BR112021000116A2

BR112021000116A2 - Aditivos de alimento contendo xilanase para alimento de animal à base de cereal

Info

Publication number: BR112021000116A2
Application number: BR112021000116-6A
Authority: BR
Inventors: Susan Arent Lund; Marion Bernardeau; Zheyong Yu; Zhen Qian
Original assignee: Dupont Nutrition Biosciences Aps
Priority date: 2018-07-06
Filing date: 2019-07-01
Publication date: 2021-04-06
Also published as: MX2021000149A; CN112654703A; US20210277374A1; WO2020009964A1; EP3818154A1

Abstract

a presente invenção refere-se a um aditivo de alimento contendo xilanase para alimento de animal à base de cereal para facilitar a degradação de glucuronoxilano insolúvel.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ADITI-

VOS DE ALIMENTO CONTENDO XILANASE PARA ALIMENTO DE ANIMAL À BASE DE CEREAL". REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente In- ternacional nº PCT/CN2018/094752, depositado em 6 de julho de 2018, e do Pedido de Patente Internacional nº POT/CN2018/095761, depositado em 16 de julho de 2018, em que as revelações de cada um estão incorporadas ao presente documento a título de referência em suas totalidades.

INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] A listagem de sequência fornecida no arquivo denominado NB40864-WO-PCT[3] Sequence Listing ST25" com um tamanho de 149 KB, que foi criado em 26 de junho de 2019 e que é depositado com o presente documento, é incorporada a título de referência no presente documento em sua totalidade.

CAMPO

[0003] O campo refere-se a xilanases inovadoras e usos das mesmas em alimento de animal à base de cereal.

ANTECEDENTES

[0004] Xilano é um grupo de hemiceluloses que são encontradas em paredes celulares vegetais e algumas algas. Os xilanos são polis- sacarídeos produzidos a partir de unidades de xilose (um açúcar pen- tose). Os xilanos são quase tão ubíquos quanto a celulose em paredes celulares vegetais e contêm predominantemente unidades de D-xilose B-ligadas. Os heteropolímeros principais de hemicelulose são xilano, manano, galactanos e arabinanos.

[0005] O xilano é também um dos principais fatores antinutricio- nais em matérias-primas de gênero alimentício de uso comum, tais como milho, arroz, sorgo, etc.

[0006] O xilano de fibra de milho é heteroxilano complexo conten- do resíduos de xilose beta-1,4-ligada. Essa cadeia principal é altamen- te substituída por cadeias laterais monoméricas de arabinose ligada a O-2 e/ou O-3 de resíduos de xilose, cadeias laterais monoméricas de ácido glicurônico ou seu derivado de 4-O-metila e cadeias laterais oli- goméricas contendo arabinose, xilose e algumas vezes resíduos de galactose. O xilano na fibra de milho é altamente resistente à degrada- ção enzimática.

[0007] Xilanase é o nome dado a uma classe de enzimas que de- gradam o polissacarídeo linear beta-1,4-xilano em xilose, quebrando, assim, a hemicelulose, que é um dos componentes principais de pare- des celulares vegetais. Xilanases são enzimas chave para a despoli- merização de xilano e clivam ligações glicosídicas internas em posi- ções aleatórias ou específicas de uma cadeia principal de xilano em oligêmeros pequenos. Desse modo, as mesmas desempenham um papel principal no crescimento de micro-organismos em fontes vege- tais para a degradação da matéria vegetal em nutrientes utilizáveis. As xilanases são produzidas por fungos, bactérias, leveduras, algas mari- nhas, protozoários, caracóis, crustáceos, insetos, sementes, etc.

[0008] Com base nas informações genéticas e estruturais, as xila- nases foram classificadas em diferentes famílias de Glicosídeo Hidro- lase (GH) (Henrissat, (1991) Biochem. J. 280, 309 a 316). As enzimas glicosil hidrolase, que incluem xilanases, mananases, amilases, B- glucanases, celulases e outras carboidrases, são classificadas com base em tais propriedades como a sequência de aminoácidos, sua es- trutura tridimensional e a geometria de seu sítio catalítico (Gilkes, et al., 1991, Microbiol. Reviews 55: 303 a 315). As enzimas com ativida- de de endo-xilanase principalmente foram descritas nas famílias de GH, 5, 8,10, 11, 30 e 98.

[0009] Conforme foi observado acima, o xilano na fibra de milho e outros cereais é altamente resistente à degradação enzimática. Dado que o milho é usado globalmente em alimento de animal, há uma ne- cessidade de se ter a capacidade para degradar xilanos derivados de cereal a fim de melhorar a liberação de nutrientes.

SUMÁRIO

[0010] Em uma primeira modalidade, é revelado um aditivo para alimento de animal que compreende milho ou arroz, em que o dito adi- tivo de alimento compreende pelo menos uma enzima que tem ativi- dade glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima que tem atividade endo-beta-1,4-xilanase, em que a degradação de glucuro-noxilano in- solúvel é maior do que se qualquer uma das enzimas fosse usada so- zinha.

[0011] Em outra modalidade, a xilanase que tem atividade de glu- curonoxilanase é uma glucuronoxilanase de GH30.

[0012] Em uma segunda modalidade, a xilanase com atividade de glucuronoxilanase é derivada de Bacillus ou Paenibacillus sp..

[0013] Em outra modalidade, a xilanase que tem atividade de glu- curonoxilanase é derivada de B. subtilis ou B. licheniformis.

[0014] Em outra modalidade, a xilanase que tem atividade de glu- curonoxilanase compreende um polipeptídeo que tem pelo menos 90% (tal como qualquer um dentre 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) de identidade de sequência com um poli- peptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ |ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ |ID

NO:40, SEQ ID NO:41, e SEQ ID NO:42.

[0015] Em uma terceira modalidade, a xilanase com atividade de endo-beta-1,4-xilanase é derivada de um fungo filamentoso (por exemplo, sem limitação, Fusarium sp.).

[0016] Em outra modalidade, a xilanase com atividade de endo- beta-1,4-xilanase compreende um polipeptídeo que tem pelo menos 90% (tal como qualquer um dentre 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%) de identidade de sequência com um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 e SEQ ID NO:52.

[0017] Em uma quarta modalidade, pelo menos uma das xilanases é produzida de modo recombinante.

[0018] Em uma quinta modalidade, é revelado um aditivo de ali- mento que compreende pelo menos uma enzima com atividade de glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima que tem atividade de en- do-beta-1,4-xilanase, em que a dita combinação é melhor no estímulo do crescimento de bactérias benéficas em um trato digestivo de um animal monogástrico alimentado com uma dieta à base de milho quando comparado com o uso da xilanase que tem atividade endo- beta-1,4-xilanase sozinha.

[0019] Em uma sexta modalidade, é descrito um aditivo de alimen- to que compreende pelo menos uma enzima com atividade de glucu- ronoxilanase e pelo menos uma enzima que tem atividade de endo- beta-1,4-xilanase, em que a dita combinação é capaz de aumentar a produção de pelo menos um ácido graxo de cadeia curta em um ani- mal monogástrico alimentado com uma dieta à base de milho em comparação com o uso da xilanase que tem atividade endo-beta-1,4- xilanase sozinha.

[0020] Em uma sétima modalidade, o ácido graxo de cadeia curta é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido acético, ácido propiônico ou ácido butírico.

[0021] Em uma oitava modalidade, qualquer um dos aditivos de alimento revelados aqui pode compreender uma ou mais das enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em uma amilase, pro- tease, endo-glucanase e fitase.

[0022] Em uma nona modalidade, é revelada uma pré-mistura que compreende o aditivo de alimento de qualquer uma das reivindicações 1a7 e pelo menos uma vitamina e/ou mineral.

[0023] Em uma décima modalidade, é revelado um alimento de animal à base de milho ou arroz que compreende pelo menos uma en- zima que tem atividade glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima que tem atividade endo-beta-1,4-xilanase, em que a degradação de glucuro-noxilano insolúvel é maior do que se qualquer uma das enzi- mas fosse usada sozinha.

[0024] Em uma décima primeira modalidade, é revelado um ali- mento de animal à base de milho que compreende pelo menos uma enzima com atividade de glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima GH10 que tem atividade de endo-beta-1,4-xilanase, em que a dita combinação é melhor no estímulo do crescimento de bactérias benéfi- cas em um trato digestivo de um animal monogástrico quando compa- rado com o uso da xilanase que tem atividade endo-beta-1,4-xilanase sozinha.

[0025] Em uma décima segunda modalidade, é revelado um ali- mento de animal à base de milho que compreende pelo menos uma enzima com atividade de glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima que tem atividade de endo-beta-1,4-xilanase, em que a dita combina- ção é capaz de aumentar a produção de pelo menos um ácido graxo de cadeia curta em um animal monogástrico em comparação com o uso da xilanase que tem atividade endo-beta-1,4-xilanase sozinha.

[0026] Em uma décima terceira modalidade, é revelado um ali-

mento de animal em que o ácido graxo de cadeia curta é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido acético, ácido propiônico ou ácido butírico.

[0027] Em uma décima quarta modalidade, é revelado qualquer um dos alimentos de animal descritos no presente documento que compreende adicionalmente uma ou mais das enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em uma amilase, protease, endo- glucanase e fitase.

[0028] Em outra modalidade, é fornecido no presente documento um método para degradar glucuronoxilano insolúvel em um alimento de animal que compreende milho ou arroz que compreende colocar o milho ou arroz em contato com pelo menos uma enzima com atividade de glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima que tem atividade de endo-beta-1,4-xilanase.

[0029] Em outra modalidade, é fornecido no presente documento um método para melhorar a digestibilidade de glucuronoxilano insolú- vel em um alimento de animal à base de milho ou arroz que compre- ende administrar a um animal um alimento de animal à base de milho Ou arroz que compreende pelo menos uma enzima com atividade de glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima que tem atividade de en- do-beta-1,4-xilanase.

[0030] Em outra modalidade, a xilanase que tem atividade de glu- curonoxilanase é uma glucuronoxilanase de GH30.

[0031] Em outra modalidade, a xilanase que tem atividade de glu- curonoxilanase é derivada de Bacillus ou Paenibacillus sp.

[0032] Em outra modalidade, a xilanase que tem atividade de glu- curonoxilanase é derivada de B. subtilis ou B. licheniformis.

[0033] Em outra modalidade, a xilanase que tem atividade de glu- curonoxilanase compreende um polipeptídeo que tem pelo menos 90% (tal como qualquer um dentre 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,

97%, 98%, 99%, ou 100%) de identidade de sequência com um poli- peptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ |ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ |ID NO:40, SEQ ID NO:41, e SEQ ID NO:42.

[0034] Em outra modalidade, a xilanase que tem atividade de en- do-beta-1,4-xilanase é derivada de um fungo filamentoso.

[0035] Em outra modalidade, a xilanase que tem atividade de en- do-beta-1,4-xilanase compreende um polipeptídeo que tem pelo me- nos 90% (tal como qualquer um dentre 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%)de identidade de sequência com um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 e SEQ ID NO:52.

[0036] Em outra modalidade, pelo menos uma das xilanases é produzida de modo recombinante.

[0037] Em outra modalidade, o método compreende adicionalmen- te administrar ao animal (a) uma ou mais das enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em uma amilase, protease, endo- glucanase e fitase; (b) um ou mais microbianos diretamente alimenta- dos; ou (c) uma combinação de (a) e (b).

[0038] Em outra modalidade, o animal é um animal monogástrico selecionado a partir do grupo que consiste em porcos e suínos, perus, patos, frango, salmão, truta, tilápia, bagre, carpa, camarões e gambas.

[0039] Em outra modalidade, o animal é um animal ruminante se- lecionado a partir do grupo que consiste em gado, bezerros jovens, cabras, ovelhas, girafas, bisão, alce, cervo, iaques, búfalo de água,

veado, camelos, alpacas, lhamas, antílopes, antilocapra e nilgó.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS E DAS SEQUÊNCIAS

[0040] As Figuras 1A e 1B representam a medição de atividade de xilanase para as enzimas FveXyn4.v1, BsuGH30 e BliXyn1. A Figura 1A representa a resposta à dose de atividade de FveXyn4.v1 na faixa de concentração de O a 0,0008 mg/ml, ao mesmo tempo que as res- postas de BsuGH30 e BliXyn1i foram determinadas na faixa de con- centração de O a 0,008 mg/ml. A Figura 1B representa as curvas de resposta à dose de atividade para BsuGH30 e BliXyn1 dentro da faixa de O a 0,004 mg/ml que são lineares.

[0041] A Figura 2 mostra um aumento em arabinoxilano relatado em equivalentes de xilose após 2 h de incubação de DDGS de milho com concentrações crescentes das enzimas BsuGH30, BliXyn1, Fve- Xyn4 e FveXyn4.v1.

[0042] A Figura 3 mostra um aumento em arabinoxilano extraível relatado em equivalentes de xilose após 2 h de incubação de DDGS de milho com 12,6 ug/g de FveXyn4, FveXyn4.v1 e glucuronoxilanases de GH30 (BsuGH30, BliXyn1, BamGh2, BsaXyn1, PmaXyn4, PcoXyn1 e PtuXyn2).

[0043] A Figura 4 mostra um aumento em arabinoxilano relatado em equivalentes de xilose após 2 h de incubação de DDGS de milho com as enzimas selecionadas. A Figura 4A mostra uma comparação de tratamento com 3,2 ug/g de enzimas GH30 sozinhas e em combi- nação com 3,2 ug/g de FveXyn4. A resposta de aditivo calculada como a soma do aumento em arabinoxilano extraível obtida a partir de tra- tamentos independentes com 3,2 ug/g de enzima GH30 e 3,2 ug/g de FveXyn4 é também mostrada. A Figura 4B mostra uma comparação de tratamento com 3,2 ug/g de enzimas GH30 sozinhas e em combi- nação com 3,2 ug/g de FveXyn4.v1. É também mostrada a resposta de aditivo calculada como a soma do aumento em arabinoxilano extra-

ível obtida a partir de tratamentos independentes com 3,2 ug/g de en- zima GH30 e 3,2 ug/g de FveXyn4.v1.

[0044] A Figura 5 mostra um aumento em arabinoxilano extraível relatado em equivalentes de xilose. 5A) após 2 h de incubação de fare- lo de arroz 5% com BsuGH30 (enzima GH30) e FveXyn4 (enzima GH10) ou sozinhas ou em combinação e 5B) após 2 h de incubação de farelo de arroz 10% com as enzimas BliXyn1 e FveXyn4.v1 ou so- zinhas ou em combinação. Para as combinações, a inclusão de xila- nase é a soma da concentração da enzima GH30 e a concentração da enzima GH10. A concentração da enzima GH30 é relatada na caixa de legendas e a concentração da enzima GH10 é a diferença entre a in- clusão de xilanase no eixo geométrico X e a concentração da enzima GH30 dada na caixa de legendas.

[0045] A Figura 6 mostra um aumento em arabinoxilano relatado em equivalentes de xilose após 2 h de incubação de DDGS de milho com 1,1 ug/g das enzimas pré-tratadas BsuGH30 e BliXyn1. As barras cinza claro mostram as amostras de controle, incubadas a pH 5,0, e as barras cinza escuro mostram os resultados para as enzimas pré- incubadas com pepsina a pH 3,5.

[0046] A Figura 7 apresenta um alinhamento de múltiplas sequên- cias de sequências de comprimento completo de glucuronoxilanases de GH30.

[0047] As sequências a seguir cumprem com o Título 37, Seções 1,821 a 1,825 do C.F.R. ("Requirements for Patent Applications Con- taining Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosu- res - the Sequence Rules") e são consistentes com o Padrão ST.25 da Organização Mundial de Propriedade Intelectual (WIPO) (2009) e as solicitações de listagem de sequência das Regras da Convenção Eu- ropeia de Patente (EPC) e do Tratado de Cooperação em Matéria de Patente (PCT) 5,2 e 49,5(a-bis), e Seção 208 e Anexo C das Instru-

ções Administrativas. Os símbolos e o formato usados para os dados de sequência de nucleotídeos e aminoácidos cumprem com as regras estabelecidas no Título 37 do C.F.R. $ 1,822. TABELA 1A E 1B. SUMÁRIO DE NÚMEROS DE SEQ ID DE NUCLE-

OTÍDEO E AMINOÁCIDO IA. Glucuronoxilanases de GH30 Proteína delProteína Madura Origem Nome Gene Icomprimento Icompleto Bacillus subtilis BsuGH30 |SEQID No.1 ISEQ ID No. 2º ISEQ ID No. 29 Bacillus licheniformis BliXyn1 SEQIDNo.3 |SEQIDNo.4 |SEQID No. 30 Bacillus amyloliquefaciens; ISEQ ID No. 31 BamGh2 |SEQIDNo.5 |SEQIDNo.6 |FZB42 Bacillus safensis BsaXyn1 SEQIDNo.7 |SEQIDNo.8 |SEQID No. 32 Paenibacillus macerans = |PmaXyn4 |SEQIDNo.9 |SEQID No. 10[SEQ ID No. 33 Paenibacillus cookii DSM| 1SEQ ID No. 34 PcoXyn1 —|SEQIDNo.11 ISEQID No. 12 16944 Paenibacillus tundrae| 1SEQ ID No. 35 PtuXyn2 ISEQ ID No. 13 |ISEQ ID No. 14 IDSM 21291 B. Glucuronoxilanases de GH30 (genes sintéticos e sequências de proteínas recom-| binantes) Proteína — Recombinante Proteína —Recom-; Origem Gene Sintético de Comprimento Comple-binante Madura Ito [Bacillus subtilis ISEQ ID No. 15 SEQ ID No. 16 ISEQ ID No. 36 Bacillus licheniformis 1SEQ ID No. 17 SEQ ID No. 18 1SEQ ID No. 37 Bacillus amyloliquefaciens) ISEQ ID No. 38 ISEQ ID No. 19 SEQ ID No. 20 |FZB42 Bacillus safensis 1SEQ ID No. 21 SEQ ID No. 22 1SEQ ID No. 39 IPaenibacillus macerans — |SEQ ID No. 23 SEQ ID No. 24 ISEQ ID No. 40 Paenibacillus cookii DSM) 1SEQ ID No. 41 ISEQ ID No. 25 SEQ ID No. 26 16944 Paenibacillus tundrae| 1SEQ ID No. 42 ISEQ ID No. 27 SEQ ID No. 28 IDSM 21291

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0048] Todas as patentes, pedidos de patente e publicações men-

cionados estão incorporados ao presente documento a título de refe- rência em sua totalidade.

[0049] Nesta revelação, são usados vários termos e abreviações. As definições a seguir se aplicam, a menos que especificamente de- clarado de outro modo.

[0050] Os artigos "um", "uma", "o" e "a" que antecedem um ele- mento ou componente são destinados a serem não restritivos em rela- ção ao número de casos (isto é, ocorrências) do elemento ou compo- nente. Portanto, "um", "uma", "o" e "a" devem ser lidos como incluindo um ou pelo menos um, e a forma de expressão no singular do elemen- to ou componente também inclui o plural, a menos que o número seja obviamente destinado a ser singular.

[0051] O termo "que compreende" significa a presença dos recur- sos, números inteiros, etapas ou componentes declarados conforme referido nas reivindicações, mas não exclui a presença ou a adição de um ou mais outros recursos, números inteiros, etapas, componentes ou grupos dos mesmos. O termo "que compreende" destina-se a inclu- ir modalidades abrangidas pelos termos "que consiste essencialmente em" e "que consiste em". De modo similar, o termo "que consiste es- sencialmente em" destina-se a incluir modalidades abrangidas pelo termo "que consiste em".

[0052] Quando presentes, todas as faixas são inclusivas e combi- náveis. Por exemplo, quando uma faixa de "1 a 5" é declarada, a faixa declarada deve ser interpretada como incluindo as faixas "1 a4","1 a 3","1a2/,1a2e4a5","1ladeb5"esimilares.

[0053] Conforme usado no presente documento em conexão com um valor numérico, o termo "cerca de" refere-se a uma faixa de +/- 0,5 do valor numérico, a menos que o termo seja especificamente definido de outro modo no contexto. Por exemplo, a expressão um "valor de pH de cerca de 6" refere-se a valores de pH de 5,5 a 6,5, a menos que o valor de pH seja especificamente definido de outro modo.

[0054] Entende-se que todas as limitações numéricas máximas dadas ao longo deste Relatório Descritivo incluam todas as limitações numéricas inferiores, como se tais limitações numéricas inferiores fos- sem expressamente escritas no presente documento. Todas as limita- ções numéricas mínimas dadas ao longo deste Relatório Descritivo incluirão todas as limitações numéricas superiores, como se tais limi- tações numéricas superiores fossem expressamente escritas no pre- sente documento. Todas as faixas numéricas dadas ao longo deste Relatório Descritivo incluirão todas as faixas numéricas mais estreitas que residam dentro de tal faixa numérica mais ampla, como se tais fai- xas numéricas mais estreitas fossem todas expressamente escritas no presente documento.

[0055] O termo "xilanase" (EC 3.2.1.8, endo-(1->4)-beta-xilano 4- xilano-hidrolase, endo-1,4-xilanase, endo-1,4-beta-xilanase, beta-1,4- xilanase, endo-1,4-beta-D-xilanase, 1,4-beta-xilano xilano-hidrolase, beta-xilanase, beta-1,4-xilano xilano-hidrolase, beta-D-xilanase) signi- fica um domínio de proteína ou polipeptídeo derivado de um micro- organismo, por exemplo, fungos, bactérias, levedura, algas marinhas ou protozoários. A xilanase tem a capacidade para hidrolisar xilano. Os termos "xilanase", "glicosídeo hidrolase" e "hidrolase" podem ser usa- dos de modo intercambiável no presente documento.

[0056] O termo "glucuronoxilanase" (EC 3.2.1.136, glucuronoara- binoxilano endo-1,4-B-xilanase, feraxano endoxilanase, feraxanase, endoarabinoxilanase, glucuronoxilano xilo-hidrolase, glucuronoxilano xilano-hidrolase, glucuronoarabinoxilano 1,4-B-D-xilano-hidrolase, glu- curonoarabinoxilano 4-B-D-xilano-hidrolase) significa um domínio de proteína ou polipeptídeo derivado de um micro-organismo, por exem- plo, fungos, bactérias, levedura, algas marinhas ou protozoários. À glucuronoxilanase tem a capacidade para hidrolisar glucuronoxilano.

[0057] O termo "glicosídeo hidrolase" (GH) refere-se a enzimas que ajudam na hidrólise da ligação glicosídica de glicosídeos, isto é, ajudam na hidrólise de ligações glicosídicas em açúcares complexos. As glicosídeo hidrolases (também chamadas de glicosidases ou glico- sil hidrolases) ajudam na hidrólise de ligações glicosídicas em açúca- res complexos.

[0058] As glicosídeo hidrolases (O-Glicosil hidrolases) EC 3.2.1. são um grupo amplamente distribuído de enzimas que hidrolisam a ligação glicosídica entre dois ou mais carboidratos ou entre uma por- ção química carboidrato e uma não carboidrato. Um sistema de classifi- cação para glicosil hidrolases, com base na similaridade de sequência, levou à definição de inúmeras famílias diferentes. Essa classificação está disponível no site da web CAZy (CArbohydrate-Active EnZymes). De- vido ao enovelamento de proteínas ser mais bem conservado do que suas sequências, algumas das famílias podem ser agrupadas em “clãs”. Até outubro de 2011, CAZy incluía 128 famílias de glicosil hidro- lases e 14 clãs.

[0059] A família de glicosídeo hidrolase 30 (GH30) CAZY GH 30 compreende enzimas com várias atividades conhecidas: glucuronoxi- lanase (EC 3.2.1.136), xilanase (EC 3.2.1.8), B-glucosidase (3.2.1.21), B-glucuronidase (EC 3.2.1.31), B-xilosidase (EC 3.2.1.37), B-fucosi- dase (EC 3.2.1.38); glucosilceramidase (EC 3.2.1.45), B-1,6-glucanase (EC 3.2.1.75), endo-B-1,6-galactanase (EC:3.2.1.164) e [extremidade redutora] B-xilosidase (EC 3.2.1.-).

[0060] A família de glicosídeo hidrolase 10 (GH10) CAZY GH 10 compreende enzimas com várias atividades conhecidas: xilanase (EC

3.2.1.8), endo-1,3-beta-xilanase (EC 3.2.1.32) e celobio-hidrolase (EC

3.2.1.91). Essas enzimas eram anteriormente conhecidas como família de celulase F. A degradação microbiana de celulose e xilanos exige diversos tipos de enzimas, tais como endoglucanases (EC 3.2.1.4),

celobio-hidrolases (EC 3.2.1.91) (exoglucanases) ou xilanases (EC

3.2.1.8). Os fungos e as bactérias produzem um espectro de enzimas celulolíticas (celulases) e xilanases que, com base nas similaridades de sequência, podem ser classificadas em famílias. Uma dessas famí- lias é conhecida como a família de celulase F ou como a família de glicosil hidrolases.

[0061] A família de glicosídeo hidrolase 11 (GH11) CAZY GH 11 compreende enzimas com apenas duas atividades conhecidas: xila- nase (EC 3.2.1.8) e endo-B-1,3-xilanase (EC 3.2.1.32). Essas enzimas eram previamente conhecidas como a família de celulases G.

[0062] Os termos "animal" e "indivíduo" são usados de modo inter- cambiável no presente documento. Um animal inclui todos os animais não ruminantes (incluindo seres humanos) e ruminantes. Em uma mo- dalidade específica, o animal é um animal não ruminante, como um cavalo ou um animal monogástrico. Exemplos de animais monogástri- cos incluem, mas sem limitação, porcos e suínos, como leitões, porcos em crescimento, porcas; aves domésticas, como perus, patos, galinha, frangos de corte, galinhas poedeiras; peixe, como salmão, truta, tilá- pia, bagre e carpas; e crustáceos, como camarões e camarões gran- des. Em uma modalidade adicional, o animal é um animal ruminante incluindo, porém sem limitação, gado, bezerros jovens, cabras, ovelha, girafas, bisão, alce americano, alce indonésio, iaques, búfalo de água, veado, camelos, alpacas, lhamas, antílope, antílope americano e antí- lope asiático.

[0063] Um "alimento" significa qualquer dieta natural ou artificial, refeição ou similares ou componentes de tais refeições destinados ou adequados para serem comidos, tomados, digeridos, por um animal não humano e um ser humano, respectivamente. O termo "alimento" é usado com referência a produtos que são fornecidos aos animais na criação de gado. Os termos "alimento" e "alimento de animal" são usa-

dos de modo intercambiável.

[0064] O termo "microbiano diretamente alimentado" ("DFM") con- forme usado no presente documento é a fonte de micro-organismos de ocorrência natural vivos (viáveis). Un DFM pode compreender um ou mais de tais microrganismos de ocorrência natural, como cepas bacte- rianas. As categorias de DFMs incluem Bacillus, Bactérias formadoras de ácido láctico e Leveduras. Dessa forma, o termo DFM abrange um ou mais dentre os seguintes: bactérias diretamente alimentadas, leve- dura diretamente alimentada e combinações das mesmas.

[0065] Bacilli são hastes gram-positivas exclusivas que formam esporos. Os esporos são muito estáveis e podem suportar condições ambientais, como calor, umidificação e uma faixa de pH Estes esporos germinam em células vegetativas ativas quando ingeridos por um ani- mal e podem ser usados em refeição e dietas peletizadas. As Bacté- rias formadoras de ácido láctico são cocos gram-positivos que produ- zem ácido láctico que são antagonísticos a patógenos. Uma vez que as bactérias formadoras de ácido láctico parecem ser um tanto sensí- veis ao calor, as mesmas não podem ser usadas em dietas peletiza- das. Os tipos de Bactérias formadoras de ácido láctico incluem Bifido- bacterium, Lactobacillus e Streptococcus.

[0066] O termo "prebiótico" significa um ingrediente alimentar não digestível que afeta beneficamente o hospedeiro por estimulação sele- tiva do crescimento e/ou da atividade de uma ou um número limitado de bactérias benéficas.

[0067] O termo "cultura probiótica", conforme usado no presente documento, define micro-organismos vivos (incluindo bactérias ou le- veduras, por exemplo) que, quando, por exemplo, ingeridos ou aplica- dos localmente em números suficientes, afetam de modo benéfico o organismo hospedeiro, isto é, conferindo-se um ou mais benefícios de saúde demonstráveis no organismo hospedeiro. Os probióticos podem melhorar o equilíbrio microbiano em uma ou mais superfícies da mu- cosa. Por exemplo, a superfície mucosa pode ser o intestino, o trato urinário, o trato respiratório ou a pele. O termo "probiótico", conforme usado no presente documento, também abrange micro-organismos vivos que podem estimular as ramificações benéficas do sistema imu- nitário e ao mesmo tempo diminuir as reações inflamatórias em uma superfície da mucosa, por exemplo, o intestino. Enquanto ainda não há limites inferiores ou superiores para ingestão probiótica, foi sugerido que pelo menos 10º a 10"?, preferencialmente pelo menos 10º a 10º, preferencialmente 10º a 10º cfu como uma dose diária será eficaz para alcançar os efeitos de saúde benéficos em um indivíduo.

[0068] O termo "CFU" conforme usado no presente documento significa "unidades formadoras de colônias" e é uma medida de células viáveis nas quais uma colônia representa um agregado de células de- rivadas a partir de uma única célula progenitora.

[0069] O termo "isolado" significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Os exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância incluindo, porém sem limitação, qualquer célula hospedeira, enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removido de um ou mais ou da totalidade dos constituintes de ocorrência natural aos quais está associado na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância presente na natureza; ou (4) qualquer substância modificada mediante aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está natu- ralmente associada. Os termos "molécula de ácido nucleico isolada", "polinucleotídeo isolado" e "fragmento de ácido nucleico isolado" serão usados de forma intercambiável e se referem a um polímero de RNA ou DNA que é de fita simples ou dupla fita, que contém opcionalmente bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou alteradas. Uma molé- cula de ácido nucleico isolada na forma de um polímero de DNA pode ser compreendida por um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômi- co ou DNA sintético.

[0070] O termo "purificado" conforme aplicado aos ácidos nuclei- cos ou polipeptídeos, de modo geral, denotados como um ácido nu- cleico ou polipeptídeo que é essencialmente livre de outros componen- tes conforme determinado pelas técnicas analíticas bem conhecidas na técnica (por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo purificado forma uma banda discreta em um gel eletroforético, eluato cromatográ- fico e/ou uma mídia submetida à centrifugação de gradiente por densi- dade). Por exemplo, um ácido nucleico ou polipeptídeo que origina es- sencialmente uma banda em um gel eletroforético é "purificado". Um ácido nucleico ou polipeptídeo purificado é pelo menos cerca de 50% puro, normalmente pelo menos cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cer- ca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cer- ca de 99,5%, cerca de 99,6%, cerca de 99,7%, cerca de 99,8% ou mais puro (por exemplo, porcentagem em peso em uma base molar). Em um sentido relacionado, uma composição é enriquecida para uma molécula quando há um aumento substancial na concentração da mo- lécula após aplicação de uma técnica de purificação ou enriquecimen- to. O termo "enriquecido" refere-se a um composto, polipeptídeo, célu- la, ácido nucleico, aminoácido ou outro material ou componente espe- cificado que esteja presente em uma composição em uma concentra- ção relativa ou absoluta que seja maior que uma composição inicial.

[0071] Conforme usado no presente documento, o termo "ensaio funcional" refere-se a um ensaio que fornece uma indicação da ativi- dade de uma proteína. Em algumas modalidades, o termo refere-se a sistemas de ensaio em que uma proteína é analisada acerca de sua habilidade para funcionar em sua capacidade normal. Por exemplo, no caso de uma xilanase, um ensaio funcional envolve determinar a efi- cácia da xilanase para hidrolisar xilano.

[0072] Os termos "peptídeos", "proteínas" e "polipeptídeos" são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a um polímero de aminoácidos unidos por ligações peptídicas. Uma "proteína" ou um "polipeptídeo" compreende uma sequência polimérica de resíduos de aminoácido. O código de uma única letra e de 3 letras para aminoácidos definido em conformidade com IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) é usado ao longo desta revelação. A única letra X refere-se a qualquer um dos vinte aminoácidos. Compreende-se também que um polipeptídio pode ser codificado por mais do que uma sequência de nucleotídeos devido à degeneração do código genético. As mutações podem ser denomina- das pelo código de uma letra para o aminoácido original, seguido por um número da posição e, então, o código de uma letra para o aminoá- cido variante. Por exemplo, a mutação de glicina (G) na posição 87 para serina (S) é representada como "G087S" ou "G87S". Ao descre- ver as modificações, uma posição seguida pelos aminoácidos listados entre parênteses indica uma lista de substituições nessa posição por qualquer um dos aminoácidos listados. Por exemplo, 6(L,!) significa que a posição 6 pode ser substituída por uma leucina ou uma isoleuci- na. Algumas vezes, em uma sequência, uma barra (/) é usada para definir substituições, por exemplo, F/V indica que a posição particular pode ter uma fenilalanina ou valina nessa posição.

[0073] Uma "pró-sequência" ou "sequência de pró-peptídeos" refe- re-se a uma sequência de aminoácidos entre a sequência de peptídeo de sinalização e sequência de xilanase madura que é necessária para o enovelamento e secreção apropriados da xilanase; por vezes, são denominadas chaperonas intramoleculares. A clivagem da pró- sequência ou da sequência de pró-peptídeo resulta em uma xilanase ativa madura. A xilanase pode ser expressa como pró-enzimas.

[0074] Os termos "sequência de sinalização" e "peptídeo de sinali- zação" referem-se a uma sequência de resíduos de aminoácido que pode participar na secreção ou no transporte direto da forma madura ou precursora de uma proteína. A sequência de sinalização está tipi- camente localizada no terminal N da sequência de proteínas precurso- ra ou madura. A sequência de sinalização pode ser endógena ou exó- gena. Uma sequência de sinalização está normalmente ausente da proteína madura. Uma sequência de sinalização é tipicamente clivada da proteína por uma peptidase de sinalização após a proteína ser transportada.

[0075] O termo "ácido graxo de cadeia curta" também denominado ácidos graxos voláteis ("VFAs") são ácidos graxos com dois a seis átomos de carbono. Os ácidos graxos de cadeia curta são produzidos quando a fibra dietária é fermentada no cólon.

[0076] O termo forma "madura" de uma proteína, um polipeptídeo ou um peptídeo refere-se à forma funcional da proteína, do polipeptí- deo ou da enzima sem a sequência de peptídeo de sinalização e se- quência de pró-peptídeo.

[0077] O termo forma "precursora" de uma proteína ou peptídeo se refere a uma forma imatura da proteína que tem uma pró-sequência operacionalmente ligada ao terminal amino ou carbonila da proteína. O precursor também pode ter uma sequência "de sinalização" ligada de modo funcional ao terminal amino da pró-sequência. O precursor tam- bém pode ter polipeptídeos adicionais que estão envolvidos na ativi- dade pós-transcrição (por exemplo, polipeptídeos clivados a partir da mesma para deixar a forma madura de uma proteína ou um peptídeo).

[0078] O termo "tipo selvagem" em referência a uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácidos nucleicos indica que a se- quência de aminoácidos ou sequência de ácidos nucleicos é uma se- quência nativa ou de ocorrência natural. Conforme usado no presente documento, o termo "de ocorrência natural" refere-se a qualquer coisa (por exemplo, proteínas, aminoácidos ou sequências de ácidos nuclei- cos) que seja encontrada na natureza. Inversamente, o termo "de ocorrência não natural" refere-se a qualquer coisa que não seja encon- trada na natureza (por exemplo, ácidos nucleicos recombinantes e se- quências de proteínas produzidas no laboratório ou modificação da sequência de tipo selvagem).

[0079] Conforme usado no presente documento em relação às po- sições de resíduo de aminoácido, "que corresponde a" ou "correspon- de a" ou "corresponde" refere-se a um resíduo de aminoácido na posi- ção enumerada em uma proteína ou um peptídeo, ou um resíduo de aminoácido que seja análogo, homólogo ou equivalente a um resíduo enumerado em uma proteína ou um peptídeo. Conforme usado no presente documento, "região correspondente", em geral, refere-se a uma posição análoga em uma proteína relacionada ou uma proteína de referência.

[0080] Os termos "derivado de" e "obtido a partir de" referem-se a não apenas uma proteína produzida ou produzível por uma cepa do organismo em questão, mas também uma proteína codificada por uma sequência de DNA isolada de tal cepa e produzida em um organismo hospedeiro que contém tal sequência de DNA. Adicionalmente, o ter- mo refere-se a uma proteína que é codificada por uma sequência de DNA de origem sintética e/ou de cDNA e que tem as características de identificação da proteína em questão.

[0081] O termo "aminoácido" refere-se à unidade estrutural quími- ca básica de uma proteína ou um polipeptídeo. As abreviações a se- guir usadas no presente documento para identificar aminoácidos es-

pecíficos podem ser encontradas na Tabela 2. Tabela 2. Abreviações de Aminoácidos de Uma e Três Letras Aminoácido Três Letras Uma Letra eme — ag Rg Aspas NO asso do sema tmentárer ap o sum a a see — e eme e No gem e Qualquer aminoácido ou conforme | Xaa x cominme mese áemeto

[0082] Seria reconhecido por uma pessoa versada na técnica que modificações das sequências de aminoácidos reveladas no presente documento podem ser feitas ao mesmo tempo que se retém a função associada com as sequências de aminoácidos reveladas. Por exem-

plo, é bastante conhecido na técnica que alterações em um gene que resultam na produção de um aminoácido quimicamente equivalente em um determinado sítio, mas não afetam as propriedades funcionais da proteína codificada, são comuns. Por exemplo, qualquer aminoáci- do particular em uma sequência de aminoácidos revelada no presente documento pode ser substituído por outro aminoácido funcionalmente equivalente. Para os propósitos da presente revelação, as substitui- ções são definidas como trocas dentro de um dos seguintes cinco gru- pos:

1. Resíduos ligeiramente polares ou não polares, alifáticos pequenos: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);

2. Resíduos negativamente carregados, polares e amidas dos mesmos: Asp, Asn, Glu, Gln;

3. Resíduos positivamente carregados, polares: His, Arg, Lys;

4. Resíduos não polares, alifáticos grandes: Met, Leu, lle, Val (Cys); e

5. Resíduos aromáticos grandes: Phe, Tyr e Trp.

[0083] Assim, um códon para o aminoácido alanina, um aminoáci- do hidrofóbico, pode ser substituído por um códon que codifica outro resíduo menos hidrofóbico (tal como glicina) ou um resíduo mais hidro- fóbico (tal como valina, leucina ou isoleucina). Similarmente, espera-se também que alterações que resultam na substituição de um resíduo negativamente carregado por outro ou um resíduo positivamente car- regado por outro (tal como lisina por arginina) produzam um produto funcionalmente equivalente. Em muitos casos, não seria esperado também que as alterações de nucleotídeo que resultam em alteração das porções N-terminais e C-terminais da molécula de proteína alte- rassem a atividade da proteína. Cada uma das modificações propostas está bem dentro da habilidade comum na técnica, como está a deter-

minação de manutenção de atividade biológica dos produtos codifica- dos.

[0084] O termo "com otimização de códon", em referência a genes ou regiões de codificação de moléculas de ácido nucleico para trans- formação de vários hospedeiros, refere-se à alteração de códons no gene ou regiões de codificação as moléculas de ácido nucleico para refletir o uso de códon típico do organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídeo para o qual o DNA codifica.

[0085] O termo "gene" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, incluindo sequências regulado- ras anteriores (sequências de não codificação 5') e posteriores (se- quências de não codificação 3') à sequência de codificação. "Gene na- tivo" refere-se a um gene conforme encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras. "Gene quimérico" refere-se a qual- quer gene que não seja um gene nativo, que compreende sequências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natu- reza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender se- quências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências de codi- ficação derivadas da mesma fonte, mas disposta de uma maneira dife- rente daquela encontrada na natureza. "Gene endógeno" refere-se a um gene nativo em sua localização natural no genoma de um orga- nismo. Um gene "estranho" refere-se a um gene que não é normal- mente encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por transferência de gene. Os genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo ou genes quiméricos. Um "transgene" é um gene que foi intro- duzido no genoma por um procedimento de transformação.

[0086] O termo "sequência de codificação" refere-se a uma se- quência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos específica. "Sequências reguladoras adequadas" referem-se a se- quências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências de não codificação 5'), dentro ou a jusante (sequências de não codificação 3') de uma sequência de codificação e que influenciam a transcrição, es- tabilidade ou processamento de RNA ou tradução da sequência de codificação associada. As sequências reguladoras podem incluir pro- motores, sequências de iniciação de tradução, sítio de processamento de RNA, sítios de ligação efetores e estruturas de haste-laço.

[0087] O termo "ligado de maneira funcional" refere-se à associa- ção de sequências de ácidos nucleicos em uma única molécula de ácido nucleico de modo que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor é ligado de maneira funcional a uma se- quência de codificação quando o mesmo tem a capacidade para afetar a expressão dessa sequência de codificação, isto é, a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor. As sequên- cias de codificação podem ser ligadas de maneira funcional às se- quências reguladoras em uma orientação senso ou antissenso.

[0088] Os termos "sequência reguladora" ou "sequência de contro- le" são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a um segmento de uma sequência de nucleotídeos que tem capacidade para aumentar ou diminuir a expressão de genes especiífi- cos dentro de um organismo. Os exemplos de sequências reguladoras incluem, porém sem limitação, promotores, sequência de sinal, opera- dores e similares. Conforme indicado acima, as sequências regulado- ras podem ser ligadas de maneira funcional em orientação senso ou antissenso à sequência de codificação/gene de interesse.

[0089] "Promotor" ou "sequências promotoras" referem-se a se- quências de DNA que definem onde começa a transcrição de um gene por RNA polimerase. As sequências promotoras estão tipicamente lo- calizadas diretamente a montante ou na extremidade 5' do sítio de ini-

ciação de transcrição. Os promotores podem ser derivados na sua to- talidade de uma sequência nativa ou de ocorrência natural ou podem ser compostos por diferentes elementos derivados de diferentes pro- motores encontrados na natureza ou ainda compreender segmentos de DNA sintéticos. É entendido por aqueles versados na técnica que diferentes promotores podem direcionar a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de célula ou em diferentes estágios de de- senvolvimento ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas ("promotores induzíveis").

[0090] As "sequências de não codificação 3" referem-se a se- quências de DNA localizadas a jusante de uma sequência de codifica- ção e incluem sequências que codificam sinais reguladores com capa- cidade para afetar o processamento de mRNA ou a expressão de ge- ne, tal como terminação de transcrição.

[0091] O termo "transformação", conforme usado no presente do- cumento, refere-se à transferência ou à introdução de uma molécula de ácido nucleico em um organismo hospedeiro. A molécula de ácido nucleico pode ser introduzida como uma forma linear ou circular de DNA. A molécula de ácido nucleico pode ser um plasmídeo que replica autonomamente ou pode se integrar ao genoma de um hospedeiro de produção. Os hospedeiros de produção que contêm o ácido nucleico transformado são denominados organismos "transformados" ou "re- combinantes" ou "transgênicos" ou "transformantes".

[0092] Os termos "recombinante" e "geneticamente modificado" são usados de modo intercambiável no presente documento e se refe- rem a uma combinação artificial de dois segmentos de sequências e ácidos nucleicos de outro modo separados, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação de segmentos isolados de ácidos nuclei- cos por meio de técnicas de engenharia genética. Por exemplo, DNA em que um ou mais segmentos ou genes foram inseridos, naturalmen-

te ou por manipulação em laboratório, de uma molécula diferente, de outra parte da mesma molécula ou uma sequência artificial, resultando na introdução de uma nova sequência em um gene e subsequente- mente em um organismo. Os termos "recombinante", "transgênico", "transformado", "modificado", "geneticamente modificado" e "modifica- do para expressão de gene exógena" são usados de modo intercam- biável no presente documento.

[0093] Os termos "construto recombinante", "construto de expres- são", "construto de expressão recombinante" e "cassete de expressão" são usados de modo intercambiável no presente documento. Uma construção recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácido nucleico, por exemplo, sequências reguladoras e de codificação que não são todas encontradas juntas na natureza. Por exemplo, uma construção pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encon- trada na natureza. Tal construto pode ser usado sozinho ou pode ser usado em conjunto com um vetor. Se um vetor for usado, então, a es- colha de vetor depende do método que será usado para transformar células hospedeiras conforme é conhecido pelos indivíduos versados na técnica. Por exemplo, um vetor de plasmídeo pode ser usado. O indivíduo versado na técnica está bem ciente dos elementos genéticos que devem estar presentes no vetor a fim de transformar, selecionar e propagar de modo bem-sucesso células hospedeiras. O indivíduo ver- sado na técnica também reconhecerá que diferentes eventos de trans- formação independentes podem resultar em diferentes níveis e pa- drões de expressão (Jones et al., (1985) EMBO J 4:2411 a 2418; De Almeida et al., (1989) Mol Gen Genetics 218:78 a 86) e, dessa forma, que múltiplos eventos são tipicamente rastreados a fim de obter linha-

gens que exibam o padrão e nível de expressão desejados. Tal tria- gem pode ser realizada com o uso de ensaios biológicos moleculares, bioquímicos e outros ensaios incluindo análise Southern de DNA, aná- lise Northern de expressão de RNAm, PCR, PCR quantitativa em tem- po real (qPCR), PCR de transcrição reversa (RT-PCR), análise de imunoblot da expressão proteica, ensaios enzimáticos ou de atividade e/ou análise fenotípica.

[0094] Os termos "hospedeiro de produção", "hospedeiro" e "célula hospedeira" são usados de modo intercambiável no presente docu- mento e se referem a qualquer organismo, ou célula do mesmo, seja humano ou não humano, em que um construto recombinante pode ser introduzido de modo estável ou temporário a fim de expressar um ge- ne. Esse termo abrange qualquer progênie de uma célula original que não é idêntica à célula original devido a mutações que ocorrem duran- te a propagação.

[0095] O termo "porcentagem de identidade" é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequên- cias de polinucleotídeos, conforme determinado através da compara- ção de sequências. Na técnica, "identidade" também significa o grau de relação de sequência entre as sequências de polipeptídeos ou poli- nucleotídeos, conforme possa ser o caso, conforme determinado pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos correlacionados entre as ca- deias de tais sequências. "Identidade" e "similaridade" podem ser fa- cilmente calculadas por métodos conhecidos, incluindo, porém sem limitação, aqueles descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part | (Griffin, A. M., and Griffin, H G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e

Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Os métodos para determinar a identidade e a similaridade são codificados em programas de computador publi- camente disponíveis.

[0096] Conforme usado no presente documento, "% de identidade" ou porcentagem de identidade" ou "PID" refere-se à identidade de se- quência de proteínas. A porcentagem de identidade pode ser determi- nada com o uso de técnicas padrão conhecidas na técnica. Algoritmos úteis incluem os algoritmos BLAST (Consultar Altschul et al., J Mol Bi- ol, 215:403 a 410, 1990; e Karlin e Altschul, Proc Natl Acad Sci EUA, 90:5,873 a 5,787, 1993). O programa BLAST usa diversos parâmetros de pesquisa, a maioria dos quais é definida para os valores padrão. O algoritmo NCBI BLAST encontra as sequências mais relevantes em termos de similaridade biológica, mas não é recomendado para se- quências de consulta de menos de 20 resíduos (Altschul et a/., Nucleic Acids Res, 25:3,389 a 3,402, 1997; e Schaffer et al., Nucleic Acids Res, 29:2,994 a 3,005, 2001). Os parâmetros BLAST padrão exempli- ficativos para uma pesquisa de sequência de ácidos nucleicos inclu- em: Limite de palavras vizinhas = 11; Corte de valor E = 10; Matriz de Pontuação = NUC.3,1 (correspondência = 1, não correspondência = -3); Abertura de Lacuna = 5; e Extensão de Lacuna = 2. Os parâme- tros BLAST padrão exemplificativos para as pesquisas de sequência de aminoácidos incluem: Tamanho de palavra = 3; Corte de valor E = 10; Matriz de Pontuação = BLOSUMG62; Abertura de lacuna= 11; e Ex tensão de lacuna = 1. Uma porcentagem (%) de identidade de se- quência de aminoácidos é determinada pelo número de resíduos idên- ticos correspondentes dividido pelo número total de resíduos da se- quência de "referência". Os algoritmos BLAST referem-se à sequência "de referência" como a sequência "de consulta".

[0097] Conforme usado no presente documento, o termo "proteí-

nas homólogas" ou "xilanases homólogas" refere-se a proteínas que têm similaridade distinta na estrutura primária, secundária e/ou terciá- ria. A homologia da proteína pode se referir à similaridade na sequên- cia de aminoácidos linear quando as proteínas estão alinhadas. À pesquisa homóloga de sequências de proteínas pode ser feita com o uso de BLASTP e PSI-BLAST de NCBI BLAST com limiar (corte de valor E) a 0,001. (Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new gen- eration of protein database search programs". Nucleic Acids Res, 1 de setembro de 1997; 25(17): 3,389 a 3,402). Com o uso dessas informa- ções, as sequências de proteínas podem ser agrupadas. Uma árvore filogenética pode ser construída com o uso das sequências de amino- ácidos.

[0098] Os alinhamentos de sequências e os cálculos de identidade percentual podem ser realizados com o uso do programa Megalign do suíte de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI), o programa AlignX de Vector NTI v. 7,0 (Informax, Inc., Bethesda, MD) ou o Suíte de Software Aberto EMBOSS (EMBL-EBI; Rice et al., Trends in Genetics 16, (6):276 a 277 (2000)). O alinhamen- to múltiplo das sequências pode ser realizado com o uso do método CLUSTAL (tal como CLUSTALW; por exemplo, versão 1,83) de ali- nhamento (Higgins e Sharp, CABIOS, 5:151 a 153 (1989); Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22:4,673 a 4,680 (1994); e Chenna et al., Nu- cleic Acids Res 31 (13):3,497 a 3,500 (2003)), disponíveis junto ao Eu- ropean Molecular Biology Laboratory por meio do European Bioinfor- matics Institute) com os parâmetros-padrão. Os parâmetros adequa- dos para alinhamentos de proteína CLUSTALW incluem penalidade por existência de GAP=15, extensão de GAP=0,2, matriz = Gonnet (por exemplo, Gonnet250), ENDGAP de proteína = -1, GAPDIST de proteína=4 e KTUPLE=1. Em uma modalidade, um alinhamento rápido ou lento é usado com os ajustes-padrão quando há um alinhamento lento. Alternativamente, os parâmetros que usam o método CLUS- TALW (por exemplo, versão 1,83) podem ser modificados para usar também KTUPLE =1, GAP PENALTY=10, extensão de GAP=1, matriz = BLOSUM (por exemplo, BLOSUM64), WINDOW=5 e TOP DIAGO- NALS SAVED=5.

[0099] O programa MUSCLE (Robert C. Edgar. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput Nucl. Acids Res. (2004) 32 (5): 1,792 a 1,797) é ainda outro exemplo de um algoritmo de alinhamento de múltiplas sequências.

[00100] O termo "variante", em relação a um polipeptídeo, refere-se a um polipeptídeo que se diferencia de um polipeptídeo de tipo selva- gem, original ou de referência especificado em que o mesmo inclui uma ou mais substituições, inserções ou deleções de um aminoácido de ocorrência natural ou feitas pelo homem. Similarmente, o termo "va- riante", em relação a um polinucleotídeo, refere-se a um polinucleotí- deo que difere em sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo do tipo selvagem, original ou de referência especificado. A identidade do polipeptídeo ou polinucleotídeo de tipo selvagem, original ou de re- ferência será evidente a partir do contexto. Uma sequência de polipep- tídeos ou sequência de polinucleotídeos variante pode ter pelo menos 60%, 61%, 62%,63%,64%, 65%, 66%, 67%, 68%,69%, 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, T5%, 16%, 177%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência revelada no presente documento. A sequência de aminoácidos ou sequência de polinucleotídeos variante tem a mesma função da sequência revelada ou pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% da função da sequência re- velada.

[00101] Os termos "plasmídeo", "vetor" e "cassete" referem-se a um elemento extracromossômico que muitas vezes carrega genes que não são parte do metabolismo central da célula e normalmente sob a forma de DNA de fita dupla. Tais elementos podem ser sequências de replicação autônoma, sequências de integração ao genoma, sequên- cias de fago ou nucleotídeos, em forma linear ou circular, de um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, derivadas de qualquer fonte, em que várias sequências de nucleotídeos foram unidas ou recombinadas em uma construção exclusiva que tem a capacidade para introduzir um polinucleotídeo de interesse em uma célula. "Cassete de transforma- ção" refere-se a um vetor específico que contém um gene e que tem elementos adicionalmente ao gene que facilita a transformação de uma célula hospedeira específica. Os termos "cassete de expressão" e "vetor de expressão" são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem a um vetor específico que contém um gene e que tem elementos adicionais ao gene que permitem expressão da- quele gene em um hospedeiro.

[00102] O termo "expressão", conforme usado no presente docu- mento, refere-se à produção de um produto final funcional (por exem- plo, um mRNA ou uma proteína) na forma precursora ou madura. À expressão pode também se referir à tradução de mMRNA em um poli- peptídeo.

[00103] A expressão de um gene envolve a transcrição do gene e a tradução do MRNA em um precursor ou proteína madura. Proteína "madura" refere-se a um polipeptídeo pós-traducionalmente processa- do, isto é, um a partir do qual qualquer sequência de sinalização, pré ou pró-peptídeos presentes no produto de translação primário foram removidos. Proteína "precursora" refere-se ao produto primário da tra- dução de mRNA, isto é, com pré- ou pró-peptídeos ainda presentes. Os pré- ou pró-peptídeos podem ser, porém sem limitação, sinais de localização intracelulares. "Transformação estável" refere-se à transfe- rência de um fragmento de ácido nucleico em um genoma de um or- ganismo hospedeiro, incluindo genomas tanto nucleares quanto orga- nelares, resultando na herança geneticamente estável. Em contraste, "transformação temporária" refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucleico para o núcleo ou organela que contém DNA de um organismo hospedeiro, resultando na expressão de genes sem inte- gração ou herança estável.

[00104] O vetorde expressão pode ser um dentre vários vetores ou cassetes úteis para a transformação de hospedeiros de produção ade- quados conhecidos na técnica. Tipicamente, o vetor ou o cassete in- cluirão sequências que direcionam a transcrição e a tradução do gene relevante, um marcador selecionável e sequências que permitem repli- cação autônoma ou integração cromossômica. Os vetores adequados, de modo geral, incluem uma região 5' do gene que abriga controles de iniciação transcricional e uma região 3' do fragmento de DNA que con- trola a terminação transcricional. Ambas as regiões de controle podem ser derivadas de genes homólogos para genes de uma célula hospe- deira de produção transformada e/ou genes nativos ao hospedeiro de produção, embora tais regiões de controle não precisem ser assim de- rivadas.

[00105] Regiões de controle de iniciação ou promotores possíveis que podem ser incluídos no vetor de expressão são diversos e familia- res àqueles versados na técnica. Virtualmente qualquer promotor com a capacidade para acionar esses genes é adequado, incluindo, porém sem limitação, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHOS5S, GA- PDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (úteis para a expressão em Saccharomyces); AOX1 (útil para a expressão em Pichia); e lac, araB, tet, trp, IP1, IPR, T7, tac e tre (Útil para a expressão em Escheri- chia coli) assim como os promotores amy, apr, npr e vários promotores de fago úteis para a expressão em Bacillus.

Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo ou induzível.

Um "promotor constitutivo" é um promotor que é ativo sob a maioria das condições ambientais e de desenvolvimento.

Um promotor "induzível" ou "repri- mível" é um promotor que é ativo sob regulação ambiental ou de de- senvolvimento.

Em algumas modalidades, promotores são induzíveis ou reprimíveis devido a mudanças em fatores ambientais incluindo, porém sem limitação, a disponibilidade de carbono, nitrogênio ou outro nutriente, temperatura, pH, osmolaridade, a presença de metal (ou me- tais) pesado, a concentração de inibidor (ou inibidores), tensão ou uma combinação dos anteriores, conforme conhecido na técnica.

Em algu- mas modalidades, os promotores induzíveis ou reprimíveis são induzí- veis ou reprimíveis por fatores metabólicos, tais como o nível de de- terminadas fontes de carbono, o nível de determinadas fontes de energia, o nível de determinados catabólitos ou uma combinação dos anteriores conforme conhecido na técnica.

Em uma modalidade, o promotor é um que é nativo à célula hospedeira.

Por exemplo, em al- guns casos, quando Trichoderma reesei é o hospedeiro, o promotor pode ser um promotor de 7. reesei nativo, tal como o promotor cbh1 que é depositado no GenBank com o Número de Acesso D86235. Ou- tros exemplos não limitantes adequados de promotores úteis para ex- pressão fúngica incluem cbh2, egl1, egl2, egl3, egl4, egl5, xyn1 e xyn2, promotor de gene de fosfatase de ácido reprimível (phoA) de P. chrysogenus (consultar, por exemplo, Graessle et al., (1997) Appl.

En- viron.

Microbiol., 63 :753 a 756), promotor de PCK1 reprimível de gli- cose (consultar, por exemplo, Leuker et a/., (1997), Gene, 192:235 a 240), promotor de MET3 reprimível por glicose, induzível por maltose (consultar Liu et a/l., (2006), Eukary.

Cell, 5:638 a 649), promotor pKi e promotor cpc1. Outros exemplos de promotores úteis incluem promo- tores de genes de glicoamilase de A. awamori e A. niger (consultar,

por exemplo, Nunberg et al., (1984) Mol. Cell Biol. 15 4:2,306 a 2,315 e Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1,581 a 1,585). Ademais, os promoto- res do gene xln1 de T. reesei podem ser úteis (consultar, por exemplo, o documento EPA 137280Al).

[00106] Os fragmentos de DNA que controlam a terminação trans- cricional podem ser também derivados de vários genes nativos a uma célula hospedeiro de produção preferencial. Em certas modalidades, a inclusão de uma região de controle de terminação é opcional. Em cer- tas modalidades, o vetor de expressão inclui uma região de controle de terminação derivada da célula hospedeira preferencial.

[00107] O vetor de expressão pode ser incluído no hospedeiro de produção, particularmente, nas células de hospedeiros de produção microbianos. As células hospedeiras de produção podem ser hospe- deiros microbianos encontrados dentro das famílias fúngicas ou bacte- rianas e que crescem ao longo de uma faixa ampla de temperatura, valores de pH e tolerâncias a solvente. Por exemplo, contempla-se que qualquer um dentre bactérias, algas e fungos, tais como fungos filamentosos e leveduras, podem adequadamente hospedar o vetor de expressão.

[00108] A inclusão do vetor de expressão na célula hospedeira de produção pode ser usada para expressar a proteína de interesse, de modo que a mesma possa residir de maneira intracelular, extracelular ou uma combinação de ambas dentro e fora da célula. A expressão extracelular produz a recuperação da proteína desejada de um produto de fermentação mais fácil que métodos para recuperação de proteína produzida por expressão intracelular.

[00109] É possível recuperar opcionalmente a proteína desejada do hospedeiro de produção. Em outro aspecto, um sobrenadante de cul- tura contendo xilanase é obtido com o uso de qualquer um dos méto- dos conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00110] Uma enzima secretada a partir das células hospedeiras po- de ser usada em uma preparação de caldo total. A preparação de um caldo de fermentação inteiro gasto de um micro-organismo recombi- nante pode ser alcançada com o uso de qualquer método de cultivo conhecido na técnica que resulta na expressão de uma xilanase. O termo "caldo de fermentação inteiro gasto" é definido no presente do- cumento como conteúdo não fracionado do material de fermentação que inclui o meio de cultura, proteínas extracelulares (por exemplo, enzimas) e biomassa celular. Entende-se que o termo "caldo de fer- mentação inteiro gasto" também abrange biomassa celular que foi li- sada ou permeabilizada com o uso de métodos bem conhecidos na técnica.

[00111] Uma enzima secretada a partir das células hospedeiras po- de ser convenientemente recuperada do meio de cultura por procedi- mentos bem conhecidos, incluindo separar as células do meio por cen- trifugação ou filtração e precipitar componentes proteináceos do meio através de um sal, tal como sulfato de amônio, seguido do uso de pro- cedimentos cromatográficos, tais como cromatografia por troca iônica, cromatografia por afinidade ou similares.

[00112] As técnicas de fermentação, separação e concentração são bem conhecidas na arte e métodos convencionais podem ser usados para preparar uma solução concentrada contendo polipeptídeo de xi- lanase. Após a fermentação, um caldo de fermentação é obtido, as células microbianas e vários sólidos suspensos, incluindo os materiais de fermentação brutos residuais, são removidos por técnicas de sepa- ração convencionais a fim de obter uma solução de xilanase. Filtração, centrifugação, microfiltração, filtração em tambor giratório a vácuo, ul- trafiltração, centrifugação seguida por ultrafiltração, extração ou cro- matografia ou similares são geralmente usadas.

[00113] É desejável concentrar uma solução contendo polipeptídeo de xilanase variante a fim de otimizar a recuperação. O uso de solu- ções não concentradas exige tempo de incubação aumentado a fim de coletar o precipitado de enzima enriquecido ou purificado. A solução contendo enzima é concentrada com o uso de técnicas de concentra- ção convencionais até o nível de enzima desejado ser obtido. A con- centração da solução contendo enzima pode ser alcançada por qual- quer uma das técnicas discutidas no presente documento. Os métodos exemplificativos de enriquecimento e purificação incluem, porém sem limitação, filtragem a vácuo giratória e/ou ultrafiltração.

[00114] Adicionalmente, a concentração do produto de proteína de- sejado pode ser realizada com o uso de, por exemplo, um agente de precipitação, tal como agente de precipitação de haleto de metal. O agente de precipitação de haleto de metal, cloreto de sódio, pode ser também usado como um conservante. O agente de precipitação de haleto de metal é usado em uma quantidade eficaz para precipitar a xilanase. A seleção de pelo menos uma quantidade eficaz e uma quantidade ideal de haleto de metal eficaz para causar a precipitação da enzima, assim como as condições da precipitação para máxima recuperação incluindo o tempo de incubação, pH, temperatura e con- centração de enzima, serão prontamente evidentes para uma pessoa versada na técnica, após testes de rotina. Geralmente, pelo menos cerca de 5% em p/v (peso/volume) a cerca de 25% em p/v de haleto de metal é adicionado à solução de enzima concentrada e usualmente pelo menos 8% em p/v.

[00115] Outro modo alternativo para precipitar a enzima é usar compostos orgânicos. Os agentes de precipitação de composto orgâ- nico exemplificativos incluem: ácido 4-hidroxibenzoico, sais de metais alcalinos de ácido 4-hidroxibenzoico, ésteres alquílicos de ácido 4- hidroxibenzoico e mesclas de dois ou mais desses compostos orgâni- cos. A adição dos agentes de precipitação de composto orgânico pode ocorrer antes, simultaneamente ou subsequente à adição do agente de precipitação de haleto de metal, e a adição de ambos os agentes de precipitação, composto orgânico e haleto de metal pode ser execu- tada sequencial ou simultaneamente. Geralmente, os agentes de pre- cipitação orgânicos são selecionados dentre o grupo que consiste em sais de metais alcalinos de ácido 4-hidroxibenzoico, tais como sais de sódio ou potássio, e ésteres alquílicos lineares ou ramificados de ácido 4-hidroxibenzoico, em que o grupo alquila contém de 1 a 12 átomos de carbono, e mesclas de dois ou mais desses compostos orgânicos. Os compostos orgânicos adicionais também incluem, porém sem limita- ção, éster metílico de ácido 4-hidroxibenzoico (nomeado metil PARA- BENO), éster propílico de ácido 4-hidroxibenzoico (nomeado PARA- BENO). Para descrições adicionais, consultar, por exemplo, a Patente nº U.S. 5.281.526. A adição do agente de precipitação de composto orgânico fornece a vantagem de alta flexibilidade das condições de precipitação em relação ao pH, temperatura, concentração de xilanase variante, concentração de agente de precipitação e tempo de incuba- ção. Geralmente, pelo menos cerca de 0,01% em p/v e no máximo cerca de 0,3% em p/v de agente de precipitação de composto orgânico é adicionado à solução de enzima concentrada.

[00116] Após o período de incubação, a enzima enriquecida ou pu- rificada é, então, separada do pigmento dissociado e outras impurezas coletadas por técnicas de separação convencionais, tais como filtra- ção, centrifugação, microfiltração, filtração giratória a vácuo, ultrafiltra- ção, filtração por prensa, microfiltração por membrana cruzada, micro- filtração por membrana de fluxo cruzado ou similares. O enriquecimen- to ou purificação adicional do precipitado de enzima pode ser obtida lavando-se o precipitado com água. Por exemplo, o precipitado de en- zima enriquecido ou purificado é lavado com água contendo o agente de precipitação de haleto de metal ou com água contendo o haleto de metal e os agentes de precipitação de composto orgânico.

[00117] Além disso é descrito no presente documento um hospedei- ro de produção microbiano recombinante para expressar pelo menos um polipeptídeo descrito no presente documento, sendo que o dito hospedeiro de produção microbiano recombinante compreende um construto recombinante descrito no presente documento. Em outra modalidade, esse hospedeiro de produção microbiano recombinante é selecionado a partir do grupo que consiste em bactérias, fungos e al- gas.

[00118] A expressão será entendida como incluindo qualquer etapa envolvida na produção de pelo menos um polipeptídeo descrito no presente documento que inclui, porém sem limitação, transcrição, mo- dificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-tradução e se- creção.

[00119] Técnicas para modificar sequências de ácido nucleico que usam métodos de clonagem são bem conhecidas na arte.

[00120] Um polinucleotídeo que codifica uma xilanase pode ser manipulado em uma variedade de modos para fornecer a expressão do polinucleotídeo em uma célula hospedeira microbiana heteróloga , tal como Bacillus ou Trichoderma. A manipulação da sequência de po- linucleotídeos antes de sua inserção em um construto de ácido nuclei- co ou vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do constru- to de ácido nucleico ou vetor ou da célula hospedeira microbiana hete- róloga. As técnicas para modificar sequências de nucleotídeos utili- zando métodos de clonagem são bem conhecidas na arte.

[00121] As sequências reguladoras são definidas acima. As mes- mas incluem todos os componentes que são necessários ou vantajo- Sos para a expressão de uma xilanase. Cada sequência de controle pode ser nativa ou estranha para a sequência de nucleotídeos que co- difica a xilanase. Tais sequências reguladoras incluem, porém sem limitação, um líder, uma sequência de poliadenilação, uma sequência de pró-peptídeos, um promotor, uma sequência de sinalização e um terminador de transcrição. Sequências reguladoras podem ser forneci- das com ligantes com o propósito de introduzir sítios de restrição es- pecíficos que facilitam a ligação ou as sequências reguladoras com a região de codificação da sequência de nucleotídeos que codifica uma xilanase.

[00122] Um construto de ácido nucleico que compreende um poli- nucleotídeo que codifica uma xilanase pode ser ligado de maneira fun- cional a uma ou mais sequências de controle com a capacidade para direcionar a expressão da sequência de codificação em um microbiano heterólogo, tal como a célula hospedeiras de Bacillus, sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[00123] Cada sequência de controle pode ser nativa ou estranha ao polinucleotídeo que codifica uma xilanase. Tais sequências de controle incluem, porém sem limitação, um líder, um promotor, uma sequência de sinalização e um terminador de transcrição. No mínimo, as sequên- cias de controle incluem um promotor e sinais de terminação da trans- crição e tradução. As sequências de controle podem ser dotadas de ligantes para a finalidade de introdução de sítios de restrição específi- cos, facilitando a ligação das sequências de controle com a região de codificação do polinucleotídeo que codifica uma xilanase.

[00124] A sequência de controle pode ser uma região promotora apropriada, uma sequência de nucleotídeos que é reconhecida por uma célula hospedeira microbiana heteróloga para expressão do poli- nucleotídeo que codifica uma xilanase. A região promotora contém se- quências de controle de transcrição que mediam a expressão de uma xilanase. A região promotora pode ser qualquer sequência de nucleo- tídeos que mostra a atividade transcricional em uma célula hospedeira de Bacillus de escolha e pode ser obtida a partir de genes que direcio-

nam a síntese de polipeptídeos extracelulares ou intracelulares que têm atividade biológica homóloga ou heteróloga à célula hospedeira de Bacillus.

[00125] A região promotora pode compreender um único promotor ou uma combinação de promotores. Quando a região promotora com- preende uma combinação de promotores, os promotores estão prefe- rencialmente em tandem. Um promotor da região promotora pode ser qualquer promotor que possa iniciar a transcrição de um polinucleotí- deo que codifica um polipeptídeo que tem atividade biológica em uma célula hospedeira microbiana heteróloga de interesse. O promotor po- de ser nativo, estranho ou uma combinação dos mesmos à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem atividade bioló- gica. Tal promotor pode ser obtido a partir de genes que direcionam a síntese de polipeptídeos extracelulares ou intracelulares que têm ativi- dade biológica homóloga ou heteróloga para a célula hospedeira mi- crobiana heteróloga.

[00126] Assim, em certas modalidades, a região promotora com- preende um promotor obtido a partir de uma fonte bacteriana. Em ou- tras modalidades, a região promotora compreende um promotor obtido a partir de uma bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. As bactérias Gram-positivas incluem, porém sem limitação, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lacto- coccus, Clostridium, Geobacillus, e Oceanobacillus. As bactérias Gram-negativas incluem, porém sem limitação, E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacte- rium, Ilyobacter, Neisseria e Ureaplasma.

[00127] A região promotora pode compreender um promotor obtido a partir de uma cepa de Bacillus (por exemplo, Bacillus agaradherens, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Baci- Ilus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Baci-

Ilus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Baci- llus thuringiensis); ou a partir de uma cepa de Streptomyces (por exemplo, Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus).

[00128] A região promotora pode compreender um promotor que é um promotor "consenso" que tem a sequência TTGACA para a região ".35" e TATAAT para a região "-10". O promotor consenso pode ser obtido a partir de qualquer promotor que possa funcionar em uma célu- la hospedeira de Bacillus. A construção de um promotor "consenso" pode ser realizada por mutagênese sítio-dirigida com o uso de méto- dos bem conhecidos na técnica para criar um promotor que conforma mais perfeitamente às sequências consenso estabelecidas para as regiões "-10" e "-35" dos promotores "sigma tipo A" vegetativos para Bacillus subtilis (Voskuil et al., 1995, Molecular Microbiology 17: 271 a 279).

[00129] Uma sequência de controle pode também ser uma sequên- cia terminadora de transcrição adequada, tal como uma sequência re- conhecida por uma célula hospedeira de Bacillus para terminar a transcrição. A sequência terminadora é ligada de modo funcional ao terminal 3' da sequência de nucleotídeos que codifica a xilanase. Qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira de Baci- Ilus pode ser usado.

[00130] A sequência de controle também pode ser uma sequência líder adequada, uma região não traduzida de um mRNA que é impor- tante para tradução por uma célula hospedeira de Bacillus. A sequên- cia líder é ligada de maneira funcional à terminação 5' da sequência de nucleotídeos que direcionada a síntese do polipeptídeo que tem ativi- dade biológica. Qualquer sequência que seja funcional em uma célula hospedeira de Bacillus de escolha pode ser usada na presente inven- ção.

[00131] A sequência de controle pode também ser uma sequência estabilizante de MRNA. O termo "sequência estabilizante de MRNA" é definido no presente documento como uma sequência localizada a ju- sante de uma região promotora e a montante de uma sequência de codificação de um polinucleotídeo que codifica uma xilanase à qual a região promotora é ligada de maneira funcional, de modo que todos os MRNAs sintetizados da região promotora possam ser processados pa- ra gerar transcritos de MRNA com uma sequência estabilizante na ex- tremidade 5' dos transcritos. Por exemplo, a presença de tal sequência estabilizante na extremidade 5' dos transcritos de MRNA aumenta sua meia-vida (Agaisse e Lereclus, 1994, supra, Hue et a/., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3,465 a 3,471). A sequência de estabilização/pro- cessamento de mRNA é complementar à extremidade 3' do RNA ri- bossômico 168 bacteriano. Em certas modalidades, a sequência de estabilização/processamento de mRNA gera essencialmente transcri- tos de tamanho único com uma sequência de estabilização na extre- midade 5' dos transcritos. A sequência de estabilização/processa- mento de mRNA é, preferencialmente, uma que é complementar à ex- tremidade 3' do RNA ribossômico 168 bacteriano. Consultar a Patente nº U.S. 6.255.076 e a Patente nº U.S. 5.955.310.

[00132] O construto de ácido nucleico pode, então, ser introduzido em uma célula hospedeira de Bacillus com o uso de métodos conheci- dos na técnica ou daqueles métodos descritos no presente documento para introduzir e expressar uma xilanase.

[00133] Um construto de ácido nucleico que compreende um DNA de interesse que codifica uma proteína de interesse pode também ser construído similarmente conforme descrito acima.

[00134] Para obter a secreção da proteína de interesse do DNA in- troduzido, a sequência de controle pode também compreender uma região de codificação de peptídeo de sinalização, que codifica uma sequência de aminoácidos ligada ao terminal amino de um polipeptí- deo que pode direcionar o polipeptídeo expresso para a trajetória se- cretória da célula. A região de codificação de peptídeo de sinalização pode ser nativa ao polipeptídeo ou pode ser obtida a partir de fontes estranhas. A extremidade 5' da sequência de codificação da sequência de nucleotídeos pode conter inerentemente uma região de codificação do peptídeo de sinalização naturalmente ligada em quadro de leitura de tradução com o segmento da região de codificação que codifica o polipeptídeo secretado. Alternativamente, a extremidade 5' da sequên- cia de codificação pode conter uma região de codificação de peptídeo de sinalização que é estranha a essa porção da sequência de codifi- cação que codifica que codifica o polipeptídeo secretado. A região de codificação de peptídeo de sinalização estranha pode ser necessária quando a sequência de codificação não contém normalmente uma re- gião de codificação de peptídeo de sinalização. Alternativamente, a região de codificação de peptídeo de sinalização estranha pode sim- plesmente substituir a região de codificação de peptídeo de sinaliza- ção natural a fim de obter a secreção aumentada do polipeptídeo em relação à região de codificação de peptídeo de sinalização natural normalmente associada à sequência de codificação. A região de codi- ficação de peptídeo de sinalização pode ser obtida a partir de um gene de amilase ou xilanase de uma espécie de Bacillus. Entretanto, qual- quer região de codificação de peptídeo de sinalização com a capaci- dade para direcionar o polipeptídeo expresso à trajetória secretória de uma célula hospedeira de Bacillus de escolha pode ser usada na pre- sente invenção.

[00135] Uma região de codificação de peptídeo de sinalização efi- caz para uma célula hospedeira de Bacillus é a região de codificação de peptídeo de sinalização obtida a partir do gene de amilase malto- gênica de Bacillus NCIB 11837, do gene de alfa-amilase Bacillus stea-

rothermophilus, do gene de subtilisina de Bacillus licheniformis, do ge- ne de beta-lactamase Bacillus licheniformis, dos genes de proteases neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) e do gene prsA Bacillus subitilis.

[00136] Assim, um construto de polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um construto de xilanase que compre- ende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de interesse (POI) pode ser construído de modo que seja expresso por uma célula hospedeira. Por causa das degenerescências conhecidas no código genético, diferentes polinucleotídeos que codificam uma sequência de aminoácidos idêntica podem ser projetados e produzidos com habili- dades comuns na técnica. Por exemplo, otimizações de códon podem ser aplicadas para otimizar a produção em uma célula hospedeira par- ticular.

[00137] Os ácidos nucleicos que codificam proteínas de interesse podem ser incorporados em um vetor, em que o vetor pode ser trans- ferido para uma célula hospedeira que usa técnicas de transformação bem conhecidas, tais como aquelas reveladas no presente documento.

[00138] O vetor pode ser qualquer vetor que pode ser transformado em e replicado dentro de uma célula hospedeira. Por exemplo, um ve- tor que compreende um ácido nucleico que codifica um POI pode ser transformado e replicado em uma célula hospedeira bacteriana como um meio de propagar e amplificar o vetor. O vetor também pode ser transformado em um hospedeiro de expressão de Bacillus da revela- ção, de modo que a proteína que codifica ácido nucleico (por exemplo, um ORF) possa ser expressa como uma proteína funcional.

[00139] Um vetor representativo que pode ser modificado com habi- lidade rotineira para compreender e expressar um ácido nucleico que codifica um POI é o vetor p2JM103BBI.

[00140] Um polinucleotídeo que codifica uma xilanase ou um POI pode ser ligado de maneira funcional a um promotor adequado, que permite a transcrição na célula hospedeira. O promotor pode ser qual- quer sequência de ácidos nucleicos que mostra atividade transcricional na célula hospedeira de escolhida e pode ser derivado de genes que codificam proteínas ou homólogos ou heterólogos à célula hospedeira. Os meios de avaliar a atividade/resistência de promotor são rotineiros para o versado na técnica.

[00141] Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição de uma sequência de polinucleotídeos que codifica o poli- peptídeo comS1 ou um POI da revelação, especialmente em um hos- pedeiro bacteriano, incluem o promotor do operon lac de E. coli, os promotores de gene dagA ou celA de agarase de Streptomyces coeli- color, os promotores do gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), os promotores do gene de amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), os promotores da alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), os promotores dos genes xy/A e xy/B de Bacillus subtilis e similares.

[00142] “Um promotor para direcionar a transcrição de uma sequên- cia de polinucleotídeos que codifica um POI pode ser um promotor aprE de tipo selvagem, um promotor aprE mutante ou um promotor aprE de consenso apresentados na Publicação Internacional PCT nº WOZ2001/51643. Em outras determinadas modalidades, um promotor para direcionar a transcrição de uma sequência de polinucleotídeos que codifica um POI é um promotor spoVG de tipo selvagem, um pro- motor spoVG mutante ou um promotor spoVG de consenso (Frisby e Zuber, 1991).

[00143] “Um promotor para direcionar a transcrição da sequência de polinucleotídeos que codifica uma xilanase ou um POI é um promotor ribossômico, tal como um promotor de RNA ribossômico ou um promo- tor de proteína ribossômico. O promotor de RNA ribossômico pode ser um promotor rrn derivado de B. subtilis, mais particularmente, o pro- motor rrn pode ser um promotor ribossômico rrnB, rrnl ou rrnE de B. subtilis. Em certas modalidades, o promotor de RNA ribossômico é um promotor P2 rrnl de B. subtilis apresentado na Publicação Internacio- nal PCT nº WO2013/086219.

[00144] Um vetor adequado pode compreender adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos habilitando o vetor a se replicar na célu- la hospedeira. Os exemplos de tais sequências habilitadoras são as origens de replicação de plasmídeos puC19, pACYC177, puB110, PE 194, pAMB, plJ702 e similares.

[00145] Um vetor adequado pode também compreender um marca- dor selecionável, por exemplo, um gene cujo produto complementa um defeito na célula hospedeira isolada, tal como os genes dal de B. subti- lis ou B. licheniformis; ou um gene que confere resistência a antibióti- cos, tal como, por exemplo, resistência à ampicilina, resistência à ca- namicina, resistência a cloranfenicol, resistência a tetraciclina e simila- res.

[00146] Um vetor de expressão adequado inclui tipicamente com- ponentes de um vetor de clonagem, tal como, por exemplo, um ele- mento que permite a replicação autônoma do vetor no organismo hos- pedeiro selecionado e um ou mais marcadores fenotipicamente detec- táveis para propósitos de seleção. Os vetores de expressão tipicamen- te compreendem também sequências de nucleotídeos de controle, tais como, por exemplo, promotor, operador, sítio de ligação a ribossoma, sinal de iniciação de tradução e, opcionalmente, um gene repressor, uma ou mais sequências de genes ativadores ou similares.

[00147] — Adicionalmente, um vetor de expressão adequado pode compreender adicionalmente uma sequência que codifica uma se- quência de aminoácidos com a capacidade para alvejar a proteína de interesse a uma organela de célula hospedeira, tal como um peroxis-

soma, ou a um compartimento de célula hospedeira particular. Tal se- quência de alvejamento pode ser, por exemplo, a sequência de ami- noácidos "SKL". Para a expressão sob a direção de sequências de controle, a sequência de ácidos nucleicos da proteína de interesse po- de ser ligada de maneira funcional às sequências de controle de uma maneira de modo que a expressão ocorra.

[00148] — Protocolos, tal como descrito no presente documento, usa- dos para ligar o construto de DNA que codifica uma proteína de inte- resse, promotores, terminadores e/ou outros elementos e inserir os mesmos em vetores adequados contendo as informações necessárias para replicação são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técni- ca.

[00149] “Uma célula isolada, que compreende um construto de poli- nucleotídeo ou um vetor de expressão, é vantajosamente usada como uma célula hospedeira na produção recombinante de um POLI. A célula pode ser transformada com o construto de DNA que codifica o POI, convenientemente integrando o construto (em uma ou mais cópias) no cromossomo hospedeiro. A integração é geralmente considerada uma vantagem, na medida em que a sequência de DNA assim introduzida é mais propensa a ser estavelmente mantida na célula. A integração dos construtos de DNA no cromossomo hospedeiro pode ser realizada aplicando-se métodos convencionais, por exemplo, por recombinação homóloga ou heteróloga. Por exemplo, a Publicação Internacional POT nº WO2002/14490 descreve os métodos da transformação de Bacillus, transformantes dos mesmos e bibliotecas dos mesmos. Alternativa- mente, a célula pode ser transformada com um vetor de expressão conforme descrito acima em conexão com os diferentes tipos de célu- las hospedeiras.

[00150] Algumas vezes, é vantajoso deletar genes dos hospedeiros de expressão, em que a deficiência de gene pode ser curada pelo ve-

tor de expressão. Os métodos conhecidos podem ser usados para ob- ter uma célula hospedeira bacteriana que têm um ou mais genes inati- vados. A inativação de gene pode ser realizada por deleção completa ou parcial, por inativação por inserção ou por qualquer outro meio que dê origem a um gene não funcional para seu propósito previsto de modo que o gene seja impedido de expressar uma proteína funcional.

[00151] As técnicas para a transformação de bactérias e cultivo das bactérias são padrão e bem conhecidas na arte. As mesmas podem ser usadas para transformar os hospedeiros aprimorados da presente invenção para a produção de proteínas recombinantes de interesse. À introdução de um construto ou vetor de DNA em uma célula hospedei- ra inclui técnicas, tais como transformação, eletroporação, microinje- ção nuclear, transdução, transfecção (por exemplo, lipofecção media- da e transfecção mediada por DEAE-Dextrina), incubação com precipi- tado de DNA de fosfato de cálcio, bombardeamento de velocidade alta com microprojéteis revestidos com DNA, transformação biobalística ou biolística e fusão de protoplasto e similares. Métodos de transformação e expressão para bactérias também são revelados em Brigidi et al. (1990).

[00152] Os métodos para transformar ácidos nucleicos em fungos filamentosos, tais como Aspergillus spp., por exemplo, A. oryzae ou A. niger, H grisea, H insolens e T. reesei., são bem conhecidos na técni- ca. Um procedimento adequado para a transformação de células hos- pedeiras de Aspergillus é descrito, por exemplo, no documento nº EP238023. Um procedimento adequado para transformação de células hospedeiras de Trichoderma é descrito, por exemplo, em Steiger et al 2011, Appl. Environ. Microbiol. TT:114 a 121.

[00153] A escolha de um hospedeiro de produção pode ser qual- quer micro-organismo adequado, tal como bactérias, fungos e algas.

[00154] Tipicamente, a escolha dependerá do gene que codifica a xilanase e sua fonte.

[00155] A introdução de um vetor ou construto de DNA em uma cé- lula hospedeira inclui técnicas, tais como transformação; eletropora- ção; microinjeção nuclear; transdução; transfecção, (por exemplo, lipo- fecção mediada e transfecção mediada por DEAE-Dextrina); incuba- ção com precipitado de DNA de fosfato de cálcio; bombardeamento de alta velocidade com microinjetáveis revestidos com DNA e fusão de protoplasto. Os textos básicos revelam métodos gerais que podem ser usados incluem Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Ma- nual (2a edição, 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A La- boratory Manual (1990); e Ausubel et a/l., eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)). Os métodos de transformação da presente invenção podem resultar na integração estável de todo ou parte do ve- tor de transformação no genoma de uma célula hospedeira, tal como uma célula hospedeira fúngica filamentosa. No entanto, também é contemplada transformação resultando na manutenção de um vetor de transformação extracromossômico autorreplicante.

[00156] Diversos métodos de transfecção padrão podem ser usa- dos para produzir linhagens de células bacterianas e fúngicas filamen- tosas (por exemplo, Aspergillus ou Trichoderma) que expressam gran- des quantidades da xilanase. Alguns dos métodos publicados para a introdução de construtos de DNA nas cepas de produção de celulase de Trichoderma incluem Lorito, Hayes, DiPietro e Harman, (1993) Curr. Genet. 24: 349 a 356; Goldman, VanMontagu e Herrera-Estrella, (1990) Curr. Genet. 17:169 a 174; e Penttila, Nevalainen, Ratto, Sal- minen e Knowles, (1987) Gene 6: 155 a 164, consultar também USP

6.022.725; USP 6.268.328 e Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homolo- gous and Heterologous Genes" em Molecular Industrial Mycology, Eds, Leong e Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) páginas 129 a 148; para

Aspergillus incluem Yelton, Hamer e Timberlake, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1,470 a 1,474, para Fusarium incluem Bajar, Podila e Kolattukudy, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8,202 a 8,212, para Streptomyces incluem Hopwood et a/., 1985, Genetic Manipula- tion of Streptomyces: Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, UK e Fernandez-Abalos et al., Microbiol 149:1,623 a 1,632 (2003) e para Bacillus incluem Brigidi, DeRossi, Bertarini, Riccardi e Matteuzzi, (1990) FEMS Microbiol. Lett. 55: 135 a 138).

[00157] Entretanto, pode ser usado qualquer um dos procedimentos bem conhecidos para introduzir sequências de nucleotídeos estranhas em células hospedeiras. Esses incluem o uso de transfecção com fos- fato de cálcio, polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, biolísti- ca, lipossomos, microinjeção, vetores plasmáticos, vetores virais e quaisquer dos outros métodos bem conhecidos de introdução de DNA genômico, cDNA, DNA sintético clonados ou outro material genético estranho em uma célula hospedeira (consultar, por exemplo, Sambro- ok et al., supra). Também é de uso o método de transfecção mediado por Agrobacterium descrito na Patente nº U.S. 6.255.115. Também é necessário que o procedimento de manipulação genética particular usado tenha capacidade para introduzir de modo bem-sucedido o pelo menos um gene na célula hospedeira com capacidade para expressar o gene.

[00158] Após o vetor de expressão ser introduzido nas células, as células transfectadas ou transformadas são cultivadas sob condições que favorecem a expressão de genes sob controle das sequências promotoras.

[00159] O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para cultivo da célula hospedeira e ob- tenção da expressão de um polipeptídeo que tem atividade de xila- nase. Mídias e componentes de mídia adequados estão disponíveis junto a fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com receitas publicadas (por exemplo, conforme descrito em catálogos da American Type Culture Collection).

[00160] Um polipeptídeo que tem atividade de xilanase secretado das células hospedeiras pode ser usado, com processamento pós- produção mínimo, como uma preparação de caldo inteiro.

[00161] “Dependendo da célula hospedeira usada, podem ser feitas modificações pós-transcricionais e/ou pós-traducionais. Um exemplo não limitante de uma modificação pós-transcricional e/ou pós- traducional é "recorte" ou "truncamento" de um polipeptídeo. Por exemplo, isso pode resultar em levar uma xilanase de um estado inati- vo ou substancialmente inativo para um estado ativo como no caso de um pró-peptídeo submetido a processamento pós-tradução adicional a um peptídeo maduro que tem a atividade enzimática. Em outro caso, esse recorte pode resultar em tomar um polipeptídeo de xilanase ma- duro e remover adicionalmente os aminoácidos N ou C-terminais para gerar formas truncadas da xilanase que retêm atividade enzimática.

[00162] Outros exemplos de modificações pós-transcricionais ou pós-translacionais incluem, porém sem limitação, miristoilação, glicosi- lação, truncação, lipidação e fosforilação de tirosina, serina ou treoni- na. A pessoa versada perceberá que o tipo de modificações pós- transcricionais ou pós-traducionais que uma proteína pode sofrer pode depender do organismo hospedeiro em que a proteína é expressa.

[00163] Em algumas modalidades, a preparação de um caldo de fermentação inteiro gasto de um micro-organismo recombinante pode ser alcançada com o uso de qualquer método de cultivo conhecido na técnica que resulta na expressão de uma xilanase, isto é, um polipep- tídeo que tem atividade de xilanase.

[00164] A fermentação pode, portanto, ser entendida como com- preendendo o cultivo em frasco de agitação, fermentação em pequena ou grande escala (incluindo as fermentações em batelada, em batela- da alimentada ou de estado sólido) em fermentadores industriais reali- zados em um meio adequado e sob condições que permitem que a xilanase seja expressa ou isolada. O termo "caldo de fermentação in- teiro gasto" é definido no presente documento como conteúdo não fra- cionado do material de fermentação que inclui o meio de cultura, prote- íÍnas extracelulares (por exemplo, enzimas) e biomassa celular. Enten- de-se que o termo "caldo de fermentação inteiro gasto" também abrange biomassa celular que foi lisada ou permeabilizada com o uso de métodos bem conhecidos na técnica.

[00165] Células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições adequadas que permitem a expressão de uma xilanase. A expressão das enzimas pode ser constitutiva de modo que as mesmas sejam continuamente produzidas ou induzíveis, exigindo um estímulo para iniciar a expressão. No caso da expressão induzível, a produção de proteína pode ser iniciada quando exigido, por exemplo, pela adição de uma substância indutora ao meio de cultura, por exemplo, dexame- tasona ou IPTG ou soforose.

[00166] Qualquer um dos métodos de fermentação bem conhecidos na técnica pode ser usado para fermentar a cepa fúngica transformada ou derivada conforme descrito acima. Em algumas modalidades, as células fúngicas são cultivadas sob condições de fermentação em ba- telada ou contínua.

[00167] Uma fermentação em batelada clássica é um sistema fe- chado, em que a composição do meio é estabelecida no início da fer- mentação, e a composição não é alterada durante a fermentação. No início da fermentação, o meio é inoculado com o organismo (ou orga- nismos) desejado. Em outras palavras, o processo de fermentação in- teiro ocorre sem a adição de quaisquer componentes ao sistema de fermentação inteiro.

[00168] Alternativamente, uma fermentação em batelada se qualifi- ca como uma "batelada" em relação à adição da fonte de carbono. Além disso, são feitas frequentemente tentativas de controlar fatores, tais como pH e concentração de oxigênio, por todo o processo de fer- mentação. Tipicamente, o metabólito e as composições de biomassa do sistema de batelada mudam constantemente até ao momento em que a fermentação é interrompida. Dentro das culturas de batelada, as células progridem através de uma fase de latência estática até uma fase logarítmica de crescimento alto e finalmente até uma fase estaci- onária, em que a taxa de crescimento é diminuída ou retida. Se fos- sem deixadas não tratadas, as células na fase estacionária eventual- mente morreriam. Em geral, as células na fase logarítmica são res- ponsáveis pelo volume de produção de produto. Uma variação ade- quada no sistema de batelada padrão é o sistema de "fermentação em batelada alimentada". Nessa variação de um sistema de batelada típi- co, o substrato é adicionado em incrementos conforme a fermentação progride. Os sistemas de batelada alimentada são úteis quando se sa- be que a repressão de catabólito inibiria o metabolismo das células, e/ou em que é desejável ter quantidades limitadas de substratos no meio de fermentação. A medição da concentração de substrato atual em sistemas de batelada alimentada é difícil e, portanto, estimada com base nas mudanças de fatores mensuráveis, tal como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de gases residuais, tais como CO>. As fermentações em batelada e batelada alimentada são bem conhecidas na técnica.

[00169] Fermentação contínua é outro método conhecido de fer- mentação. A mesma é um sistema aberto em que um meio de fermen- tação definido é adicionado a um biorreator, e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para o processamen- to. A fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma densidade constante, em que as células são mantidas principalmente em crescimento de fase logarítmica. A fermentação contínua permite a modulação de um ou mais fatores que afetam o crescimento celular e/ou concentração de produto. Por exemplo, um nutriente limitante, tal como a fonte de carbono ou fonte de nitrogênio, por ser mantido em uma taxa fixa, e a todos os outros parâmetros é permitida moderação. Em outros sistemas, inúmeros fatores que afetam o crescimento po- dem ser alterados continuamente, embora a concentração celular, medida por turvação de mídia, seja mantida constante. Os sistemas contínuos se esforçam para manter condições de crescimento de es- tado estável. Portanto, a perda celular devido ao meio que é extraído deve ser equilibrada em relação à taxa de crescimento celular na fer- mentação. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de cresci- mento para processos de fermentação contínua, assim como técnicas para maximizar a taxa de formação de produto, são bem conhecidos na técnica de microbiologia industrial.

[00170] As técnicas de separação e concentração são conhecidas na técnica, e métodos convencionais podem ser usados para preparar um caldo ou solução concentrada que compreende um polipeptídeo de xilanase da invenção.

[00171] Após a fermentação, um caldo de fermentação é obtido, as células microbianas e vários sólidos suspensos, incluindo os materiais de fermentação brutos residuais, são removidos por técnicas de sepa- ração convencionais a fim de obter uma solução de xilanase. Filtração, centrifugação, microfiltração, filtração em tambor giratório a vácuo, ul- trafiltração, centrifugação seguida por ultrafiltração, extração ou cro- matografia ou similares são geralmente usadas.

[00172] Algumas vezes pode ser desejável concentrar uma solução ou caldo que compreende um polipeptídeo de xilanase para otimizar a recuperação. O uso de caldo ou soluções não concentradas aumenta-

ria tipicamente o tempo de incubação a fim de coletar o precipitado de enzima enriquecido ou purificado.

[00173] A solução contendo enzima pode ser concentrada com o uso de técnicas de concentração convencionais até o nível de enzima desejado ser obtido. A concentração da solução contendo enzima po- de ser alcançada por qualquer uma das técnicas discutidas no presen- te documento. Os exemplos de métodos de enriquecimento e purifica- ção incluem, porém sem limitação, filtragem a vácuo giratória e/ou ul- trafiltração.

[00174] A solução ou caldo que contém xilanase pode ser concen- trada até o momento em que a atividade de enzima da solução ou cal- do que contém polipeptídeo de xilanase concentrado estar em um ní- vel desejado.

[00175] A concentração pode ser realizada com o uso, por exemplo, de um agente de precipitação, tal como um agente de precipitação de haleto de metal. Os agentes de precipitação de haleto de metal inclu- em, porém sem limitação, cloretos metálicos alcalinos, brometos metá- licos alcalinos e mesclas de dois ou mais desses haletos de metal.

[00176] Os haletos de metal exemplificativos incluem cloreto de só- dio, cloreto de potássio, brometo de sódio, brometo de potássio e mesclas de dois ou mais desses haletos de metal. O agente de preci- pitação de haleto de metal, cloreto de sódio, pode ser também usado como um conservante. Para recuperação de escala de produção, poli- peptídeos de xilanase podem ser enriquecidos ou parcialmente purifi- cados conforme geralmente descrito acima removendo-se células por meio da floculação com polímeros. Alternativamente, a enzima pode ser enriquecida ou purificada por microfiltração seguida por concentra- ção por ultrafiltração usando membranas e equipamentos disponíveis. Entretanto, para algumas aplicações, a enzima não precisa ser enri- quecida ou purificada, e a cultura de caldo inteira pode ser lisada e usada sem tratamento adicional. A enzima pode, então, ser processa- da, por exemplo, em grânulos.

[00177] As xilanases podem ser isoladas ou purificadas em uma variedade de formas conhecidas por aqueles indivíduos versados na técnica dependendo de quais outros componentes estão presentes na amostra. Métodos de purificação padrões incluem, mas sem limitação, cromatografia (por exemplo, troca de íons, afinidade, hidrofóbico, cro- matofocalização, exclusão imunológica e de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solu- bilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), microfiltração de extração, separação de duas fases. Por exemplo, a proteína de interesse pode ser purificada com o uso de uma antiprote- Ína padrão de coluna de anticorpo de interesse. As técnicas de ultrafil- tração e diafiltração, em combinação com a concentração de proteína, também são úteis. Para orientação geral em técnicas de purificação adequadas, consultar Scopes, Protein Purification (1982). O grau de purificação necessário variará dependendo do uso da proteína de inte- resse. Em alguns casos, nenhuma purificação será necessária.

[90178] — Ensaios para detectar e medir a atividade enzimática de uma enzima, tal como um polipeptídeo de xilanase, são bem conheci- dos. Vários ensaios para detectar e medir a atividade de xilanase tam- bém são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00179] A atividade de xilanase pode ser determinada com o uso de 4-O-Metil-D-glucurono-D-xilano solúvel tingido com azul brilhante de Remazol R (RBB-Xilano) como substrato. Após a precipitação de RBB- Xilano de alto peso molecular não degradado, a absorbância do so- brenadante é proporcional à produção de fragmentos de baixo peso molecular por tratamento enzimático. Outro método para medir a ativi- dade de xilanase é medir sua capacidade para degradar os arabinoxi- lanos não extraíveis por água (WU-AX) em DDGS de milho ou farelo de arroz. Por exemplo, uma solução de substrato 5% ou 10% de DDGS de milho ou farelo de arroz, triturado até um tamanho de partí- cula <212 um e hidratado em tampão até o pH desejado, tal como pH 6, pode ser usada. Após a incubação com a enzima xilanase, a quan- tidade total de unidades de açúcar C5 na solução pode ser medida como equivalentes de xilose pelo método de Douglas com o uso de um aparelho de injeção de fluxo contínuo, tal como um da SKALAR Analytical, conforme descrito por Rouau X & Surget A (1994). A com- binação de calor e baixo pH levará a uma decomposição de arabinoxi- lano nos monoaçúcares de pentose, arabinose e xilose, que desidrata- rão adicionalmente em furfural. Pela reação com floroglucinol, um complexo colorido é formado. Medindo-se a absorbância a 550 nm com 510 nm como os comprimentos de onda de referência, a concen- tração de monoaçúcares de pentose na solução pode ser medida co- mo equivalentes de xilose com o uso de uma curva padrão de xilose. O arabinoxilano extraído pode ser determinado como a massa dos equivalentes de xilose hidratados por massa de substrato. Os resulta- dos são relatados como o aumento em arabinoxilano extraível calcula- do como a diferença entre o arabinoxilano extraído para a amostra tra- tada com enzima xilanase e para a amostra virgem.

[00180] Em uma modalidade, é revelado um aditivo para alimento de animal que compreende milho ou arroz, em que o aditivo de alimen- to compreende pelo menos uma enzima que tem atividade glucurono- xilanase e pelo menos uma enzima que tem atividade endo-beta-1,4- xilanase, em que a degradação de glucuro-noxilano insolúvel é maior do que se qualquer uma das enzimas fosse usada sozinha.

[00181] A xilanase com atividade de glucuronoxilanase é derivada de Bacillus ou Paenibacillus sp. Essa xilanase é atualmente identifica- da como um membro da família GH30.

[00182] A xilanase que tem atividade de endo-beta-1,4-xilanase é derivada de Fusarium sp. Essa xilanase é atualmente identificada co- mo um membro da família GH10.

[00183] Em outramodalidade, pelo menos uma das xilanases reve- ladas no presente documento pode ser recombinantemente produzida conforme discutido acima.

[00184] Em ainda outra modalidade, é revelado um aditivo de ali- mento que compreende pelo menos uma enzima com atividade de glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima que tem atividade de en- do-beta-1,4-xilanase, em que a dita combinação é melhor no estímulo do crescimento de bactérias benéficas em um trato digestivo de um animal monogástrico alimentado com uma dieta à base de milho quando comparado com o uso da xilanase que tem atividade endo- beta-1,4-xilanase sozinha.

[00185] A flora do intestino, microbiota do intestino ou microbiota gastrointestinal é a comunidade complexa de micro-organismos que vivem nos tratos digestivos de seres humanos e outros animais. A re- lação entre alguns animais e flora do intestino não é apenas comensal (isto é, uma coexistência não nociva), mas, em vez disso, uma relação mutualística. Alguns micro-organismos do intestino animal beneficiam o animal fermentando a fibra dietária em ácidos graxos de cadeia cur- ta, tais como ácido acético, ácido propiônico e/ou ácido butírico que são, então, absorvidos pelo animal.

[00186] Em outro aspecto, é revelado um aditivo de alimento que compreende pelo menos uma enzima com atividade de glucuronoxila- nase e pelo menos uma enzima que tem atividade de endo-beta-1,4- xilanase, em que a combinação é capaz de aumentar a produção de pelo menos um ácido graxo de cadeia curta em um animal monogás- trico alimentado com uma dieta à base de milho em comparação com o uso da xilanase que tem atividade endo-beta-1,4-xilanase sozinha.

[00187] O ácido graxo de cadeia curta é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido acético, ácido propiônico ou ácido butíri- Co.

[00188] Em ainda outro aspecto, qualquer um dos aditivos de ali- mento descritos no presente documento pode compreender adicional- mente uma ou mais enzimas selecionadas dentre, porém sem limita- ção, enzimas tais como amilase, protease, endo-glucanase, celulase, fitase, etc.

[00189] “Qualquer uma dessas enzimas pode ser usada em uma quantidade que varia de 0,1 a 500 microgramas/g de alimento ou gê- nero alimentício.

[00190] Amilases, tais como alfa-amilases (alfa-1,4-glucano-4-glu- cano-hidrolase, EC 3.2.1.1.), hidrolisam ligações de alfa-1,4-glícosídi- cas internas em amido, amplamente e aleatoriamente para produzir dextranos de peso molecular menor. Esses polipeptídeos são usados, inter alia, no processamento de amido e na produção de álcool. Quaisquer alfa-amilases podem ser usadas, por exemplo, aquelas descritas na Patente número U.S. 8.927.250 e 7.354.752.

[00191] Fitase refere-se a uma proteína ou polipeptídeo que tem capacidade para catalisar a hidrólise de fitato para (1) mio-inositol e/ou (2) mono-, di-, tri-, tetra- e/ou penta-fosfatos do mesmo e (3) fosfato inorgânico. Por exemplo, enzimas que têm atividade catalítica confor- me definido na Comissão de Enzima EC número 3.1.3.8 ou EC núme- ro 3.1.3.26. Qualquer fitase pode ser usada, tal como descrito nas Pa- tentes número U.S. 8.144.046, 8.673.609 e 8.053.221.

[00192] “Glucanases são enzimas que quebram glucano, um polis- sacarídeo produzido a partir de diversas subunidades de glicose. Na medida em que realizam hidrólise da ligação glicosídica, as mesmas são hidrolases. Enzimas beta-glucanase (EC 3.2.1.4) digerem fibra. Isso ajuda na quebra de paredes de planta (celulose).

[00193] Celulases são qualquer uma das diversas enzimas produzi-

das por fungos, bactérias e protozoários que catalisam celulólise, a decomposição de celulose e de alguns polissacarídeos relacionados. O nome também é usado para qualquer mistura de ocorrência natural ou complexo de várias de tais enzimas que atuam em série ou sinergi- camente para decompor material celulósico. Quaisquer celulases po- dem ser usadas que sejam adequadas para alimento de animal.

[00194] Uma "protease" é qualquer domínio de proteína ou polipep- tídeo derivado de um micro-organismo, por exemplo, um fungo, bacté- ria ou de uma planta ou animal e que tem a capacidade de catalisar a clivagem de ligações de peptídeo em uma ou mais de várias posições de uma cadeia principal de proteína (por exemplo, E.C. 3,4). Os ter- mos "protease", "peptidase" e "proteinase" podem ser usados de modo intercambiável. As proteases podem ser encontradas em animais, plantas, fungos, bactérias, archaea e vírus. A proteólise pode ser atin- gida por enzimas atualmente classificadas em seus grupos amplos: aspartil proteases, cisteína proteases, serina proteases, treonina pro- teases, proteases glutâmicas e metaloproteases. Qualquer protease pode ser usada que seja adequada para alimento de animal.

[00195] Em ainda outro aspecto, o aditivo de alimento pode com- preender pelo menos um DFM ou sozinho ou em combinação com pe- lo menos uma outra enzima conforme descrito acima.

[00196] Pelomenos um DFM pode compreender pelo menos um micro-organismo viável, tal como uma cepa bacteriana viável ou uma levedura viável ou um fungo viável. Preferencialmente, o DFM com- preende pelo menos uma bactéria viável.

[00197] É possível que o DFM possa ser uma cepa bacteriana de formação de esporo e, portanto, o termo DFM pode ser compreendido por ou conter esporos, por exemplo, esporos bacterianos. Assim, o termo "micro-organismo viável" conforme usado no presente documen- to pode incluir esporos microbianos, tais como endósporos ou conídia.

Alternativamente, o DFM na composição de aditivo de alimento descri- ta no presente documento pode não compreender ou pode não conter esporos microbianos, por exemplo, endósporos ou conídia.

[00198] O microrganismo pode ser um micro-organismo de ocor- rência natural ou pode ser um micro-organismo transformado.

[00199] Um DFM conforme descrito no presente documento pode compreender micro-organismos de um ou mais dentre os seguintes gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pedio- coccus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacte- rium, Bifidobacterium, Clostridium e Megasphaera e suas combina- ções.

[00200] —Preferencialmente, o DEM compreende uma ou mais cepas bacterianas selecionadas a partir das seguintes Bacillus spp: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilis e Bacillus amyloliquefaciens.

[00201] O gênero "Bacillus", conforme usado no presente documen- to, inclui todas as espécies do gênero "Bacillus", conforme conhecido por aqueles versados na técnica, incluindo, porém sem limitação, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. mega- terium, B. coagulans, B. circulans, B. gibsonii, B. pumilis e B. thurin- giensis. É reconhecido que o gênero Bacillus continua a ser submetido a reorganização taxonômica. Portanto, pretende-se que o gênero in- clua espécies que foram reclassificadas, o que inclui, porém sem limi- tação, tais organismos como Bacillus stearothermophilus, que é agora denominado "Geobacillus stearothermophilus", ou Bacillus polymyxa, que agora é "Paenibacillus polymyxa". A produção de endósporos re- sistentes sob condições ambientais de estresse é considerada o re- curso de definição do gênero Bacillus, embora essa característica também se aplique aos recentemente denominados Alicyclobacillus,

Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobaci- Ilus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermo- bacillus, Ureibacillus, e Virgibacillus.

[00202] Em outro aspecto, o DFM pode ser adicionalmente combi- nado com as seguintes Lactococcus spp.: Lactococcus cremoris e Lac- tococcus lactis e combinações das mesmas.

[00203] O DFM pode ser adicionalmente combinado com as seguin- tes Lactobacillus spp: Lactobacillus buchneri, Lactobacillus acidophi- lus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus bifidus, Lac- tobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus cur- vatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus reu- teri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbreuckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Lac- tobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii e Lactobacillus jensenii e combinações de qualquer uma das mesmas.

[00204] Em ainda outro aspecto, o DFM pode ser adicionalmente combinado com as seguintes Bifidobacteria spp: Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium ani- malis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium adolescentis, e Bifidobacterium angulatum e combinações de qualquer uma das mesmas.

[00205] “Podem ser mencionadas bactérias das seguintes espécies: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Ba- cillus pumilis, Enterococcus , Enterococcus spp, e Pediococcus Spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pe- diococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Ba- cillus subtilis, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminis, Lac-

tobacillus rhamnosus, Megasphaera elsdenii, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. Salivarius, Propionibacteria sp e combinações das mesmas.

[00206] Um microbiano diretamente alimentado descrito no presen- te documento que compreende uma ou mais cepas bacterianas pode ser do mesmo tipo (gênero, espécie e cepa) ou pode compreender uma mistura de gêneros, espécies e/ou cepas.

[00207] —Alternativamente, um DFM pode ser combinado com um ou mais dos produtos ou dos micro-organismos contidos naqueles produ- tos revelados no documento nº WO2012110778 e resumidos na se- guinte forma: Bacillus subtilis cepa 2084 Número de Acesso NRRI B- 50013, Bacillus subtilis cepa LSSAO1 Número de Acesso NRRL B- 50104 e Bacillus subtilis cepa 15A-P4 ATCC Número de Acesso PTA- 6507 (a partir de Enviva Pro€. anteriormente conhecido como Avi- corrO); Bacillus subtilis Strain C3102 (a partir de Calsporin&); Bacillus subtilis Cepa PB6 (a partir de Clostat&); Bacillus pumilis (8G-134); En- terococcus NCIMB 10415 (SF68) (a partir de Cylactin&O); Bacillus subti- lis Cepa C3102 (a partir de Gallipro& & GalliproMaxO); Bacillus licheni- formis (a partir de Gallipro&TectO); Enterococcus e Pediococcus (a partir de Poultry star&); Lactobacillus, Bifidobacterium e/ou Enterococ- cus a partir de Protexin&); Bacillus subtilis cepa OST 713 (a partir de Proflora&); Bacillus amyloliquefaciens CECT-5940 (a partir de Ecobi- ol& & EcobiolO& Plus); Enterococcus faecium SF68 (a partir de Fortiflo- raO); Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis (a partir de BioPlus2B0); Bactéria formadora de ácido láctico 7 Enterococcus faecium (a partir de LactifermO); cepa de Bacillus (a partir de CSIGO); Saccharomyces cerevisiae (a partir de Yea-SaccO); Enterococcus (a partir de Biomin IMB520); Pediococcus acidilactici, Enterococcus, Bifidobacterium ani- malis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp.

salivarius (a partir de Biomin C50); Lactobacillus farciminis (a partir de BiactonO); Enterococcus (a partir de Oralin E17070); Enterococcecus (2 cepas), Lactococcus lactis DSM 1103(a partir de Probios-pioneer PDFMO); Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus farciminis (a partir de SorbifloreG&); Bacillus subtilis (a partir de Animavit&); Enterococcus (a partir de Bonvital&O); Saccharomyces cerevisiae (a partir de Levucell SB 2080); Saccharomyces cerevisiae (a partir de Levucell SC 0 & SC1060 ME); Pediococcus acidilacti (a partir de Bactocell); Saccha- romyces cerevisiae (a partir de ActiSaf& (anteriormente BioSafO)); Saccharomyces cerevisiae NOYC Sc47 (a partir de Actisafê& SC47); Clostridium butyricum (a partir de Miya-Gold&); Enterococcus (a partir de Fecinor e Fecinor Plus8&); Saccharomyces cerevisiae NOCYC R-625 (a partir de InteSwineO); Saccharomyces cerevisia (a partir de BioS- print&); Enterococcus e Lactobacillus rhamnosus (a partir de Provita€); Bacillus subtilis e Aspergillus oryzae (a partir de PepSoyGen-CG8); Ba- cillus cereus (a partir de ToyocerinO); Bacillus cereus var. toyoi NCIMB 40112/CNCM 1-1012 (a partir de TOYOCERINGO) ou outros DFMs, tais como Bacillus licheniformis e Bacillus subtilis (a partir de BioPlus& YC) e Bacillus subtilis (a partir de GalliPro&).

[00208] O DFM pode ser combinado com Enviva& PRO que é co- mercialmente disponível a partir de Danisco A/S. Enviva ProO é uma combinação de Bacillus cepa 2084 Número de Acesso NRRI B-50013, Bacillus cepa LSSAO1 Número de Acesso NRRL B-50104 e Bacillus cepa 15A-P4 ATCC Número de Acesso PTA-6507 (conforme ensinado no documento número US 7.754.469 B — incorporado no presente do- cumento a título de referência).

[00209] “Também é possível combinar o DFM descrito no presente documento com uma levedura dos gêneros: Saccharomyces spp.

[00210] —Preferencialmente, o DFM descrito no presente documento compreende micro-organismos que são geralmente reconhecidos co-

mo seguros (GRAS) e são preferencialmente aprovados por GRAS.

[00211] Uma pessoa versada na técnica estará prontamente ciente de espécies e/ou cepas específicas de microrganismos dentro dos gê- neros descritos no presente documento que são usadas nas indústrias alimentar e/ou agrícola e que são geralmente consideradas adequadas para consumo animal.

[00212] Em algumas modalidades, é importante que o DFM seja tolerante ao calor, isto é, seja termotolerante. Isto é particularmente o caso quando o alimento é peletizado. Portanto, em outra modalidade, o DFM pode ser um micro-organismo termotolerante, tal como bacté- rias termotolerantes, que incluem, por exemplo, Bacillus spp.

[00213] Em outros aspectos, pode ser desejável que o DFM com- preenda uma bactéria de produção de esporo, como Bacilli, por exem- plo, Bacillus spp. Os Bacilli têm capacidade para formar endósporos estáveis quando as condições para o crescimento não são favoráveis e são muito resistentes ao calor, pH, umidade e desinfetantes.

[00214] O DFM descrito no presente documento pode diminuir ou impedir o estabelecimento intestinal de micro-organismos patogênicos (tais como Clostridium perfringens e/ou E. coli e/ou Salmonella spp e/ou Campylobacter spp.). Em outras palavras, o DFM pode ser anti- patogênico. O termo "antipatogênico", conforme usado no presente documento, significa que o DFM neutraliza um efeito (efeito negativo) de um patógeno.

[00215] Conforme descrito acima, o DFM pode ser qualquer DFM adequado. Por exemplo, o seguinte ensaio "ENSAIO DE DFM" pode ser usado para determinar a adequação de um micro-organismo para ser um DFM. O ensaio de DFM, conforme usado no presente docu- mento, é explicado em maiores detalhes no documento nº US2009/

0280090. Para evitar qualquer dúvida, o DFM selecionado como uma cepa inibitória (ou um DFM antipatogênico) de acordo com o "ENSAIO

DE DFM" mostrado no presente documento é um DFM adequado para o uso de acordo com a presente revelação, isto é, na composição de aditivo de alimento de acordo com a presente revelação.

[00216] Os tubos foram inoculados, cada um, com um patógeno representativo (por exemplo, bactérias) de um agrupamento represen- tativo.

[00217] O sobrenadante de um DFM potencial, desenvolvido de maneira aeróbica ou anaeróbica, é adicionado aos tubos inoculados (exceto para o controle a qual nenhum sobrenadante é adicionado) e incubados. Após incubação, a densidade óptica (OD) do controle e tu- bos tratados com sobrenadante foi medida para cada patógeno.

[00218] As colônias de cepas (DFM potencial) que produziram uma OD reduzida em comparação com o controle (que não continha qual- quer sobrenadante) podem ser, então, classificadas como uma cepa inibitória (ou um DFM antipatogênico). Dessa forma, o ensaio de DFM, conforme usado no presente documento, é explicado em maiores de- talhes no documento nº US2009/0280090.

[00219] De preferência, um patógeno representativo nesse ensaio de DFM pode ser um (ou mais) dentre os seguintes: Clostridium, como Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile, e/ou E. coli e/ou Sal- monella spp e/ou Campylobacter spp. Em uma modalidade preferenci- al, o ensaio é conduzido com um ou mais dentre Clostridium perfrin- gens elou Clostridium difficile e/ou E. coli, de preferência, Clostridium perfringens e/ou Clostridium difficile, mais preferencialmente, Clostri- dium perfringens.

[00220] —DFMs antipatogênicos incluem uma ou mais das seguintes bactérias e são descritos no documento número WO2013029013.: cepa de Bacillus subtilis 3BP5 nº de acesso NRRL B-50510, cepa de Bacillus amyloliquefaciens 918 ATCC de nº de acesso NRRL B-50508, e cepa de Bacillus amyloliquefaciens 1013 ATCC de nº de acesso NRRL B-50509.

[00221] Os DFMs podem ser preparados como cultura (ou culturas) e carreador (ou carreadores) (quando usados) e podem ser adiciona- dos a um misturador de fita ou pá e misturados durante cerca de 15 minutos, apesar de o tempo poder ser aumentado ou diminuído. Os componentes são misturados de modo que uma mistura uniforme das culturas e carreadores seja resultante. O produto final é preferencial- mente um pó fluxível seco. O DFM (ou DFMs) que compreende uma ou mais cepas bacterianas pode ser, então, adicionado ao alimento de animal ou uma pré-mistura de alimento, adicionado à água de um ani- mal ou administrado de outras formas conhecidas na técnica (de prefe- rência, simultaneamente com as enzimas descritas no presente docu- mento.

[00222] Inclusão das cepas individuais na mistura de DFM pode ser nas proporções que variam de 1% a 99% e, preferencialmente, de 25% a 715%

[00223] “Dosagens adequadas do DFM no alimento de animal po- dem variar de cerca de 1x10º CFU/g de alimento a cerca de 1x10º CFU/g de alimento, adequadamente entre cerca de 1x10º CFU/g de alimento e cerca de 1x10º CFU/g de alimento, adequadamente entre cerca de 7,5x10º CFU/g de alimento e cerca de 1x107 CFU/g de ali- mento.

[00224] Em um outro aspecto, o DFM pode ser dosado no gênero alimentício em mais que cerca de 1x10º CFU/g de alimento, adequa- damente, mais que cerca de 1x10º CFU/g de alimento, adequadamen- te, mais que cerca de 5x10º CFU/g de alimento ou, adequadamente, mais que cerca de 1x10º CFU/g de alimento.

[00225] O DFM pode ser dosado em uma composição de aditivo de alimento de cerca de 1x10º CFU/g de composição a cerca de 1x10'?

CFU/g de composição, de preferência, 1x10º CFU/g de composição a cerca de 1x10º*? CFU/g de composição, com mais preferência, entre cerca de 1x10º CFU/g de composição e cerca de 1x10*? CFU/g de composição e, com máxima preferência, entre cerca de 3,75x107 CFU/g de composição e cerca de 1x10** CFU/g de composição. Em um outro aspecto, o DFM pode ser dosado em uma composição de aditivo de alimento em mais que cerca de 1x105º CFU/g de composi- ção, de preferência, mais que cerca de 1x10º CFU/g de composição e, com máxima preferência, mais que cerca de 3,75x10” CFU/g de com- posição. Em uma modalidade, o DFM é dosado na composição de adi- tivo de alimento em mais que cerca de 2x10º CFU/g de composição, adequadamente mais que cerca de 2x10º CFU/g de composição, ade- quadamente mais que cerca de 3,75x10” CFU/g de composição.

[00226] “Qualquer um dos aditivos de alimento descrito no presente documento pode também compreender adicionalmente à glucuronoxi- lanases de GH30 e xilanases de GH10 descritas no presente docu- mento, usadas isoladamente ou (a) em combinação com pelo menos um micro-organismo de alimentação direta ou (b) em combinação com pelo menos uma outra enzima ou (c) em combinação com pelo menos um micro-organismo de alimentação direta e pelo menos uma outra enzima, e (d) pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbi- tol, glicerol, propilenoglicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potás- sio, formato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, clo- reto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissul- feto de sódio, metil parabeno e propil parabeno.

[00227] Em ainda um outro aspecto, é revelada uma composição de aditivo de alimento granulada para uso no alimento de animal que compreende pelo menos um polipeptídeo que tem atividade de xila- nase, conforme descrito no presente documento, usado isoladamente ou em combinação com pelo menos um microbiano diretamente ali- mentado ou em combinação com pelo menos uma outra enzima ou em combinação com pelo menos um microbiano diretamente alimentado e pelo menos uma outra enzima, em que a composição de aditivo de alimento granulada compreende partículas produzidas por um proces- so selecionado dentre o grupo que consiste em granulação de alto ci- salhamento, granulação em tambor, extrusão, esferonização, aglome- ração de leito fluidizado, revestimento por aspersão de leito fluidizado, secagem por aspersão, secagem por congelamento, compressão, res- friamento por aspersão, atomização por disco giratório, coacervação, preparação de comprimidos ou quaisquer combinação dos processos acima.

[00228] Além disso, as partículas da composição de aditivo de ali- mento granulada podem ter um diâmetro médio maior do que 50 míi- crons e menor do que 2,000 mícrons

[00229] A composição de aditivo de alimento pode ser uma forma líquida, e a forma líquida pode também ser adequada para secagem por aspersão em um pélete de alimento.

[00230] Os alimentos de animal podem incluir material vegetal, tal como milho, trigo, sorgo, soja, canola, girassol ou misturas de qualquer um desses materiais vegetais ou fontes de proteína vegetais para aves, porcos, ruminantes, aquicultura e animais de estimação. Os ali- mentos de animal de interesse no presente documento são alimentos de animal à base de cereal que compreendem milho ou arroz. É con- templado que os parâmetros de desempenho do animal, tais como crescimento, ingesta de alimento e eficácia de alimento, mas também uniformidade aprimorada, concentração de amônia reduzida no aloja-

mento de animais e, consequentemente, bem-estar e situação de saú- de dos animais aprimorados, serão melhorados. Mais especificamente, conforme usado no presente documento, o "desempenho do animal" pode ser determinado pela eficácia de alimento e/ou ganho de peso do animal e/ou pela razão de conversão de alimento e/ou pela digestibili- dade de um nutriente em uma alimento (por exemplo, digestibilidade de aminoácidos) e/ou energia digestível ou energia metabolizável em uma alimento e/ou por retenção de nitrogênio e/ou pela capacidade de um animal de evitar os efeitos negativos da enterite necrótica e/ou pela resposta imunológica do sujeito.

[00231] — Preferencialmente, o "desempenho do animal" é determi- nado por eficiência de alimento e/ou ganho de peso do animal e/ou pela razão de conversão de alimento.

[00232] Por "desempenho aprimorado do animal" entende-se que há eficiência de alimento aumentada e/ou ganho de peso aumentado e/ou razão de conversão de alimento reduzida e/ou digestibilidade me- lhorada de nutrientes ou energia em um alimento e/ou por retenção de nitrogênio melhorada e/ou por habilidade aprimorada para evitar os efeitos negativos de enterite necrótica e/ou por uma resposta imunoló- gica melhorada no assunto resultante do uso de composição de aditivo de alimento da presente invenção no alimento em comparação com o alimento que não compreende a dita composição de aditivo de alimen- to.

[00233] Preferencialmente, por "desempenho aprimorado do ani- mal", se entende que existe uma eficácia de alimento aumentada e/ou ganho de peso aumentado e/ou razão de conversão de alimento redu- zida. Conforme usado no presente documento, o termo "eficácia de alimento" refere-se à quantidade de ganho de peso em um animal que ocorre quando o animal é alimentado à vontade ou uma quantidade especificada de alimento durante um período de tempo.

[00234] Por"eficácia aumentada de alimento" se entende que o uso de uma composição de aditivo de alimento de acordo com a presente invenção em alimento resulta em um ganho de peso aumentado por unidade de ingestão de alimento em comparação com um animal ali- mentado sem a dita composição de aditivo de alimento estar presente.

[00235] Conforme usado no presente documento, o termo "razão de conversão de alimento" refere-se à quantidade de alimento fornecida a um animal para aumentar o peso do animal em uma quantidade espe- cificada.

[00236] Uma razão de conversão de alimento aprimorada significa uma razão de conversão de alimento mais baixa.

[00237] —Por"razão de conversão de alimento mais baixa" ou "razão de conversão de alimento aprimorada" se entende que o uso de uma composição de aditivo de alimento em alimentação resulta em uma quantidade de alimento mais baixa que é necessária para ser alimen- tada a um animal para aumentar o peso do animal por uma quantidade especificada em comparação com a quantidade de alimento necessá- ria para aumentar o peso do animal pela mesma quantidade quando o alimento não compreende a dita composição de aditivo de alimento.

[00238] A digestibilidade de nutrientes conforme usado no presente documento significa a fração de um nutriente que desaparece do trato gastrointestinal ou um segmento especificado do trato gastrointestinal, por exemplo, o intestino delgado. A digestibilidade de nutrientes pode ser medida como a diferença entre o que é administrado ao indivíduo e o que sai nas fezes do indivíduo, ou entre o que é administrado ao in- divíduo e o que permanece no digerido em um segmento especificado do trato gastrointestinal, por exemplo, o íleo.

[00239] A digestibilidade de nutrientes conforme usado no presente documento pode ser medida pela diferença entre a ingestão de um nutriente e o nutriente excretado por meio da coleta total de excreções durante um período de tempo; ou com o uso de um marcador inerte que não seja absorvido pelo animal, e permite que o investigador cal- cule a quantidade de nutriente que desapareceu no trato gastrointesti- nal inteiro ou um segmento do trato gastrointestinal. Um tal marcador inerte pode ser dióxido de titânio, óxido crômico ou cinza insolúvel em ácido. A digestibilidade pode ser expressa como uma percentagem do nutriente no alimento, ou como unidades de massa de nutriente diges- tível por unidades de massa no alimento.

[00240] A digestibilidade de nutrientes, conforme usado no presente documento, abrange a digestibilidade de amido, digestibilidade de gor- dura, digestibilidade de proteína e digestibilidade de aminoácidos.

[00241] Digestibilidade de energia conforme usado no presente do- cumento significa a energia bruta do alimento consumido menos a energia bruta das fezes ou a energia bruta do alimento consumido menos a energia bruta da digestão remanescente em um segmento especificado do trato gastrointestinal do animal, por exemplo, o íleo. Energia metabolizável, conforme usado no presente documento, refe- re-se à energia metabolizável aparente e significa a energia bruta da alimentação consumida menos a energia bruta contida nas fezes, uri- na e produtos gasosos da digestão. A digestibilidade de energia e a energia metabolizável podem ser medidas como a diferença entre a ingestão de energia bruta e a energia bruta excretada nas fezes ou no digerido presente em segmento especificado do trato gastrointestinal com o uso dos mesmos métodos para medir a digestibilidade de nutri- entes, com correções apropriadas para excreção de nitrogênio para se calcular a energia metabolizável do alimento.

[00242] Em algumas modalidades, as composições descritas no presente documento podem aprimorar a digestibilidade ou utilização de hemicelulose dietética ou fibra em um indivíduo. Em algumas mo- dalidades, o sujeito é um porco.

[00243] “Retenção de nitrogênio como usada aqui significa a capaci- dade de um sujeito de reter nitrogênio a partir da dieta como massa corporal. Ocorre um equilíbrio de nitrogênio negativo quando a excre- ção de nitrogênio excede a ingestão diária e é frequentemente visto quando o músculo está sendo perdido. Um equilíbrio de nitrogênio po- sitivo está frequentemente associado ao crescimento dos músculos, particularmente, em animais em crescimento.

[00244] A retenção de nitrogênio pode ser medida como a diferença entre a absorção de nitrogênio e o nitrogênio excretado por meio da coleta total de excreta e urina durante um período de tempo. É enten- dido que o nitrogênio excretado inclui proteína não digerida do alimen- to, secreções proteicas endógenas, proteína microbiana e nitrogênio urinário.

[00245] O termo sobrevivência conforme usado no presente docu- mento significa o número de sujeitos ainda vivos. O termo "sobrevi- vência aprimorada" pode ser uma outra maneira de dizer "mortalidade reduzida”.

[00246] O termo rendimento da carcaça conforme usado no presen- te documento significa a quantidade de carcaça como uma proporção do peso corporal vivo, após um processo de abate comercial ou expe- rimental. O termo carcaça significa o corpo de um animal que foi abati- do para alimento, com a cabeça, entranhas, parte dos membros e pe- nas ou pele removidos. O termo rendimento da carne conforme usado no presente documento significa a quantidade de carne comestível como uma porção do peso corporal vivo ou a quantidade de uma car- ne especificada cortada como uma proporção do peso corporal vivo.

[00247] Um "ganho de peso aumentado" refere-se a um animal que tem peso corporal aumentado no alimento ao ser alimentado com ali- mento que compreende uma composição de aditivo de alimento em comparação com um animal que é alimentado com um alimento sem uma dita composição de aditivo de alimento estar presente.

[00248] No presente contexto, pretende-se que o termo "alimento de animal de estimação" seja entendido como significando um alimen- to para um animal doméstico, tal como, porém sem limitação, cachor- ros, gatos, gerbos, hamsters, chinchilas, ratos extravagantes, porqui- nhos da índia; aves de estimação, tais como canários, periquitos e pa- pagaios; répteis de estimação, como tartarugas, lagartos e cobras; e animais de estimação aquáticos, tais como peixe tropical e sapos.

[00249] Em outra modalidade, é revelado um alimento de animal à base de milho que compreende pelo menos uma enzima GH30 com atividade de glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima GH10 que tem atividade de endo-beta-1,4-xilanase, em que a combinação é me- lhor no estímulo do crescimento de bactérias benéficas em um trato digestivo de um animal monogástrico quando comparado com o uso da xilanase de GH10 sozinha.

[00250] É também revelado um alimento de animal à base de milho que compreende pelo menos uma enzima GH30 com atividade de glu- curonoxilanase e pelo menos uma enzima GH10 que tem atividade de endo-beta-1,4-xilanase, em que a dita combinação é capaz de aumen- tar a produção de pelo menos um ácido graxo de cadeia curta em um animal monogástrico em comparação com o uso da GH10 sozinha.

[00251] O ácido graxo de cadeia curta pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em ácido acético, ácido propiônico e ácido butí- rico.

[00252] Esse alimento de animal pode compreender adicionalmente pelo menos um DFM ou pelo menos uma outra enzima ou uma combi- nação de tanto pelo menos um DFM quanto uma ou mais outras enzi- mas conforme já foi descrito no presente documento.

[00253] Os termos "composição de alimento de animal", "alimento", "gênero alimentício" e "forragem" são usados de modo intercambiável e podem compreender um ou mais materiais alimentícios selecionados a partir do grupo que compreende a) cereais, como pequenos grãos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias e combinações dos mes- mos) e/ou grãos grandes como maís ou sorgo; b) subprodutos de ce- reais, como farinha de milho com glúten, Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS) (particularmente Grãos Secos de Destilaria com Solúveis à base de milho (cDDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, fa- relo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos; c) proteína obtida a partir de fontes como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, fava, algo- dão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seca, farinha de car- ne e ossos, proteína da batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gordu- ras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; e/ou e) minerais e vitaminas.

[00254] O termo "cereal" é usado para descrever qualquer grama cultivada para os componentes comestíveis de seu grão (botanica- mente, um tipo de fruta chamado cariopse), composto do endosperma, germe e farelo. Os grãos de cereal, tais como milho e arroz, são culti- vados em maiores quantidades e fornecem mais energia em todo o mundo do que qualquer outro tipo de cultura e são, portanto, culturas básicas.

[00255] Os termos "aditivo de alimento", "composição de aditivo de alimento" e "composição de enzima" são usados de modo intercambi- ável no presente documento.

[00256] O alimento pode estar na forma de uma solução ou como um sólido ou como um semissólido dependendo do uso e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.

[00257] “Quando usada como, ou na preparação de, um alimento, tal como alimento funcional, a enzima ou composição de aditivo de ali- mento descrita no presente documento pode ser usada em conjunção com um ou mais dentre: um carreador nutricionalmente aceitável, um diluente nutricionalmente aceitável, um excipiente nutricionalmente aceitável, um adjuvante nutricionalmente aceitável, um ingrediente nu- tricionalmente ativo. Por exemplo, pode ser mencionado pelo menos um componente selecionado dentre o grupo que consiste em uma pro- teína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propilenoglicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de po- tássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formato de potássio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfeto de sódio, metil para- beno e propil parabeno.

[00258] Em outro aspecto, o aditivo de alimento revelado no pre- sente documento é misturado por adição com um componente de ali- mento para formar um gênero alimentício. O termo "componente de alimento" conforme usado no presente documento significa todo o ou parte do gênero alimentício. Parte do gênero alimentício pode signifi- car um constituinte do gênero alimentício ou mais do que um consti- tuinte do gênero alimentício, por exemplo, 2 ou 3 ou 4. Em uma moda- lidade, o termo "componente de alimento" abrange uma pré-mistura ou constituintes de pré-mistura. Preferencialmente, o alimento pode ser uma forragem, ou uma pré-mistura da mesma, um alimento de com- posto, ou uma pré-mistura do mesmo. Uma composição de aditivo de alimento pode ser misturada por adição com um alimento de compos- to, um componente de alimento de composto ou a uma pré-mistura de um alimento de composto ou a uma forragem, um componente de for- ragem ou uma pré-mistura de uma forragem.

[00259] “Qualquer gênero alimentício descrito no presente documen- to pode compreender um ou mais materiais alimentícios selecionados a partir do grupo que compreende a) cereais, tais como pequenos grãos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias, triticale e combina- ções dos mesmos) e/ou grãos grandes como maís ou sorgo; b) sub- produtos de cereais, tais como farinha de milho com glúten, torta úmi- da (particularmente torta úmida à base de milho), Grãos Secos de Destilaria (DDG) (particularmente Grãos Secos de Destilaria à base de milho (cDDG)), Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS) (par- ticularmente Grãos Secos de Destilaria com Solúveis à base de milho (cDDGS)), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos; c) proteína obtida a partir de fontes, tais como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seca, farinha de carne e ossos, proteína da batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; e) minerais e vitaminas.

[00260] O termo "forragem" conforme usado no presente documen- to significa qualquer alimento que seja proporcionado a um animal (ao invés de o animal ter de forragear por si próprio). A forragem abrange plantas que foram cortadas. Ademais, forragem inclui silagem, alimen- tações comprimidas e peletizadas, óleos e rações mistas e também grãos germinados e legumes.

[00261] A forragem pode ser obtida a partir de uma ou mais das plantas selecionadas dentre: milho (maís) alfafa (luzerna), cevada, cornichão, brássicas, couve-de-folha, couve, colza (canola), rutabaga (couve-nabo), nabo, trevo, trevo híbrido, trevo vermelho, trevo subter- râneo, trevo branco, festuca, bromus, painço, aveia, sorgo, sojas, árvo- res (brotos de árvores em talhadia de cabeça para feno), trigo e legu- mes.

[00262] O termo "alimento de composto" significa um alimento co- mercial na forma de uma farinha, um pélete, nozes, bolo ou uma miga-

lha. Os alimentos de composto podem ser misturados a partir de vá- rias matérias-primas e aditivos. Estas combinações são formuladas de acordo com os requisitos específicos do animal alvo.

[00263] Os alimentos de composto podem ser alimentos completos que fornecem todos os nutrientes diários requeridos, concentrados que fornecem uma parte da ração (proteína, energia) ou suplementos que fornecem somente micronutrientes adicionais, tais como minerais e vitaminas.

[00264] Os principais ingredientes usados em alimentação de com- posto são os grãos de alimentação que incluem milho, trigo, farinha de canola, farinha de colza, tremoço, feijão soja, sorgo, aveia e cevada.

[00265] — Adequadamente, uma pré-mistura denominada no presente documento pode ser uma composição composta por microingredien- tes, tais como vitaminas, minerais, conservantes químicos, antibióti- cos, produtos de fermentação e outros ingredientes essenciais. As pré- misturas são usualmente composições adequadas para combinação em rações comerciais.

[00266] Em uma modalidade, o gênero alimentício compreende ou consiste em milho, DDGS (tais como cDDGS), trigo, farelo de trigo ou qualquer combinação dos mesmos.

[00267] Em uma modalidade, o componente de alimento pode ser milho, DDGS (por exemplo, cDDGS), trigo, farelo de trigo ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o gênero alimentício compreende ou consiste em milho, DDGS (tais como cDDGS) ou uma combinação dos mesmos.

[00268] Um gênero alimentício descrito no presente documento po- de conter pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 60% em peso de farinha de milho e soja ou milho e soja com gordura total ou farinha de trigo ou farinha de girassol.

[00269] Por exemplo, um gênero alimentício pode conter entre cer-

ca de 5 a cerca de 40% de DDGS de milho. Para aves, o gênero ali- mentício pode conter, em média, entre cerca de 7 a 15% de DDGS de milho. Para suínos (porcos), o gênero alimentício pode conter, em mé- dia, 5 a 40% de DDGS de milho. O mesmo pode conter milho como um único grão, em tal caso, o gênero alimentício pode compreender entre cerca de 35% a cerca de 80% de milho.

[00270] Nos gêneros alimentícios que compreendem grãos mistu- rados, por exemplo, que compreendem milho e trigo, por exemplo, a composição de alimento pode compreender pelo menos 10% de milho.

[00271] Adicional ou alternativamente, um gênero alimentício pode também compreender pelo menos um material de alimento com alto teor de fibra e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um mate- rial de alimento com alto teor de fibra para fornecer um gênero alimen- tício com alto teor de fibra. Os exemplos de materiais de alimentação ricos em fibras incluem: trigo, cevada, centeio, aveia, subprodutos de cereais, tais como farinha de milho com glúten, alimentação de milho com glúten, torta úmida, Grãos Secos de Destilaria (DDG), Grãos Se- cos de Destilaria com Solúveis (DDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos. Algumas fontes de proteínas podem ser também consideradas como ricas em fibras: proteína obtida a partir de fontes, tais como girassol, tremoço, favas e algodão. Em um aspecto, o gênero alimentício conforme descrito no presente documen- to compreende pelo menos um material rico em fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de alimento rico em fibras selecionado a partir do grupo que consiste em Grãos Secos de Desti- laria com Solúveis (DDGS), particularmente, cDDGS, torta úmida, Grãos Secos de Destilaria (DDG), particularmente, cDDG, farelo de trigo e trigo, por exemplo. Em uma modalidade, o gênero alimentício da presente invenção compreende pelo menos um material rico em fibras e/ou pelo menos um subproduto do pelo menos um material de alimentação rico em fibras selecionado a partir do grupo que consiste em Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS), particularmente cDDGS, farelo de trigo e trigo, por exemplo.

[00272] O alimento pode ser um ou mais dos seguintes: um alimen- to de composto e pré-mistura, incluindo péletes, nozes ou bolo (de ga- do); uma cultura ou resíduo de cultura: milho, soja, sorgo, aveia, ceva- da, copra, palha, joio, desperdício de beterraba-sacarina; farinha de peixe; farinha de carne e ossos; melaços; bolo de óleo e bolo de baga- ço; oligossacarídeos; plantas de forragem conservadas; silagem; alga marinha; sementes e grãos, inteiros ou preparados por esmagamento, moagem, etc.; grãos germinados e legumes; extrato de levedura.

[00273] O termo "alimento" conforme usado no presente documento engloba, em algumas modalidades, alimento de animal de estimação. Um alimento de animal de estimação é material vegetal ou animal des- tinado ao consumo por animais de estimação, tal como alimento para cães ou alimento para gatos. O alimento de animal de estimação, tal como alimento para cães e gatos, pode estar em uma forma seca, tal como croquete para cães, ou forma enlatada úmida. O alimento para gatos pode conter o aminoácido taurina.

[00274] A alimentação animal pode também incluir um alimento pa- ra peixes. Um alimento para peixes contém normalmente macronutri- entes, elementos vestigiais e vitaminas necessários para manter o pei- xe cativo em boa saúde. O alimento para peixes pode estar na forma de um floco, pélete ou comprimido. As formas peletizadas, algumas das quais se afundam rapidamente, são frequentemente usadas para peixes maiores ou espécies que se alimentam do fundo. Alguns ali- mentos para peixes contêm também aditivos, tais como betacaroteno ou hormônios sexuais, para intensificar artificialmente a cor do peixe ornamental.

[00275] Em ainda outro aspecto, o alimento de animal engloba ali- mento para pássaros. O alimento para pássaros inclui alimento que é usado tanto em alimentadores de pássaros como para alimentar pás- saros de estimação. Tipicamente, o alimento para pássaros compre- ende uma variedade de sementes, mas pode também englobar sebo (gordura de bovino ou carneiro).

[00276] Conforme usado no presente documento, o termo "coloca- do em contato" refere-se à aplicação direta ou indireta de uma enzima xilanase (ou composição que compreende xilanase) a um produto (por exemplo, o alimento). Os exemplos dos métodos de aplicação que po- dem ser usados incluem, porém sem limitação, tratamento do produto em um material que compreende a composição de aditivo de alimento, aplicação direta por mistura da composição de aditivo de alimento com o produto, pulverização da composição de aditivo de alimento na su- perfície do produto ou imersão do produto em uma preparação da composição de xilanase de aditivo de alimento. Em uma modalidade, a composição de aditivo de alimento da presente invenção é preferenci- almente misturada com o produto (por exemplo, gênero alimentício). Alternativamente, a composição de aditivo de alimento pode ser incluí- da na emulsão ou ingredientes em bruto de um gênero alimentício. Pa- ra algumas aplicações é importante que a composição seja tornada disponível na ou à superfície de um produto a ser afetado/tratado. Isto permite que a composição confira um benefício de desempenho.

[00277] Em alguns aspectos, os aditivos de alimento descritos são usados para o pré-tratamento de alimento ou alimentação. Por exem- plo, o alimento que tem 10 a 300% de umidade é misturada e incuba- da com as xilanases a 5 a 80 ºC, preferencialmente a 25 a 50 ºC, mais preferencialmente entre 30 e 45 ºC por 1 min a 72 horas sob condi- ções aeróbicas ou 1 dia a 2 meses sob condições anaeróbicas. O ma- terial pré-tratado pode ser alimentado diretamente aos animais (deno-

minado alimentação líquida). O material pré-tratado pode também ser peletizado a vapor em temperaturas elevadas de 60 a 120 ºC. As xila- nases podem ser impregnadas em material de alimento ou alimentício por um revestidor a vácuo.

[00278] Tais aditivos de alimento podem ser aplicados para interca- lar, revestir e/ou impregnar um produto (por exemplo, gênero alimentí- cio ou ingredientes em bruto de um gênero alimentício) com uma quantidade controlada de uma ou mais enzimas.

[00279] De preferência, a composição de aditivo de alimento será termicamente estável para tratamento térmico de até cerca de 70 ºC; até cerca de 85 ºC; ou até cerca de 95 “ºC. O tratamento térmico pode ser realizado por até cerca de 1 minuto; até cerca de 5 minutos; até cerca de 10 minutos; até cerca de 30 minutos; até cerca de 60 minu- tos. O termo termicamente estável significa que pelo menos cerca de 75% dos componentes da enzima e/ou DFM que estavam presen- tes/ativos no aditivo antes do aquecimento até a temperatura especifi- cada ainda estão presentes/ativos após o resfriamento à temperatura ambiente. Preferencialmente, pelo menos cerca de 80% do componen- te de xilanase e/ou DFM compreendendo uma ou mais cepas bacteri- anas que estavam presentes e ativos no aditivo antes do aquecimento até à temperatura especificada estão ainda presentes e ativos após resfriar até a temperatura ambiente. Em uma modalidade particular- mente preferencial, o aditivo de alimento é homogeneizado para pro- duzir um pó.

[00280] & Alternativamente, o aditivo de alimento é formulado a grâà- nulos conforme descrito no documento nº WO2007/044968 (denomi- nados grânulos TPT) incorporado ao presente documento a título de referência.

[00281] Em outra modalidade preferencial, quando o aditivo de ali- mento é formulado em grânulos, os grânulos compreendem um sal de barreira hidratado revestido sobre o núcleo de proteína. A vantagem de tal revestimento de sal é termotolerância aprimorada, estabilidade de armazenamento aprimorada e proteção contra outros aditivos de alimento tendo de outro modo efeito adverso na pelo menos uma xila- nase e/ou DFM que compreende uma ou mais cepas bacterianas. De preferência, o sal usado para o revestimento de sal tem uma atividade em água superior a 0,25 ou umidificação constante superior a 60% a ºC. De preferência, o revestimento de sal compreende um Na2SO2.

[00282] O método para preparar um aditivo de alimento pode tam- bém compreender a etapa adicional de peletização do pó. O pó pode ser misturado com outros componentes conhecidos na técnica. O pó, ou mistura que compreende o pó, pode ser forçado através de uma matriz e as fitas resultantes são cortadas em péletes adequados de comprimento variável.

[00283] —Opcionalmente, a etapa de peletização pode incluir um tra- tamento com vapor, ou estágio de condicionamento, antes da forma- ção dos péletes. A mistura que compreende o pó pode ser colocada em um condicionador, por exemplo, um misturador com injeção de va- por. A mistura é aquecida no condicionador até uma temperatura es- pecificada, como de 60 a 100 “ºC, temperaturas típicas seriam 70 ºC, 80 ºC, 85 ºC, 90 ºC ou 95 “ºC. O tempo de residência pode ser variável de segundos a minutos e mesmo horas. Como 5 segundos, 10 segun- dos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minutos, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos e 1 hora. Será compreendido que as xilanases (ou composição que compreende as xilanases) descritas no presente documento são adequadas para adição a qualquer material de alimento apropriado.

[00284] Será entendido pela pessoa versada na técnica que ani- mais diferentes necessitam de gêneros alimentícios diferentes, e ainda o mesmo animal pode necessitar de gêneros alimentícios diferentes,

dependendo do propósito para o qual o animal é criado.

[00285] —“Opcionalmente, o gênero alimentício também pode conter minerais adicionais, tais como, por exemplo, cálcio e/ou vitaminas adi- cionais. Em algumas modalidades, o gênero alimentício é uma mistura de farinha de milho e soja.

[00286] O gênero alimentício é tipicamente produzido em moinhos de alimento nos quais as matérias-primas são em primeiro lugar tritu- radas até um tamanho de partículas adequado e depois misturadas com aditivos apropriados. O gênero alimentício pode ser, então, pro- duzido como um mingau ou péletes; em que os últimos envolvem tipi- camente um método pelo qual a temperatura é aumentada até um ní- vel alvo e, então, a alimentação é passada através de uma matriz para produzir péletes de um tamanho particular. Permite-se que os péletes resfriem. Subsequentemente, aditivos líquidos, como como gordura e enzima, podem ser adicionados. A produção de gênero alimentício po- de também envolver uma etapa adicional que inclui extrusão ou ex- pansão antes da peletização, em particular, por técnicas adequadas que podem incluir pelo menos o uso de vapor.

[00287] O aditivo de alimento e/ou o gênero alimentício que com- preende o aditivo de alimento podem ser usados em qualquer forma adequada. A composição de aditivo de alimentação pode ser usada na forma de preparações sólidas ou líquidas ou suas alternativas. Exem- plos de preparações sólidas incluem pós, pastas, bólus, cápsulas, pé- letes, comprimidos, poeiras e grânulos que podem ser molháveis, se- cos por pulverização ou liofilizados. Exemplos de preparações líquidas incluem, porém sem limitação, soluções, suspensões e emulsões aquosas, orgânicas ou aquosas-orgânicas.

[00288] Em algumas aplicações, o aditivo de alimento pode ser mis- turado com alimento ou administrado na água potável.

[00289] Um aditivo de alimento conforme ensinado no presente do-

cumento com um carreador, diluente ou excipiente e (opcionalmente) embalagem aceitável de alimento.

[00290] O gênero alimentício e/ou o aditivo de alimento podem ser combinados com pelo menos um mineral e/ou pelo menos uma vitami- na. As composições assim derivadas podem ser denominadas no pre- sente documento como uma pré-mistura.

[00291] As xilanases e as glucuronoxilanases podem estar presen- tes no gênero alimentício na faixa de 1 ppb (parte por bilhão) a 10 % (em p/p) com base na proteína enzimática pura. Em algumas modali- dades, a xilanase está presente na substância de alimento na faixa de 0,1 a 100 ppm (partes por milhão). Uma dose preferencial pode ser de 0,2 a 20 g de xilanase por tonelada de produto de alimento ou compo- sição de alimento ou uma dose final de 0,2 a 20 ppm de xilanase no produto final.

[00292] —Preferencialmente, as xilanases presentes no gênero ali- mentício devem ser pelo menos cerca de 250 XU/kg ou pelo menos cerca de 500 XU/kg de alimento, pelo menos cerca de 750 XU/kg de alimento, ou pelo menos cerca de 1,000 XU/ kg de alimento, ou pelo menos cerca de 1,500 XU/kg de alimento, ou pelo menos cerca de 2,000 XU/kg de alimento, ou pelo menos cerca de 2,500 XU/kg de ali- mento, ou pelo menos cerca de 3,000 XU/kg de alimento, ou pelo me- nos cerca de 3,500 XU/kg de alimento, ou pelo menos cerca de 4,000 XU/kg de alimento.

[00293] Em outro aspecto, as xilanases conforme descrito no pre- sente documento podem estar presentes no gênero alimentício em menos do que cerca de 30,000 XU/kg de alimento, ou em menos do que cerca de 20,000 XU/kg de alimento, ou em menos do que cerca de 10,000 XU/kg de alimento, ou em menos do que cerca de 8,000 XU/kg de alimento, ou em menos do que cerca de 6,000 XU/kg de ali- mento, ou em menos do que cerca de 5,000 XU/kg de alimento.

[00294] As faixas podem incluir, porém sem limitação, qualquer combinação das faixas inferior e superior discutidas acima.

[00295] A atividade de xilanase pode ser expressa em unidades de xilanase (XU) medidas a pH 5,0 com AZCL-arabinoxilano (arabinoxila- no de trigo reticulado com azurina, tabletes de Xilazima, Megazyme) como substrato. A hidrólise por endo-(1-4)-R&-D-xilanase (xilanase) produz fragmentos tingidos solúveis em água, e a taxa de liberação dos mesmos (aumento na absorbância a 590 nm) pode estar direta- mente relacionada à atividade enzimática. As unidades de xilanase (XU) são determinadas em relação a um padrão de enzima (Danisco Xylanase, disponível junto à Danisco Animal Nutrition) a condições de reação padrão, que são 40 ºC, tempo de reação de 10 min em tampão de Mcllvaine, pH 5,0.

[00296] A atividade de xilanase da enzima padrão é determinada como a quantidade de grupos finais de açúcar redutor liberados de um substrato de xilano de aveia e espelta por min a pH 5,3 e 50 ºC. Os grupos finais de açúcar redutor reagem com ácido 3,5-dinitrossalicílico, e a formação do produto de reação pode ser medida como o aumento na absorbância a 540 nm. A atividade enzimática é quantificada em relação a uma curva padrão de xilose (equivalentes de açúcar redu- tor). Uma unidade de xilanase (XU) é a quantidade de enzima padrão que libera 0,5 umol de equivalentes de açúcar redutor por min a pH 5,3 e 50ºC.

[00297] Os exemplos não limitantes das composições e métodos revelados no presente documento incluem:

1. Um aditivo para alimento de animal que compreende mi- lho ou arroz, em que o dito aditivo de alimento compreende pelo me- nos uma enzima que tem atividade glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima que tem atividade endo-beta-1,4-xilanase, em que a de- gradação de glucuro-noxilano insolúvel é maior do que se qualquer uma das enzimas fosse usada sozinha.

2. O aditivo de alimento da modalidade 1 em que a xilanase que tem atividade de glucuronoxilanase é derivada de Bacillus ou Pa- enibacillus sp..

3. O aditivo de alimento da modalidade 1 em que a xilanase que tem atividade de endo-beta-1,4-xilanase é derivada de Fusarium Sp..

4. O aditivo de alimento da modalidade 1 em que pelo me- nos uma das xilanases é produzida de modo recombinante.

5. Um aditivo de alimento que compreende pelo menos uma enzima com atividade de glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima que tem atividade de endo-beta-1,4-xilanase, em que a dita combinação é melhor no estímulo do crescimento de bactérias benéfi- cas em um trato digestivo de um animal monogástrico alimentado com uma dieta à base de milho quando comparado com o uso da xilanase que tem atividade endo-beta-1,4-xilanase sozinha.

6. Um aditivo de alimento que compreende pelo menos uma enzima com atividade de glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima que tem atividade de endo-beta-1,4-xilanase, em que a dita combinação é capaz de aumentar a produção de pelo menos um ácido graxo de cadeia curta em um animal monogástrico alimentado com uma dieta à base de milho em comparação com o uso da xilanase que tem atividade endo-beta-1,4-xilanase sozinha.

7. O aditivo de alimento da modalidade 6 em que o ácido graxo de cadeia curta é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido acético, ácido propiônico ou ácido butírico.

8. O aditivo de alimento de qualquer uma das modalidades 1 a 7 que compreende adicionalmente uma ou mais das enzimas sele- cionadas a partir do grupo que consiste em uma amilase, protease, endo-glucanase e fitase.

9. Uma pré-mistura que compreende o aditivo de alimento de qualquer uma das modalidades 1 a 7 e pelo menos uma vitamina e/ou mineral.

10. Um alimento de animal à base de milho ou arroz que compreende pelo menos uma enzima que tem atividade glucuronoxi- lanase e pelo menos uma enzima que tem atividade endo-beta-1,4- xilanase, em que a degradação de glucuro-noxilano insolúvel é maior do que se qualquer uma das enzimas fosse usada sozinha.

11. Um alimento de animal à base de milho que compreen- de pelo menos uma enzima com atividade de glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima que tem atividade de endo-beta-1,4-xilanase, em que a dita combinação é melhor no estímulo do crescimento de bacté- rias benéficas em um trato digestivo de um animal monogástrico quando comparado com o uso da xilanase que tem avalone.

12. Um alimento de animal à base de milho que compreen- de pelo menos uma enzima com atividade de glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima que tem atividade de endo-beta-1,4-xilanase, em que a dita combinação é capaz de aumentar a produção de pelo me- nos um ácido graxo de cadeia curta em um animal monogástrico em comparação com o uso da xilanase que tem atividade endo-beta-1,4- xilanase sozinha.

13. O alimento de animal da modalidade 12 em que o ácido graxo de cadeia curta é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido acético, ácido propiônico ou ácido butírico.

14. O alimento de animal de qualquer uma das modalida- des 11 a 13 que compreende adicionalmente uma ou mais das enzi- mas selecionadas a partir do grupo que consiste em uma amilase, pro- tease, endo-glucanase e fitase.

EXEMPLOS

[00298] A menos que definido de outro modo no presente documen-

to, todos os termos técnicos e científicos usados no presente docu- mento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual esta revelação pertence. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2º Edição, John Wiley e Sons, Nova lorque (1994), e Hale e Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.I. (1991) fornecem a uma pessoa ver- sada na técnica um dicionário geral de muitos dos termos usados nes- ta revelação.

[00299] A revelação é adicionalmente definida nos seguintes Exem- plos. Deve ser entendido que os Exemplos, embora indicando certas modalidades, são dados somente a título de ilustração. A partir da dis- cussão acima e dos Exemplos, uma pessoa versada na técnica pode determinar características essenciais desta revelação e, sem se afas- tar do seu espírito e escopo, pode fazer várias mudanças e modifica- ções para se adaptar a vários usos e condições. EXEMPLO 1 Ensaios

[00300] Determinação de proteína. As concentrações de amostras de proteína purificadas foram medidas no Espectrofotômetro Nano- Drop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.) com o uso do método A280 de acordo com as instruções do fabricante. O coeficiente de extinção (0,1%) de cada proteína foi usado para o cálculo de concentração de proteína. O coeficiente de extinção (0,1%) para BsuGH30 e BliXyn1 é de 2,1 e, respectivamente, 1,8 e 1,9 para FveXyn4 e FveXyn4.v1.

[00301] Ensaio de atividade de xilanase Solução de substrato 1% (em p/p): 0,2 g de 4-O-Metil-D-glucurono-D-xilano tingido com azul bri- lhante de Remazol R (RBB-Xilano) (Sigma número de catálogo 66960) foi misturado com tampão de fosfato 100 mM, pH 6,0 e colocado para ferver com agitação até o pó dissolver. Após o resfriamento até a tem-

peratura ambiente, o peso final da solução foi ajustado a 20 g.

[00302] Em um tubo de teste, 500 ul de solução de enzima foram misturados com 500 ul de solução de substrato 1% (em p/p). A mistura foi incubada por 30 minutos a 50 ºC. A reação foi interrompida, e frag- mentos de alto peso molecular foram precipitados com a adição de 5 ml de etanol 96% e misturação subsequente. Os tubos foram deixados em repouso à temperatura ambiente por 10 min, antes da misturação e centrifugação repetidas a 1,500 x g por 10 min a 20 ºC. A resposta foi medida como a diferença na absorbância a 585 nm e 445 nm para os sobrenadantes.

[00303] Degradação de arabinoxilano não extraível em água (WU- AX) medida como o aumento em arabinoxilano extraível mediante tra- tamento com xilanase. Solução de substrato 5% ou 10%: DDGS de milho ou farelo de arroz triturado a um tamanho de partícula <212 um foi hidratado em tampão de MES 100 mM, pH 6,0 por agitação por 15 min a 600 rpm. Subsequentemente, o pH foi ajustado até pH 6,0. 190 ul/poço de solução de substrato foram transferidos para as placas de substrato, que foram armazenadas a -20 ºC até o uso.

[00304] Todas as diluições foram preparadas com um robô dispen- sador Biomek (Beckman Coulter, EUA) em placas de 96 poços (placa de substrato e placa de coleta: Microplaca de Poliestireno Transparen- te, Corning, nº de catálogo 9017; Placa de filtro: membrana de PVDF de 0,2 um, Corning, nº de catálogo 3504).

[00305] Todas as enzimas foram diluídas com tampão de diluição (tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 5,0). 10 ul de solução foram adicionados às placas de substrato pré-produzidas. Para as amostras virgens, 10 ul de tampão de diluição foram adicionados, para o teste de enzimas únicas, 10 ul de solução de enzima ou 5 ul de solução de enzima e 5 ul de tampão de diluição foram adicionados, e para o teste de combinações, 5 ul de cada solução de enzima foram adicionados.

As placas foram incubadas 40 ºC por 120 minutos em um incubador de microplaca iEMS (Thermo Scientific). Após a incubação final, a amostra foi transferida para uma placa de filtro, que foi colocada no topo de placas de coleta e centrifugada por 10 min a 1,666 x g. As pla- cas de coleta foram armazenadas a -20 ºC e subsequentemente diluí- das 10 vezes com água DI antes da análise adicional.

[00306] A quantidade total de unidades de açúcar C5 na solução foi medida como equivalentes de xilose pelo método de Douglas com o uso de um aparelho de injeção de fluxo contínuo (SKALAR Analytical, Breda, Holanda) conforme descrito por Rouau X & Surget A (1994). A combinação de calor e baixo pH levará a uma decomposição de arabi- noxilano nos monoaçúcares de pentose, arabinose e xilose, que desi- dratarão adicionalmente em furfural. Pela reação com floroglucinol, um complexo colorido é formado.

[00307] Essencialmente, as amostras filtradas foram tratadas a 95 ºC com uma mistura 55:1 de CH;ãCOOH e HCl e uma solução 20% de floroglucinol (1,3,5-tri-hidroxibenzeno, Merck número de catálogo 107069) dissolvido em etanol. Medindo-se a absorbância a 550 nm com 510 nm como os comprimentos de onda de referência, a concen- tração de monoaçúcares de pentose na solução foi medida como equivalentes de xilose com o uso de uma curva padrão de xilose (5 a 300 ug de xilose/ml). Diferentemente do complexo de pentose- floroglucinol, a absorbância do complexo de hexose-floroglucinol é constante nesses comprimentos de onda.

[00308] O arabinoxilano extraído foi determinado como a massa dos equivalentes de xilose hidratados (massa molar: 150,13 g/mol) por massa de substrato (CDDGS ou farelo de arroz). Os resultados são relatados como o aumento em arabinoxilano extraível calculado como a diferença entre o arabinoxilano extraído para a amostra tratada com enzima e para a amostra virgem.

[00309] Cálculo: * Taxas de inclusão de enzima (pg/g) = Volume da amostra de enzima (ul) x concentração de amostra de enzima (vug/ml) / (190 ul x concentração de substrato (g/ml)) * Arabinoxilano extraído (mg/g) = Concentração de equiva- lentes de xilose (mg/ml) x 200 ul / (190 ul x concentração de substrato (g/ml)) * Aumento em arabinoxilano extraível (mg/g) = Arabinoxila- no extraído (mg/g), amostra tratada com enzima — Arabinoxilano extra- ído (mg/g), amostra virgem

[00310] Desempenho após a exposição à pepsina: À amostra de enzima foi diluída a uma concentração final de 2 ug/ml com solução À (tampão de glicina 100 MM, pH 3,5 contendo 0,2 mg/ml de pepsina) ou como controle na solução B (tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 5,0) e incubada por 2 horas a 40 ºC com agitação em um agitador iEMS (Thermo Scientific). Após a incubação final, o desempenho da amostra tratada com pepsina (diluída na solução A) foi comparado à amostra de controle (diluída na solução B) com o uso do ensaio de degradação WU-AX descrito acima.

EXEMPLO 2 Identificação de glucuronoxilanases de GH30

[00311] Três glucuronoxilanases de GH30: BsuGH30 (também co- nhecida como XynC), BliXyn1 e BamGh2 foram identificadas a partir do banco de dados NCBI (os números de são WP 063694996.1, WP 035400315.1 e ABS74177, respectivamente). Adicionalmente, homólogos dessas glucuronoxilanases foram identificados pelo se- quenciamento dos genomas das cepas de Bacillus safensis, Paeniba- cillus macerans, Paenibacillus cookii DSM 16944 e Paenibacillus tun- drae DSM 21291. Os genomas inteiros desses organismos foram se- quenciados com o uso da tecnologia de sequenciamento da próxima geração de Illumina, montados, e as sequências contíguas foram ano- tadas. A origem do organismo doador, o nome da proteína e os núme- ros de SEQ ID para os genes e proteínas nativas são listados na Ta- bela 3. e be dos [gg] Origem Nome Gene comprimento completo EXEMPLO 3 Clonagem e expressão de glucuronoxilanases de GH30

[00312] Genes sintéticos que codificam sete genes de glucuronoxi- lanase homólogos descritos no Exemplo 2 (Tabela 1) foram gerados com o uso de técnicas conhecidas na arte e inseridos no vetor de ex- pressão p2JM103BBI (Vogtentanz, Protein Expr Purif, 55:40 a 52, 2007). Os plasmídeos de expressão resultantes contêm: um promotor de aprE (SEQ ID No. 43), uma sequência de sinalização de aprE (SEQ ID No. 44 representa a sequência de aminoácidos), um oligonucleotí- deo que codifica o tripeptídeo Ala-Gly-Lys na extremidade 5', a se- quência de nucleotídeos sintética que codifica a região madura do ge- ne de glucuronoxilanase de interesse (SEQ ID No.15, 17, 19, 21, 23, ou 27) e o terminador de AprE (SEQ ID No 45). A Tabela 4 fornece os números de listagem de sequências de cada gene recombinante usado para a expressão de GH30 e sequências de proteínas maduras e de comprimento completo resultantes.

Tabela 4: Números de SEQ ID de Glucuronoxilanases de GH30 (genes sintéticos e sequências de proteínas recombinantes) Proteína Recombi- | Proteína Recom- Origem Gene Sintético | nante de Compri- | binante Madura mento Completo Bacillus subtilis SEQ ID No. 15 | SEQID No. 16 SEQ ID No. 36 Bacillus licheniformis SEQ ID No. 17 | SEQID No. 18 SEQ ID No. 37 Bacillus — amyloliquefaciens SEQ ID No. 19 | SEQ ID No. 20 SEQ ID No. 38 FZB42 Bacillus safensis SEQ ID No. 21 | SEQID No. 22 SEQ ID No. 39 Paenibacillus macerans SEQ ID No. 23 | SEQ ID No. 24 SEQ ID No. 40 Paenibacilus —cookii DSM SEQ ID No. 25 | SEQ ID No. 26 SEQ ID No. 41 16944 Paenibacillus tundrae DSM SEQ ID No. 27 | SEQ ID No. 28 SEQ ID No. 42 21291

[00313] Uma cepa hospedeira de B. subtilis adequada foi transfor- mada com cada um dos plasmídeos de expressão, e as células trans- formadas foram espalhadas em placas de Luria Agar suplementadas com cloranfenicol 5 ppm. Para produzir cada uma das enzimas lista- das acima, transformantes de B. subtilis contendo os plasmídeos fo- ram cultivados em frascos de agitação de 250 ml em um meio definido à base de MOPS, suplementado com mais CaCl2 5 mM.

EXEMPLO 4 Purificação de glucuronoxilanases

[00314] “BsuGH30 foi purificada em três etapas cromatográficas. O sobrenadante de cultura clarificado, equilibrado a fosfato de sódio 20 mM pH 6,0 foi primeiramente carregado em uma coluna de troca ca- tiônica SP, eluída com um gradiente de sal (NaCl). Frações contendo a proteína de interesse foram ajustadas a sulfato de amônio 1 M antes do carregamento em uma coluna HiLoad phenyl-HP Sepharose e eluí- das com um gradiente de sulfato de amônio 1M-0 em Tris 20 mM pH 7,0. As frações contendo a proteína de interesse foram, então, carre- gadas em uma coluna Superdex 75 e eluídas com fosfato de sódio 20 MM pH 7,0 com NaCl 0,15 M.

[00315] As enzimas BliXyn1 e BsaXyn1 foram purificadas em duas etapas cromatográficas. O sobrenadante de cultura clarificado foi con- centrado e equilibrado a 0,8 M de sulfato de amônio antes do carre- gamento em uma coluna Phenyl Sepharose HP. As frações contendo a proteína de interesse foram eluídas com Tris-HCI 20 mM, pH 7,5, agrupadas, concentradas e carregadas em uma coluna Superdex 75 e eluídas com Tris-HCI 20 mM pH 7,5 contendo NaCl 0,15 M.

[00316] BamGh2 foi purificada em duas etapas cromatográficas. O sobrenadante de cultura clarificado foi concentrado, equilibrado com fosfato de sódio 20 mM pH 6, carregado em coluna de troca catiônica SP, e proteína de interesse foi eluída com um gradiente de NaCl O a 200 mM. As frações contendo a proteína de interesse foram concen- tradas, carregadas em uma coluna Superdex 75 e eluídas com fosfato de sódio 20 mM pH 7,0 com NaCl 0,15 M.

[00317] —PmaXynd4 foi purificada em três etapas. O sobrenadante de cultura clarificado foi ajustado a sulfato de amônio de saturação de 65%. O precipitado foi coletado e suspenso em acetato de sódio 20 mM pH 5 com sulfato de amônio 1 M, carregado em uma coluna Hi- Prep phenyl-FF Sepharose e eluído com um gradiente de sulfato de amônio 1-OM em tampão. As frações contendo a proteína de interesse foram agrupadas, dessalinizadas, carregadas em uma coluna de troca catiônica HiPrep SP-XL Sepharose, e a proteína-alvo foi eluída com um gradiente linear de NaCl O a 0,5 M.

[00318] As enzimas PcoXyn1 e PtuXyn2 foram purificadas em duas etapas cromatográficas. Os sobrenadantes de cultura clarificados fo- ram concentrados e equilibrados com sulfato de amônio 1 M antes do carregamento em uma coluna phenyl-HP Sepharose. As frações con- tendo a proteína de interesse foram eluídas com um gradiente de sul- fato de amônio 1-OM em Tris 20 mM pH 8,0, as frações agrupadas e carregadas em uma troca aniônica HiPrep Q-XL Sepharose. A proteí- na foi eluída com um gradiente de NaCl O a 0,5 M.

[00319] Em todos os casos, as resinas de cromatografia foram obti- das a partir da coluna GE Healthcare, e as frações de coluna final con- tendo as proteínas-alvo purificadas foram agrupadas e concentradas com o uso de um dispositivo 10K Amicon Ultra-15. Os produtos finais foram 90 a 95% puros (por determinação de SDS-PAGE) e foram ajus- tados a glicerol 40% e armazenados a -20 ºC ou -80 ºC até o uso. EXEMPLO 5 Atividade de xilanase de BsuGH30 e BliXyn1

[00320] A atividade de xilanase de BsuGH30, BIliXyn1 e da xilanase de GH10 FveXyn4.v1 (descrita no pedido de patente WO2015114112) foi determinada com o uso de 4-O-Metil-D-glucurono-D-xilano solúvel tingido com azul brilhante de Remazol R (RBB-Xilano) como substrato. Após a precipitação de RBB-Xilano de alto peso molecular não degra- dado, a absorbância do sobrenadante é proporcional à produção de fragmentos de baixo peso molecular por tratamento enzimático. Embo- ra tanto BsuGH30 quanto BliXyn1 tenham exibido atividade de xila- nase, fica claro a partir dos resultados apresentados na Figura | que BsuGH30 e BliXyn1 produziram uma quantidade menor de fragmentos de baixo peso molecular do que FveXyn4.v1 na mesma concentração de enzimas, mas também em termos da quantidade máxima de frag- mentos de baixo peso molecular obtidos com uma determinada con- centração de substrato. As duas enzimas GH30 não tiveram bom de- sempenho assim como a enzima GH10 nesse ensaio, mas BsuGH30 e BliXyn1 eram surpreendentemente boas na degradação de arabinoxilano não extraível em água (WU-AX) do milho conforme descrito abaixo. EXEMPLO 6 Degradação de WU-AX em DDGS de milho por BsuGH30 e BliXyn1

[00321] As enzimas BsuGH30 e BliXyn1 foram testadas juntamente com as enzimas GH10 FveXyn4 (descrita no pedido de patente WOZ2014020142) e FveXyn4.v1 (descrita no pedido de patente

WOZ2015114112) quanto à sua capacidade de degradar os arabinoxi- lanos não extraíveis em água (WU-AX) em DDGS de milho com o uso do ensaio descrito no Exemplo 1. A Figura 2 mostra o aumento em arabinoxilano extraível após 2 h de incubação de DDGS de milho tritu- rado com enzima. Os dados mostram que consideravelmente mais arabinoxilano foi extraível após a incubação com BsuGH30 e BliXyn1 do que com as enzimas FveXyn4 e FveXyn4.v1i quando testadas com o uso da mesma concentração de enzima. FveXyn4 mostrou anterior- mente ser eficiente na degradação de DDGS de milho não extraível em água (patente número WO2014020142), mas as enzimas GH30 mostram uma capacidade ainda maior para degradar arabinoxilanos não extraíveis em água em DDGS de milho. EXEMPLO 7 Degradação de WU-AX em DDGS de milho por glucuronoxilana- ses de GH30 adicionais

[00322] Sete glucuronoxilanases de GH30 (BsuGH30, BliXyn1, BamGh2, BsaXyn1, PmaXyn4, PcoXyn1 e PtuXyn2) e duas enzimas GH10 (FveXyn4 e FveXyn4.v1) foram testadas quanto à sua capaci- dade para degradar arabinoxilano não extraível em água em DDGS de milho triturado com o uso do ensaio descrito no Exemplo 1. As sete glucuronoxilanases de GH30 e as duas enzimas GH10 foram testadas em concentrações crescentes e os resultados obtidos ao usar 12,6 ug de enzima/g de DDGS de milho são mostrados na Figura 3. Os resul- tados mostram que a incubação com todas as glucuronoxilanases de GH30 testadas resultou em mais arabinoxilano extraível do que a in- cubação com as enzimas GH10, FveXyn4 e FveXyn4.v1, quando tes- tadas nas mesmas doses. EXEMPLO 8 Degradação de WU-AX em DDGS de milho e farelo de arroz por glu- curonoxilanases de GH30 em combinação com xilanase de GH10

[00323] A combinação de glucuronoxilanase de GH30 com uma xi- lanase de GH10 foi avaliada com o uso de DDGS de milho como subs- trato. A Figura 5 (A e B) mostra os resultados para as enzimas GH30 sozinhas e em combinação com a xilanase de GH10 FveXyn4 ou Fve- Xyn4.v1. A adição da xilanase de GH10 às enzimas GH30 intensificou o aumento em arabinoxilano extraível. Para BsuGH30, BamGh2, Pco- Xyn1 e PtuXyn2, o aumento adicional no arabinoxilano extraível obtido com a combinação de 3,2 ug/g de enzima GH30 mais 3,2 ug/g de xila- nase de GH10 em comparação com o uso único de 3,2 ug/g de enzi- ma GH30 foi igual ao aumento obtido com 3,2 ug/g de xilanase de GH10 sozinha, e a aditividade completa do desempenho dessas enzi- mas GH30 e das enzimas GH10 testadas foi, assim, demonstrada. |s- so é ilustrado na Figura 4 comparando-se o aumento obtido com a combinação de 3,2 ug/g de enzima GH30 mais 3,2 ug/g de xilanase de GH10 e a soma do aumento obtido pelo uso único de 3,2 ug/g de en- zima GH30 e 3,2 ug/g de xilanase de GH10, respectivamente.

[00324] A combinação de glucuronoxilanases de GH30 e xilanase de GH10 foi também avaliada com o uso de farelo de arroz como substrato. A Figura SA mostra os resultados para as enzimas FveXyn4 GH10 e BsuGH30 GH30 respectivamente e em combinação, e a Figu- ra 5B mostra os resultados das enzimas FveXyn4.v1 GH10 e BliXyn1 GH30 respectivamente e em combinação a doses na faixa de O a 12,6 vpg/g de concentração de farelo de arroz. Um aumento em arabinoxila- no extraível foi observado com adição de FveXyn4, FveXyn4.vi, BsuGH30 e BliXyn1, respectivamente. Em todos os casos, foi consta- tado que a combinação das enzimas GH10 e GH30 teve um efeito si- nérgico, na medida em que todas as combinações testadas levaram a um aumento maior em arabinoxilanos extraíveis do que as enzimas individuais testadas na mesma concentração de enzimas total; por exemplo, um aumento comparável em arabinoxilano extraível (respec-

tivamente 7,6 e 7,4 mg/g) foi obtido com 12,6 ug/g de BliXyn1 ou Fve- Xyn4.v1, entretanto, o mesmo aumento (7,5 mg/g) poderia ser obtido com uma concentração de enzimas total de apenas 6,3 ug/g com o uso de uma mistura 1:1 de BliXyn1 e FveXyn4.v1 ou com uma concen- tração de enzimas total de 7,1 ug/g com o uso de uma mistura 1:8 de BliXyn1 e FveXyn4.v1. EXEMPLO 9 Desempenho de BsuGH30 e BliXyn1 após a exposição à pepsina

[00325] As amostras de BsuGH30 e BliXyn1 foram incubadas com pepsina conforme descrito no Exemplo 1 para avaliar seu desempenho após a exposição à pepsina. A Figura 6 mostra o aumento em arabi- noxilano extraível após a incubação de DDGS de milho triturado com uma amostra de enzima de controle, que foi exposta a condições mo- deradas (pH 5,0), e a amostra de enzima correspondente, que foi ex- posta à pepsina, pH 3,5. A inclusão de enzima testada corresponde a 1,1 ug/g de DDGS de milho. Tanto BsuGH30 quanto BliXyn1 mantêm a capacidade para degradar WU-AX de DDGS de milho após a expo- sição à pepsina, embora o desempenho tenha diminuído. Exemplo 10

ESTUDO DE FERMENTAÇÃO DE CÓLON DE PORCO EX VIVO NA PRESENÇA DAS ENZIMAS GH10 E GH30

[00326] Um aumento na produção de gás de parte posterior do in- testino está associado à saúde melhorada do intestino em monogástri- cos e reflete o estímulo do crescimento de bactérias benéficas devido a um aumento nos substratos que as bactérias metabolizam. Um efeito estatisticamente significativo (tipicamente > 5%) na produção de gás indica que os produtos de teste, tais como as enzimas adicionadas a um produto de alimento, estão fornecendo um benefício. Outra métrica importante da saúde do intestino é a produção aumentada de ácidos graxos de cadeia curta (SCFA), os principais produtos finais do meta-

bolismo bacteriano no intestino grosso, principalmente produzidos por degradação de carboidrato (Macfarlane S., Macfarlane G.T. (2003). Regulation of short-chain fatty acid production. Proceedings of the Nu- trition Society. 62 páginas 67 a 72). No estudo descrito abaixo, as enzi- mas FveXyn4.v1 sozinha e FveXyn4.v1 mais BsuGH30 foram testadas na digestão de porco ex vivo e os resultados são mostrados abaixo.

[00327] Preparação de substrato para simulação ex vivo: O di- gerido do íleo distal, ceco e cólon proximal foi coletado de porcos ali- mentados com dieta à base de milho contendo 5% de trigo e 15% de DDGS de milho. Com o uso de centrifugação de alta velocidade (18,000 x g), a amostra foi separada em uma fase líquida e sólida. A fase líquida é armazenada a -20 ºC até o uso. A fase sólida foi adicio- nalmente lavada três vezes com tampão (pH=5,0) para remover a maioria das bactérias presentes no digerido e seca a 55 ºC.

[00328] Protocolo de simulação: A enzima foi dosada com base na quantidade de matéria seca (DM) no substrato (fases sólida e líqui- da). A Tabela 5 fornece o esboço para a dosagem de enzima. A dose de enzima no alimento por grama de alimento foi multiplicada por um fator 2,2 para compensar a redução em DM devido à digestão e ab- sorção de nutrientes de fácil digestão por exemplo, amido) no trato di- gestivo superior. mento rido BsuGH30

[00329] Antes do início do estímulo, o inóculo fresco foi coletado do cólon distal de dois porcos. Em uma caixa de luvas anaeróbica, o inó- culo foi suspenso na fase líquida do substrato e dispensado através de uma malha de aço inoxidável (1 mm). O inóculo, substrato (fases sóli- da e líquida), tampão (pH 6,5) e aditivo foram adicionados nos vasos de simulação em uma câmara anaeróbica. O volume total dos vasos de simulação foi de 15 ml, que continha 0,59 g (0,08 g de fase líquida e 0,51 g de fase sólida) de matéria seca derivada de substrato e inócu- lo 1,5%. Os vasos foram vedados com tampões de borracha de butila espessos, transferidos a 37 “ºC e continuamente misturados em um agitador giratório a 100 rom. Cada um dos tratamentos listados na Ta- bela 4 foi executada em 3 réplicas. A incubação foi executada por 18 horas. Parâmetros analisados:

[00330] Produção de gás bacteriano. A produção de gás total foi medida perfurando-se o tampão de borracha com uma agulha conec- tada a uma seringa de vidro de 15 ml precisa com um êmbolo de base sensível. O volume de gás liberado dos vasos foi registrado em uma simulação de 4, 8, 10, 12, 15 e 18 horas e usado como uma medida geral de atividade bacteriana.

[00331] Ácidos graxos de cadeia curta. No final da simulação de 18 horas, subamostras de 1 ml foram retiradas de três vasos replicados perfurando o tampão de borracha de butila com uma agulha conectada a uma seringa de 1 ml. A partir dessas subamostras, os ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs) foram analisados por cromatografia gasosa, com o uso de ácido piválico como um padrão interno. Os ácidos acéti- co, propiônico e butírico foram medidos.

[00332] A análise estatística consistiu em testes t bicaudais para todos os parâmetros medidos. Os testes foram realizados contra o tra- tamento com controle negativo sem nenhuma emenda de produto de teste. Significância de acordo com os testes t de Student: valor p < 0,05 *e valor p < 0,01 **.

[00333] Os resultados desses estudos de fermentação de porco ex vivo são resumidos na Tabela 6 e na Tabela 7. Conforme mostrado na Tabela 6, a combinação de FveXyn4.v1 e BsuGH30 aumentou a for- mação de gás microbiano significativamente, enquanto a inclusão de apenas FveXyn4.v1 não aumentou.

| GAS (gás liberado durante os períodos de fempo listados (medido em ml) | | josan [oash [oatoh [0at2h [0a1sh [0atsh | [eontals fas 7a 7 es ee ee FveXyn4.v1 [4,2 7,8" EX 94" 9,77 10,7* + BsuGH30 [aa SE Pere tm TAcido propiônico (mim Acido putiico (il) | FveXyn4.v1 | 47,1% 28,2* 17,3" + BsuGH30

[00334] — Adicionalmente, após 18 horas de incubação, um aumento considerável na produção de ácidos acéticos, propiônicos e butíricos foi observado com a inclusão da combinação das enzimas FveXyn4.v1 e BsuGH30 em comparação com o controle (sem enzima). Em contra- partida, FveXyn4.v1 sozinha, rendeu apenas um aumento na elevação de ácido butírico que foi estatisticamente significativo (Tabela 7).

EXEMPLO 11 Comparação das Sequências de Glucuronoxilanase

[00335] Proteínas relacionadas foram identificadas por uma pesqui- sa BLAST (Altschul et a/., Nucleic Acids Res, 25:3,389 a 3,402, 1997) com o uso das sequências de aminoácidos maduros para BsuGH30 (SEQ ID NO:29 ); BIiXyn1 (SEQ ID NO:30); BamGh2 (SEQ ID NO:31 ); BsaXyn1 (SEQ ID NO:32 ); PmaXyn4 (SEQ ID NO:33); PcoXyn1 (SEQ ID NO:34); e PtuXyn2 (SEQ ID NO:35) contra os bancos de dados de patente Genome Quest e Públicos com parâmetros de pesquisa ajus- tados em valores padrão e um subconjunto é mostrado nas Tabelas

8A e 8B (BsuGH30); Tabelas 9A e 9B (BliXyn1); Tabelas 10A e 10B (BamGh2); Tabelas 11A e 11B (BsaXyn1); Tabelas 12A e 12B (PmaXyn4); Tabelas 13A e 13B (PcoXyn1); e Tabelas 14A e 14B (PtuXyn2) respectivamente.

A identidade percentual (PID) para ambos os conjuntos de pesquisa é definida como o número de resíduos idên- ticos divididos pelo número de resíduos alinhados no alinhamento de pares de sequências.

Os valores identificados com "Comprimento de sequência" nas tabelas correspondem ao comprimento (em aminoáci- dos) para as proteínas denominadas com os números de acesso lista- dos, enquanto "Comprimento alinhado" refere-se à sequência usada para alinhamento e cálculo de PID.

Tabela 8A: Lista de sequências com identidade percentual à proteina madura) BsuGH30 identificada a partir do banco de dados de proteína não redundante NCBI

|IComprimento |IComprimento del Nº de Acesso Organismo de Sequência jAlinhamento WwP 003231534.1 —f100,0 [Bacillus subtilis |WP 072566343.1 |oe5 — Bacillus subtilis WP 071579318.1 oe2 — [Bacillus sp.

FMQ74 |WP 024573168.1 oe 2 — Bacillus subtilis |WP 014476954.1 |er,7 — [Bacillus subtilis |WP 086343892.1 |oe2 — [Bacillus subtilis WwP o60398719.1 — jas9 — Bacillus subtilis WwP o75746411.1 — asa — Bacillus licheniformis |WP 064814128.1 |es,1 — [Bacillus subtilis Tabela 8B: Lista de sequências com identidade percentual à proteina madura| BsuGH30 identificada a partir do banco de dados Genome Quest Identificador GQ Organismo |IComprimento |Comprimento del alinhamento BCMO3707 100,00 |Bacillus subtilis Bacillus amylolique- US20160354436-0659 —fo4,36 lfaciens 394 1390 |AZG68558 3,85 — |Não identificado KR1020160056941-0659 [93,08 — |Não identificado Us20160040203-0020 —fa231 Bacillus atrophaeus Bacillus amylolique- US20160040203-0025 [o1,28 lfaciens 389 388

BsuGH30 identificada a partir do banco de dados Genome Quest O A A aa ra alinhamento dusanenoananaanes fone far ob be US20160040203-0021 85,684 |ricus 387 389 monotonia con sas fare a a WO2017103159-0012 85,38 19179 391 1390 Tabela 9A: Lista de sequências com identidade percentual à proteina madura BliXyn1 Comprimento delComprimento de)

PE E Bacilus — paralicheni-| Bacillus glycinifermen-| Tabela 9B: Lista de sequências com identidade percentual à proteina madura BliXyn1 Identificador GQ Organismo |Compri- |)Comprimento del a a e meo

Tabela 9B: Lista de sequências com identidade percentual à proteina madura BliXyn1 Identificador GQ Organismo |Compri- |)Comprimento del O a ee aeeo Tabela 10A: Lista de sequências com identidade percentual à proteina madura| |IComprimento delComprimento — de «Issa — fo mo ent “umas O re Roo fases fr ir pre e a RO o ciens a a A A ciens ciens ciens ciens

Tabela 10A: Lista de sequências com identidade percentual à proteina madura| ciens ciens Tabela 10B: Lista de sequências com identidade percentual à proteina madura| Identificador GQ Organismo Compri- |Comprimento del

SS A Tabela 11A: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura Bsa- |IComprimento Comprimento denis — po orem GSSNaa ientmneto

Tabela 11A: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura Bsa- |IComprimento Comprimento dna — po orgmamo GStNaa tento [For Roo ese — E [ora Roo fosso Roo RT a Foo Roo oem çamts Er a UNC125MFCrub1,1 Tabela 11B: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura Bsa- Identificador GQ Organismo Compri- |Comprimento de

SA

Tabela 12A: Lista de sequências com identidade percentual à proteina madura Compri- Comprimento mento de | de Alinha- Nº de Acesso Organismo Sequência | mento Tabela 12B: Lista de sequências com identidade percentual à proteina madura| Identificador GQ Organismo Compri- |Comprimento del

NS Tabela 13A: Lista de sequências com identidade percentual à proteina madura Pco- |IComprimento — (Comprimento «rsencmso — pio lramieme — nsatnãs eae Tabela 13B: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura Pco- Identificador GQ Organismo Compri- |Comprimento de

A

Tabela 14A: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura Ptu- Xyn2 identificada a partir do banco de dados de proteína não redundante NCBI |IComprimento Comprimento Nº de Acesso Organismo de Sequência de Alinhamento |WP 063567972.1 Ps,o — Paenibacilus sp. 0199 |WP 064640831.1 Ps,o — Paenibacilus sp. AD87 OAX48465.1 Ps,o — Paenibacilus sp. AD87 |WP 079693657.1 P87 — Paenibacilus sp. RUSA IWP 072733029.1 P87 — Paenibacilus sp. ov031 SEN81008.1 r,7 — Paenibacilus sp. OKO76 IWP 062319325.1 3,9 — jPaenibacilus pabuli Tabela 14B: Lista de sequências com identidade percentual à proteína madura Ptu- Xyn2 identificada a partir do banco de dados Genome Quest Identificador GQ Organismo IComprimento Comprimento de, alinhamento Anne — as AZG68556 [84,95 |Não identificado US20160040203- 0013 84,69 lPaenibacillus sp. 1390 1389

[00336] As sequências de aminoácidos para as proteínas de com- primento completo BsuGH30 (SEQ ID NO:2); BIliXyn1 (SEQ ID NO: 4); BamGh2 (SEQ ID NO:6); BsaXyn1 (SEQ ID NO:8); PmaXyn4 (SEQ ID NO:10); PcoXyn1 (SEQ ID NO:12); e PtuXyn2 (SEQ ID NO:14), e as sequências de outras xilanases de GH30 das Tabelas 3 a 9 foram ali- nhas com os parâmetros padrão com o uso do programa MUSCLE do software Geneious (Biomatters Ltd.) (Robert C. Edgar. MUSCLE: mul- tiple sequence alignment with high accuracy and high throughput Nucl. Acids Res. (2004) 32 (5): 1,792 a 1,797). O alinhamento de múltiplas sequências é mostrado na Figura 7. A identidade percentual das se- quências de aminoácidos maduros das glucuronoxilanases de GH30 é mostrada na Tabela 15.

Tabela 15. Identidade de sequência percentual dentre as sequências de aminoácidos Epa pra pr Fr e es e e e e e ps ET Te e e e) ss Tr e e je e e o Je Te Tas Tee e pe ss Je Te Te Te e Pp TE Te Je TT mA

PE TE E E E

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Aditivo para alimento de animal, caracterizado pelo fato de que compreende milho ou arroz, em que o dito aditivo de alimento compreende pelo menos uma enzima que possui atividade glucurono- xilanase e pelo menos uma enzima que possui atividade endo-beta- 1,4-xilanase, em que a degradação de glucuronoxilano insolúvel é maior do que se qualquer uma das enzimas fosse usada sozinha.

2. Aditivo de alimento, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma enzima com atividade de glucuronoxila- nase e pelo menos uma enzima que possui atividade endo-beta-1,4- xilanase, em que a dita combinação é melhor no estímulo do cresci- mento de bactérias benéficas em um trato digestivo de um animal mo- nogástrico alimentado com uma dieta à base de milho quando compa- rado com o uso da xilanase que possui atividade endo-beta-1,4- xilanase sozinha.

3. Aditivo de alimento, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma enzima com atividade de glucuronoxila- nase e pelo menos uma enzima que possui atividade endo-beta-1,4- xilanase, em que a dita combinação é capaz de aumentar a produção de pelo menos um ácido graxo de cadeia curta em um animal mono- gástrico alimentado com uma dieta à base de milho em comparação com o uso da xilanase que possui atividade endo-beta-1,4-xilanase sozinha.

4. Aditivo de alimento, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo de cadeia curta é seleci- onado a partir do grupo que consiste em ácido acético, ácido propiôni- co ou ácido butírico.

5. Aditivo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a xilanase que possui ativi- dade de glucuronoxilanase é uma glucuronoxilanase de GH30.

6. Aditivo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a xilanase que possui atividade de glucuronoxilanase é derivada de Bacillus ou Paenibacillus sp.

7. Aditivo, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracte- rizado pelo fato de que a xilanase que possui atividade de glucuronoxi- lanase é derivada de B. subtilis ou B. licheniformis.

8. Composição de aditivo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a xilanase que possui atividade de glucuronoxilanase compreende um polipeptídeo que possui pelo me- nos 90% de identidade de sequência com um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:42.

9. Aditivo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a xilanase que possui atividade de glucuronoxilanase compreende um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ |ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ |ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:42.

10. Aditivo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a xilanase que possui ativi-

dade endo-beta-1,4-xilanase é derivada a partir de um fungo filamen- toso.

11. Aditivo, de acordo com a reivindicação 10, caracteri- zado pelo fato de que a xilanase que possui atividade endo-beta-1,4- xilanase compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 90% de identidade de sequência com um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 e SEQ ID NO:52.

12. Aditivo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das xila- nases é produzida de modo recombinante.

13. Aditivo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmen- te (a) uma ou mais das enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma amilase, protease, endo-glucanase e fitase; ou (b) um ou mais microbianos diretamente alimentados; ou (c) uma combinação de (a) e (b).

14. Pré-mistura, caracterizada pelo fato de que compreen- de o aditivo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, e pelo menos uma vitamina e/ou mineral.

15. Alimento de animal à base de milho ou arroz caracteri- zado pelo fato de que compreende pelo menos uma enzima com ativi- dade de glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima que possui ati- vidade endo-beta-1,4-xilanase, em que a degradação de glucuronoxi- lano insolúvel é maior do que se qualquer uma das enzimas fosse usada sozinha.

16. Alimento de animal à base de milho, caracterizado pe- lo fato de que compreende pelo menos uma enzima com atividade de glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima que possui atividade en- do-beta-1,4-xilanase, em que a dita combinação é melhor no estímulo do crescimento de bactérias benéficas em um trato digestivo de um animal monogástrico em comparação com o uso da xilanase que pos- sui atividade endo-beta-1,4-xilanase sozinha.

17. Alimento de animal à base de milho, caracterizado pe- lo fato de que compreende pelo menos uma enzima com atividade de glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima que possui atividade en- do-beta-1,4-xilanase, em que a dita combinação é capaz de aumentar a produção de pelo menos um ácido graxo de cadeia curta em um animal monogástrico em comparação com o uso da xilanase que pos- sui atividade endo-beta-1,4-xilanase sozinha.

18. Alimento de animal, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo de cadeia curta é seleci- onado a partir do grupo consistindo em ácido acético, ácido propiônico ou ácido butírico.

19. Alimento de animal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que a xilanase que possui atividade de glucuronoxilanase é uma glucuronoxilanase de GH30.

20. Alimento de animal, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a xilanase que possui atividade de glu- curonoxilanase é derivada a partir de Bacillus ou Paenibacillus sp.

21. Alimento de animal, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a xilanase que possui atividade de glucuronoxilanase é derivada de B. subtilis ou B. licheniformis.

22. Alimento de animal, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a xilanase que possui atividade de glu- curonoxilanase compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 90% de identidade de sequência com um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14,

SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:42.

23. Alimento de animal, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a xilanase que possui atividade de glu- curonoxilanase compreende um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ |ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ |ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:42.

24. Alimento de animal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 23, caracterizado pelo fato de que a xilanase que possui atividade endo-beta-1,4-xilanase é derivada a partir de um fun- go filamentoso.

25. Alimento de animal, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a xilanase que possui atividade endo- beta-1,4-xilanase compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 90% de identidade de sequência com um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 e SEQ ID NO:52.

26. Alimento de animal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 25, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das xilanases é produzida de modo recombinante.

27. Alimento de animal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 26, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente (a) uma ou mais das enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma amilase, protease, endo-glucanase e fitase; (b) um ou mais microbianos diretamente alimentados; ou (c) uma combi- nação de (a) e (b).

28. Método para degradar glucuronoxilano insolúvel em um alimento de animal compreendendo milho ou arroz, caracterizado pelo fato de que compreende colocar o milho ou arroz em contato com pelo menos uma enzima com atividade de glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima que possui atividade endo-beta-1,4-xilanase.

29. Método para aprimorar a digestibilidade de glucurono- xilano insolúvel em um alimento de animal à base de milho ou arroz, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um animal um alimento de animal à base de milho ou arroz compreendendo pelo menos uma enzima com atividade de glucuronoxilanase e pelo menos uma enzima que possui atividade endo-beta-1,4-xilanase.

30. Método, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, ca- racterizado pelo fato de que a xilanase que possui atividade de glucu- ronoxilanase é uma glucuronoxilanase de GH30.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracteri- zado pelo fato de que a xilanase que possui atividade de glucuronoxi- lanase é derivada a partir de Bacillus ou Paenibacillus sp.

32. Método, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, ca- racterizado pelo fato de que a xilanase que possui atividade de glucu- ronoxilanase é derivada de B. subtilis ou B. licheniformis.

33. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracteri- zado pelo fato de que a xilanase que possui atividade de glucuronoxi- lanase compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 90% de identidade de sequência com um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ |ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ |ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:42.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracteri- zado pelo fato de que a xilanase que possui atividade de glucuronoxi- lanase compreende um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ |ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:42.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 28 a 34, caracterizado pelo fato de que a xilanase que possui ati- vidade endo-beta-1,4-xilanase é derivada a partir de um fungo filamen- toso.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracteri- zado pelo fato de que a xilanase que possui atividade endo-beta-1,4- xilanase compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 90% de identidade de sequência com um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 e SEQ ID NO:52.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 28 a 36, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das xi-

lanases é produzida de modo recombinante.

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 28 a 37, caracterizado pelo fato de que compreende adicional- mente administrar ao animal (a) uma ou mais das enzimas seleciona- das do grupo consistindo em uma amilase, protease, endo-glucanase e fitase; (b) um ou mais microbianos diretamente alimentados; ou (c) uma combinação de (a) e (b).

39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 28 a 38, caracterizado pelo fato de que o animal é um animal monogástrico selecionado a partir do grupo consistindo em porcos e suínos, perus, patos, frango, salmão, truta, tilápia, bagre, carpa, cama- rões e gambas.

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 28 a 38, caracterizado pelo fato de que o animal é um animal ru- minante selecionado a partir do grupo consistindo em gado, bezerros jovens, cabras, ovelhas, girafas, bisão, alce, cervo, iaques, búfalo de água, veado, camelos, alpacas, lhamas, antílopes, antilocapra e nilgó.