醇和10mM NH4Cl的1ml 3％琼脂糖基本培养基混合。转化体生长后，将来自每孔的孢子合并，并补加在含基本培养基的新鲜24孔微量滴定板上，其中基本培养基包含乙酰胺，以提供额外的选择压力。形成孢子后，收集孢子并用于在24孔微量滴定板格式或摇瓶中的以下生产培养基中接种液体培养物：37g/L葡萄糖、1g/L槐糖、9g/L酪蛋白氨基酸、10g/L(NH4)2SO4、5g/L KH2PO4、1g/L CaCl2x2H2O、1g/LMgSO4x7H2O、33g/L 1,4-哌嗪双(丙磺酸)(pH 5.5)、2.5ml/L的400X里氏木霉痕量元素(175g/L柠檬酸、200g/L FeSO4x7H2O、16g/L ZnSO4x7H2O、3.2g/L CuSO4x5H2O、1.4g/LMnSO4xH2O、0.8g/L硼酸)。添加1ml生产培养基，以在24孔微量滴定板中产生变体。对于摇瓶而言，按比例放大体积。
将平板在28℃和80％湿度下培养6天，并在200rpm下振摇。通过真空过滤收集培养上清液，并使用培养上清液测定它们的性能以及表达水平。
对于大规模生产而言，在6升可高压灭菌的连续搅拌式反应器中进行发酵。在摇瓶中接种孢子，并在以下摇瓶培养基中于28℃下振摇温育3天：5g/L(NH4)2SO4、4.5g/L KH2PO4、1g/L MgSO4x7H2O、14.4g/L柠檬酸x1H2O、1g/L CaCl2x2H2O、27.5g/L葡萄糖、1滴消泡剂(EROLDF 6000K)。用NaOH(2M)将pH调节至5.5，并将培养基在122℃下高压灭菌20分钟。冷却后，加入2.5ml/L的400X里氏木霉痕量元素(175g/L柠檬酸、200g/L FeSO4x7H2O、16g/LZnSO4x7H2O、3.2g/L CuSO4x5H2O、1.4g/L MnSO4xH2O、0.8g/L硼酸)。使用来自摇瓶的细胞接种生物反应器，该生物反应器包含以下生物反应器培养基：4.7g/L KH2PO4、1g/LMgSO4x7H2O、4.3g/L(NH4)2SO4、45g/L葡萄糖、0.7g/L CaCl2x2H2O、0.3g/L消泡剂(EROL DF6000K)、2.5ml/L的400X里氏木霉痕量元素(175g/L柠檬酸、200g/L FeSO4x7H2O、16g/LZnSO4x7H2O、3.2g/L CuSO4x5H2O、1.4g/L MnSO4xH2O、0.8g/L硼酸)。温度控制在34℃；通过添加20％氢氧化铵持续控制pH。通过改变搅拌速率，将溶解氧控制到最小40％饱和度。测量废气中二氧化碳和氧的含量。当初始葡萄糖耗尽时，开始恒定补加葡萄糖/槐糖。与此同时，使温度降低到28℃并控制在该温度，使pH升高到4.5并控制在该pH。140小时后终止发酵。将发酵液从罐中取出，并通过过滤去除细胞。细胞分离后，通过超滤浓缩滤液。最后，无菌过滤浓缩液，并用于制丸稳定性研究。
酶样品
使用下述测量木聚糖酶活性的方法，测量来自微量滴定板的培养上清液的木聚糖酶活性。将培养上清液在25mM乙酸钠、250mM NaCl(pH 4.0)中稀释20和130倍。将25μL稀释酶样品与150μL 0.5％WE-AX底物(pH 5.0)混合，并在30℃下振摇温育15分钟。温育后，将45.4μL反应样品与135μL PAHBAH工作溶液混合并在95℃下温育5分钟，之后冷却至20℃10秒。将100μL样品转移到微量滴定板孔并在410nm下读取平板。
计算三个重复样的平均值减去空白样得到活性，该空白样包含25mM乙酸钠、250mMNaCl(pH 4.0)而不含酶。基于纯化的FveXyn4(SEQ ID No.1)的标准曲线计算样品的蛋白质浓度。将所有样品在25mM乙酸钠、250mM NaCl(pH 4.0)中稀释到50ppm。将这些归一化的样品用作下述测定法中的酶储备溶液。
如下所述，通过HPLC来测量酶储备溶液中的蛋白质浓度。
通过以下活性测定法，测量来自大规模生产的无菌过滤的浓缩物的木聚糖酶活性。称量0.5g的每种浓缩物到100ml容量瓶中，然后用McIlvaine缓冲液(pH 5.0)定容。使用McIlvaine缓冲液(pH 5.0)将样品稀释到大约6XU/ml。将100μl稀释样品加入到试管中的1ml McIlvaine缓冲液(pH 5.0)中，并在40℃下平衡2分钟。加入Xylazyme片(100mg)引发反应，并将样品在40℃下温育10分钟，之后通过加入10ml 2％Tris(pH 12.0)终止反应。使用涡旋混合该溶液，使溶液静置5分钟并再次混合，之后在3500rpm下离心10分钟。在590nm处测量上清液的吸光度。每个样品重复测量两次。相对于酶标准(Danisco木聚糖酶，可得自Danisco Animal Nutrition公司)定量木聚糖酶活性。
基准酶
Figure GDA0003001128500000911
XT可商购获得，并且从商业干燥配制样品中提取。使用McIlvain缓冲液(pH 5.0)在33％(w/w)浆液中提取来自
Figure GDA0003001128500000912
XT商业干燥配制样品的木聚糖酶组分。使用离心(3000RCF，10分钟)使提取物变澄清，并使用PALL Acrodisc PF注射过滤器(0.8/0.2μm Supor膜)过滤，随后在70℃下加热20分钟。离心(38 724RCF，15分钟)去除沉淀后，通过用20mM柠檬酸钠、20mM NaCl(pH 3.4)平衡的Sephadex G25柱(得自Pharmacia公司的PD10)更换缓冲液。使用Source 15S树脂进行木聚糖酶组分的纯化，之后用线性递增的盐梯度(20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 3.4)中的NaCl)洗脱。
Econase
Figure GDA0003001128500000913
是菌株里氏木霉RF5427(CBS 114044)产生的内切-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)，可得自ABVista公司。
通过测量280nm处的吸光度来测定蛋白质浓度。消光系数是来自氨基酸序列的估计值。对于Econase XT，1mg/ml在280nm处的吸光度计算为2.84AU。
通过HPLC进行蛋白质测定
使用包含100μL酶储备溶液且每孔大约浓度为50ppm的微量滴定板(Agilent部件号5042-1385)进行高效液相色谱(HPLC)蛋白质测定方法。使用配备有Acuity UPLC BEH125SEC(Waters公司)柱的Agilent 1260或1290(Hewlett Packard公司)HPLC分离剩余污染物。使用含250mM氯化钠的25mM磷酸钠缓冲溶液(pH为6.8)，从色谱柱中洗脱样品。在220nm处测量吸光度，使用ChemStation软件(Agilent Technologies)积分，并且基于具有SEQ IDNo.1氨基酸序列的纯化FveXyn4蛋白质/酶的标准曲线，测定样品的蛋白质浓度。
木聚糖酶活性的测量
通过测量从水解的小麦WE-AX(水可提取的阿拉伯木聚糖)释放的还原糖的量，测定酶样品的木聚糖酶活性。通过PAHBAH方法测量还原糖的量。简而言之，通过加热和碱性条件，使还原端基与无色PAHBAH(4-对羟基苯甲酸酰肼)反应，从而使PAHBAH氧化，并在410nm处测量吸光度(Lever,1972)。
通过如下方式制备0.5％WE-AX底物(pH 5.0)：用2.5ml 96％的乙醇润湿0.25g可溶性小麦阿拉伯木聚糖(例如，Megazyme，高粘度约43cSt，P-WAXYH)，之后加入50ml 0.1M乙酸钠(pH 5.0)。在pH 5.0下测定标准活性。对于其它pH值下的测量，将50ml 0.1M乙酸钠(pH5.0)替换为所指示的缓冲液。将溶液搅拌加热至沸腾，然后搅拌冷却至室温。
通过如下方式制备PAHBAH工作溶液：将0.5M HCl中的5％PAHBAH(4-羟基苯甲酰肼，例如Sigma-Aldrich H9882)储备溶液与0.5M NaOH以1:4(v/v)比率混合。在分析当日制备溶液，并避光保护。
在分析之前，用所指示的缓冲液将酶样品稀释至浓度1μg/ml。将25μL稀释酶样品与150μL 0.5％WE-AX底物(pH 5.0)混合，并在30℃下振摇温育15分钟。温育后，将45.4μL反应样品与135μL PAHBAH工作溶液混合并在95℃下温育5分钟，之后冷却至20℃10秒。将100μL样品转移到微量滴定板孔并在410nm下读取平板。
计算三个重复样的平均值减去空白样得到活性，该空白样包含适当的稀释缓冲液而不含酶。
用于测量热稳定性的测定法
通过以下方式测量FveXyn4变体的热变性曲线：将酶样品在pH 6.0的25mM MES缓冲液(0.00125％吐温80—25mM MES缓冲液(pH 6.0)，0.00125％(V:V)吐温80)中稀释并在不同温度(分别为66、66.7、68.2、70.6、73.5、76.8、79.7、81.9、83.5、84.6和85℃)下预温育10分钟，随后通过上述木聚糖酶活性方法测量残余活性。将在未预温育情况下测得的活性设定为100％，并相对于此值计算每种变体在每个温度下的残余活性。根据热变性曲线将Tm值计算为得到50％残余活性时的温度。
pH曲线
通过测量pH 4.0、5.0和6.0下的活性，研究FveXyn4变体的pH曲线。基本上按照上述木聚糖酶活性方法中所述的方式测量活性。在分析pH 4.0、5.0或6.0下的活性之前，分别将酶样品稀释在0.1M乙酸钠(pH 4.0)、0.1M乙酸钠(pH 5.0)、0.1％BSA(例如，SigmaA7906)或McIlvaine缓冲液(pH 6.0)中。按照针对0.5％WE-AX底物(pH 5.0)所述的那样制备pH 4.0和6.0下的0.5％WE-AX底物，但将0.1M乙酸钠(pH 5.0)分别替换为0.1M乙酸钠(pH4.0)或McIlvaine缓冲液(pH 6.0)。所有数据均相对于pH 5.0下的FveXyn4计算得出。
戊聚糖溶解(AXinsol溶解)
用于测量FveXyn4变体作用下的戊聚糖溶解的底物为玉米DDGS和小麦麸。将100mg粒度小于212μm的cDDGS或小麦麸转移至2ml微量离心管中，并记录精确的重量。添加750μl温育缓冲液(200mM HEPES、100mM NaCl、2mM CaCl2，pH 6.0)和900μl氯霉素(40μg/ml溶于温育缓冲液中)。添加递增的酶剂量，使总体积达到1.8ml。
成对平行地测定每个样品与对照样品(不含酶)。在40℃下振摇温育样品。温育18小时后，使用96孔过滤板(Pall公司，AcroPrep 96孔过滤板，1.0μm玻璃纤维，天然材料，1mL孔)过滤上清液。过滤后，将样品保存在4℃下，直至分析C5糖阿拉伯糖和木糖的总量。
C5糖(戊聚糖)的定量
利用Rouau和Surget(1994)的方法，用持续流动注射装置测量带入溶液中的戊糖的总量。用酸处理上清液，以将多糖水解为单糖。添加间苯三酚(1,3,5-三羟基苯)，使之与单戊糖和单己糖反应，从而形成有色复合物。
通过测量550nm处的吸光度与510nm处的吸光度的差值，使用标准曲线计算溶液中的戊糖量。与戊糖-间苯三酚复合物不同，己糖-间苯三酚复合物的吸光度在这些波长下是恒定的。将葡萄糖加入到间苯三酚溶液中，以产生恒定葡萄糖信号，并进一步确保不受己糖干扰。使用木糖标准曲线测定样品中的戊糖浓度。
体外动物模型测定法中的粘度降低
使用Bedford和Classen(1993Poultry Sci.,72,137-143)所述工序的修改版本测定小麦的粘度降低。将3.6mL胃蛋白酶溶液(2000U/mL，溶于0.1N HCl中)与2.4g小麦混合，之后加入所指示量的木聚糖酶(FveXyn4变体)，然后在40℃下温育45分钟。接着将1.2ml胰酶溶液(8mg/mL，溶于1M MES中，pH 6.8)混合到浆液中，得到6.0的最终pH。使样品在40℃下温育60分钟并在30和60分钟后混合。然后将样品置于冰上5分钟以终止反应，并在3320RCF下离心10分钟，之后通过0.45μm过滤器过滤得到澄清上清液。然后使用装配有CPE-40锥板的布氏数字粘度计(型号DV-I+，Brookfield Engineering Laboratories,Stoughton,MA02172,USA))在20℃下测量样品粘度。每个数据点是三个重复测试的平均值。
制丸稳定性
制丸试验全面在Technological Institute,Kolding,Denmark进行。将每种无菌过滤的木聚糖酶浓缩物配制于小麦上并混入玉米/大豆饲料混合物(61.1％玉米、31.52％Hipro大豆48、4.00％大豆油、0.40％碳酸氢钠、0.25％维生素/矿物质Leghennen、0.20％DL-甲硫氨酸、1.46％磷酸二钙、1.16％石灰石)中。通过如下方式制备预混物：将配制于小麦上的木聚糖酶变体混入10kg玉米/大豆饲料混合物中并混合10分钟。然后将预混物加入到120kg饲料中并混合10分钟，之后进行调理。将饲料在90℃和95℃下调理30秒，之后制丸。使用Perten实验室磨机研磨醪液和所得的饲料粒料(务必同时研磨所有样品)，之后使用天青精交联的小麦阿拉伯木聚糖(例如，Xylazyme片，Megazyme,Ireland)作为底物，根据下述提取或浆液方法分析样品中的木聚糖酶活性。
提取方法：将5.0g研磨样品与50ml McIlvaine缓冲液(pH 5.0)混合，并在磁力搅拌器上搅拌10分钟。通过玻璃纤维过滤器过滤提取物，并在50ml McIlvaine缓冲液(pH5.0)中稀释3-6倍。将100μl稀释提取物与400μL McIlvaine缓冲液(pH 5.0)混合，并在50℃下平衡2分钟。加入Xylazyme片(60mg)引发反应，并将样品在50℃下温育60分钟，之后通过加入5ml 2％的Tris(pH 12.0)终止反应。使用涡旋混合该溶液，使溶液静置5分钟并再次混合，之后在3500rpm下离心10分钟。在590nm处测量上清液的吸光度。每个样品重复测量两次。
通过在空白(无酶)醪液和90℃饲料上使用每种木聚糖酶制备木聚糖酶标准曲线，使用该标准曲线定量木聚糖酶活性。将相应小麦配制的木聚糖酶在Mc Ilvaine缓冲液(pH5.0)中提取10分钟，得到160XU/mL的浓度。将提取物通过玻璃纤维过滤器过滤，之后将0、200、400、600、800和1000μL提取物加入到研磨空白醪液和90℃饲料的5.0g样品中。如以上提取方法中所述的那样测量这些标准样品中的木聚糖酶活性。每一标准曲线制定一次。
浆液方法：将1.0g研磨样品与50ml McIlvaine缓冲液(pH 5.0)混合，并在磁力搅拌器上于50℃水浴中搅拌2分钟。加入Xylazyme片(100mg)引发反应，并将样品在50℃下搅拌温育20分钟(就变体B而言，温育30分钟)。温育后，将样品通过玻璃纤维过滤器过滤，并在590nm处测量上清液的吸光度。每个样品重复测量两次。
使用针对每种木聚糖酶变体制定的木聚糖酶标准曲线，在空白醪液饲料(无酶)上对木聚糖酶活性进行定量。将相应小麦配制的木聚糖酶在Mc Ilvaine缓冲液(pH 5.0)中提取10分钟，得到30XU/mL的浓度。将提取物通过玻璃纤维过滤器过滤，之后将0、200、400、600、800和1000μL加入到研磨空白醪液饲料的1.0g样品中。如以上浆液方法中所述的那样测量这些标准样品中的木聚糖酶活性。标准曲线制定一次。
将醪液饲料中测得的回收率设定为100％，并相对于此值计算90℃和95℃饲料的残余活性。
结果和讨论
通过大量研究鉴定了主链木聚糖酶FveXyn4的五种变体。
相较于基准/亲本分子FveXyn4，这五种变体均显著更具热稳定性，如图11所示。
对于例如饲料应用中所用木聚糖酶的重要生化和性能特性方面进一步的变体表征将这些变体鉴定为既具有热稳定又具有良好性能/生化活性的变体。
Figure GDA0003001128500000961
图11示出了与FveXyn4相比的5种变体A、B、C、D和E的Tm值。Tm值被测量为10分钟温育后得到50％残余活性时的温度。
图12示出了在pH 4.0、5.0和6.0下测得的五种变体的pH曲线，并且所有数据均相对于pH 5.0下的野生型得出。所有五种变体具有适用于例如饲料应用的pH曲线。
图13a和图13b示出了分别在五种变体作用下玉米DDGS和小麦麸中关于戊聚糖溶解的剂量响应曲线。所有五种变体均显示出具有较高的溶解来自DDGS和小麦麸的阿拉伯木聚糖(戊聚糖)的能力，并且全都处于与野生型分子相同的水平。所有五种变体非常适用于例如动物饲料。
图14示出了实施例1中教导的“体外动物模型测定法中的粘度降低”中的粘度降低。所有五种变体均显示出具有较高的降低粘度的能力，并且全都处于与野生型分子相同的水平，并且比基准Econase XT好得多。
图15示出了在90℃和95℃下制丸后的饲用木聚糖酶的回收率。所有五种变体均显示出较高的制丸后木聚糖酶回收率，并且显著高于野生型。
实施例2
串珠镰刀菌主链(亲本)木聚糖酶(FveXyn4)的克隆
将从串珠镰刀菌菌株分离的基因组DNA用于扩增木聚糖酶基因。所克隆的基因(称为FveXyn4基因)的序列以SEQ ID No.2示出。由FveXyn4基因编码的成熟蛋白质以SEQ IDNo.1示出。基于PFAM搜索(http://pfam.sanger.ac.uk/)，基因FveXyn4的蛋白质产物属于糖基水解酶家族10(GH10)。
实施例3
FveXyn4主链(亲本)蛋白质的表达
使用以下引物从串珠镰刀菌的基因组DNA扩增FveXyn4基因：引物15’-caccATGAAGCTGTCTTCTTTCCTCTA-3’(SEQ ID No.22)，以及引物25’-TTTTTAGCGGAGAGCGTTGACAACAGC-3’(SEQ ID No.23)。将PCR产物克隆到pENTR/D-TOPO载体(Invitrogen K2400)中，生成FveXyn4 pEntry质粒。使用
Figure GDA0003001128500000971
LR
Figure GDA0003001128500000972
II酶试剂盒(Invitrogen 11791)，通过FveXyn4 pEntry质粒与pTrex3gM表达载体(US 2011/0136197A1中所述)之间的Gateway克隆反应，获得表达质粒pZZH254。质粒pZZH254的图谱作为图16提供。通过DNA测序确认FveXyn4基因的序列(SEQ ID No.2)。使用生物射弹法(Te'o VS等人，J Microbiol Methods,51:393-9,2002)将质粒pZZH254转化到四重缺失的里氏木霉菌株(WO 05/001036中所述)。
序列确认后，使用PEG原生质体方法(Penttila等人，Gene,61:155-164,1987)，用表达质粒pZZH254转化四重缺失的里氏木霉菌株(WO 05/001036中所述)的原生质体。对于原生质体制备，使孢子在24℃下于木霉基本培养基MM(20g/L葡萄糖、15g/L KH2PO4(pH4.5)、5g/L(NH4)2SO4、0.6g/L MgSO4x7H2O、0.6g/L CaCl2x2H2O、1ml的1000X里氏木霉痕量元素溶液(175g/L无水柠檬酸、200g/L FeSO4x7H2O、16g/L ZnSO4x7H2O、3.2g/L CuSO4、1.4g/LMnSO4xH2O和0.8g/L硼酸)中生长约10小时。通过离心收集发芽孢子，并用30mg/mL VinoflowFCE(Novozymes,AG Switzerland)溶液以100rpm在30℃下处理7小时至过夜，从而裂解真菌细胞壁。在包含0.6M山梨醇的0.1M Tris HCl缓冲液(pH 7)中洗涤原生质体，并将原生质体重悬于包含1.2M山梨醇和10mM氯化钙的10mM Tris HCl缓冲液(pH 7.5)中。对于PEG转化，用2ml 25％的PEG溶液处理总体积为200μl的大约1μg DNA和1-5×107原生质体，用2个体积的1.2M山梨醇/10mM Tris(pH 7.5)/10mM CaCl2溶液稀释。在包含作为唯一氮源的乙酰胺的培养基(乙酰胺0.6g/L；氯化铯1.68g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氢钾15g/L；七水硫酸镁0.6g/L；二水氯化钙0.6g/L；硫酸亚铁(II)5mg/L；硫酸锌1.4mg/L；氯化钴(II)1mg/L；硫酸锰(II)1.6mg/L；琼脂20g/L；pH 4.25)上选择转化体。约1周内出现转化的菌落(约50-100个)。在乙酰胺平板上生长后，收集孢子并在乙酰胺平板上重新选择。5天后，使用10％甘油收集孢子，并将1×108孢子接种于含30ml葡萄糖/槐糖限定培养基的250ml摇瓶中以进行蛋白质表达。通过SDS-PAGE确认蛋白质表达。随后使孢子悬浮液在包含60％葡萄糖-槐糖进料的限定培养基的7L发酵罐中生长。葡萄糖/槐糖限定培养基(每升)组成如下：(NH4)2SO4 5g，PIPPS缓冲液33g，酪蛋白氨基酸9g，KH2PO4 4.5g，CaCl2(无水)1g，MgSO4.7H2O 1g，用50％NaOH调节pH至5.5，并且用Milli-Q H2O定容至966.5mL。在灭菌后，添加以下物质：26mL60％葡萄糖/槐糖，以及400X里氏木霉痕量金属2.5mL。
使用两个色谱柱，从7L发酵罐培养物的浓缩发酵液中纯化FveXyn4。将在包含1M硫酸铵的20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)中缓冲的浓缩发酵液上样于疏水相互作用色谱柱(快流速苯基-琼脂糖凝胶柱(Sepharose Phenyl FF)，26/10)上。使用平衡/洗涤缓冲液到20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)的线性梯度，将蛋白质从柱中洗脱下来。将包含FveXyn4蛋白质的级分上样于凝胶过滤柱(HiLoad Superdex 75pg 26/60)上，所使用的流动相为包含0.15M NaCl的20mM磷酸钠(pH 7.0)。使用3K Amicon Ultra-15设备浓缩纯化的蛋白质，并将经浓缩的蛋白质级分用于进一步研究。
FveXyn4基因的核苷酸序列作为SEQ ID No.24示出。信号序列以粗体(大写体)示出，并且所预测的内含子以小写粗体示出。
FveXyn4蛋白质的氨基酸序列作为SEQ ID No.26示出。由SignalP-NN软件预测的信号序列以下划线示出。这是前原蛋白。
FveXyn4蛋白质的成熟形式的氨基酸序列作为SEQ ID No.1示出。这是酶的活性形式。SEQ ID No.27示出了前蛋白，即翻译后修饰之前。取决于宿主，翻译后修饰可有所差异，因此本发明还涵盖SEQ ID No.27的成熟、活性形式。
实施例4
FveXyn4(亲本木聚糖酶)的木聚糖酶活性
FveXyn4属于糖基水解酶10家族(GH10，CAZy编号)。使用来自桦木的1％木聚糖(Sigma 95588)或来自小麦面粉的1％阿拉伯木聚糖(Megazyme P-WAXYM)作为底物，测量FveXyn4的β1-4木聚糖酶活性。在50mM柠檬酸钠(pH 5.3)、0.005％吐温80缓冲液中于50℃下进行10分钟测定。
所释放的还原糖通过如下方式定量：与3,5-二硝基水杨酸反应，并测量540nm处的吸光度。酶活性通过与木糖标准曲线进行对比而定量。在该测定法中，一个木聚糖酶单位(U)被定义为在测定条件下每分钟生成1微摩尔木糖还原糖当量所需的酶量。
实施例5
FveXyn4(亲本木聚糖酶)的温度曲线
通过如下方式测定纯化的FveXyn4(亲本酶)的最适温度：在pH 5.3的50mM柠檬酸钠缓冲液中，在40℃与75℃之间变化的温度下，测定木聚糖酶活性10分钟。将活性报告为相对活性，其中将最适温度下的活性设定为100％。FveXyn4的温度曲线在图17中示出。研究发现FveXyn4具有60℃的最适温度，并且发现在45℃与64℃之间保留最大活性的70％以上。
实施例6
基于谷物的材料(例如，用于生物燃料制备)中的粘度降低
小麦粘度降低
在欧洲燃料乙醇产业中，小粒谷物如小麦、大麦和裸麦是常用原材料，相比之下，美国主要使用玉米。这些小粒谷物包含仅次于淀粉的高含量的非淀粉多糖聚合物(NSP)，如纤维素、β-葡聚糖和半纤维素。
对于每种原料而言，不同NSP所占的比率有所差异。表1示出了与一些其它原料相比小麦、大麦和裸麦中的NSP的不同量。
表1：存在于不同原料中的非淀粉多糖(g kg-1干物质)1,2
Figure GDA0003001128500000991
Figure GDA0003001128500001001
1(Bach Knudsen,1997)"Carbohydrate and lignin contents of plantmaterials used in animal feeding."Anim.Feed Sci.Technol.,67(4):319-338
2 Englyst,H.N.、Anderson,V.和Cummings,J.H.，1983."Starch and non-starchpolysaccharides in some cereal foods."J.Sci.Food Agric.,34:1434–1440。
3非纤维素多糖：戊聚糖、(阿拉伯)木聚糖及其它半纤维素
NSP赋予谷物醪液高粘度。高粘度对乙醇制备具有负面影响，因为其会限制可用于淀粉糖化的固体浓度，并且会降低过程的能量效率。另外，存在于整个过程中的残余半纤维素可造成换热器和蒸馏设备中的污垢。当醪液冷却至发酵温度(32℃)时，观察到高粘度的最大影响。这解释了需要在过程的冷却步骤之前的任何时间点降低粘度。根据所用工艺的不同，需要在60℃和/或85℃下发挥作用的酶。
可在乙醇制备工艺的不同阶段添加降粘酶：混合和/或糖化/发酵。优选地在混合中添加酶，以降低初始粘度。
在乙醇制备工艺中使用降粘酶的有益效果是多重的：
·可在该工艺中使用更高干物质醪液
·可获得最终糖浆的更高固形物含量
·热传递更佳，能量需求更低
·蒸发器污垢减少，使得清洁成本降低
·最终乙醇收率提高
·DDGS的质量改善
方法
使用得自Perten Instruments公司的快速粘度分析仪(RVA 4500)测量小麦醪液的粘度曲线。根据以下方案制备该小麦醪液：
按如下方式制备60克30％的DS(34.65％“原样”)小麦浆液(用于在两个RVA上同时运行)：
-称取20.80克小麦
-在100ml玻璃烧杯中，称取39.20克自来水并添加137μl 4N H2SO4
-将小麦加入水中，并用顶置式搅拌器以最大速度(大约500rpm)搅拌5分钟
-将25.0克浆液转移到RVA杯中，添加稀释50倍的酶并开始RVA运行(检查起始pH是否为约5.3)
-在RVA运行结束时检查pH(5.6-5.7)
在每个实验(25克浆液)中，以对应于2.9μg蛋白质/g小麦“原样”的25μg蛋白质(每8.66g小麦“原样”)投料木聚糖酶。以0.15kg/MT小麦“原样”(2.2AAU/g“原样”或2.6AAU/gDS)投料
Figure GDA0003001128500001013
CL。
在RVA中模拟标准小麦液化。在60℃下预处理20分钟，随后是在85℃下进行30分钟的液化步骤。预处理和液化后，将浆液冷却至32℃，以测定发酵条件下的粘度。液化pH保持在5.3-5.7之间。
在该实验中，将FveXyn4的性能与变体A、B、C、D和E进行比较。
Figure GDA0003001128500001011
结果示于上文和图22中。
这些数据表明，FveXyn4和所有变体表现非常相似，相较于空白(仅
Figure GDA0003001128500001012
CL)，粘度降低55-67％。
实施例7
小麦面筋-淀粉分离
小麦面粉分离成淀粉和面筋级分，这在工业上大规模应用，以获得高质量A-淀粉及副产物B-淀粉和活性面筋。通过添加木聚糖酶来改善分离。
7.1材料和方法
以下测定法模拟40℃洗面筋工艺的小麦淀粉分离。在该测定法中，将工业小麦面粉(Cargill公司)加入预处理的自来水(50℃)中，通过在厨房用混合器(Braun公司)中混合1分钟形成35％DS的浆液。浆液的pH保持“原样”，为约6.1。将100克该浆液转移到40℃下校准的Haake VT550粘度计中。温育1分钟后，将酶溶液加入浆液中。同时，在添加酶之前和之后监测粘度曲线总共15分钟。温育后，取出三份温育的浆液样品和一份t0浆液样品进行旋转测试。每个旋转测试样品具有22.5g的总重量，这包含加入到6.6-6.7g一次性离心管(15ml)中的15.8-15.9g浆液样品。将所有样品在Hermle Z400离心机中以3500rpm离心15分钟。由
离心样品的糖浆测定白利度值。
实施例8
主链(亲本)尖孢镰刀菌木聚糖酶FoxXyn2的克隆
从尖孢镰刀菌分离的FoxXyn2基因的核苷酸序列作为SEQ ID No.30(图4A)示出。信号序列以粗体示出，并且所预测的内含子以小写斜体示出。
FoxXyn2蛋白质的氨基酸序列作为SEQ ID No.29(图3A)示出。信号序列以斜体示出。
FoxXyn2蛋白质的成熟形式的核苷酸序列作为SEQ ID No.31或SEQ ID No.4(图3B和图3C)示出。
基因FoxXyn2的蛋白质产物属于糖基水解酶家族10。这表明，FoxXyn2是分泌的糖基水解酶。
实施例9
主链(亲本)FoxXyn2蛋白质的表达
使用以下引物从尖孢镰刀菌的基因组DNA扩增FoxXyn2基因：引物15’-ccgcggccgcaccATGAAGCTGTCTTCCTTCCTCTACACC-3’(SEQ ID NO:24)，以及引物2 5’-ccggcgcgcccttaTTAGCGGAGAGCGTTGACAACAG-3’(SEQ ID NO:25)。在用Not I和Asc I消化后，将PCR产物克隆到用相同限制性酶消化的pTrex3gM表达载体(US 2011/0136197 A1中所述)中，并将所得质粒标记为pZZH135。pZZH135的质粒图谱提供于图18中。通过DNA测序确认FoxXyn2基因的序列。
使用生物射弹法(Te'o VS等人，J Microbiol Methods,51:393-9,2002中教导)将质粒pZZH135转化进四重缺失的里氏木霉菌株(以引用方式并入本文的WO 05/001036中所述)。使用分离自过滤后的培养上清液的蛋白质进行SDS-PAGE分析和木聚糖酶活性测定，以确认酶表达。
来自表达质粒pZZH135的FoxXyn2基因的核苷酸序列作为SEQ ID No.4示出。FoxXyn2蛋白质的成熟形式的氨基酸序列作为SEQ ID No.3示出。
使用亲和色谱树脂蓝色琼脂糖凝胶(Blue Sepharose)6FF从培养上清液纯化FoxXyn2蛋白质，并且将样品用于后续实施例中所述的生化表征。
实施例10
主链(亲本)FoxXyn2的木聚糖酶活性
FoxXyn2属于糖基水解酶10家族(GH10，CAZy编号)。使用来自桦木的1％木聚糖(Sigma 95588)或来自小麦面粉的1％阿拉伯木聚糖(Megazyme P-WAXYM)作为底物，测量FoxXyn2的β1-4木聚糖酶活性。在50mM柠檬酸钠(pH 5.3)、0.005％吐温80缓冲液中于50℃下进行10分钟测定。
所释放的还原糖通过如下方式定量：与3,5-二硝基水杨酸反应，并测量540nm处的吸光度。酶活性通过与木糖标准曲线进行对比而定量。在该测定法中，一个木聚糖酶单位(U)被定义为在测定条件下每分钟生成1微摩尔木糖还原糖当量所需的酶量。
实施例11
FoxXyn2的温度曲线
通过如下方式测定纯化的FoxXyn2的最适温度：在pH 5.3的50mM柠檬酸钠缓冲液中，在45℃与94℃之间变化的温度下，测定木聚糖酶活性10分钟。将活性报告为相对活性，其中将最适温度下的活性设定为100％。FoxXyn2的温度曲线在图19中示出。研究发现FveXyn2具有60℃的最适温度，并且发现在40℃与65℃之间保留最大活性的50％以上。
实施例12
热稳定性
在63℃下测量FveXyn4野生型(wt)和FveXyn4变体的热稳定性(参见表2中的数据)。可清楚看出，相较于FveXyn4，代表不同数量(2-4)和组合的突变的所有变体在63℃下具有更高的残余活性，因此可推断这些变体全都比FveXyn4野生型(例如，本文示出为SEQID No.1或SEQ ID No.27)更具热稳定性。
材料和方法
FveXyn4的变体得自组合文库，或通过引入如实施例1中所述的特定突变而获得。通过如下方式测量FveXyn4变体的热稳定性：将酶样品在pH6.0的25mM MES缓冲液(0.00125％吐温80—25mM MES缓冲液(pH 6.0)，0.00125％(V:V)吐温80)中稀释并在63℃下预温育10分钟。温育后，通过实施例1中所述的木聚糖酶活性方法测量残余活性。将在未预温育情况下测得的活性设定为100％，并相对于此值计算每种变体在相应温度下的残余活性。
表2示出了FveXyn4的14种组合变体，相较于FveXyn4 wt，其热稳定性显著提高。如上文在该实施例12的材料和方法部分中所述的那样，将热稳定性测量为在63℃下预温育10分钟后的残余活性。
Figure GDA0003001128500001041
上面说明书中提及的所有出版物均以引用的方式并入本文。对本领域的技术人员将显而易见的是，可在不背离本发明的范围和实质的条件下对所描述的本发明方法和系统作出各种修改和变型。虽然已结合特定的优选实施方案对本发明进行了描述，但应该理解，所要求保护的本发明不应不当地局限于这些特定的实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的不同修改形式也应该在以下权利要求书范围内。
Figure IDA0001062402650000011
Figure IDA0001062402650000021
Figure IDA0001062402650000031
Figure IDA0001062402650000041
Figure IDA0001062402650000051
Figure IDA0001062402650000061
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Figure IDA0001062402650000081
Figure IDA0001062402650000091
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Figure IDA0001062402650000171
Figure IDA0001062402650000181
Figure IDA0001062402650000191
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Figure IDA0001062402650000211
Figure IDA0001062402650000221
Figure IDA0001062402650000231
Figure IDA0001062402650000241

Claims (27)

1.一种酶，其中所述酶为GH10木聚糖酶，其中相较于亲本GH10木聚糖酶，所述酶具有提高的热稳定性，所述酶与亲本GH10木聚糖酶的区别在于：已在第217和298位，以及任选地在7、33和79位中的一处或多处被修饰，其中编号基于SEQ ID No.1的FveXyn4的氨基酸编号；
其中所述修饰选自以下项：
N7D；
T33V；
K79Y或K79F；
A217Q；和
T298Y或T298F；
其中所述亲本GH10木聚糖酶为：
a)选自以下项的氨基酸序列的木聚糖酶：SEQ ID No.1、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.3、SEQ ID No 28、SEQ ID No.29或SEQ ID No.5；或
b)由这样的核苷酸序列编码的木聚糖酶：所述核苷酸序列由此处示出为SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33的核苷酸序列组成。
2.权利要求1所述的酶，其中所述酶与亲本GH10木聚糖酶的区别在于：已在至少以下位置处被修饰：7、33、79、217和298。
3.权利要求1所述的酶，其中所述修饰选自以下项：
N7D；
T33V；
K79Y；
A217Q；和
T298Y。
4.权利要求1所述的酶，其中所述酶与亲本GH10木聚糖酶的区别在于：在以下位置中的一处或多处被进一步修饰：25、57、62、64、89、103、115、147、181、193、219；其中所述修饰选自以下项：
N25P；
S57Q；
N62T；
G64T；
S89G、；
T103M；
V115L；
N147Q；
G181Q；
S193Y；和/或
G219P。
5.权利要求1至4中任一项所述的酶，其中所述修饰选自以下项：
i.N7D、N25P、T33V、G64T、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；
ii.N7D、N25P、T33V、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；
iii.N7D、N25P、T33V、S57Q、N62T、G64T、K79Y、T103M、V115L、N147Q、G181Q、S193Y、A217Q、G219P和T298Y；
iv.N7D、N25P、T33V、S57Q、N62T、K79Y、S89G、T103M、V115L、N147Q、G181Q、S193Y、A217Q、G219P和T298Y；
v.N7D、T33V、S57Q、N62T、G64T、K79Y、S89G、A217Q和T298Y；
vi.K79F_A217Q_T298F；
vii.N7D_T33V_A217Q_T298F；
xi.T33V_A217Q_T298Y；
xii.N7D_A217Q_T298F。
6.一种酶，其中所述酶为GH10木聚糖酶，所述酶与亲本GH10木聚糖酶的区别在于：包含217Q和298Y、298F或298W，以及任选的在所指示一处或更多处位置中包含以下氨基酸：7D；33V；79Y或79F；其中所述编号基于SEQ ID No.1的FveXyn4的氨基酸编号；其中所述亲本GH10木聚糖酶为：
a)选自以下项的氨基酸序列的木聚糖酶：SEQ ID No.1、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.3、SEQ ID No 28、SEQ ID No.29或SEQ ID No.5；或
b)由这样的核苷酸序列编码的木聚糖酶：所述核苷酸序列由此处示出为SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33的核苷酸序列组成。
7.权利要求6所述的酶，其中所述酶还在所指示位置处包含以下氨基酸中的至少一种：
25P；
57Q；
62T；
64T；
89G；
103M；
115L；
147Q；
181Q；
193Y；和/或
219P。
8.权利要求6或7所述的酶，其中所述酶在所指示位置处包含以下氨基酸：
i.7D、25P、33V、64T、79Y、89G、217Q和298Y；
ii.7D、25P、33V、79Y、89G、217Q和298Y；
iii.7D、25P、33V、57Q、62T、64T、79Y、103M、115L、147Q、181Q、193Y、217Q、219P和298Y；
iv.7D、25P、33V、57Q、62T、79Y、89G、103M、115L、147Q、181Q、193Y、217Q、219P和298Y；
v.7D、33V、57Q、62T、64T、79Y、89G、217Q和298Y；
vi.79F_217Q_和298F；或
vii.7D_33V_217Q_和298F。
9.权利要求1或6所述的酶，其中所述酶是示出为SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ IDNo.19、SEQ ID No.20或SEQ ID No.21的氨基酸序列中的一者。
10.一种编码权利要求1至9中任一项所述的酶的重组核酸分子。
11.一种包含权利要求10所述的重组核酸的载体、重组构建体或宿主细胞。
12.权利要求11所述的宿主细胞，其中所述细胞选自真菌细胞、酵母细胞、丝状真菌细胞和植物细胞。
13.一种用于提高GH10木聚糖酶的热稳定性的方法，所述方法包括在第217和298位，以及任选地在下列位置7、33和79位中的至少一处或多处修饰亲本GH10木聚糖酶，其中所述编号基于SEQ ID No.1的FveXyn4的氨基酸编号，其中所述修饰选自以下项：
N7D；
T33V；
K79Y或K79F；
A217Q；和
T298Y、T298F或T298W；
其中所述亲本GH10木聚糖酶为：
a)选自以下项的氨基酸序列的木聚糖酶：SEQ ID No.1、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.3、SEQ ID No 28、SEQ ID No.29或SEQ ID No.5；或
b)由这样的核苷酸序列编码的木聚糖酶：所述核苷酸序列由此处示出为SEQ ID No.2、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.4、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.6、SEQ ID No 32或SEQ ID No.33的核苷酸序列组成。
14.一种包含权利要求1至9中任一项所述的酶的酶组合物或饲料添加剂组合物。
15.一种预混物，其包含权利要求1至9中任一项所述的酶、或者权利要求14所述的酶组合物或饲料添加剂组合物、以及至少一种维生素和/或至少一种矿物质。
16.权利要求14所述的酶组合物或饲料添加剂组合物或权利要求15所述的预混物，其还包含选自以下的酶中的一种或多种：蛋白酶和/或淀粉酶和/或植酸酶。
17.权利要求16的所述的酶组合物或饲料添加剂组合物或预混物，其中所述淀粉酶包括α-淀粉酶E.C.3.2.1.1、G4-形成淀粉酶E.C.3.2.1.60、β-淀粉酶E.C.3.2.1.2和γ-淀粉酶E.C.3.2.1.3。
18.权利要求16或17所述的酶组合物或饲料添加剂组合物或预混物，其中所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶E.C.3.4.21.62或芽孢杆菌溶素E.C.3.4.24.28或碱性丝氨酸蛋白酶E.C.3.4.21.x或角蛋白酶E.C.3.4.x.x；所述植酸酶是6-植酸酶E.C.3.1.3.26或3-植酸酶E.C.3.1.38。
19.一种饲料或饲料原料，其包含权利要求1至9中任一项所述的酶或者权利要求14所述的酶组合物或饲料添加剂组合物。
20.权利要求1至9中任一项所述的酶或者权利要求14所述的酶组合物或饲料添加剂组合物或权利要求15所述的预混物或权利要求16至18中任一项所述的酶组合物或饲料添加剂组合或预混物用于降解含木聚糖的材料中阿拉伯木聚糖的用途。
21.权利要求20所述的用途，其中所述含木聚糖的材料选自由以下项构成的组中的一者或多者：饲料组分；醪液；麦芽汁；麦芽；发芽的大麦；辅料；以及谷类面粉。
22.权利要求20的用途，其中所述含木聚糖的材料为基于谷物的材料。
23.权利要求20的用途，其中所述含木聚糖的材料为饲料或饲料原料。
24.权利要求21的用途，其中所述醪液为大麦醪液。
25.权利要求21-24中任一项所述的用途，其中所述木聚糖酶与选自以下的酶中的一种或多种组合地使用：内切葡聚糖酶E.C.3.2.1.4；纤维二糖水解酶E.C.3.2.1.91、β-葡萄糖苷酶E.C.3.2.1.21、纤维素酶E.C.3.2.1.74、地衣多糖酶E.C.3.1.1.73、脂肪酶E.C.3.1.1.3、脂质酰基转移酶E.C.2.3.1.x、磷脂酶E.C.3.1.1.4、E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5、其它木聚糖酶E.C.3.2.1.8、E.C.3.2.1.32、E.C.3.2.1.37、E.C.3.1.1.72、E.C.3.1.1.73、和/或芽孢杆菌溶素E.C.3.4.24.28。
26.权利要求21-24中任一项所述的用途，其中所述木聚糖酶与选自以下的酶中的一种或多种组合地使用：植酸酶、淀粉酶、半纤维素酶、蛋白酶、脱支酶、角质酶、酯酶和/或甘露聚糖酶。
27.权利要求26所述的用途，其中所述植酸酶是6-植酸酶E.C.3.1.3.26或3-植酸酶E.C.3.1.3.8，所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶E.C.3.4.21.62，碱性丝氨酸蛋白酶E.C.3.4.21.x或角蛋白酶E.C.3.4.x.x，所述甘露聚糖酶是β-甘露聚糖酶E.C.3.2.1.78，和/或所述淀粉酶是α-淀粉酶E.C.3.2.1.1或葡糖淀粉酶E.C.3.2.1.3。
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