CN112654703A - 用于基于谷类的动物饲料的含木聚糖酶饲料添加剂 - Google Patents

Abstract

描述了一种用于谷类动物饲料的含木聚糖酶的饲料添加剂，以促进不溶性葡糖醛酸木聚糖的降解。

Description

用于基于谷类的动物饲料的含木聚糖酶饲料添加剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年7月6日提交的国际专利申请号PCT/CN2018/094752和2018年7月16日提交的国际专利申请号PCT/CN2018/095761的优先权，每个国际专利申请的披露内容均通过引用以其全文并入本文。

通过引用并入序列表

将于2019年6月26日创建并同时提交的、以大小为149KB和名称为“NB40864-WO-PCT[3]Sequence Listing_ST25”的文件形式提供的序列表通过引用以其全文并入本文。

技术领域

该领域涉及新颖木聚糖酶及其在基于谷类的动物饲料中的用途。

背景技术

木聚糖是一组在植物细胞壁和某些藻类中发现的半纤维素。木聚糖是由木糖(戊糖)单元组成的多糖。在植物细胞壁中木聚糖几乎与纤维素一样普遍，并且主要包含β-连接的D-木糖单元。半纤维素的主要杂聚物是木聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯聚糖。

木聚糖也是常用喂养料原料(例如玉米、稻、高粱等)中最重要的抗营养因子之一。

玉米纤维木聚糖是含有β-1,4-连接的木糖残基的复合杂木聚糖。该主链被与O-2个和/或O-3个木糖残基连接的阿拉伯糖的单体侧链，葡糖醛酸或其4-O-甲基衍生物的单体侧链，以及含有阿拉伯糖、木糖和有时半乳糖残基的低聚侧链高度取代。玉米纤维中的木聚糖高度抵抗酶促降解。

木聚糖酶是将直链多糖β-1,4-木聚糖降解为木糖从而分解半纤维素(植物细胞壁的主要组分之一)的一类酶的名称。木聚糖酶是用于木聚糖解聚作用的关键酶并将木聚糖骨架的随机或特定位置处的内部糖苷键切割成小的低聚物。因此，它们在靠植物来源旺盛生长的微生物中起主要作用，用于将植物物质降解为能用的营养素。木聚糖酶是由真菌、细菌、酵母、海藻、原生动物、蜗牛、甲壳类、昆虫、种子等产生的。

基于结构和遗传信息，木聚糖酶被分类为不同糖苷水解酶(GH)家族(Henrissat,(1991)Biochem.J.[生物化学杂志]280,309-316)。糖基水解酶(包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶和其他糖酶)基于诸如氨基酸序列、其三维结构以及其催化位点几何形状等特性来分类(Gilkes等人,1991,Microbiol.Reviews[微生物学综述]55:303-315)。在GH家族5、8、10、11、30和98中已经描述了主要具有内切木聚糖酶活性的酶。

如上所述，玉米纤维和其他谷类中的木聚糖高度抵抗酶促降解。鉴于玉米在全球范围内被用于动物饲料，因此需要能够降解谷类来源的木聚糖以改善营养素释放。

发明内容

在第一个实施例中，公开了一种用于动物饲料的添加剂，所述动物饲料包含玉米或稻，所述饲料添加剂包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中不溶性葡糖醛酸木聚糖的降解大于单独使用任何一种酶情况下的降解。

在另一个实施例中，所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶是GH30葡糖醛酸木聚糖酶。

在第二个实施例中，所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自芽孢杆菌属(Bacillus)或类芽孢杆菌属(Paenibacillus)物种。

在另一个实施例中，所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)。

在另一个实施例中，所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶包含与选自由以下组成的组的多肽具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％中任一项)序列同一性的多肽：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、和SEQ ID NO:42。

在第三个实施例中，所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自丝状真菌(例如但不限于镰孢菌属(Fusarium)物种)。

在另一个实施例中，所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶包含与选自由以下组成的组的多肽具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％中任一项)序列同一性的多肽：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、和SEQ ID NO:52。

在第四个实施例中，重组生产所述木聚糖酶中的至少一种。

在第五个实施例中，公开了一种饲料添加剂，所述饲料添加剂包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中当与单独使用所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶相比，所述组合更好地刺激饲喂基于玉米的饮食的单胃动物消化道中有益细菌的生长。

在第六个实施例中，描述了一种饲料添加剂，所述饲料添加剂包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中当与单独使用所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶相比，所述组合能够增加饲喂基于玉米的饮食的单胃动物中至少一种短链脂肪酸的生产。

在第七个实施例中，所述短链脂肪酸选自由以下组成的组：乙酸、丙酸或丁酸。

在第八个实施例中，本文公开的饲料添加剂中任一种可以包含选自由以下组成的组的一种或多种酶：淀粉酶、蛋白酶、内切葡聚糖酶和植酸酶。

在第九个实施例中，公开了一种预混物，所述预混物包含如权利要求1-7中任一项所述的饲料添加剂和至少一种维生素和/或矿物质。

在第十个实施例中，公开了一种基于玉米或稻的动物饲料，所述动物饲料包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中不溶性葡糖醛酸木聚糖的降解大于单独使用任何一种酶情况下的降解。

在第十一个实施例中，公开了一种基于玉米的动物饲料，所述动物饲料包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的GH10酶，其中当与单独使用所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶相比，所述组合更好地刺激单胃动物消化道中有益细菌的生长。

在第十二个实施例中，公开了一种基于玉米的动物饲料，所述动物饲料包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中当与单独使用所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶相比，所述组合能够增加单胃动物中至少一种短链脂肪酸的生产。

在第十三个实施例中，公开了一种动物饲料，其中所述短链脂肪酸选自由以下组成的组：乙酸、丙酸或丁酸。

在第十四个实施例中，公开了本文所述的动物饲料中任一种，所述动物饲料进一步包含选自由以下组成的组的一种或多种酶：淀粉酶、蛋白酶、内切葡聚糖酶和植酸酶。

在另一个实施例中，本文提供了一种用于降解包含玉米或稻的动物饲料中的不溶性葡糖醛酸木聚糖的方法，所述方法包括使所述玉米或稻与至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶接触。

在另一个实施例中，本文提供了一种用于改善基于玉米或稻的动物饲料中不溶性葡糖醛酸木聚糖的消化率的方法，所述方法包括向动物施用基于玉米或稻的动物饲料，所述动物饲料包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶。

在另一个实施例中，所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶是GH30葡糖醛酸木聚糖酶。

在另一个实施例中，所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属物种。

在另一个实施例中，所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。

在另一个实施例中，所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶包含与选自由以下组成的组的多肽具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％中任一项)序列同一性的多肽：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、和SEQ ID NO:42。

在另一个实施例中，所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自丝状真菌。

在另一个实施例中，所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶包含与选自由以下组成的组的多肽具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％中任一项)序列同一性的多肽：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、和SEQ ID NO:52。

在另一个实施例中，重组生产所述木聚糖酶中的至少一种。

在另一个实施例中，所述方法进一步包括向所述动物施用(a)选自由以下组成的组的一种或多种酶：淀粉酶、蛋白酶、内切葡聚糖酶和植酸酶；(b)一种或多种直接饲喂微生物；或(c)(a)和(b)的组合。

在另一个实施例中，所述动物是选自由以下组成的组的单胃动物：猪(pigs和swine)、火鸡、鸭、鸡、鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲤鱼、虾和对虾。

在另一个实施例中，所述动物是选自由以下组成的组的反刍动物：牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。

附图说明

图1A和1B描绘了FveXyn4.v1、BsuGH30和BliXyn1酶的木聚糖酶活性测量值。图1A描绘了FveXyn4.v1在0至0.0008mg/mL的浓度范围内的活性剂量响应，而BsuGH30和BliXyn1的响应在0至0.008mg/mL的浓度范围内确定。图1B描绘了0至0.004mg/mL范围内的BsuGH30和BliXyn1的活性剂量响应曲线是线性的。

图2显示了玉米DDGS与增加浓度的BsuGH30、BliXyn1、FveXyn4和FveXyn4.v1酶孵育2h后，以木糖当量报告的可提取的阿拉伯糖基木聚糖的增加。

图3显示了玉米DDGS与12.6μg/g的FveXyn4、FveXyn4.v1和GH30葡糖醛酸木聚糖酶(BsuGH30、BliXyn1、BamGh2、BsaXyn1、PmaXyn4、PcoXyn1和PtuXyn2)孵育2h后，以木糖当量报告的可提取的阿拉伯糖基木聚糖的增加。

图4显示了玉米DDGS与所选酶孵育2h后，以木糖当量报告的可提取的阿拉伯糖基木聚糖的增加。图4A显示了单独使用3.2μg/g GH30酶处理和与3.2μg/g FveXyn4组合处理的比较。还显示了如由用3.2μg/g GH30酶和3.2μg/g FveXyn4进行独立处理获得的可提取阿拉伯糖基木聚糖的增加值之和计算的加和性响应。图4B显示了单独使用3.2μg/g GH30酶处理和与3.2μg/g FveXyn4.v1组合处理的比较。还显示了如由用3.2μg/g GH30酶和3.2μg/g FveXyn4.v1进行独立处理获得的可提取阿拉伯糖基木聚糖的增加值之和计算的加和性响应。

图5显示了以木糖当量报告的可提取的阿拉伯糖基木聚糖的增加。5A)将5％的米糠与BsuGH30(GH30酶)和FveXyn4(GH10酶)(单独或组合)孵育2h后，和5B)将10％的米糠与BliXyn1和FveXyn4.v1酶(单独或组合)孵育2h后。对于所述组合，木聚糖酶包含量是GH30酶浓度和GH10酶浓度的总和。GH30酶的浓度在图例框中说明，GH10酶的浓度是X轴上的木聚糖酶包含量与图例框中给出的GH30酶浓度之间的差值。

图6显示了玉米DDGS与1.1μg/g预处理的酶BsuGH30和BliXyn1孵育2h后，以木糖当量报告的可提取的阿拉伯糖基木聚糖的增加。浅灰色条显示了在pH 5.0孵育的对照样品，深灰色条显示了在pH 3.5与胃蛋白酶预孵育的酶的结果。

图7列出了GH30葡糖醛酸木聚糖酶的全长序列的多序列比对。

以下序列遵循37 C.F.R.§§1.821-1.825(“Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid SequenceDisclosures-the Sequence Rules[含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则]”)并符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(2009)、以及欧洲专利公约(EPC)和专利合作条约(PCT)法规第5.2和49.5(a-bis)条、以及行政章程第208款和附件C关于序列表的要求。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37 C.F.R.§1.822中所示的条例。

表1A和1B.核苷酸和氨基酸SEQ ID号的汇总

具体实施方式

引用的所有专利、专利申请和出版物均通过引用以其全文并入本文。

在本公开中，使用了许多术语和缩写。除非另有特别说明，否则适用以下定义。

在元素或组分前的冠词“一个/种(a/an)”和“所述(the)”在关于所述元素或组分的实例(即，出现)的数目旨在是非限制性的。因此，“一个/种(a/an)”和“所述(the)”应理解为包括一个/种或至少一个/种，并且元素或组分的单数词语形式还包括复数，除非所述数字明显意指单数。

术语“包括”意指如权利要求书中所提及的说明的特征、整数、步骤或组分的存在，而并未排除一个或多个其他特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包括”旨在包括由术语“基本上由……组成”和“由……组成”所涵盖的实施例。类似地，术语“基本上由……组成”旨在包括由术语“由……组成”所涵盖的实施例。

在存在的情况下，所有范围是包含端值的和可组合的。例如，当列举“1至5”的范围时，所列举的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等范围。

如本文与数值结合所用的，术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非所述术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的pH值”是指pH值为5.5至6.5，除非所述pH值另有具体定义。

在本说明书全文中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同这类较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同这类较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一数值范围将包括落入这类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同这类较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。

术语“木聚糖酶”(EC 3.2.1.8，内切-(1->4)-β-木聚糖4-木聚糖水解酶、内切-1,4-木聚糖酶、内切-1,4-β-木聚糖酶、β-1,4-木聚糖酶、内切-1,4-β-D-木聚糖酶、1,4-β-木聚糖木聚糖水解酶、β-木聚糖酶、β-1,4-木聚糖木聚糖水解酶、β-D-木聚糖酶)意指衍生自微生物(例如真菌、细菌、酵母、海藻或原生动物)的蛋白质或多肽结构域。木聚糖酶具有水解木聚糖的能力。术语“木聚糖酶”、“糖苷水解酶”和“水解酶”在本文中可以互换使用。

术语“葡糖醛酸木聚糖酶”(EC 3.2.1.136，葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖内切-1,4-β-木聚糖酶、feraxan内切木聚糖酶、feraxanase、内切阿拉伯糖基木聚糖酶、葡糖醛酸木聚糖木糖水解酶、葡糖醛酸木聚糖木聚糖水解酶、葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖1,4-β-D-木聚糖水解酶、葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖4-β-D-木聚糖水解酶)意指衍生自微生物(例如真菌、细菌、酵母、海藻或原生动物)的蛋白质或多肽结构域。葡糖醛酸木聚糖酶具有水解葡糖醛酸木聚糖的能力。

术语“糖苷水解酶”(GH)是指有助于糖苷的糖苷键的水解的酶，即有助于复合糖中糖苷键水解的酶。糖苷水解酶(也称为糖苷酶或糖基水解酶)有助于复合糖中糖苷键的水解。

糖苷水解酶(O-糖基水解酶)EC 3.2.1.是一组广泛的酶，这组酶水解两个或更多个碳水化合物之间的糖苷键，或碳水化合物与非碳水化合物部分之间的糖苷键。基于序列相似性的糖基水解酶分类系统导致了许多不同家族的定义。可在CAZy(碳水化合物活性酶(CArbohydrate-Active EnZymes))网站上找到此分类。因为蛋白质的折叠比它们的序列更加保守，所以一些家族可以分为宗族。截至2011年10月，CAZy包括128个糖基水解酶家族和14个宗族。

所述糖苷水解酶家族30(GH30)CAZY GH_30包含具有多种已知活性的酶：葡糖醛酸木聚糖酶(EC 3.2.1.136)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、β-葡糖苷酶(3.2.1.21)、β-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.31)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、β-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.38)；葡糖神经酰胺酶(EC 3.2.1.45)、β-1,6-葡聚糖酶(EC 3.2.1.75)、内切-β-1,6-半乳聚糖酶(EC:3.2.1.164)、和[还原末端]β-木糖苷酶(EC 3.2.1.-)。

糖苷水解酶家族10(GH10)CAZY GH_10包含具有多种已知活性的酶：木聚糖酶(EC3.2.1.8)、内切-1,3-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.32)、和纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)。这些酶以前称为纤维素酶家族F。纤维素和木聚糖的微生物降解需要几种酶，例如内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(外切葡聚糖酶)或木聚糖酶(EC 3.2.1.8)。真菌和细菌产生一系列的纤维素分解酶(纤维素酶)和木聚糖酶，基于序列相似性，这些酶可以分为多个家族。这些家族之一被称为纤维素酶家族F或糖基水解酶家族。

糖苷水解酶家族11(GH11)CAZY GH_11包含仅具有两种已知活性的酶：木聚糖酶(EC 3.2.1.8)和内切-β-1,3-木聚糖酶(EC 3.2.1.32)。这些酶以前称为纤维素酶家族G。

术语“动物”和“受试者”在本文中可互换地使用。“动物”包括所有非反刍动物(包括人类)和反刍动物。在具体实施例中，所述动物是非反刍动物，例如马和单胃动物。单胃动物的实例包括但不限于猪(pigs和swine)，例如仔猪、生长猪、母猪；家禽，例如火鸡、鸭、鸡、肉仔鸡、下蛋鸡；鱼，例如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳动物，例如虾和对虾。在另外的实施例中，所述动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。

“饲料”意指任何天然或人造饮食、膳食等，或此类膳食的组分，其意在或适合于分别被非人类动物和人类食用、摄取、消化。关于在饲养家畜时饲喂动物的产品，使用术语“饲料”。术语“饲料”和“动物饲料”可互换地使用。

如本文所用的，术语“直接饲喂微生物”(“DFM”)是活的(有活力的)天然存在的微生物的来源。DFM可以包含一个或多个这样的天然存在的微生物，例如细菌菌株。DFM的类别包括芽孢杆菌属、乳酸细菌和酵母菌。因此，术语DFM涵盖以下中的一种或多种：直接饲喂细菌、直接饲喂酵母、直接饲喂酵母及其组合。

芽孢杆菌纲(Bacilli)是独特的、形成孢子的革兰氏阳性杆菌。这些孢子非常稳定，并且可以承受环境条件，如热、水分和一定范围的pH。这些孢子当被动物摄入后会萌发成有活性的营养细胞，并可用于粉和压成丸粒的饮食中。乳酸菌是革兰氏阳性球菌，可产生对病原体有拮抗作用的乳酸。由于乳酸菌似乎有点对热敏感，所以它们不能用于压成丸粒的饮食中。乳酸细菌的种类包括双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)和链球菌(Streptococcus)。

术语“益生菌”意指通过选择性地刺激一种或有限数量的有益细菌的生长和/或活性来有益地影响宿主的不可消化食物成分。

如本文所用的，术语“益生菌培养物”定义了当例如以足够数量摄取或局部应用时，有益地影响宿主生物体(即通过赋予宿主生物体一个或多个可证明的健康益处)的活的微生物(包括例如细菌或酵母)。益生菌可以改善一个或多个粘膜表面的微生物平衡。例如，粘膜表面可以是肠、泌尿道、呼吸道或皮肤。如本文所用的，术语“益生菌”还涵盖可以刺激免疫系统的有益分支并同时减少在粘膜表面(例如肠)中的炎症反应的活的微生物。虽然没有益生菌摄入的下限或上限，但是已经表明，至少10⁶-10¹²，优选至少10⁶-10¹⁰，优选10⁸-10⁹cfu作为日剂量将在受试者中有效地实现有益的健康效果。

如本文所用的，术语“CFU”意指“集落形成单位”并且是代表衍生自单个祖细胞的细胞聚集的集落中的活细胞的测量。

术语“分离的”意指处于在自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)任何物质，包括但不限于，任何宿主细胞、酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子，其至少部分地从与其天然相关的天然发生的成分中的一种或多种或全部中去除；(3)任何经人手修饰的物质(相对于自然界中发现的物质)；或(4)相对于与其天然相关的其他成分，通过增加物质的量进行修饰的任何物质。术语“分离的核酸分子”、“分离的多核苷酸”、和“分离的核酸片段”将可互换使用并是指单链或双链的RNA或DNA的聚合物，任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。呈DNA聚合物形式的分离的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成的DNA的一个或多个区段构成。

术语“经纯化的”如应用于核酸或多肽时通常表示基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术确定的(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱物和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散的带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一条带的核酸或多肽是“经纯化的”。经纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，在摩尔基础上按重量计的百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子的浓度的大幅度增加时，对于所述分子而言组合物被富集了。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他特定材料或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。

如本文所用的，术语“功能测定”是指提供蛋白质活性指示的测定法。在一些实施例中，所述术语是指其中针对以其通常的能力发挥功能的能力来分析蛋白质的测定系统。例如，在木聚糖酶的情况下，功能测定涉及确定木聚糖酶水解木聚糖的有效性。

术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用，并且是指通过肽键连接在一起的氨基酸的聚合物。“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。贯穿本公开使用了遵照IUPAC-IUB生物化学术语联合委员会(Joint Commission on BiochemicalNomenclature，JCBN)定义的氨基酸的单字母和3字母代码。单字母X是指二十个氨基酸中的任一个。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。突变可以由亲本氨基酸的单个字母代码命名，随后是位置编号，然后是变体氨基酸的单个字母代码。例如，将在位置87处的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)表示为“G087S”或“G87S”。当描述修饰时，位置后面在括号中列出的氨基酸指示由任何列出的氨基酸在所述位置处的取代清单。例如，6(L,I)意指位置6可以被亮氨酸或异亮氨酸取代。有时，在序列中，将斜线(/)用于定义取代，例如，F/V指示特定位置，在所述位置处可以具有苯丙氨酸或缬氨酸。

“前序列(prosequence)”或“前肽序列(propeptide sequence)”是指在信号肽序列与成熟木聚糖酶序列之间的、木聚糖酶的正确折叠和分泌所必需的氨基酸序列；它们有时被称为分子内伴侣。前序列或前肽序列的切割产生成熟的活性木聚糖酶。木聚糖酶可以表达为酶原(pro-enzymes)。

术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基序列。通常，信号序列位于前体或成熟蛋白序列的N-末端。信号序列可以是内源的或外源的。成熟蛋白中一般不存在信号序列。通常，在蛋白质转运后，信号序列通过信号肽酶从蛋白质切割。

术语“短链脂肪酸”也称为挥发性脂肪酸(“VFA”)，是具有两个至六个碳原子的脂肪酸。当膳食纤维在结肠中发酵时会产生短链脂肪酸。

术语“成熟”形式的蛋白质、多肽或肽是指没有信号肽序列和前肽序列的蛋白质、多肽或酶的功能形式。

术语“前体”形式的蛋白质或肽是指具有有效地连接到蛋白质的氨基或羧基末端的前序列的蛋白质的未成熟形式。前体还可以具有有效地连接到前序列的氨基末端的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的另外的多肽(例如，从其切割以留下成熟形式的蛋白质或肽的多肽)。

关于氨基酸序列或核酸序列，术语“野生型”指示氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。如本文所用的，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在”是指在自然界中没有发现的任何物质(例如，在实验室中生产的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。

如本文所使用的，关于氨基酸残基位置，“对应于”(corresponding to或corresponds to)或“对应”是指在蛋白质或肽中所列举位置处的氨基酸残基，或类似于、同源于或等同于蛋白质或肽中所列举残基的氨基酸残基。如本文所使用的，“对应区域”通常是指相关蛋白质或参比蛋白质中的类似位置。

术语“衍生自”和“获得自”不仅是指由所讨论的生物体的菌株生产或可以由其生产的蛋白质，而且是指由从此类菌株分离的DNA序列编码并且在含有此类DNA序列的宿主生物体中生产的蛋白质。另外，所述术语是指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码并且具有所讨论的蛋白质的鉴定特征的蛋白质。

术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。在表2中可以找到本文中使用的缩写以识别特定氨基酸。

表2.单个字母和三个字母的氨基酸缩写

本领域技术人员将认识到，在保留与公开的氨基酸序列相关的功能的同时，可以对本文公开的氨基酸序列进行修改。例如，基因的改变导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码蛋白质的功能特性是常见的，这是本领域所熟知的。例如，本文公开的氨基酸序列中的任何特定氨基酸都可以替代另一种功能上等价的氨基酸。出于本公开的目的，取代被定义为以下五组中的一组中的交换：

1.小的脂肪族、非极性或轻微极性残基：Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)；

2.极性、带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；

3.极性、带正电荷的残基：His、Arg、Lys；

4.大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；以及

5.大的芳香族残基：Phe、Tyr、和Trp。

因此，氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(如甘氨酸)或疏水性较强的残基(如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基取代另一个带负电荷的残基或者一个带正电荷的残基取代另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸取代精氨酸)的改变也可以预期产生功能上等效的产物。在许多情况下，导致蛋白分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变所述蛋白的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如确定所编码的产物的生物活性的保留情况。

术语“密码子优化的”，如它是指用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区，是指核酸分子的基因或编码区中密码子的改变，以反映宿主生物体的典型密码子使用，而不改变DNA编码的多肽。

术语“基因”是指表达特定蛋白质的核酸分子，包括所述编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指自然界中发现的具有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含不是在自然界中一起被发现的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可以包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含衍生自同一来源但以不同于天然发生的方式排列的调控序列和编码序列。“内源基因”是指位于生物体基因组的天然位置中的天然基因。“外来”基因是指通常不在宿主生物体中被发现，但通过基因转移引入宿主生物体中的基因。外来基因可以包含插入非天然生物体中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序引入基因组中的一种基因。

术语“编码序列”是指编码特异性氨基酸序列的核苷酸序列。“合适的调控序列”是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或者翻译的核苷酸序列。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

术语“有效地连接”是指核酸序列在单个核酸分子上的缔合，使得一个核酸片段的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，所述编码序列在启动子的转录控制下)时，启动子与所述编码序列有效地连接。编码序列可以在正义或反义方向上有效地连接到调控序列上。

术语“调控序列”或“控制序列”在本文中可互换地使用，并且是指能够增加或减少生物体内特定基因表达的核苷酸序列区段。调控序列的实例包括但不限于启动子、信号序列、操纵子等。如上所述，调控序列能以正义或反义方向有效地连接到目的编码序列/基因。

“启动子”或“启动子序列”是指定义RNA聚合酶在何处开始基因转录的DNA序列。启动子序列通常直接位于转录起始位点的上游或5'末端。启动子可以全部衍生自天然或天然发生的序列，或者由衍生自在自然界发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可能指导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或者响应于不同环境或生理条件的表达(“诱导型启动子”)。

所述“3’非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，并包括编码能够影响mRNA加工或基因表达(如转录终止)的调控信号的序列。

如本文所用的，术语“转化”是指将核酸分子转移或引入到宿主生物体中。所述核酸分子可以作为线性或环状形式的DNA引入。所述核酸分子可以是自主复制的质粒，或者它可以整合进生产宿主的基因组中。含有转化的核酸的生产宿主被称为“转化的”或“重组的”或“转基因的”生物体或“转化体”。

如本文所用的，术语“重组”和“基因工程化的”在本文中可互换使用，是指例如通过化学合成或者通过经基因工程技术操纵分离的核酸区段来将两个原本分离的核酸序列区段进行人工组合。例如，其中一个或多个区段或基因已经被插入的DNA，其自然地或通过实验室操作，从不同的分子、同一分子的另一部分或人工序列插入，导致在基因中引入新的序列并随后在生物体中引入。术语“重组”、“转基因”、“转化的”、“工程化的”、“基因工程化的”和“经修饰用于外源基因表达”在本文中可互换地使用。

术语“重组构建体”、“表达构建体”、“重组表达构建体”和“表达盒”在本文中可互换地使用。重组构建体包含核酸片段，例如在自然界中未全部一起发现的调控序列和编码序列的人工组合。例如，构建体可以包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含衍生自相同来源但以不同于天然发生的方式排列的调控序列和编码序列。这种构建体可以单独使用或可以与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于如本领域技术人员熟知的将用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。技术人员充分了解必须存在于载体上以便成功转化，选择和繁殖宿主细胞的遗传元件。本领域技术人员还将认识到，不同的独立转化事件可能导致不同的表达水平和模式(Jones等人,(1985)EMBO J[欧洲分子生物学组织杂志]4:2411-2418；De Almeida等人,(1989)Mol Gen Genetics[分子遗传学和普通遗传学]218:78-86)，因此典型地筛选多个事件，以获得显示所希望的表达水平和模式的品系。此类筛选可以是完成的标准分子生物学测定、生物化学测定以及其他测定，这些测定包括DNA的印迹分析、mRNA表达的Northern分析、PCR、实时定量PCR(qPCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、蛋白表达的免疫印迹分析、酶测定或活性测定、和/或表型分析。

术语“生产宿主”、“宿主”和“宿主细胞”在本文中可互换地使用，并且指任何生物体或其细胞，无论是人类还是非人类，其中重组构建体可以稳定或瞬时引入以表达基因。所述术语涵盖了亲本细胞的任何后代，由于在繁殖期间发生的突变，其与亲本细胞不同。

术语“百分比同一性”是如通过比较这些序列所确定的两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“同一性”也意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，如通过此类序列的串之间的匹配核苷酸或氨基酸的数目所确定的。可通过已知方法容易地计算“同一性”和“相似性”，所述方法包括但不限于以下文献中所述的那些：Computational Molecular Biology[计算分子生物学](Lesk,A.M.编辑)Oxford University Press[牛津大学出版社],纽约州(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物计算：信息学和基因组项目](Smith,D.W.编辑),Academic Press[学术出版社],纽约州(1993)；Computer Analysis ofSequence Data[序列数据的计算机分析],第I部分,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press[胡玛纳出版社],新泽西州(1994)；Sequence Analysis in MolecularBiology[分子生物学的序列分析](von Heinje,G.编辑),Academic Press[学术出版社](1987)；Sequence Analysis Primer[序列分析引物](Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton Press[斯托克顿出版社],纽约州(1991)。确定同一性和相似性的方法被编入公开可用的计算机程序中。

如本文所用的，“％同一性”或“百分比同一性”或“PID”是指蛋白质序列同一性。百分比同一性可以使用本领域已知的标准技术来确定。有用的算法包括BLAST算法(参见Altschul等人,J Mol Biol[分子生物学杂志],215:403-410,1990；以及Karlin和Altschul，Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报]，90:5873-5787,1993)。BLAST程序使用几个搜索参数，其中大部分设置为默认值。NCBI BLAST算法按照生物相似性找到最相关的序列，但是不推荐用于少于20个残基的查询序列(Altschul等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],25:3389-3402,1997和Schaffer等人，Nucleic Acids Res[核酸研究],29:2994-3005,2001)。核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：相邻字长阈值＝11；E值截止值＝10；评分矩阵(Scoring Matrix)＝NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放＝5；以及空位延伸＝2。氨基酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：字长＝3；E值截止值＝10；评分矩阵＝BLOSUM62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。氨基酸序列同一性值百分比％由匹配的相同残基数目除以“参考”序列的残基总数来确定。BLAST算法将“参比”序列称为“查询”序列。

如本文所用的，“同源蛋白质”或“同源木聚糖酶”是指在一级、二级和/或三级结构中具有不同相似性的蛋白质。当比对蛋白质时，蛋白质同源性可以是指线性氨基酸序列的相似性。蛋白质序列的同源搜索可以使用来自NCBI BLAST的BLASTP和PSI-BLAST使用阈值(E值截止值)0.001进行。(Altschul SF,Madde TL,Shaffer AA,Zhang J,Zhang Z,MillerW,Lipman DJ.Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein databasesearch programs.[空位BLAST和PSI BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序]NucleicAcids Res[核酸研究]1997年第1组；25(17):3389-402)。使用该信息，可以将蛋白质序列分组。可以使用氨基酸序列构建系统发育树。

可以使用LASERGENE生物信息计算包的Megalign程序(DNASTAR公司，麦迪逊，威斯康星州)、Vector NTI v.7.0的AlignX程序(Informax公司，贝塞斯达，马里兰州)或EMBOSS开放软件包(EMBL-EBI；Rice等人,Trends in Genetics[遗传学趋势]16,(6):276-277(2000))进行序列比对和百分比同一性计算。可以使用具有默认参数的CLUSTAL比对方法(例如CLUSTALW；例如版本1.83)(Higgins和Sharp,CABIOS，5:151-153(1989)；Higgins等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680(1994)；和Chenna等人,Nucleic AcidsRes[核酸研究]31(13):3497-500(2003))(其可通过欧洲生物信息学研究所从欧洲分子生物学实验室获得)来执行序列的多重比对。用于CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括空位存在罚分＝15、空位延伸＝0.2、矩阵＝Gonnet(例如，Gonnet250)、蛋白结束空位(ENDGAP)＝-1、蛋白空位距离(GAPDIST)＝4和KTUPLE＝1。在一个实施例中，在慢比对情况下，使用快或慢比对以及默认设置。可替代地，可以修饰使用CLUSTALW方法(例如版本1.83)的参数以同样使用KTUPLE＝1、空位罚分＝10、空位延伸＝1、矩阵＝BLOSUM(例如BLOSUM64)、窗口(WINDOW)＝5和顶部存储的对角线(TOP DIAGONALS SAVED)＝5。

MUSCLE程序(Robert C.Edgar,MUSCLE:multiple sequence alignment withhigh accuracy and high throughput[MUSCLE：具有高精确度和高通量的多序列比对],Nucl.Acids Res.[核酸研究](2004)32(5):1792-1797)是多重序列比对算法的又另一个实例。

关于多肽，术语“变体”是指与指定的野生型、亲本或参比多肽不同的多肽，因为它包括一种或多种天然发生的或人造的氨基酸取代、插入或缺失。类似地，关于多核苷酸，术语“变体”是指在核苷酸序列中与指定的野生型、亲本或参考多核苷酸不同的多核苷酸。野生型、亲本或参考多肽或多核苷酸的特性将从上下文中显而易见。变体多肽序列或多核苷酸序列可以与本文公开的序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述变体氨基酸序列或多核苷酸序列具有与所公开的序列相同的功能，或具有所公开的序列的功能的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。

术语“质粒”、“载体”和“盒”意指染色体外元件，其通常携带非细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常呈双链DNA的形式。这样的元件可以是衍生自任何来源的、单链或双链DNA或RNA的、处于直链或环状形式的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体、或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已经被连接或重组成能够将目的多核苷酸引入细胞中的独特构造。“转化盒”是指包含基因并具有促进特定宿主细胞转化的基因之外的元件的特定载体。术语“表达盒”和“表达载体”在本文中可互换使用，并且是指含有基因并具有允许在宿主中表达所述基因的基因之外的元件的特定载体。

如本文所用的，术语“表达”是指处于前体抑或成熟形式的功能性终产物(例如，mRNA或蛋白质)的生产。表达也可指将mRNA翻译成多肽。

基因的表达涉及所述基因的转录并将mRNA翻译成前体或成熟蛋白。“成熟”蛋白指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何信号序列、原肽(prepeptide)或前肽(propeptide)的多肽。“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的原肽和前肽。前肽或原肽可以是但不限于细胞内定位信号。“稳定转化”是指将核酸片段转移至宿主生物体的基因组中，包括细胞核的和细胞器的基因组，导致遗传稳定的遗传。相比之下，“瞬时转化”是指将核酸片段转移至宿主生物体的细胞核中或含有DNA的细胞器中，导致基因表达而无整合或稳定的遗传。

所述表达载体可以是用于转化本领域已知的合适的生产宿主的任何数量的载体或盒中的一种。通常，所述载体或盒将包括指导相关基因的转录和翻译的序列、可选择标记、和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体通常包括含有转录起始控制的基因的5'区和控制转录终止的DNA片段的3'区。两个控制区都可以衍生自与转化的生产宿主细胞的基因同源的基因和/或对所述生产宿主来说是天然的基因，尽管这样的控制区不需要如此衍生。

可以包含在表达载体中的可能的起始控制区或启动子是众多的并且是本领域技术人员熟悉的。实际上任何能够驱动这些基因的启动子都是合适的，包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属(Pichia)中表达)；以及lac、araB、tet、trp、lP_L、lP_R、T7、tac、和trc(用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达)以及用于在芽孢杆菌中表达的amy、apr、npr启动子和各种噬菌体启动子。在一些实施例中，所述启动子是组成型或诱导型启动子。“组成型启动子”是一种在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”或“阻抑型”启动子是指在环境调节或发育调节下具有活性的启动子。在一些实施例中，启动子是诱导型或阻抑型的，原因是环境因素的变化，所述环境因素包括但不限于碳、氮或其他营养素可用性、温度、pH、渗透压、一种或多种重金属的存在、一种或多种抑制剂的浓度、胁迫或上述因素的组合，如在本领域中已知的。在一些实施例中，诱导型或阻抑型的启动子是通过代谢因素诱导或阻抑的，例如某些碳源的水平、某些能量源的水平、某些分解代谢物的水平、或上述因素的组合，如在本领域中已知的。在一个实施例中，所述启动子是对宿主细胞天然的启动子。例如，在一些情况下，当里氏木霉(Trichoderma reesei)为宿主时，启动子可以是天然的里氏木霉(T.reesei)启动子，例如cbh1启动子，其保藏在GenBank中的登录号D86235下。其他合适的用于真菌表达的启动子的非限制性实例包括cbh2、egl1、egl2、egl3、egl4、egl5、xyn1、和xyn2，产黄青霉菌(P.chrysogenus)的阻抑型酸性磷酸酶基因(phoA)启动子(参见例如Graessle等人,(1997)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学],63:753-756)，葡萄糖阻抑型PCK1启动子(参见例如Leuker等人,(1997),Gene[基因],192:235-240)，麦芽糖诱导型、葡萄糖阻抑型MET3启动子(参见Liu等人,(2006),Eukary.Cell[真核细胞],5:638-649)，pKi启动子和cpc1启动子。其他有用启动子的实例包括来自泡盛曲霉(A.awamori)和黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶基因的启动子(参见Nunberg等人,(1984)Mol.Cell Biol.[分子与细胞生物学]15 4:2306-2315和Boel等人,(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3:1581-1585)。此外，里氏木霉xln1基因的启动子可能是有用的(参见例如EPA 137280Al)。

控制转录终止的DNA片段也可以衍生自对优选的生产宿主细胞来说是天然的各种基因。在某些实施例中，包括终止控制区是任选的。在某些实施例中，所述表达载体包括衍生自优选的宿主细胞的终止控制区。

所述表达载体可以包括在所述生产宿主中，具体是在微生物生产宿主的细胞中。所述生产宿主细胞可以是在真菌或细菌家族中发现的微生物宿主，并且其在大范围的温度、pH值和溶剂耐受性下生长。例如，预期细菌、藻类和真菌(如丝状真菌和酵母)中的任何一种可以合适地容纳所述表达载体。

在所述生产宿主细胞中包括所述表达载体可以用于表达目的蛋白质，使得其可以存在于细胞内、细胞外或细胞内和细胞外的组合中。与用于回收细胞内表达所产生的蛋白质的方法相比，细胞外表达使从发酵产物中回收所需蛋白质更容易。

可以任选地从生产宿主中回收所需蛋白质。在另一方面，通过使用本领域技术人员已知的任何方法获得了含木聚糖酶的培养物上清液。

从宿主细胞中分泌的酶可以用于全培养液制剂中。可以使用本领域已知的任何培养方法来实现重组微生物的所消耗的全发酵液的制备，从而导致木聚糖酶的表达。术语“所消耗的全发酵液”在本文中定义为包括培养基、胞外蛋白质(例如，酶)和细胞生物质的发酵材料的未分级内容物。应当理解，术语“所消耗的全发酵液”还涵盖已经使用本领域熟知的方法裂解或透化的细胞生物质。

从宿主细胞中分泌的酶可方便地通过熟知的程序从培养基中回收，所述程序包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，并借助于盐(例如硫酸铵)沉淀培养基的蛋白质组分，然后使用色谱法，例如离子交换色谱法、亲和色谱法等。

发酵、分离和浓缩技术是本领域熟知的，并且可使用常规方法来制备含浓缩的木聚糖酶多肽的溶液。发酵后，获得发酵液，通过常规分离技术去除微生物细胞和各种悬浮固体(包括剩余的粗发酵材料)，以便获得木聚糖酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、旋转真空鼓式过滤、超滤、离心然后超滤、提取或色谱法等。

期望浓缩含有变体木聚糖酶多肽的溶液以优化回收。使用未浓缩的溶液需要增加孵育时间以收集富集或纯化的酶沉淀物。使用常规浓缩技术浓缩含酶溶液，直至获得所需的酶水平。含酶溶液的浓缩可以通过在本文中所讨论的技术中的任一种来实现。富集和纯化的示例性方法包括但不限于旋转真空过滤和/或超滤。

另外，可以使用例如沉淀剂(例如金属卤化物沉淀剂)来进行所需蛋白质产物的浓缩。金属卤化物沉淀剂，氯化钠，也可用作防腐剂。金属卤化物沉淀剂以有效沉淀木聚糖酶的量使用。常规测试后，选择至少有效量和最佳量的金属卤化物以有效引起酶的沉淀，连同为了最大化回收的沉淀的条件，包括孵育时间、pH、温度和酶浓度，对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。一般情况下，向浓缩的酶溶液中添加至少约5％w/v(重量/体积)至约25％w/v的金属卤化物，并且通常为至少8％w/v。

沉淀酶的另一种替代方式是使用有机化合物。示例性有机化合物沉淀剂包括：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯、以及这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。有机化合物沉淀剂的添加可以在添加金属卤化物沉淀剂之前、与之同时或之后进行，并且添加两种沉淀剂，有机化合物和金属卤化物的添加可以依次或同时进行。一般情况下，有机沉淀剂选自由以下组成的组：4-羟基苯甲酸的碱金属盐(例如钠盐或钾盐)，和4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯，其中所述烷基基团含有1至12个碳原子，以及这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。另外的有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲酸甲酯(称为对羟基苯甲酸甲酯)、4-羟基苯甲酸丙酯(称为对羟基苯甲酸丙酯)。有关进一步的描述，参见例如美国专利号5,281,526。有机化合物沉淀剂的添加提供了沉淀条件在pH、温度、变体木聚糖酶浓度、沉淀剂浓度和孵育时间方面的高度灵活性的优点。通常，将至少约0.01％w/v且不超过约0.3％w/v的有机化合物沉淀剂添加到浓缩的酶溶液中。

孵育期后，然后通过常规分离技术(例如过滤、离心、微滤、旋转真空过滤、超滤、压滤、交叉膜微滤、交叉流膜微滤等)，将富集或纯化的酶与解离的色素和其他杂质分离，并且收集。通过用水洗涤沉淀物可以获得酶沉淀物的进一步富集或纯化。例如，用含有金属卤化物沉淀剂的水，或用含有金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水洗涤富集或纯化的酶沉淀物。

本文还描述了用于表达至少一种本文所述的多肽的重组微生物生产宿主，所述重组微生物生产宿主包含本文所述的重组构建体。在另一个实施例中，该重组微生物生产宿主选自由以下组成的组：细菌、真菌和藻类。

表达将被理解为包括产生至少一种本文所述的多肽的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

利用克隆方法对核酸序列进行修饰的技术是本领域中众所周知的。

编码木聚糖酶的多核苷酸可以以多种方式操作，以提供多核苷酸在异源微生物宿主细胞(例如芽孢杆菌属或木霉属)中的表达。在插入核酸构建体或载体之前对多核苷酸序列的操作可能是希望的或必需的，这取决于核酸构建体或载体或异源微生物宿主细胞。利用克隆方法修饰核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

上文定义了调控序列。它们包括表达木聚糖酶所必需或有利的所有组分。每个控制序列对于编码木聚糖酶的核苷酸序列来说可以是天然的或外来的。这种调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。出于引入促进调控序列与编码木聚糖酶的核苷酸序列的编码区进行连接的特异性限制位点的目的，这些调控序列可以提供有多个接头。

包含编码木聚糖酶的多核苷酸的核酸构建体可以与一种或多种控制序列有效地连接，所述控制序列能够在与控制序列相容的条件下指导编码序列在异源微生物(例如芽孢杆菌属)宿主细胞中表达。

每个控制序列对于编码木聚糖酶的多核苷酸来说可以是天然的或外来的。这种控制序列包括但不限于前导序列、启动子、信号序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码木聚糖酶的多核苷酸的编码区进行连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

控制序列可以是适当的启动子区，即异源微生物宿主细胞识别的核苷酸序列，用于表达编码木聚糖酶的多核苷酸。启动子区含有介导木聚糖酶表达的转录控制序列。启动子区可以是在所选择的芽孢杆菌属宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，并且可以从指导合成具有生物活性的胞外或胞内多肽的、与芽孢杆菌属宿主细胞同源或异源的基因获得。

启动子区可包含单个启动子或启动子的组合。当启动子区包含启动子的组合时，启动子优选地串联。启动子区的启动子可以是任何启动子，所述启动子可以引发编码在目的异源微生物宿主细胞中具有生物活性的多肽的多核苷酸的转录。启动子相对于编码具有生物活性的多肽的核苷酸序列可以是天然的、外源的或其组合。这种启动子可以从指导合成具有生物活性的胞外或胞内多肽的、与异源微生物宿主细胞同源或异源的基因中获得。

因此，在某些实施例中，启动子区包含从细菌来源获得的启动子。在其他实施例中，启动子区包含从革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌获得的启动子。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)和大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)和脲原体属(Ureaplasma)。

启动子区可包含获得自芽孢杆菌属菌株(例如，粘琼脂芽孢杆菌(Bacillusagaradherens)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis))的启动子；或获得自链霉菌属菌株(例如，变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus))的启动子。

启动子区可以包含是“共有”启动子的启动子，所述启动子具有针对“-35”区的序列TTGACA和针对“-10”区的TATAAT。共有启动子可以从任何可以在芽孢杆菌宿主细胞中起作用的启动子获得。“共有”启动子的构建可以通过使用本领域熟知的方法进行定点诱变来完成，以产生更完美地符合所建立的共有序列的启动子，所述共有序列是针对枯草芽孢杆菌的营养“σA型”启动子的“-10”和“-35”区(Voskuil等人,1995,Molecular Microbiology[分子微生物学]17:271-279)。

控制序列也可以是合适的转录终止子序列，如芽孢杆菌宿主细胞识别的终止转录的序列。终止子序列与编码木聚糖酶的核苷酸序列的3'末端有效地连接。可以使用任何在芽孢杆菌宿主细胞中起作用的终止子。

控制序列也可以是合适的前导序列，即对芽孢杆菌宿主细胞的翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与核苷酸序列的5'末端有效地连接，指导具有生物活性的多肽的合成。在所选择的芽孢杆菌宿主细胞中起作用的任何前导序列均可用于本发明。

控制序列也可以是mRNA稳定序列。术语“mRNA稳定序列”在本文中定义为位于启动子区下游和编码木聚糖酶的多核苷酸编码序列上游的序列，其中启动子区与所述序列有效地连接，使得可以加工从启动子区合成的所有mRNA以产生在转录物的5'末端具有稳定序列的mRNA转录物。例如，在mRNA转录物的5'末端存在这种稳定序列会增加它们的半衰期(Agaisse和Lereclus,1994，同上；Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。mRNA加工/稳定序列与细菌16S核糖体RNA的3'端互补。在某些实施例中，mRNA加工/稳定序列产生基本上单一大小的转录物，在转录物的5'末端具有稳定序列。mRNA加工/稳定序列优选地与细菌16S核糖体RNA的3'端互补。参见，美国专利号6,255,076和美国专利号5,955,310。

然后可以使用本领域已知的方法或本文所述的那些方法将核酸构建体引入芽孢杆菌属宿主细胞中，用于引入和表达木聚糖酶。

包含编码目的蛋白质的目的DNA的核酸构建体也可以如上所述类似地构建。

为了获得引入的DNA的目的蛋白质的分泌，控制序列还可以包含信号肽编码区，所述信号肽编码区编码与多肽的氨基末端连接的氨基酸序列，所述氨基酸序列可以指导表达的多肽进入细胞分泌途径。信号肽编码区相对于多肽可以是天然的或可以从外源获得。核苷酸序列的编码序列的5'末端可以固有地含有信号肽编码区，所述区在翻译阅读框中与编码分泌多肽的编码区的区段天然连接。可替代地，编码序列的5'末端可含有信号肽编码区，所述区对编码分泌多肽的编码序列部分而言是外源的。在编码序列通常不含有信号肽编码区的情况下，可能需要外源信号肽编码区。可替代地，外源信号肽编码区可简单地取代天然信号肽编码区，以相对于通常与编码序列相关的天然信号肽编码区获得增强的多肽分泌。信号肽编码区可以从芽孢杆菌属物种的淀粉酶或木聚糖酶基因获得。然而，任何能够指导表达的多肽进入所选择的芽孢杆菌宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可用于本发明。

用于芽孢杆菌宿主细胞的有效信号肽编码区是从以下获得的信号肽编码区：来自芽孢杆菌NCIB 11837的生麦芽糖淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA基因。

因此，可以构建包含编码木聚糖酶构建体的核酸的多核苷酸构建体，所述木聚糖酶构建体包含编码目的多肽(POI)的核酸，使宿主细胞表达目的多肽。由于遗传密码中已知的简并性，编码相同氨基酸序列的不同多核苷酸可以用本领域常规技术进行设计和制备。例如，可以应用密码子优化来优化具体宿主细胞中的生产。

可以将编码目的蛋白质的核酸掺入载体中，其中可以使用熟知的转化技术(例如本文所公开的那些技术)，将所述载体转移至宿主细胞中。

载体可以是可以转化到宿主细胞中并在宿主细胞内复制的任何载体。例如，包含编码POI的核酸的载体可以在作为繁殖和扩增载体的手段的细菌宿主细胞中转化并复制。载体也可以被转化到本公开的芽孢杆菌属表达宿主中，使得编码蛋白质的核酸(例如，ORF)可以被表达为功能性蛋白质。

可用常规技术修饰以包含并且表达编码POI的核酸的代表性载体是载体p2JM103BBI。

可以将编码木聚糖酶或POI的多核苷酸有效地连接到允许在宿主细胞中转录的合适的启动子上。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，并且可以衍生自编码与宿主细胞同源抑或异源的蛋白质的基因。评估启动子活性/强度的手段对于本领域技术人员是常规的。

(尤其是在细菌宿主细胞中)用于指导编码本公开的comS1多肽或POI的多核苷酸序列的转录的合适的启动子的实例包括大肠杆菌的乳糖操纵子的启动子、天蓝色链霉菌琼脂酶基因dagA或celA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。

用于指导编码POI的多核苷酸序列的转录的启动子可以是PCT国际公开WO 2001/51643中所阐述的野生型aprE启动子、突变体aprE启动子或共有aprE启动子。在某些其他实施例中，用于指导编码POI的多核苷酸序列的转录的启动子是野生型spoVG启动子、突变体spoVG启动子或共有spoVG启动子(Frisby和Zuber，1991)。

用于指导编码木聚糖酶或POI的多核苷酸序列转录的启动子是核糖体启动子，例如核糖体RNA启动子或核糖体蛋白质启动子。核糖体RNA启动子可以是衍生自枯草芽孢杆菌的rrn启动子，更具体地，rrn启动子可以是来自枯草芽孢杆菌rrnB、rrnI或rrnE核糖体启动子。在某些实施例中，核糖体RNA启动子是来自PCT国际公开号WO 2013/086219中阐述的来自枯草芽孢杆菌的P2 rrnI启动子。

合适的载体可以进一步包含使得所述载体能够在宿主细胞中复制的核酸序列。此类赋能的序列的实例包括质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、pIJ702等的复制起点。

合适的载体还可以包含可选择标记，例如其产物弥补分离的宿主细胞中的缺陷的基因，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等)的基因。

合适的表达载体典型地包括克隆载体的组分，例如允许载体在选择的宿主生物体中自主复制的元件和用于选择目的一个或多个表型可检测的标记。表达载体典型地还包含控制核苷酸序列，例如启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号以及任选地抑制子基因、一个或多个激活子基因序列、或类似序列。

此外，合适的表达载体可以进一步包含编码氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列能够将目的蛋白质靶向宿主细胞细胞器(如过氧化物酶体)或靶向具体宿主细胞区室。这样的靶向序列可以是例如氨基酸序列“SKL”。对于在控制序列的指导下进行表达，将目的蛋白质的核酸序列以合适的方式有效地连接到控制序列，使得表达发生。

如本文所述的用于连接编码目的蛋白质的DNA构建体、启动子、终止子和/或其他元件，并将它们插入到包含复制必需信息的适合载体中的方案是本领域技术人员熟知的。

包含多核苷酸构建体或表达载体的分离的细胞有利地用作重组产生POI的宿主细胞。所述细胞可以用编码POI的DNA构建体转化，方便地通过将构建体(按一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中。整合通常被认为是有利的，因为如此引入的DNA序列更可能稳定地维持在细胞中。DNA构建体整合到宿主染色体中可以应用常规方法进行，例如通过同源或异源重组。例如，PCT国际公开号WO 2002/14490描述了芽孢杆菌转化的方法、其转化体及其文库。可替代地，可以用如上所述的与不同类型的宿主细胞相关的表达载体转化细胞。

有时从表达宿主中缺失基因是有利的，其中基因缺陷可以通过表达载体治愈。已知的方法可用于获得具有一个或多个失活基因的细菌宿主细胞。可以通过完全或部分缺失，通过插入失活或通过使基因对其预期目的不起作用的任何其他方式使得所述基因被阻止表达功能性蛋白来完成基因灭活。

用于转化细菌和培养细菌的技术是本领域中标准和熟知的。它们可以用于转化本发明的改善宿主以产生目的重组蛋白。将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括如下技术如：转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染，例如脂质介导的转染和DEAE-糊精介导的转染；用磷酸钙DNA沉淀孵育；用DNA包被的微粒高速轰击；基因枪(gene gun)或生物射弹转化和原生质体融合等。Brigidi等人还公开了细菌的转化和表达方法(1990)。

将核酸转化为丝状真菌(例如曲霉属物种(Aspergillus spp.)，例如米曲霉(A.oryzae)或黑曲霉(A.niger)、灰腐质酶(H.grisea)、特异腐质霉(H.insolens)和里氏木霉)的方法是本领域熟知的。用于转化曲霉属宿主细胞的合适的程序描述于例如EP 238023中。用于转化木霉属宿主细胞的合适的程序描述于例如Steiger等人,2011,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]77:114-121。

生产宿主的选择可以是任何合适的微生物，如细菌、真菌和藻类。

典型地，选择将取决于编码木聚糖酶的基因及其来源。

将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括以下技术，例如转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染(例如脂质转染介导的和DEAE-右旋糖酐介导的转染)；与磷酸钙DNA沉淀一起孵育；用DNA包被的微粒高速轰击；以及原生质体融合。公开了可以使用的一般方法的基本文献包括Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第2版,1989)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual[基因转移和表达：实验室手册](1990)；以及Ausubel等人编辑,Current Protocols inMolecular Biology[分子生物学现代方法](1994))。本发明的转化的方法可以导致转化载体的全部或一部分稳定整合到宿主细胞(例如丝状真菌宿主细胞)的基因组中。然而，还考虑了导致维持自主复制的染色体外转化载体的转化。

许多标准转染方法可以用于产生表达大量木聚糖酶的细菌和丝状真菌(例如曲霉属或木霉属)细胞系。一些用于将DNA构建体引入木霉属的产纤维素酶菌株的公开的方法包括Lorito,Hayes,DiPietro和Harman,(1993)Curr.Genet.[当代遗传学]24:349-356；Goldman,VanMontagu和Herrera-Estrella,(1990)Curr.Genet.[当代遗传学]17:169-174；以及Penttila,Nevalainen,Ratto,Salminen和Knowles,(1987)Gene[基因]6:155-164，还参见USP 6.022,725；USP 6,268,328和Nevalainen等人,“The Molecular Biology ofTrichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous andHeterologous Genes”[木霉属的分子生物学及其在同源和异源基因表达中的应用],在Molecular Industrial Mycology[分子工业真菌学]中,编辑Leong和Berka,MarcelDekker Inc.[马塞尔德克尔公司],纽约州(1992)第129–148页；对于曲霉属，包括Yelton,Hamer和Timberlake,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]81:1470-1474；对于镰孢菌属，包括Bajar,Podila和Kolattukudy,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88:8202-8212；对于链霉菌属，包括Hopwood等人,1985,Genetic Manipulationof Streptomyces:Laboratory Manual[链霉菌属的遗传操作：实验室手册],The JohnInnes Foundation[约翰·英尼斯基金会],诺威奇,英国和Fernandez-Abalos等人,Microbiol[微生物学]149:1623–1632(2003)；以及对于芽孢杆菌属，包括Brigidi,DeRossi,Bertarini,Riccardi和Matteuzzi,(1990)FEMS Microbiol.Lett.[FEMS微生物学快报]55:135-138)。

然而，可以使用用于将外源核苷酸序列引入宿主细胞的任何熟知的程序。这些包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、基因枪法、脂质体、显微注射、原生质载体、病毒载体，以及用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA、或其他外源遗传材料引入宿主细胞的任何其他熟知方法(参见例如，Sambrook等人，同上)。还使用的是美国专利号6,255,115中描述的农杆菌介导的转染方法。只需要使用能够成功地将至少一个基因引入能够表达所述基因的宿主细胞中的具体基因工程化程序。

将表达载体引入细胞后，在有利于表达在启动子序列控制下的基因的条件下培养转染或转化的细胞。

用于培养细胞的培养基可以是适合于宿主细胞生长并获得具有木聚糖酶活性的多肽表达的任何常规培养基。合适的培养基和培养基组分可从商业供应商获得或可以根据公开的配方(例如，如在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中所述)来制备。

可以将从宿主细胞中分泌的具有木聚糖酶活性的多肽(最少的生产后加工)用作全肉汤制剂。

取决于所使用的宿主细胞，可以进行转录后和/或翻译后修饰。转录后和/或翻译后修饰的一个非限制性实例是多肽的“剪切”或“截短”。例如，这可以导致使木聚糖酶从无活性或基本上无活性的状态变为活性状态，如前肽在进行进一步的翻译后加工后成为具有酶活性的成熟肽的情况一样。在另一个情况下，该剪切可导致获得成熟木聚糖酶多肽并且进一步去除N或C-末端氨基酸以产生截短形式的保留酶促活性的木聚糖酶。

转录后或翻译后修饰的其他实例包括但不限于肉豆蔻酰化，糖基化，截短，脂化，以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化。本领域技术人员将认识到蛋白质可能经历的转录后或翻译后修饰的类型可取决于表达蛋白质的宿主生物体。

在一些实施例中，可以使用本领域已知的任何培养方法来实现重组微生物的所消耗的全发酵液的制备，从而导致木聚糖酶(即具有木聚糖酶活性的多肽)的表达。

因此，发酵可以理解为包括在实验室或工业发酵罐中在合适的培养基和木聚糖酶能够被表达或分离的条件下进行的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、补料分批发酵或固态发酵)。术语“所消耗的全发酵液”在本文中定义为包括培养基、胞外蛋白质(例如，酶)和细胞生物质的发酵材料的未分级内容物。应当理解，术语“所消耗的全发酵液”还涵盖已经使用本领域熟知的方法裂解或透化的细胞生物质。

宿主细胞可以在允许表达木聚糖酶的合适条件下培养。所述酶的表达可以是组成型的，使得它们能被连续产生，或诱导型的，需要刺激来启动表达。在诱导型表达的情况下，当需要时可通过例如向培养基中添加诱导物质，例如地塞米松或IPTG或槐糖来启动蛋白质生产。

本领域熟知的任何发酵方法都可以合适用来使如上所述的转化的或衍生的真菌菌株发酵。在一些实施例中，真菌细胞在分批或连续发酵条件下生长。

经典的分批发酵是封闭的系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成，并且所述组成在发酵期间不改变。在发酵开始时，用一种或多种所需生物体接种培养基。换言之，整个发酵过程发生而自始至终没有向发酵系统添加任何组分。

可替代地，分批发酵符合关于添加碳源的“分批”的资格。此外，通常在整个发酵过程中进行尝试来控制因素如pH和氧气浓度。通常，分批系统的代谢物和生物质组成不断变化直到发酵停止的时间。在分批培养中，细胞通过静态停滞期进展到高生长对数期，最后进入生长速率减少或停止的稳定期。不经处理，稳定期中的细胞将最终死亡。通常，在对数期的细胞负责产物的大量生产。标准分批系统的合适的变体是“补料分批发酵”系统。在典型的分批系统的这种变化中，随着发酵的进展，将底物以增量添加。当已知分解代谢物抑制将抑制细胞的代谢时和/或在发酵培养基中希望具有有限量的底物的情况下，补料分批系统是有用的。在补料分批系统中实际底物浓度的测量是困难的，并且因此基于可测量因素(例如pH、溶解的氧和废气(例如CO₂)的分压)的变化对其进行估计。分批和补料分批发酵是本领域熟知的。

连续发酵是另一种已知的发酵方法。它是开放的系统，在所述系统中，将定义的发酵培养基连续添加到生物反应器中，同时去除等量的条件培养基以用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的密度，其中将细胞主要维持在对数期生长。连续发酵允许对一种或多种影响细胞生长和/或产物浓度的因素进行调节。例如，限制营养素(如碳源或氮源)可以维持在固定的速率，并允许调节所有其他参数。在其他系统中，影响生长的许多因素可以不断改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力保持稳定态的生长条件。因此，由于转移培养基而引起的细胞损失应当与发酵中的细胞生长速率相平衡。调节用于连续发酵过程的营养素和生长因子的方法以及最大化产物形成速率的技术在工业微生物学领域中是熟知的。

分离和浓缩技术是本领域已知的，并且常规方法可用于制备包含本发明的木聚糖酶多肽的浓缩溶液或肉汤。

发酵后，获得发酵液，通过常规分离技术去除微生物细胞和各种悬浮固体(包括剩余的粗发酵材料)，以便获得木聚糖酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、旋转真空鼓式过滤、超滤、离心然后超滤、提取或色谱法等。

有时可能需要浓缩包含木聚糖酶多肽的溶液或肉汤以优化回收。使用未浓缩的溶液或肉汤通常会增加孵育时间，以便收集富集或纯化的酶沉淀。

可以使用常规浓缩技术浓缩含酶溶液直至获得所需酶水平。含酶溶液的浓缩可以通过在本文中所讨论的技术中的任一种来实现。富集和纯化方法的实例包括但不限于旋转真空过滤和/或超滤。

含木聚糖酶的溶液或肉汤可以浓缩直至浓缩的含木聚糖酶多肽的溶液或肉汤的酶活性达到所希望的水平。

可以使用例如沉淀剂，如金属卤化物沉淀剂进行浓缩。金属卤化物沉淀剂包括但不限于碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物中的两种或更多种的共混物。

示例性金属卤化物包括氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和这些金属卤化物中的两种或更多种的共混物。金属卤化物沉淀剂，氯化钠，也可用作防腐剂。对于生产规模的回收，可以如上一般情况下所述通过用聚合物絮凝除去细胞来富集或部分纯化木聚糖酶多肽。可替代地，可以通过微滤富集或纯化酶，然后使用可用的膜和设备通过超滤进行浓缩。然而，对于一些应用，酶不需要富集或纯化，并且可以裂解和使用全培养液培养物而无需进一步处理。然后可以将酶加工成例如颗粒。

木聚糖酶能以本领域技术人员已知的各种方式被分离或纯化，这取决于样品中存在的其他组分。标准纯化方法包括但不限于色谱法(例如，离子交换、亲和力、疏水性、色谱聚焦、免疫学和尺寸排阻)、电泳(例如，制备型等电聚焦)、差异溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、提取微量过滤、两相分离。例如，目的蛋白可以使用标准抗目的蛋白抗体柱进行纯化。超滤和渗滤技术联合蛋白浓缩也是有用的。对于合适的纯化技术中的一般指导，请参见Scopes,Protein Purification[蛋白质纯化](1982)。所需的纯化程度将根据目的蛋白质的用途而变化。在一些情况下，将不需要纯化。

用于检测和测量酶(例如木聚糖酶多肽)的酶活性的测定法是熟知的。用于检测和测量木聚糖酶的活性的多种测定法也是本领域普通技术人员已知的。

木聚糖酶活性可以使用Remazol brilliant blue R染色的可溶性4-O-甲基-D-葡糖醛酸-D-木聚糖(RBB-木聚糖)作为底物来确定。在未降解的高分子量RBB-木聚糖沉淀后，上清液的吸光度与通过酶处理产生的低分子量片段成正比。

测量木聚糖酶活性的另一种方法是测量其降解玉米DDGS或米糠中水不可提取的阿拉伯糖基木聚糖(WU-AX)的能力。例如，可以使用玉米DDGS或米糠(将其研磨至粒度<212μm并在缓冲液中水合至所需的pH，例如pH 6)的5％或10％底物溶液。用木聚糖酶孵育后，溶液中C5糖单元的总量可以通过道格拉斯方法，使用连续流动注射装置(例如来自斯卡拉分析公司(SKALAR Analytical)的连续流动注射装置)，以木糖当量进行测量，如Rouau X和Surget A(1994)所述。加热和低pH值的组合将导致阿拉伯糖基木聚糖分解为戊糖单糖、阿拉伯糖和木糖，它们将进一步脱水成糠醛。通过与间苯三酚反应，形成了有色复合物。通过以510nm作为参考波长在550nm处测量吸光度，可以使用木糖标准曲线以木糖当量来测量溶液中戊糖单糖的浓度。提取的阿拉伯糖基木聚糖可以按水合木糖当量的质量/底物质量来确定。结果报告为可提取的阿拉伯糖基木聚糖的增加，其计算为木聚糖酶处理样品和空白样品的提取的阿拉伯糖基木聚糖之间的差值。

在一个实施例中，公开了一种用于动物饲料的添加剂，所述动物饲料包含玉米或稻，所述饲料添加剂包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中不溶性葡糖醛酸木聚糖的降解大于单独使用任何一种酶情况下的降解。

所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属物种。该木聚糖酶目前被鉴定为GH30家族的成员。

所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自镰孢菌属物种。该木聚糖酶目前被鉴定为GH10家族的成员。

在另一个实施例中，可以如上文讨论的重组生产至少一种本文公开的木聚糖酶。

在仍另一个实施例中，公开了一种饲料添加剂，所述饲料添加剂包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中当与单独使用所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶相比，所述组合更好地刺激饲喂基于玉米的饮食的单胃动物消化道中有益细菌的生长。

肠道菌群、肠道微生物群或胃肠道微生物群是生活在人和其他动物消化道中的复杂微生物群落。某些肠道菌群与动物之间的关系不仅是共生的(即无害共存)，而且是互惠共生关系。一些动物肠道微生物通过将膳食纤维发酵成被动物吸收的短链脂肪酸(例如乙酸、丙酸和/或丁酸)而使动物受益。

在另一方面，公开了一种饲料添加剂，所述饲料添加剂包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中当与单独使用所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶相比，所述组合能够增加饲喂基于玉米的饮食的单胃动物中至少一种短链脂肪酸的生产。

所述短链脂肪酸选自由以下组成的组：乙酸、丙酸或丁酸。

在仍另一方面，本文所述的任何饲料添加剂可进一步包含一种或多种酶，所述一种或多种酶选自但不限于例如淀粉酶、蛋白酶、内切葡聚糖酶、纤维素酶、植酸酶等的酶。

可以使用范围从0.1至500微克/g饲料或进料的这些酶中的任一者。

淀粉酶如α-淀粉酶(α-1,4-葡萄糖-4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1.)水解淀粉内的α-1,4-糖苷键，主要是随机产生更小分子量的右旋糖酐。这些多肽主要用于淀粉加工和酒精生产。可以使用任何α-淀粉酶，例如美国专利号8,927,250和7,354,752中所述。

肌醇六磷酸酶是指能够催化植酸盐水解为(1)肌醇和/或(2)其一、二、三、四和/或五磷酸盐及(3)无机磷酸盐的蛋白质或多肽。例如，具有催化活性的酶如在酶委员会EC编号3.1.3.8或EC编号3.1.3.26中定义的。可以使用任何植酸酶，例如美国专利号8,144,046、8,673,609和8,053,221中所述。

葡聚糖酶是分解葡聚糖的酶，是几个葡萄糖亚单位组成的多糖。当它们进行糖苷键的水解时，它们是水解酶。β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)消化纤维。它有助于植物细胞壁(纤维素)的分解。

纤维素酶是由真菌、细菌和原生动物产生的几种酶的一种，它能催化溶纤作用、纤维素和一些相关多糖的分解。这个名称也用于任何自然发生的混合物或各种此类酶的复合物，这些酶连续或协同作用以分解纤维素材料。可以使用适合动物饲料的任何纤维素酶。

“蛋白酶”使衍生自微生物(例如真菌、细菌)或衍生自植物或动物的任何蛋白质或多肽结构域，且其具有催化肽键在蛋白质主链的一个或多个不同位置切割的能力(如E.C.3.4)。术语“蛋白酶”、“肽酶”和“朊酶”可以互换地使用。蛋白酶可以在动物、植物、真菌、细菌、古细菌和病毒中找到。蛋白质水解可通过目前被分为以下六大组的酶实现：天冬氨酰蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。可以使用适合动物饲料的任何蛋白酶。

在仍另一方面，所述饲料添加剂还可包含单独的或与至少一种如上所述的其他酶组合的至少一种DFM。

至少一种DFM可以包含至少一种活的微生物，例如活的细菌菌株或活的酵母或活的真菌。优选地，DFM包含至少一种活细菌。

DFM可能是一种形成孢子的菌株，因此术语DFM可能由孢子组成或包含孢子，例如细菌孢子。因此，如本文所用的“活的微生物”可能包括微生物孢子，如内孢子或分生孢子。可替代地，本文所述饲料添加剂组合物中的DFM可能不由微生物孢子组成或不包含微生物孢子，例如内孢子或分生孢子。

微生物可以是自然发生的微生物，也可以是转化的微生物。

本文所述的DFM可包含如下一个或多个属的微生物：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属、明串珠菌属(Leuconostoc)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、丙酸菌属(Propionibacterium)、双歧杆菌属、梭菌属和巨球型菌属(Megasphaera)及其组合。

优选地，DFM包含一种或多种选自以下的芽孢杆菌属物种的细菌菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)和解淀粉芽孢杆菌。

如本文所用的“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌属”内的所有物种，包括但不限于：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)、短小芽孢杆菌(B.pumilis)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。据认识，芽孢杆菌属继续经历分类学重组。因此，所述属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于例如嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”)或多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)(现在是“多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)”)的此类生物体。在胁迫环境条件下产生抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的定义性特征，尽管这个特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线性杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。

在另一方面，DFM可以进一步与如下乳杆菌属物种组合：乳脂链球菌(Lactococcuscremoris)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)及其组合。

DFM可以进一步与如下乳杆菌属物种组合：布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳酸杆菌(Lactobacilluscasei)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、双叉乳酸杆菌(Lactobacillusbifidus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、戴耳布吕克氏乳杆菌(Lactobacillus delbreuckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)及其任何组合。

在仍另一方面，DFM可以进一步与如下双歧杆菌属(Bifidobacteria)物种组合：乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidium)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、假小链双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、和角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、及其任何组合。

可以提到的细菌有以下几个物种：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、肠球菌、肠球菌属物种和片球菌属物种、乳杆菌属物种、双歧杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌(Pediococsus acidilactici)、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、枯草芽孢杆菌、特恩丙酸杆菌(Propionibacteriumthoenii)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacterium animalisssp.animalis)、罗伊氏乳杆菌、蜡样芽孢杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillussalivarius ssp.Salivarius)、丙酸杆菌物种及其组合。

本文所述的直接饲喂微生物包含一种或多种细菌菌株，可以是同一类型的(属、种和菌株)，也可以包含属、种和/或菌株的混合物。

可替代地，DFM可以与WO 2012110778中公开的一种或多种产品或这些产品中包含的微生物组合，总结如下：枯草芽孢杆菌菌株2084登录号NRRl B-50013、枯草芽孢杆菌菌株LSSAO1登录号NRRL B-50104、和枯草芽孢杆菌菌株15A-P4 ATCC登录号PTA-6507(来自

(以前称为

)；枯草芽孢杆菌菌株C3102(来自

)；枯草芽孢杆菌菌株PB6(来自

)；短小芽孢杆菌(8G-134)；肠球菌NCIMB 10415(SF68)(来自

)；枯草芽孢杆菌菌株C3102(来自

)；地衣芽孢杆菌(来自

)；肠球菌和片球菌(来自

)；乳杆菌、双歧杆菌和/或肠球菌来自

)；枯草芽孢杆菌菌株QST 713(来自

)；解淀粉芽孢杆菌CECT-5940(来自

Plus)；屎肠球菌(Enterococcus faecium)SF68(来自

)；枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(来自

)；乳酸菌7屎肠球菌(来自

)；芽孢杆菌菌株(来自

)；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(来自

)；肠球菌(来自Biomin

)；乳酸片球菌、肠球菌、动物双歧杆菌动物亚种、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种(来自Biomin

)；香肠乳杆菌(来自

)；肠球菌(来自Oralin

)；肠球菌(2个菌株)、乳酸乳球菌DSM 1103(来自Probios-pioneer

)；鼠李糖乳杆菌和香肠乳杆菌(来自

)；枯草芽孢杆菌(来自

)；肠球菌(来自

)；酿酒酵母(来自Levucell SB

)；酿酒酵母(来自Levucell SC 0&

ME)；乳酸片球菌(来自Bactocell)；酿酒酵母(来自

(以前称为

))；酿酒酵母NCYC Sc47(来自

SC47)；丁酸梭菌(来自

)；肠球菌(来自Fecinor和Fecinor

)；酿酒酵母NCYC R-625(来自

)；酿酒酵母(来自

)；肠球菌和鼠李糖乳杆菌(来自

)；枯草芽孢杆菌和米曲霉(来自

)；蜡样芽孢杆菌(来自

)；蜡样芽孢杆菌变体toyoi NCIMB 40112/CNCM I-1012(来自

)；或其他DFM，例如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(来自

YC)和枯草芽孢杆菌(来自

)。

DFM可能与

组合，

可商购自丹尼斯科公司(Danisco A/S)。Enviva

是芽孢杆菌属菌株2084登录号NRRl B-50013、芽孢杆菌属菌株LSSAO1登录号NRRL B-50104和芽孢杆菌属菌株15A-P4 ATCC登录号PTA-6507的组合(如在US 7,754,469 B中所教导的-通过引用并入本文)。

也可以将本文所述的DFM与来自以下属的酵母结合：酵母属(Saccharomyces)物种。

优选地，本文所述的DFM包括通常被认为是安全(GRAS)的微生物，优选地是经GRAS批准的微生物。

本领域普通技术人员将容易地知道来自本文所述属中的特定微生物物种和/或菌株，其用于食品和/或农业工业中并且其通常被认为适合于动物消费。

在某些实施例中，重要的是DFM具有对热的耐受性，即耐热性。当饲料被压成丸粒时尤其如此。因此，在另一个实施例中，DFM可能是耐热微生物，例如耐热细菌，包括例如芽孢杆菌属物种。

在其他方面，可能需要DFM包含产孢子细菌，例如芽孢杆菌纲，例如芽孢杆菌属物种。芽孢杆菌纲能在生长不利的条件下形成稳定的内生孢子，对热、pH、水分和消毒剂有很强的抵抗力。

本文所述的DFM可减少或阻止致病性微生物(如产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属(Salmonella)物种和/或弯曲杆菌属(Campylobacter)物种)在肠道内的建立。换句话说，DFM可能具有抗致病性。如本文所用的术语“抗致病性”，是指DFM抵抗病原体的作用(负面影响)。

如上所述，DFM可以是任何合适的DFM。例如，下面的测定“DFM测定”可以用来确定微生物是否适合成为DFM。如本文所用的DFM测定在US2009/0280090中有更详细的说明。为了避免疑问，根据本文所讲授的“DFM测定”，选择作为抑制性菌株(或抗致病性DFM)的DFM，是一种适合于根据本公开使用的DFM，即跟据本公开的饲料添加剂组合物中使用的DFM。

每根试管中都植入了来自代表性簇的代表性病原体(如细菌)。

来自潜在DFM的上清液，经好氧或厌氧培养，被添加到接种的管中(不添加上清液的对照组除外)并孵育。孵育后，对每一种病原菌分别测定对照和处理的上清的管的光密度(OD)。

与对照组(不含任何上清液)相比，产生了较低的OD的(潜在的DFM)菌株的集落可以将其分类为抑制性菌株(或抗致病性DFM)。因此，如本文所用的DFM测定在US 2009/0280090中有更详细的说明。

优选地，本DFM测定中使用的代表性病原体可以是下列一种(或多种)：梭菌属，例如产气荚膜梭菌和/或艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌物种和/或弯曲杆菌物种。在一个优选的实施例中，所述测定用一个或多个产气荚膜梭菌和/或艰难梭状芽孢杆菌和/或大肠杆菌，优选地产气荚膜梭菌和/或艰难梭状芽孢杆菌，更优选地产气荚膜梭菌进行。

抗致病性DFM包括以下一种或多种细菌，并描述于WO 2013029013中：

枯草芽孢杆菌菌株3BP5(登录号NRRL B-50510)、

解淀粉芽孢杆菌菌株918ATCC登录号NRRL B-50508、和

解淀粉芽孢杆菌菌株1013ATCC登录号NRRL B-50509。

DFM可以作为一种或多种培养物和一种或多种运载体制备(如果使用的话)，并可以将它们添加到条带或桨式混合机中，并且混合约15分钟，尽管时间可以增加或减少。将组分混合，这样使得导致培养物和载体的均匀混合物。最终产物优选地为干燥的可流动粉末。DFM包括含一种或多种细菌菌株，然后可以将其添加到动物饲料或饲料预混物，添加到动物的水，或以其他本领域已知的途径施用(优选地与本文所述的酶同时)。

在DFM混合物中包含单个菌株的比例可以从1％到99％不等，优选从25％到75％不等。

动物饲料中DFM的适合剂量范围为约1x10³ CFU/g饲料至约1x10¹⁰ CFU/g饲料，合适地在约1x10⁴ CFU/g饲料至约1x10⁸ CFU/g饲料之间，适当地在约7.5x10⁴ CFU/g饲料至约1x10⁷ CFU/g饲料之间。

在另一方面，喂养料中DFM的剂量超过约1x10³ CFU/g饲料，适当地超过约1x10⁴CFU/g饲料，合适地超过约5x10⁴ CFU/g饲料，或适当地超过约1x10⁵ CFU/g饲料。

饲料添加剂组合物中DFM的剂量从约1x10³ CFU/g组合物至约1x10¹³ CFU/g组合物，优选1x10⁵ CFU/g组合物至约1x10¹³ CFU/g组合物，更优选在约1x10⁶ CFU/g组合物至约1x10¹² CFU/g组合物之间，并且最优选在约3.75x10⁷ CFU/g组合物至约1x10¹¹ CFU/g组合物之间。在另一方面，饲料添加剂组合物中DFM的剂量大于约1x10⁵ CFU/g组合物，优选大于约1x10⁶ CFU/g组合物，并且最优选大于约3.75x10⁷ CFU/g组合物。在一个实施例中，饲料添加剂组合物中DFM的剂量大于约2x10⁵ CFU/g组合物，适当地大于约2x10⁶ CFU/g组合物，合适地大于约3.75x10⁷ CFU/g组合物。

本文所述的任何饲料添加剂除了单独使用的或(a)与至少一种直接饲喂微生物组合、或(b)与至少一种其他酶组合、或(c)与至少一种直接饲喂微生物和至少一种其他酶组合使用的本文所述的GH 30葡糖醛酸木聚糖酶和GH10木聚糖酶以外，还可以包含(d)选自由以下组成的组的至少一种组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。

在仍另一方面，公开了用于在动物饲料中使用的颗粒状饲料添加剂组合物，所述颗粒状饲料添加剂组合物包含至少一种具有如本文所述的木聚糖酶活性的多肽，所述至少一种多肽单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组合、或与至少一种其他酶组合、或与至少一种直接饲喂微生物和至少一种其他酶组合使用，其中所述颗粒状饲料添加剂组合物包含通过选自由以下组成的组的方法产生的颗粒：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床凝集、流化床喷涂、喷雾干燥、冷冻干燥、造粒、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片或上述方法的任何组合。

此外，颗粒状饲料添加剂组合物的颗粒可具有大于50微米并且小于2000微米的平均直径。

饲料添加剂组合物可以是液体形式，并且液体形式也可以适合于在饲料丸粒上喷雾干燥。

动物饲料可以包括植物材料，如玉米、小麦、高粱、大豆、低芥酸菜籽、向日葵，或针对家禽、猪、反刍动物、水产养殖和宠物的这些植物材料或植物蛋白源中的任何的混合物。本文所关注的动物饲料是包含玉米或稻的基于谷类的动物饲料。预期动物性能参数，如生长、采食量和饲料效率，但同时均匀性改善、动物房内的氨浓度降低以及因此动物的福利和健康状况改善，都将得到改进。更具体地，如本文所用的“动物性能”可以通过动物的饲料效率和/或增重和/或通过饲料转化率和/或通过饲料中的营养素的消化率(例如氨基酸消化率)和/或饲料中的可消化能或代谢能和/或通过氮保留量和/或通过动物避免坏死性肠炎的负面影响的能力和/或通过受试者的免疫应答来确定。

优选地，“动物性能”通过饲料效率和/或动物增重和/或饲料转化率来确定。

“改善的动物性能”意指与不包含本发明的饲料添加剂组合物的饲料相比，由于使用所述饲料添加剂组合物，受试者中的饲料效率增加和/或增重增加和/或饲料转化率降低和/或饲料中的营养素或能量的消化率改善和/或氮保留量改善和/或避免坏死性肠炎的负面影响的能力改善和/或免疫应答改善。

优选地，“改善的动物性能”意指存在增加的饲料效率、和/或增加的增重、和/或降低的饲料转化率。如本文所用的，术语“饲料效率”是指当一段时间内给动物无限制地喂食或饲喂规定量的食物时出现的动物增重的量。

“增加的饲料效率”意指与在不存在根据本发明的饲料添加剂组合物的情况下饲喂的动物相比，在饲料中使用本发明的饲料添加剂组合物导致每单位饲料摄入量中增重增加。

如本文所用的，术语“饲料转化率”是指饲喂给动物以使动物体重增加的规定量的饲料量。

改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。

“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”意指在饲料中使用饲料添加剂组合物导致动物增重指定量饲喂给动物的所需要的饲料量低于饲料添加剂组合物的情况下使动物增重相同量时所需的饲料量。

如本文所用的营养素消化率是指从胃肠道或胃肠道特定区段(例如小肠)消失的营养素的比率。营养素消化率可测量为所施用至受试者的营养素与受试者粪便中所排出来的营养素之间的差值、或施用至受试者的营养素与保留在胃肠道指定区段(例如回肠)上的消化物中的营养素之间的差值。

如本文所用的，营养素消化率可以测量为通过一段时间内营养素摄入量与通过排泄物完全收集而得出的营养素的排出量之间的差异；或通过使用惰性标记来测量，其中所述惰性标记不被动物吸收并允许研究者可计算在整个胃肠道或胃肠道的一部分消失的营养素的量。这样的惰性标记可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可以表示为在饲料中营养素的百分比，或表示为可消化的营养素的质量单位/饲料中的营养素的质量单位。

如本文所用的营养素消化率涵盖淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。

如本文所用的能量消化率意指所消费的饲料总能量减去粪便的总能量，或所消费的饲料总能量减去动物胃肠道指定区段(例如回肠)中剩余消化物的总能量。如本文所用的，代谢能是指表观代谢能，并且意指所消耗的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中包含的总能量。可使用与测定营养素消化率相同的方法，通过总能量的摄入量与粪便排出的总能量之间的差值，或与胃肠道特定区段(例如回肠)中存在的消化物总能量之间的差值来测量能量消化率和代谢能，同时对氮排泄进行适当校正来计算饲料的代谢能。

在一些实施例中，本文所述的组合物可提高受试者对膳食半纤维素或纤维的消化率或利用率。在一些实施例中，所述受试者是猪。

如本文所用的氮保留意指受试者将饮食中的氮保有为体重的能力。当氮排泄量超过每日摄入量时，会出现负的氮平衡，肌肉减少时通常会观察到此现象。正的氮平衡常常与肌肉生长相关，尤其是对于生长期动物来说。

氮保留可以测量为在一段时间内氮的摄入量与通过排泄物和尿液完全收集而得出的氮排出量之间的差值。应当理解，排出的氮包括饲料中未消化的蛋白质、内源性蛋白质的分泌物、微生物蛋白质和尿氮。

如本文所用的术语存活率，是指存活的受试者人数。术语“改善的生存率”是“降低的死亡率”的另一种说法。

如本文所用的术语屠体收率是指经过商业或实验宰杀过程之后，作为活体重量一部分的屠体的量。术语屠体意指为食用而已被宰杀，并去除头部、内脏、四肢部分、和羽毛或皮的动物躯体。如本文所用的，术语产肉量是指作为活体重量一部分的可食用肉量，或作为活体重量一部分的特定肉块量。

“增加的增重”是指与饲喂不含所述饲料添加剂组合物的饲料的动物相比，饲喂包含饲料添加剂组合物的饲料时动物体重增加。

在本发明上下文中，术语“宠物食品”旨在被理解为意指用于以下的食品：家庭动物，例如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、南美栗鼠、褐鼠、豚鼠；鸟类宠物，例如金丝雀、长尾小鹦鹉和鹦鹉；爬行动物宠物，例如海龟、蜥蜴和蛇；以及水生宠物，例如热带鱼和青蛙。

在另一个实施例中，公开了一种基于玉米的动物饲料，所述动物饲料包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的GH30酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的GH10酶，其中当与单独使用GH10木聚糖酶相比，所述组合更好地刺激单胃动物消化道中有益细菌的生长。

还公开了一种基于玉米的动物饲料，所述动物饲料包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的GH30酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的GH10酶，其中当与单独使用GH10相比，所述组合能够增加单胃动物中至少一种短链脂肪酸的生产。

所述短链脂肪酸可以选自由以下组成的组：乙酸、丙酸和丁酸。

该动物饲料可进一步包含至少一种DFM或至少一种其他酶，或至少一种DFM与一种或多种如本文已经描述的其他酶的组合。

术语“动物饲料组合物”、“饲料”、“喂养料”和“秣料(fodder)”可互换地使用，并且包含选自下组的一种或多种饲料原料，所述组包含：a)谷类，如小粒谷物(如小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷物，如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，如玉米蛋白粉、具有可溶物的干酒糟(Distillers Dried Grains with Solubles)(DDGS)(具体是基于玉米的具有可溶物的干酒糟(cDDGS))、小麦麸、粗小麦粉、次小麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获得自以下来源的蛋白质：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获得自植物和动物来源的油和脂肪；和/或e)矿物质和维生素。

术语“谷类”用于描述培养用以得到可食用的谷类成分(植物学上是称为颖果的一种水果)(由其胚乳、胚芽和麸皮组成)的任何禾草。与其他任何类型的作物相比，谷类谷类(例如玉米和稻)在世界范围内的种植数量更大，可提供更多的食物能量，因此是主要作物。

术语“饲料添加剂”、“饲料添加剂组合物”和“酶组合物”在本文中可互换地使用。

取决于用途和/或应用模式和/或施用模式，饲料可呈溶液形式或呈固体形式或呈半固体形式。

当用作或用于制备饲料(如功能性饲料)时，本文所述的酶或饲料添加剂组合物可以与以下中的一种或多种结合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。例如，提及选自由以下组成的组的至少一种组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。

在另一方面，将本文公开的饲料添加剂与饲料组分混合以形成喂养料。如本文所用的，“饲料组分”意指喂养料的全部或部分。喂养料的部分可意指喂养料的一种成分或喂养料的一种以上(例如2种或3种或4种或更多种)成分。在一个实施例中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物成分。优选地，饲料可以是秣料或其预混物、复合饲料或其预混物。可以将所述饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分混合或将其混合至复合饲料的预混物或混合至秣料、秣料组分或秣料的预混物中。

本文所述的任何喂养料可包含一种或多种选自包含以下的组的饲料材料：a)谷类，如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦、黑小麦及其组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，如玉米蛋白粉、湿饼(特别是基于玉米的湿饼)、干酒糟(DDG)(特别是基于玉米的干酒糟(cDDG))、具有可溶物的干酒糟(DDGS)(特别是基于玉米的具有可溶物的干酒糟(cDDGS))、麦麸、粗小麦粉、次小麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获得自以下来源的蛋白质：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。

如本文所用的，术语“秣料”意指提供给动物的任何食物(而不是动物必须自己觅食)。秣料涵盖已经切下的植物。此外，秣料包括青贮饲料、压缩的和压成丸粒的饲料、油和混合口粮，并且还包括发芽谷物和豆类。

秣料可以获得自选自以下的植物中的一种或多种：玉米(玉蜀黍)、苜蓿(紫苜蓿)、大麦、百脉根、芸苔属、休马流甘兰(Chau moellier)、羽衣甘蓝、油菜籽(低芥酸菜籽)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、萝卜、三叶草、杂种三叶草、红三叶草、地下三叶草、白三叶草、羊茅草、雀麦草、粟、燕麦、高粱、大豆、树(用作树干草的修剪下的树嫩枝)、小麦、和豆科植物。

术语“复合饲料”意指呈粗粉、丸粒、球丸(nut)、饼或碎屑形式的商业饲料。复合饲料可由多种原料和添加剂共混而来。根据目标动物的特定需求配制这些共混物。

复合饲料可以是提供所有每日所需营养素的完全饲料、提供口粮(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供另外的微量营养素(如矿物质和维生素)的补充剂。

用于复合饲料中的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、小麦、低芥酸菜籽粉、油菜籽粉、羽扇豆、大豆、高粱、燕麦和大麦。

合适地，如本文所提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，所述微量成分为如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。

在一个实施例中，喂养料包含以下或由以下组成：玉米、DDGS(例如，cDDGS)、小麦、麦麸、或其任何组合。

在一个实施例中，饲料组分可为玉米、DDGS(例如，cDDGS)、小麦、麦麸、或其组合。在一个实施例中，喂养料包含以下或由以下组成：玉米、DDGS(例如，cDDGS)或其组合。

本文所述的喂养料可含有按重量计至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的玉米和大豆粉或玉米及全脂大豆、或者小麦粉或向日葵粉。

例如，喂养料可以含有约5％至约40％的玉米DDGS。对于家禽，所述喂养料平均可含有约7％至15％的玉米DDGS。对于猪(swine或pig)，所述喂养料可含有平均5％至40％的玉米DDGS。它也可以含有玉米作为单一谷物，在这种情况下，所述喂养料可以包含约35％至约80％的玉米。

在包含混合谷物(例如包含如玉米和小麦)的喂养料中，所述喂养料可包含至少10％的玉米。

另外或可替代地，喂养料也可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物以提供高纤维喂养料。高纤维饲料材料的实例包括：小麦、大麦、黑麦、燕麦，来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、玉米蛋白饲料、湿饼、干酒糟(DDG)、具有可溶物的干酒糟(DDGS)、麦麸、粗小麦粉、次小麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣。一些蛋白质源也可视为高纤维：获得自例如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花等来源的蛋白质。在一个方面，如本文所述的喂养料包含选自由以下组成的组的至少一种高纤维材料和/或所述至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物：例如具有可溶物的干酒糟(DDGS)(具体是cDDGS)、湿饼、干酒糟(DDG)(具体是cDDG)、小麦麸和小麦。在一个实施例中，本发明的喂养料包含选自由以下组成的组的至少一种高纤维材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物：例如含可溶物干酒糟(DDGS)(特别是cDDGS)、麦麸和小麦。

所述饲料可以是以下中的一种或多种：复合饲料和预混物，包括丸粒、球丸(nut)或(牲畜用)饼状物；作物或作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、椰子核、稻草、谷壳、甜菜残渣；鱼粉；肉粉和骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；低聚糖；糖渍饲用植物：青贮饲料；海草；种子和谷物，完整的或通过压碎、研磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。

如本文所用的，术语“饲料”在一些实施例中涵盖宠物食物。宠物食物是旨在由宠物消费的植物或动物材料，如狗食或猫食。宠物食物(如狗食和猫食)可以干燥形式(如用于狗的磨碎食物)或湿罐装形式。猫食可含有氨基酸牛磺酸。

动物饲料还可以包括鱼食。鱼食通常含有使养殖鱼保持良好健康所需的大量营养素、痕量元素和维生素。鱼食可以呈小片、丸粒或片的形式。压成丸粒的形式(其中的一些快速沉降)经常用于较大鱼或底饲物种。一些鱼食还含有添加剂(如β胡萝卜素或性激素)以人工增强观赏性鱼的颜色。

在仍另一方面，动物饲料涵盖鸟食。鸟食包括用于喂鸟器中以及用于饲喂宠物鸟的食物。典型地，鸟食由多种种子组成，但也可涵盖板油(牛肉或羊肉脂肪)。

如本文所用的，术语“接触”是指间接或直接将木聚糖酶(或包含木聚糖酶的组合物)应用到产品(例如饲料)中。可以使用的应用方法的实例包括但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品、通过将饲料添加剂组合物与产品混合而直接应用、将饲料添加剂组合物喷涂至产品表面上或将产品浸入饲料添加剂木聚糖酶组合物的制剂中。在一个实施例中，优选地将本发明的饲料添加剂组合物与产品(例如喂养料)混合。可替代地，喂养料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。对于一些应用而言，重要的是，使组合物在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表面。这允许所述组合物赋予性能益处。

在一些方面，所述的饲料添加剂用于食品或饲料的预处理。例如，将具有10％-300％的水分的饲料混合，并与木聚糖酶在5℃-80℃下孵育，优选地在25℃-50℃，更优选地在30℃-45℃之间在有氧条件下孵育1分钟至72小时或在厌氧条件下孵育1天至2个月。经预处理的材料可以直接饲喂给动物(所谓的液体饲喂)。经预处理的材料也可以在升高的温度(60℃-120℃)下蒸汽压成丸粒。木聚糖酶可以通过真空喷涂机浸渍到饲料或食品材料中。

此类饲料添加剂可以与受控量的一种或多种酶一起应用以散布、涂布和/或浸渍产品(例如喂养料或喂养料的原始成分)。

优选地，饲料添加剂组合物将是热稳定的以便进行高至约70℃、高至约85℃、或高至约95℃的热处理。热处理可以进行长达约1分钟；长达约5分钟；长达约10分钟；长达约30分钟；长达约60分钟。术语“热稳定”意指加热至特定温度之前添加剂中存在/有活性的酶组分和/或DFM的至少约75％在冷却至室温之后仍存在/有活性。优选地，加热至特定温度之前添加剂中存在且有活性的木聚糖酶组分和/或包含一种或多种细菌菌株的DFM的至少约80％在冷却至室温之后仍存在且有活性。在一个特别优选的实施例中，将饲料添加剂均化，以制成粉末。

可替代地，将饲料添加剂配制成如WO 2007/044968中所述的颗粒(称为TPT颗粒)，所述文献通过引用并入本文。

在另一个优选的实施例中，当将饲料添加剂配制成颗粒时，这些颗粒包含喷涂在蛋白质核心上的水合屏障盐。此类的盐涂层的优点在于使耐热性改善、使储存稳定性改善和保护免受其他原本会不利影响所述至少一种木聚糖酶和/或包含一种或多种细菌菌株的DFM的饲料添加剂的影响。优选地，用于盐涂层的盐在20℃具有大于0.25的水活度或大于60％的恒定湿度。优选地，盐涂层包含Na₂SO₄。

制备饲料添加剂的方法也可包括将粉末制成丸粒的另外的步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可强加力使粉末、或包含粉末的混合物通过模具，并将所得线料切成适宜的不同长度的丸粒。

任选地，制粒步骤可包括在丸粒形成之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调节器中，例如带有蒸汽注射的搅拌器。将混合物在达到指定温度的调节器中加热，例如从60℃-100℃，典型的温度将是70℃、80℃、85℃、90℃、或95℃。停留时间可以是从几秒钟到几分钟并且甚至几小时不等。如5秒钟、10秒钟、15秒钟、30秒钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。应当理解，本文所述的木聚糖酶(或包含木聚糖酶的组合物)适于添加至任何适当的饲料材料中。

技术人员应当理解，不同的动物要求不同的喂养料，甚至同一种动物也可能要求不同的喂养料，这取决于饲养所述动物的目的。

任选地，喂养料还可含有另外的矿物质(如，例如钙)和/或另外的维生素。在一些实施例中，喂养料为玉米大豆粉混合物。

喂养料典型地在饲料磨机中生产，在磨机中首先将原料研磨成合适的粒度，然后与适当的添加剂混合。然后，可以将喂养料生产成糊状或丸粒；后者通常涉及这样的方法，通过所述方法将温度升高至目标水平，然后使饲料通过模具从而生产出特定大小的丸粒。让丸粒冷却。随后，可添加液体添加剂例如脂肪和酶。制备喂养料也可涉及另外的步骤，所述步骤包括制粒之前的挤出或膨化，具体是通过至少可包括使用蒸汽的适宜技术进行的挤出或膨化。

所述饲料添加剂和/或包含所述饲料添加剂的喂养料可以任何合适的形式使用。所述饲料添加剂组合物能以固体或液体配制品或其替代物形式使用。固体制剂的实例包括粉剂、糊剂、大丸粒、胶囊剂、丸粒、片剂、尘剂和颗粒，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的实例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液、悬浮液和乳液。

在一些应用中，可将所述饲料添加剂与饲料混合或在饮用水中施用。

将如本文所教导的饲料添加剂与饲料可接受载体、稀释剂或赋形剂混合，并且(任选地)进行包装。

可将喂养料和/或饲料添加剂与至少一种矿物质和/或至少一种维生素混合。由此衍生的组合物可在本文中称为预混物。

基于纯酶蛋白，木聚糖酶和葡糖醛酸木聚糖酶在喂养料中可以以1ppb(十亿分之几)到10％(w/w)的范围存在。在一些实施例中，木聚糖酶在喂养料中以0.1-100ppm(百万分之一)的范围存在。优选剂量可以是0.2-20g木聚糖酶/吨饲料产品或饲料组合物，或在最终产品中0.2-20ppm木聚糖酶的最终剂量。

优选地，喂养料中存在的木聚糖酶应为至少约250XU/kg或至少约500XU/kg饲料、至少约750XU/kg饲料、或至少约1000XU/kg饲料、或至少约1500XU/kg饲料、或至少约2000XU/kg饲料、或至少约2500XU/kg饲料、或至少约3000XU/kg饲料、或至少约3500XU/kg饲料、或至少约4000XU/kg饲料。

在另一方面，如本文所述的木聚糖酶可以在喂养料中以低于约30,000XU/kg饲料、或以低于约20,000XU/kg饲料、或以低于约10,000XU/kg饲料、或以低于约8000XU/kg饲料、或以低于约6000XU/kg饲料、或以低于约5000XU/kg饲料存在。

范围可以包括但不限于上面讨论的较低和较高范围的任何组合。

木聚糖酶活性可以以在pH 5.0用AZCL-阿拉伯糖基木聚糖(天青蛋白(azurine)交联的小麦阿拉伯糖基木聚糖，Xylazyme片剂，麦格酶公司(Megazyme))作为底物测量的木聚糖酶单位(XU)表示。被内切-(1-4)-β-D-木聚糖酶(木聚糖酶)水解产生水溶性染色片段，并且释放这些水溶性染色片段的速度(在590nm处吸光度增加)可与酶活性直接相关。相对于酶标准(Danisco木聚糖酶，可获得自丹尼斯科动物营养公司(Danisco AnimalNutrition))，在标准反应条件(40℃，10min反应时间，在麦基尔文(McIlvaine)缓冲液(pH5.0)中)下测定木聚糖酶单位(XU)。

在pH 5.3和50℃，根据从燕麦木聚糖(oat-spelt-xylan)底物中释放的还原糖端基的量/分钟来确定标准酶的木聚糖酶活性。还原糖端基与3,5-二硝基水杨酸反应，并且反应产物的形成可测量为在540nm处吸光度的增加。相对于木糖标准曲线(还原糖当量)来定量所述酶活性。一个木聚糖酶单位(XU)是在pH 5.3和50℃，释放0.5μmol还原糖当量的标准酶的量/分钟。

本文公开的组合物和方法的非限制性实例包括：

1.一种用于动物饲料的添加剂，所述动物饲料包含玉米或稻，所述饲料添加剂包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中不溶性葡糖醛酸木聚糖的降解大于单独使用任何一种酶情况下的降解。

2.如实施例1所述的饲料添加剂，其中所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属物种。

3.如实施例1所述的饲料添加剂，其中所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自镰孢菌属物种。

4.如实施例1所述的饲料添加剂，其中重组生产所述木聚糖酶中的至少一种。

5.一种饲料添加剂，所述饲料添加剂包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中当与单独使用所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶相比，所述组合更好地刺激饲喂基于玉米的饮食的单胃动物消化道中有益细菌的生长。

6.一种饲料添加剂，所述饲料添加剂包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中当与单独使用所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶相比，所述组合能够增加饲喂基于玉米的饮食的单胃动物中至少一种短链脂肪酸的生产。

7.如实施例6所述的饲料添加剂，其中所述短链脂肪酸选自由以下组成的组：乙酸、丙酸或丁酸。

8.如实施例1-7中任一项所述的饲料添加剂，所述饲料添加剂进一步包含选自由以下组成的组的一种或多种酶：淀粉酶、蛋白酶、内切葡聚糖酶和植酸酶。

9.一种预混物，所述预混物包含如实施例1-7中任一项所述的饲料添加剂和至少一种维生素和/或矿物质。

10.一种基于玉米或稻的动物饲料，所述动物饲料包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中不溶性葡糖醛酸木聚糖的降解大于单独使用任何一种酶情况下的降解。

11.一种基于玉米的动物饲料，所述动物饲料包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中当与单独使用所述具有的木聚糖酶相比，所述组合更好地刺激单胃动物消化道中有益细菌的生长。

12.一种基于玉米的动物饲料，所述动物饲料包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中当与单独使用所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶相比，所述组合能够增加单胃动物中至少一种短链脂肪酸的生产。

13.如实施例12所述的动物饲料，其中所述短链脂肪酸选自由以下组成的组：乙酸、丙酸或丁酸。

14.如实施例11-13中任一项所述的动物饲料，所述动物饲料进一步包含选自由以下组成的组的一种或多种酶：淀粉酶、蛋白酶、内切葡聚糖酶和植酸酶。

实例

除非在本文中另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。Singleton等人,DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典],第2版,John Wileyand Sons[约翰威利父子公司],纽约(1994)，以及Hale和Marham,THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典],Harper Perennial[哈珀永久出版社],纽约州(1991)为技术人员提供了本公开中所使用的许多术语的通用词典。

本公开在下面的实例中进一步定义。应当理解，所述实例尽管说明了某些实施例，但仅以示例的方式给出。从以上的讨论和所述实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的本质特征，并且在不脱离本公开的实质和范围的情况下，可进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。

实例1

测定

蛋白质确定。纯化的蛋白质样品的浓度根据制造商的说明，使用A280方法在NanoDrop 2000分光光度计(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.))中测量。每种蛋白质的消光系数(0.1％)用于蛋白质浓度计算。BsuGH30和BliXyn1的消光系数(0.1％)为2.1，FveXyn4和FveXyn4.v1的消光系数分别为1.8和1.9。

木聚糖酶活性测定。1％(w/w)底物溶液：将0.2g用Remazol brilliant blue R染色的4-O-甲基-D-葡糖醛酸-D-木聚糖(RBB-木聚糖)(Sigma目录号66960)与100mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)混合，并在搅拌下煮沸直至粉末溶解。冷却至室温后，将溶液的最终重量调节至20g。

在试管中，将500μL酶溶液与500μL 1％(w/w)底物溶液混合。将混合物在50℃孵育30分钟。停止反应，并通过添加5mL 96％乙醇来沉淀高分子量片段，随后混合。将试管在室温下放置10分钟，然后重复混合并在20℃以1500x g离心10分钟。响应被测量为上清液在585nm和445nm处的吸光度之差。

水不可提取的阿拉伯糖基木聚糖(WU-AX)的降解以木聚糖酶处理后可提取的阿拉 伯糖基木聚糖的增加来测量。5％或10％底物溶液：使研磨至粒度<212μm的玉米DDGS或米糠在100mM MES缓冲液(pH 6.0)中通过在600rpm搅拌15分钟来水合。随后，将pH调节至pH6.0。将190μL/孔的底物溶液转移到底物板上，将其在-20℃储存直至使用。

所有稀释液均由Biomek分配机器人(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，美国)在96孔板(底物板和收集板：透明聚苯乙烯微板，康宁公司(Corning)，目录号9017；滤板：0.2μm PVDF膜，康宁公司，目录号3504)中制备。

将所有酶用稀释缓冲液(50mM乙酸钠缓冲液，pH 5.0)稀释。将10μL溶液添加到预制底物板中。对于空白样品，添加10μL稀释缓冲液；对于单一酶的测试，添加10μL酶溶液或5μL酶溶液和5μL稀释缓冲液；并且对于组合的测试，添加5μL每种酶溶液。在iEMS微板孵育器(赛默科技公司(Thermo Scientific))中，在40℃下将板孵育120分钟。孵育结束后，将样品转移至滤板，将滤板置于收集板的顶部并以1666x g离心10分钟。将收集板储存在-20℃，随后用DI水稀释10倍，然后进行进一步分析。

将溶液中C5糖单元的总量通过道格拉斯方法，使用连续流动注射装置(斯卡拉分析公司，布雷达(Breda)，荷兰)，以木糖当量进行测量，如Rouau X和Surget A(1994)所述。加热和低pH值的组合将导致阿拉伯糖基木聚糖分解为戊糖单糖、阿拉伯糖和木糖，它们将进一步脱水成糠醛。通过与间苯三酚反应，形成了有色复合物。

基本上，将过滤后的样品在95℃用CH₃COOH和HCl的55:1混合物以及溶于乙醇的20％间苯三酚(1,3,5-三羟基苯，默克公司(Merck)目录号107069)溶液处理。通过以510nm作为参考波长在550nm处测量吸光度，使用木糖标准曲线(5-300μg木糖/mL)以木糖当量来测量溶液中戊糖单糖的浓度。与戊糖-间苯三酚复合物不同，己糖-间苯三酚复合物的吸光度在这些波长下是恒定的。

按水合木糖当量(摩尔质量：150.13g/mol)的质量/底物质量(cDDGS或米糠)来确定提取的阿拉伯糖基木聚糖。结果报告为可提取的阿拉伯糖基木聚糖的增加，其计算为所述酶处理样品和空白样品的提取的阿拉伯糖基木聚糖之间的差值。

计算：

·酶包含率(μg/g)＝酶样品体积(μL)x酶样品浓度(μg/mL)/(190μL x底物浓度(g/mL))

·提取的阿拉伯糖基木聚糖(mg/g)＝木糖当量浓度(mg/mL)x 200μL/(190μL x底物浓度(g/mL))

·可提取的阿拉伯糖基木聚糖的增加(mg/g)＝酶处理的样品的提取的阿拉伯糖基木聚糖(mg/g)-空白样品的提取的阿拉伯糖基木聚糖(mg/g)

胃蛋白酶暴露后的性能：用溶液A(含0.2mg/mL胃蛋白酶的100mM甘氨酸缓冲液，pH3.5)将酶样品稀释至终浓度2μg/mL，或在溶液B(50mM乙酸钠缓冲液，pH 5.0)中作为对照，并在40℃在iEMS振荡器(赛默科技公司)中振荡孵育2小时。孵育结束后，使用上述WU-AX降解测定将胃蛋白酶处理的样品(在溶液A中稀释)的性能与对照样品(在溶液B中稀释)的性能进行比较。

实例2

GH30葡糖醛酸木聚糖酶的鉴定

三种GH30葡糖醛酸木聚糖酶：从NCBI数据库中鉴定了BsuGH30(也称为XynC)、BliXyn1和BamGh2(登录号分别为WP_063694996.1、WP_035400315.1和ABS74177)。另外，这些葡糖醛酸木聚糖酶的同源物通过对沙福芽孢杆菌、浸麻类芽孢杆菌、库氏类芽孢杆菌DSM16944、和苔原类芽孢杆菌DSM 21291菌株的基因组进行测序来鉴定。使用Illumina下一代测序技术对这些生物的整个基因组进行测序，并进行组装，并对重叠群进行注释。表3列出了基因和天然蛋白质的供体生物来源、蛋白质名称和SEQ ID号。

实例3

GH30葡糖醛酸木聚糖酶的克隆和表达

使用本领域已知的技术产生编码实例2(表1)中所述的七种同源葡糖醛酸木聚糖酶基因的合成基因，并将其插入表达载体p2JM103BBI(Vogtentanz,Protein Expr Purif[蛋白质表达纯化],55:40-52,2007)中。得到的表达质粒含有：aprE启动子(SEQ ID No43)、aprE信号序列(SEQ ID No.44代表氨基酸序列)、在5’末端编码三肽Ala-Gly-Lys的寡核苷酸、编码目的葡糖醛酸木聚糖酶基因的成熟区的合成核苷酸序列(SEQ ID No.15、17、19、21、23、25或27)和AprE终止子(SEQ ID No 45)。表4提供了用于GH30表达的每个重组基因的序列表编号以及所得全长和成熟蛋白质序列。

用每种表达质粒转化合适的枯草芽孢杆菌宿主菌株，并将转化的细胞涂布在补充有5ppm氯霉素的卢里亚琼脂板上。为了产生上文列出的每种酶，使含有质粒的枯草芽孢杆菌转化体在250mL摇瓶中在补充有另外的5mM CaCl₂的MOPS基确定成分培养基中生长。

实例4

葡糖醛酸木聚糖酶的纯化

在三个色谱步骤中纯化BsuGH30。首先将平衡到20mM磷酸钠(pH 6.0)中的澄清培养物上清液加载到SP阳离子交换柱上，用盐(NaCl)梯度洗脱。在加载到HiLoad phenyl-HPSepharose柱上之前，将含有目的蛋白质的级分调节至1M硫酸铵，并用在20mM Tris(pH7.0)中的1M-0硫酸铵梯度洗脱。然后将含有目的蛋白质的级分加载到Superdex 75柱上，并用20mM磷酸钠(pH 7.0)和0.15M NaCl洗脱。

在两个色谱步骤中纯化BliXyn1和BsaXyn1酶。将澄清的培养物上清液浓缩并平衡到0.8M的硫酸铵中，然后加载到Phenyl Sepharose HP柱上。用20mM Tris-HCl(pH 7.5)洗脱含有目的蛋白质的级分，合并，浓缩并加载到Superdex 75柱上，并用含0.15M NaCl的20mM Tris-HCl(pH 7.5)洗脱。

在两个色谱步骤中纯化BamGh2。浓缩澄清的培养物上清液，用20mM磷酸钠(pH 6)平衡，加载到SP阳离子交换柱上，并用0-200mM NaCl梯度洗脱目的蛋白质。浓缩含有目的蛋白质的级分，加载到Superdex 75柱上，并用具有0.15M NaCl的20mM磷酸钠(pH 7.0)洗脱。

在三个步骤中纯化PmaXyn4。将澄清的培养物上清液调节至65％饱和硫酸铵至。收集沉淀物并将其悬浮于具有1M硫酸铵的20mM乙酸钠(pH 5)中，加载到HiPrep phenyl-FFSepharose柱上，并用缓冲液中的1-0M硫酸铵梯度洗脱。合并含有目的蛋白质的级分，脱盐，加载到HiPrep SP-XL Sepharose阳离子交换柱上，并用0-0.5M NaCl线性梯度洗脱目标蛋白。

在两个色谱步骤中纯化PcoXyn1和PtuXyn2酶。将澄清的培养物上清液浓缩，并用1M硫酸铵平衡，然后加载到phenyl-HP Sepharose柱上。用在20mM Tris(pH 8.0)中1-0M硫酸铵的梯度洗脱含有目的蛋白质的级分，合并级分并将其加载到HiPrep Q-XL Sepharose阴离子交换柱上。用0-0.5M NaCl的梯度洗脱蛋白质。

在所有情况下，色谱树脂均获得自通用医疗公司(GE Healthcare)色谱柱，合并含有经纯化的目标蛋白的最终柱级分并使用10K Amicon Ultra-15装置浓缩。最终产物的纯度为90％-95％(通过SDS-PAGE确定)，并调整为40％甘油，并储存在-20℃或-80℃直至使用。

实例5

BsuGH30和BliXyn1的木聚糖酶活性

BsuGH30、BliXyn1和GH10木聚糖酶FveXyn4.v1(在专利申请WO 2015114112中描述)的木聚糖酶活性使用Remazol brilliant blue R染色的可溶性4-O-甲基-D-葡糖醛酸-D-木聚糖(RBB-木聚糖)作为底物测定。在未降解的高分子量RBB-木聚糖沉淀后，上清液的吸光度与通过酶处理产生的低分子量片段成正比。尽管BsuGH30和BliXyn1均表现出木聚糖酶活性，但从图1所示的结果可以清楚地看出，在相同的酶浓度下，BsuGH30和BliXyn1产生的低分子量片段的量比FveXyn4.v1产生的少，而且在给定的底物浓度下获得的低分子量片段的最大量方面也是如此。在该测定中，两种GH30酶的性能不如GH10酶，但BsuGH30和BliXyn1出人意料擅长如下所述的从玉米中降解水不可提取的阿拉伯糖基木聚糖(WU-AX)。

实例6

通过BsuGH30和BliXyn1降解玉米DDGS中的WU-AX

使用实例1中所述的测定，测试了BsuGH30和BliXyn1酶与GH10酶FveXyn4(在专利申请WO 2014020142中描述)和FveXyn4.v1(在专利申请WO 2015114112中描述)一起降解玉米DDGS中水不可提取的阿拉伯糖基木聚糖(WU-AX)的能力。图2显示了用酶将研磨的玉米DDGS孵育2小时后，可提取的阿拉伯糖基木聚糖的增加。数据显示，当使用相同的酶浓度进行测试时，相比于与FveXyn4和FveXyn4.v1酶一起孵育后，与BsuGH30和BliXyn1一起孵育后可提取的阿拉伯糖基木聚糖的量要多得多。先前已经显示FveXyn4在降解水不可提取的玉米DDGS方面是有效的(专利号WO 2014020142)，但是GH30酶显示出更高的降解玉米DDGS中水不可提取的阿拉伯糖基木聚糖的能力。

实例7

通过额外的GH30葡糖醛酸木聚糖酶降解玉米DDGS中的WU-AX

使用实例1中所述的测定，测试了七种GH30葡糖醛酸木聚糖酶(BsuGH30、BliXyn1、BamGh2、BsaXyn1、PmaXyn4、PcoXyn1和PtuXyn2)和两种GH10酶(FveXyn4和FveXyn4.v1)降解研磨的玉米DDGS中水不可提取的阿拉伯糖基木聚糖的能力。以增加的浓度测试了七种GH30葡糖醛酸木聚糖酶和两种GH10酶，并且图3显示了当使用12.6μg酶/g玉米DDGS时获得的结果。结果显示当在相同剂量下测试时，与GH10酶FveXyn4和FveXyn4.v1一起孵育相比，与所有测试的GH30葡糖醛酸木聚糖酶一起孵育产生更多的可提取阿拉伯糖基木聚糖。

实例8

通过GH30葡糖醛酸木聚糖酶与GH10木聚糖酶的组合降解玉米DDGS和米糠中的WU-AX

使用玉米DDGS作为底物评估了GH30葡糖醛酸木聚糖酶与GH10木聚糖酶的组合。图5(A和B)显示了单独的GH30酶以及与GH10木聚糖酶FveXyn4或FveXyn4.v1组合的结果。将GH10木聚糖酶添加到GH30酶中增强了可提取阿拉伯糖基木聚糖的增加。对于BsuGH30、BamGh2、PcoXyn1和PtuXyn2，与单独使用3.2μg/g GH30酶相比用3.2μg/g GH30酶加3.2μg/gGH10木聚糖酶的组合获得的可提取阿拉伯糖基木聚糖的额外的增加等于单独使用3.2μg/gGH10木聚糖酶获得的增加，从而证明了这些GH30酶和测试的GH10酶的性能的完全加和性。通过将由用3.2μg/g GH30酶加3.2μg/g GH10木聚糖酶的组合获得的增加值与通过单独分别使用3.2μg/g GH30酶和3.2μg/g GH10木聚糖酶获得的增加值之和进行比较，在图4中说明了这一点。

还使用米糠作为底物评估了GH30葡糖醛酸木聚糖酶和GH10木聚糖酶的组合。图5A分别和组合显示了FveXyn4 GH10和BsuGH30 GH30酶的结果，图5B分别和组合显示了FveXyn4.v1 GH10和BliXyn1 GH30酶的结果(剂量：0至12.6μg/g米糠浓度)。添加FveXyn4、FveXyn4.v1、BsuGH30和BliXyn1分别观察到可提取的阿拉伯糖基木聚糖的增加。在所有情况下，发现GH10和GH30酶的组合具有协同作用，因为在相同的总酶浓度下，所有测试的组合均导致比测试的单个酶更大的可提取的阿拉伯糖基木聚糖的增加；例如，使用12.6μg/g的BliXyn1或FveXyn4.v1获得了可提取的阿拉伯糖基木聚糖的相当的增加(分别为7.6和7.4mg/g)，但是在总酶浓度仅为6.3μg/g的情况下(使用BliXyn1和FveXyn4.v1的1:1混合物)或在总酶浓度为7.1μg/g的情况下(使用BliXyn1和FveXyn4.v1的1:8混合物)可获得相同的增加(7.5mg/g)。

实例9

胃蛋白酶暴露后BsuGH30和BliXyn1的性能

如实例1中所述将BsuGH30和BliXyn1的样品与胃蛋白酶一起孵育以评估它们在胃蛋白酶暴露后的性能。图6显示了将研磨的玉米DDGS与对照酶样品(已暴露于温和条件(pH5.0))和相应酶样品(已暴露于胃蛋白酶(pH 3.5))一起孵育后可提取的阿拉伯糖基木聚糖的增加。测试的酶包含物对应于1.1μg/g玉米DDGS。胃蛋白酶暴露后，BsuGH30和BliXyn1都维持从玉米DDGS降解WU-AX的能力，尽管性能有所下降。

实例10

在GH10和GH30酶存在下的离体猪结肠发酵研究

后肠气体产生的增加与单胃中肠道健康的改善有关，并由于细菌代谢的底物的增加反映出对有益细菌生长的刺激。对气体产生的统计学显著影响(通常>5％)表明测试产品(例如添加到饲料产品中的酶)提供了益处。肠道健康的另一个重要度量是短链脂肪酸(SCFA)的生产增加，短链脂肪酸是大肠中细菌代谢的主要最终产物，主要是由碳水化合物降解产生的(Macfarlane S.,Macfarlane G.T.(2003).Regulation of short-chainfatty acid production.[短链脂肪酸的生产的调节]Proceedings of the NutritionSociety.[营养学会会报]62.第67-72页)。在下文描述的研究中，测试了单独的FveXyn4.v1和FveXyn4.v1加BsuGH30酶对猪离体消化物的作用，结果如下所示。

用于离体模拟的底物的制备：从用含有5％小麦和15％玉米DDGS的基于玉米的饮食饲喂的猪收集来自回肠末端、盲肠和近端结肠的消化物。使用高速离心(18 000×g)，将样品分离为液相和固相。将液相在-20℃储存直至使用。将固相用缓冲液(pH＝5.0)进一步洗涤三遍，以除去消化物中存在的大多数细菌，并在55℃干燥。

模拟方案：根据底物(固相和液相)中干物质(DM)的量，给予酶。表5提供了酶剂量的概述。将进料酶剂量/克饲料乘以系数2.2，以补偿由于上消化道中易消化的营养物质(例如淀粉)的消化和吸收而导致的DM降低。

在开始模拟之前，从两只猪的远端结肠中收集新鲜的接种物。在厌氧手套箱中，将接种物悬浮在底物的液相中，并通过不锈钢网(1mm)分配。将接种物、底物(固相和液相)、缓冲液(pH 6.5)和添加剂添加到厌氧培养室内的模拟容器中。模拟容器的总体积为15ml，其含有0.59g(液相为0.08g，固相为0.51g)底物衍生的干物质和1.5％接种物。用厚丁基橡胶塞密封容器，转移至37℃，并以100rpm在旋转振荡器中连续混合。表4中列出的每种处理均进行3次重复。进行孵育18小时。

分析的参数：

细菌气体产生。通过用连接到精确15-ml玻璃注射器(带有灵敏的经打磨的柱塞)的针头刺穿橡胶塞来测量总气体产生。在4、8、10、12、15和18小时模拟时记录从容器释放的气体量，并将其用作细菌活性的一般量度。

短链脂肪酸。在18小时模拟结束时，通过用连接到1ml注射器的针头刺穿丁基橡胶塞，从三个重复容器中取出1ml子样品。从这些子样品中，使用特戊酸作为内标，通过气相色谱法分析了短链脂肪酸(SCFA)。测量了乙酸、丙酸和丁酸。

统计分析由对所有测量的参数的双尾t检验组成。针对阴性对照处理进行了测试，没有对测试产品进行修改。根据学生t检验的显著性：p值<0.05*，p值<0.01**。

表6和表7总结了这种离体猪发酵研究的结果。如表6所示，FveXyn4.v1和BsuGH30的组合显著增加了微生物气体形成，而仅具有FveXyn4.v1的包含物却没有增加微生物气体形成。

此外，孵育18小时后，与对照(不含酶)相比，加入FveXyn4.v1和BsuGH30酶的组合可观察到乙酸、丙酸和丁酸的生产的显著增加。相比之下，单独的FveXyn4.v1仅产生丁酸的产生增加，这是统计学上显著的(表7)。

实例11

葡糖醛酸木聚糖酶序列的比较

使用针对公共和基因组查询专利数据库(其中搜索参数设置为默认值)的BsuGH30(SEQ ID NO:29)、BliXyn1(SEQ ID NO:30)、BamGh2(SEQ ID NO:31)、BsaXyn1(SEQ ID NO:32)、PmaXyn4(SEQ ID NO:33)、PcoXyn1(SEQ ID NO:34)、和PtuXyn2(SEQ ID NO:35)的成熟氨基酸序列，通过BLAST搜索(Altschul等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],25:3389-402,1997)鉴定了相关蛋白质，并且子集分别显示于表8A和8B(BsuGH30)、表9A和9B(BliXyn1)、表10A和10B(BamGh2)；表11A和11B(BsaXyn1)、表12A和12B(PmaXyn4)、表13A和13B(PcoXyn1)、以及表14A和14B(PtuXyn2)。将两个搜索集的百分比同一性(PID)定义为相同残基的数量除以成对比对中经比对残基的数量。表上标有“序列长度”的值对应于以所列出的登录号提及的蛋白质的长度(以氨基酸计)，而“比对长度”涉及用于比对和PID计算的序列。

将全长蛋白质BsuGH30(SEQ ID NO:2)、BliXyn1(SEQ ID NO:4)、BamGh2(SEQ IDNO:6)、BsaXyn1(SEQ ID NO:8)、PmaXyn4(SEQ ID NO:10)、PcoXyn1(SEQ ID NO:12)、和PtuXyn2(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列与来自表3-9的其他GH30木聚糖酶的序列使用来自Geneious软件的MUSCLE程序(生物物质有限公司(Biomatters Ltd.))(RobertC.Edgar.MUSCLE:multiple sequence alignment with high accuracy and highthroughput[MUSCLE：具有高精确度和高通量的多重序列比对],Nucl.Acids Res.[核酸研究](2004)32(5):1792-1797)使用默认参数进行比对。多重序列比对如图7所示。表15中显示了GH30葡糖醛酸木聚糖酶的成熟氨基酸序列的百分比同一性。

Claims (40)

1.一种用于动物饲料的添加剂，所述动物饲料包含玉米或稻，所述饲料添加剂包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中不溶性葡糖醛酸木聚糖的降解大于单独使用任何一种酶情况下的降解。

2.一种饲料添加剂，所述饲料添加剂包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中当与单独使用所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶相比，所述组合更好地刺激饲喂基于玉米的饮食的单胃动物消化道中有益细菌的生长。

3.一种饲料添加剂，所述饲料添加剂包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中当与单独使用所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶相比，所述组合能够增加饲喂基于玉米的饮食的单胃动物中至少一种短链脂肪酸的生产。

4.如权利要求3所述的饲料添加剂，其中所述短链脂肪酸选自由以下组成的组：乙酸、丙酸或丁酸。

5.如权利要求1-4中任一项所述的添加剂，其中所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶是GH30葡糖醛酸木聚糖酶。

6.如权利要求5所述的添加剂，其中所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自芽孢杆菌属(Bacillus)或类芽孢杆菌属(Paenibacillus)物种。

7.如权利要求5或权利要求6所述的添加剂，其中所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)。

8.如权利要求6所述的添加剂组合物，其中所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶包含与选自由以下组成的组的多肽具有至少90％序列同一性的多肽：SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、和SEQ ID NO:42。

9.如权利要求8所述的添加剂，其中所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶包含选自由以下组成的组的多肽：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、和SEQ ID NO:42。

10.如权利要求1-9中任一项所述的添加剂，其中所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自丝状真菌。

11.如权利要求10所述的添加剂，其中所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶包含与选自由以下组成的组的多肽具有至少90％序列同一性的多肽：SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48、和SEQ ID NO:52。

12.如权利要求1-11中任一项所述的添加剂，其中重组生产所述木聚糖酶中的至少一种。

13.如权利要求1-12中任一项所述的添加剂，所述添加剂进一步包含(a)选自由以下组成的组的一种或多种酶：淀粉酶、蛋白酶、内切葡聚糖酶和植酸酶；或(b)一种或多种直接饲喂微生物或(c)(a)和(b)的组合。

14.一种预混物，所述预混物包含如权利要求1-13中任一项所述的添加剂和至少一种维生素和/或矿物质。

15.一种基于玉米或稻的动物饲料，所述动物饲料包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中不溶性葡糖醛酸木聚糖的降解大于单独使用任何一种酶情况下的降解。

16.一种基于玉米的动物饲料，所述动物饲料包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中当与单独使用所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶相比，所述组合更好地刺激单胃动物消化道中有益细菌的生长。

17.一种基于玉米的动物饲料，所述动物饲料包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶，其中当与单独使用所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶相比，所述组合能够增加单胃动物中至少一种短链脂肪酸的生产。

18.如权利要求17所述的动物饲料，其中所述短链脂肪酸选自由以下组成的组：乙酸、丙酸或丁酸。

19.如权利要求15-18中任一项所述的动物饲料，其中所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶是GH30葡糖醛酸木聚糖酶。

20.如权利要求19所述的动物饲料，其中所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属物种。

21.如权利要求19或权利要求20所述的动物饲料，其中所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。

22.如权利要求20所述的动物饲料，其中所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶包含与选自由以下组成的组的多肽具有至少90％序列同一性的多肽：SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、和SEQ ID NO:42。

23.如权利要求22所述的动物饲料，其中所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶包含选自由以下组成的组的多肽：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、和SEQID NO:42。

24.如权利要求15-23中任一项所述的动物饲料，其中所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自丝状真菌。

25.如权利要求24所述的动物饲料，其中所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶包含与选自由以下组成的组的多肽具有至少90％序列同一性的多肽：SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48、和SEQ ID NO:52。

26.如权利要求15-25中任一项所述的动物饲料，其中重组生产所述木聚糖酶中的至少一种。

27.如权利要求15-26所述的动物饲料，所述动物饲料进一步包含(a)选自由以下组成的组的一种或多种酶：淀粉酶、蛋白酶、内切葡聚糖酶和植酸酶；(b)一种或多种直接饲喂微生物或(c)(a)和(b)的组合。

28.一种用于在包含玉米或稻的动物饲料中降解不溶性葡糖醛酸木聚糖的方法，所述方法包括使所述玉米或稻与至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶接触。

29.一种用于改善基于玉米或稻的动物饲料中不溶性葡糖醛酸木聚糖的消化率的方法，所述方法包括向动物施用基于玉米或稻的动物饲料，所述动物饲料包含至少一种具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的酶和至少一种具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的酶。

30.如权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶是GH30葡糖醛酸木聚糖酶。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属物种。

32.如权利要求30或权利要求31所述的方法，其中所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。

33.如权利要求31所述的方法，其中所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶包含与选自由以下组成的组的多肽具有至少90％序列同一性的多肽：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、和SEQ ID NO:42。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述具有葡糖醛酸木聚糖酶活性的木聚糖酶包含选自由以下组成的组的多肽：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、和SEQ ID NO:42。

35.如权利要求28-34中任一项所述的方法，其中所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶衍生自丝状真菌。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述具有内切-β-1,4-木聚糖酶活性的木聚糖酶包含与选自由以下组成的组的多肽具有至少90％序列同一性的多肽：SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、和SEQ ID NO:52。

37.如权利要求28-36中任一项所述的方法，其中重组生产所述木聚糖酶中的至少一种。

38.如权利要求28-37中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述动物施用(a)选自由以下组成的组的一种或多种酶：淀粉酶、蛋白酶、内切葡聚糖酶和植酸酶；(b)一种或多种直接饲喂微生物；或(c)(a)和(b)的组合。

39.如权利要求28-38中任一项所述的方法，其中所述动物是选自由以下组成的组的单胃动物：猪(pigs和swine)、火鸡、鸭、鸡、鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲤鱼、虾和对虾。

40.如权利要求28-38中任一项所述的方法，其中所述动物是选自由以下组成的组的反刍动物：牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。

Images