CN106255750A - 蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分离的具有木聚糖酶活性的多肽，所述多肽选自：a)包含与SEQ ID NO:1具有至少87％同一性的氨基酸序列的多肽；b)由与SEQ ID NO:2具有至少87％同一性的多核苷酸编码的多肽；或者c)a)或b)的多肽的片段，其片段具有木聚糖酶活性。

Description

蛋白质
技术领域
本发明涉及新型合成木聚糖酶和所述木聚糖酶在包括喂养料、麦芽制造及酿造、处理包含阿拉伯聚糖的原料如谷物基材料，例如生产生物燃料或其它发酵产品，包括生化物质(例如生物基异戊二烯)、和/或小麦谷朊蛋白-淀粉分离工业应用中的用途，和使用该木聚糖酶的方法、以及包含所述木聚糖酶的组合物(诸如饲料添加剂组合物)。
背景技术
多年以来，内切-β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)(本文称为木聚糖酶)用于修饰源于植物细胞壁材料的复合碳水化合物。本领域公知的是，不同木聚糖酶(源于不同微生物或植物)的功能性极为不同。木聚糖酶是一类将直链的多糖β-1,4-木聚糖降解成木寡糖或木糖，由此使半纤维素(植物细胞壁的主要组分之一)分解的酶的命名。
基于结构和遗传学信息，木聚糖酶归类为不同的糖苷水解酶(GH)家族(Henrissat,(1991)Biochem.J.280,309-316)。
最初，所有已知且已被表征的木聚糖酶属于家族GH10或GH11。其后，进一步的工作鉴定出属于家族GH5、GH7、GH8和GH43的多种其它类型木聚糖酶(Collins等人(2005)FEMSMicrobiol Rev.,29(1),3-23)。
迄今为止，GH11家族不同于所有其它GH家族，是唯一仅由木聚糖特异性木聚糖酶组成的家族。GH11木聚糖酶的结构可描述为β-果冻卷结构或全β-链夹层折叠结构(Himmel等人1997Appl.Biochem.Biotechnol.63-65,315-325)。GH11酶具有约20kDa的催化域。
GH10木聚糖酶具有分子量在32-39kDa范围内的催化域。GH10木聚糖酶的催化域结构由八倍体β/α圆筒状组成(Harris等人1996–Acta.Crystallog.Sec.D 52,393-401)。
三维结构可用于大量的家族GH10酶，首先实现的是浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)木聚糖酶A(Derewenda等人，J Biol Chem 1994年8月19日；269(33)20811-4)、粪肥纤维单胞菌(C.fimi)内切聚糖酶Cex(White等人Biochemistry 1994年10月25日；33(42)12546-52)和纤维弧菌(Cellvibrio japonicus)Xyn10A(先前的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)亚种木聚糖酶A)(Harris等人，Structure1994年11月15日；2(11)1107-16.)。作为异种集团GHA的成员，其具有典型(α/β)8TIM桶折叠，所述(α/β)8TIM桶折叠具有位于β-链4(酸/碱基)和7(亲核物质)的C末端的两个关键活性位点谷氨酸(Henrissat等人，Proc Natl Acad Sci U S A 1995年7月18日；92(15)7090-4)。
对已被充分表征并且较纯的底物进行表征木聚糖酶官能度的全面研究(Kormelink等人，1992Characterisation and mode of action of xylanases and someaccessory enzymes.Ph.D.Thesis,Agricultural University Wageningen,Holland(第175页，English and Dutch summaries))。这些研究示出不同的木聚糖酶对于取代阿拉伯聚糖(AX)的木糖主链有不同的特定要求。一些木聚糖酶需要三个未取代的木糖残基来水解木糖主链。其它木聚糖酶仅需要一个或两个未取代的木糖残基。存在这些特异性差异的原因被认为归因于催化域内的三维结构，其继而取决于木聚糖酶的初级结构即氨基酸序列。然而，并未记载当木聚糖酶在复杂环境例如植物材料(诸如在喂养料中)中起作用时，这些不同氨基酸序列翻译为官能度不同的木聚糖酶。
植物材料中(例如小麦中)的木聚糖酶底物传统上被分为两种级分：水不可提取的AX(WU-AX)和水可提取的AX(WE-AX)。关于为什么存在两种不同AX级分，已存在多种解释。较旧的文献(D’Appolonia and MacArthur-(1976,Cereal Chem.53.711-718)以及Montgomery和Smith(1955,J.Am.Chem.Soc.77.3325-332)描述了WE-AX与WU-AX之间相当高的取代度差异。最高的取代度存在于WE-AX中。这用于解释为什么某些AX是水可提取的。相较于较低的取代度，较高的取代度使得聚合物可溶，这致使聚合物之间氢键合并随后沉淀。
不同木聚糖酶官能度之间的差异被认为是由于木聚糖酶的特异性差异并由此其优选WU-AX或WE-AX底物。
已报道了得自几乎100种不同生物体(包括植物、真菌和细菌)的木聚糖酶。木聚糖酶分为若干多于40个家族的糖基水解酶。包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶及其它糖酶的糖基水解酶基于此类特性如氨基酸序列、其三维结构及其催化部位的几何构型进行分类(Gilkes，等人，1991,Microbiol.Reviews 55:303-315)。
附图说明
图1示出本文命名为SynXyn92的合成木聚糖酶的成熟多肽(SEQ ID No.1)。
图2示出本文命名为SynXyn92的合成木聚糖酶的多核苷酸序列(SEQ ID No.2)。
图3示出本文命名为SynXyn85的合成木聚糖酶的成熟多肽(SEQ ID No.3)。
图4示出本文命名为SynXyn85的合成木聚糖酶的多核苷酸序列(SEQ ID No.4)。
图5示出本文命名为SynXyn89的合成木聚糖酶的成熟多肽(SEQ ID No.5)。
图6示出本文命名为SynXyn89的合成木聚糖酶的多核苷酸序列(SEQ ID No.6)。
图7示出本文命名为SynXyn72的合成木聚糖酶的成熟多肽(SEQ ID No.7)。
图8示出本文命名为SynXyn72的合成木聚糖酶的多核苷酸序列(SEQ ID No.8)。
图9示出本文命名为SynXyn80的合成木聚糖酶的成熟多肽(SEQ ID No.9)。
图10示出本文命名为SynXyn80的合成木聚糖酶的多核苷酸序列(SEQ ID No.9)。
图11示出本文命名为SynXyn93的合成木聚糖酶的成熟多肽(SEQ ID No.11)。
图12示出本文命名为SynXyn93的合成木聚糖酶的多核苷酸序列(SEQ ID No.12)。
图 13示出了合成木聚糖酶的表达载体的示意图谱(pTTTpyr2-synXyn_VAR)。
图14示出合成木聚糖酶的成熟多肽序列的比对-使用CLUSTAL Omega多重序列比对，采用默认参数设定(矩阵：Gonnet；空位开放罚分：10；空位延伸：0.2)。
图15示出关于合成木聚糖酶SynXyn92在90℃加工温度下的加工稳定性的制粒测试结果。
图16示出相较于阳性对照酶，根据本发明的合成酶SynXyn93的谷物基材料的粘度降低。这些数据示出SynXyn93酶在预处理步骤(60℃)期间不具有活性，但在液化步骤(85℃)中具有活性。在85℃的液化步骤期间粘度继续降低，表明SynXyn93在该升高的温度下具有显著的活性。SynXyn93的最终活性比空白低52-55％。
图17示出相较于阳性对照酶，根据本发明的合成酶SynXyn93的谷物基材料的粘度降低。这些数据证实，SynXyn93相较于阳性对照酶热稳定性增大。SynXyn93示出相较于空白粘度降低54-60％，而阳性对照酶仅为40-41％。SynXyn93的最终粘度低于阳性对照酶。
发明内容
本发明一项基本发现在于，可这样设计合成木聚糖酶，其除了具有分解(增溶)不溶性阿拉伯聚糖(AXinsol)的能力之外，还具有使其尤其用于例如以下应用的其它特性：喂养料、麦芽制造及酿造、处理含阿拉伯聚糖原料如谷物基材料，例如生产生物燃料或其它发酵产物，包括生化物质(例如生物基异戊二烯)、和/或小麦谷朊蛋白-淀粉分离工业。例如，本文提出的合成木聚糖酶令人惊奇地为热稳定的，具有令人惊奇的高回收率，例如在热处理之后(例如制粒过程期间)的残留活性，并且耐受胃蛋白酶。
在制粒过程期间，将酶(例如包含酶的饲料)在90℃下调节30秒。
在制粒过程期间，酶可配制在基材例如小麦上，并且可配制到预混物例如玉米/大豆饲料混合物(例如61.1％玉米、31.52％Hipro Soya 48、4.00％大豆油、0.40％碳酸氢钠、0.25％维生素/矿物质Leghennen、0.20％外消旋甲硫氨酸、1.46％磷酸二钙、1.16％石灰石)中。
木聚糖酶可以按确保实现最终目标剂量例如20 000XU/kg饲料的含量包含在内。可通过使配制在基材例如小麦上、配制到饲料混合物(例如10kg玉米/大豆饲料混合物)中并混合的一种或多种酶混合特定时间例如10min来制备预混物。
可将预混物添加至饲料例如110kg饲料中，并在调节之前混合特定时间例如10min。在制粒之前，通常在90℃下将包含酶的饲料调节30秒。
包含酶的饲料可经干蒸汽处理以在30秒之后达到90℃的目标温度。
如本文所用，术语“调节的”或“调节”意指使饲料/酶混合物混合并经干蒸汽处理以在30秒后达到90℃的目标温度。
在调节之后，饲料/酶混合物可成型为丸粒。丸粒的形成可通过本领域的技术人员公知的任何常规方法进行。可通过本文所述制粒方法形成丸粒。
本发明人首次能够完全表达具有木聚糖酶活性和增强特性的合成多肽。
本文提出的合成木聚糖酶为GH10木聚糖酶。
具体地，本发明合成木聚糖酶有效地分解(增溶)得自包括玉米、小麦、DDGS等，特别是小麦(包含小麦基的)产品和玉米(包括玉米基产品)两者的各种各样基材的AXinsol。这与先前已知的酶形成对比，先前已知的酶通常在增溶玉米或玉米基基材的AXinsol中处于劣势，或者在小麦-和玉米基基材两者中效率不高。
此外，本发明的合成木聚糖酶不仅可尤其有利于分解(增溶)AXinsol，而且还有效地分解(或降解)可溶性聚合物。由于能够有效地(快速)分解(降解)可溶性聚合物(由溶解AXinsol获得)，得到了(迅速)降低的粘度或者可溶性聚合物(由溶解AXinsol获得)不能有助于增大粘度。这后一种作用在一些受权利要求书保护的应用中是必要的。
不受理论的束缚，本发明的合成酶主要释放对粘度无贡献的聚合物，因为释放的聚合物较短。
通常，常规的木聚糖酶可分解AXinsol，但是通常导致混合物的粘度增大。此种增大的粘度在许多应用中很不利。
不受理论的束缚，虽然一些常规木聚糖酶分解AXinsol，但是其导致高分子量的可溶降解产物增加，从而导致混合物的粘度增大。
此外或另外，并且还不受理论的束缚，常规木聚糖酶可分解AXinsol，但是由于其无法足够快地降解高分子量可溶性产物，所以混合物的粘度并不理想。相比之下，在本发明的方法和用途下，相较于常规酶，合成木聚糖酶分解AXinsol而不会增大粘度，和/或同时快速降低粘度。不受理论的束缚，据信本发明的酶未形成高分子量产物。
发现本发明的以及如本文所述的酶不仅分解(增溶)得自包括玉米、小麦、DDGS等，特别是小麦(包含小麦基的)产品和玉米(包括玉米基产品)两者的宽泛基材范围的不溶性阿拉伯聚糖(AXinsol)，而且还有效地确保粘度没有升高和/或粘度降低。不受理论的束缚，据信本发明的酶未形成高分子量产物。
因此，本发明涉及能够增溶戊聚糖特别是含木聚糖材料，例如阿拉伯聚糖特别是不溶性阿拉伯聚糖的酶。具体地，酶特别有利于增溶广谱的基材(包括玉米基基材)中的戊聚糖特别是含木聚糖材料，例如阿拉伯聚糖特别是不溶性阿拉伯聚糖。
多种用于喂养料来增溶戊聚糖的商业化木聚糖酶是GH11酶。本领域的技术人员认为，与GH11木聚糖酶相比，GH10木聚糖酶无法如此强效增溶戊聚糖，特别是AXinsol。已令人惊奇地发现，本文所公开的合成木聚糖酶(GH10木聚糖酶)尤其有利于降解广谱的基材(包括玉米基基材)中的AXinsol。令人惊奇地，本发明人发现，本发明的合成GH10木聚糖酶在增溶戊聚糖方面的能力优于商用GH11木聚糖酶。此外，合成GH10木聚糖酶是热稳定的。
本发明的酶有效地降解得自玉米和玉米基基材的AXinsol的事实是非常有利的，原因是例如相较于其它谷类食物如小麦和黑麦，玉米保留更多不可溶形式的AX。因此，仅仅能够降解AXinsol的木聚糖酶可示出例如对玉米基食料例如玉米-大豆食料喂养的动物的显著有益效果。
GH10木聚糖酶如此有利于降解谷类食物特别是玉米或玉米基基材中的AXinsol完全出乎意料。
本发明的酶可能能够有效地(并快速地)降解由AXinsol降解所产生的或存在于谷物基材料中的聚合物和低聚物。这导致了本文提出的合成木聚糖酶出人意料的优势：其尤其有利于在多个应用中保持较低粘度或降低粘度，例如喂养料；麦芽制造及酿造；谷物基产生的葡萄糖，例如用于对生物燃料和/或生化物质(例如生物基异戊二烯)进一步加工；或小麦谷朊蛋白-淀粉分离工业以例如生产淀粉。
值得注意的是，已发现，本文所测合成酶相较于GH11酶的降解产物平均更短。这意指降解产物不会促成或导致粘度增大。
基于这些发现，根据本发明的合成木聚糖酶可用于降解含木聚糖材料，特别是阿拉伯聚糖，特别是AXinsol。此外或另选地，根据本发明的木聚糖酶可用于降解由AXinsol降解所产生的或(天然)存在于谷物基材料中的可溶性聚合物(例如低聚物)。令人惊奇地，已发现根据本发明的变体木聚糖酶可用于降解含木聚糖材料，特别是阿拉伯聚糖，特别是AXinsol，并且用于降解由AXinsol降解所产生的可溶性聚合物(例如低聚物)两者。
此类酶可用于许多行业，包括喂养料、麦芽制造及酿造、处理含阿拉伯聚糖原料如谷物基材料、小麦谷朊蛋白-淀粉分离工业、生产淀粉衍生的糖浆、生物燃料生产等。
发明陈述
在第一方面，本发明提供一种分离的具有木聚糖酶活性的多肽，所述分离的多肽选自：
(a)包含与SEQ ID NO:1具有至少87％同一性(适宜地至少89％、适宜地至少90％、适宜地至少92％、适宜地至少94％、适宜地至少98％同一性、适宜地至少100％同一性)的氨基酸序列的多肽；
(b)由与SEQ ID NO:2具有至少87％同一性(适宜地至少89％、适宜地至少90％、适宜地至少92％、适宜地至少94％、适宜地至少98％同一性、适宜地至少100％同一性)的多核苷酸编码的多肽；或者
(c)a)或b)的多肽的片段，其片段具有木聚糖酶活性。
在另一个方面，本发明提供一种分离的包含编码本发明多肽的核苷酸序列的多核苷酸(cDNA)。
在另一个方面，提供了一种分离的包含与SEQ ID NO:2具有至少87％同一性(适宜地至少89％、适宜地至少90％、适宜地至少92％、适宜地至少94％、适宜地至少98％同一性、适宜地至少100％同一性)的多核苷酸的多核苷酸(例如cDNA)；或者一种分离的因遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:2的多核苷酸。
本发明还提供了一种分离的选自下列的多核苷酸(例如cDNA)：SEQ ID No.2、SEQID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10和SEQ ID No.12，或者一种分离的因遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ IDNo.10和SEQ ID No.12的多核苷酸。
在一个方面，本发明提供一种包含本发明多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸有效连接至一个或多个指导表达宿主中多肽产生的控制序列。
在另一个方面，本发明提供一种重组表达载体，其包含本发明的核酸构建体。
还提供了一种重组宿主细胞，其包含根据本发明的多核苷酸、本发明的核酸构建体、或根据本发明的载体。
本发明还提供了一种用于产生本发明的多肽的方法，所述方法包括：(a)在有利于产生多肽的条件下培养包含根据本发明的核酸构建体的宿主细胞；以及(b)回收多肽。
在本发明的另一方面，还提供了通过本发明的方法生产的发酵物。
本发明的又一方面是提供通过本发明的方法生产的木聚糖酶。
本发明还提供了一种酶组合物，该酶组合物包含：a)根据本发明的合成木聚糖酶，b)根据本发明的发酵物，或c)它们的组合。
本发明还提供了一种饲料添加剂组合物，该饲料添加剂组合物包含：a)根据本发明的合成木聚糖酶，b)根据本发明的发酵物，或c)它们的组合。
在本发明的又一方面，提供了一种预混物，该预混物包含：a)根据本发明的合成木聚糖酶，b)根据本发明的发酵物，c)根据本发明的酶组合物，d)根据本发明的饲料添加剂组合物，或e)它们的组合；以及至少一种维生素和/或至少一种矿物质。
本发明还提供了一种饲料(或喂养料)，其包含：a)根据本发明的合成木聚糖酶，b)根据本发明的发酵物，c)根据本发明的酶组合物，d)根据本发明的饲料添加剂组合物，e)根据本发明的预混物，或f)它们的组合。
在另一个方面，提供了一种制备喂养料的方法，所述方法包括：使饲料组分与a)根据本发明的合成木聚糖酶，b)根据本发明的发酵物，c)根据本发明的酶组合物，d)根据本发明的饲料添加剂组合物，e)根据本发明的预混物或f)它们的组合相混合。
本发明还提供了一种用于降解含木聚糖材料中含阿拉伯聚糖材料的方法，所述方法包括使所述含木聚糖材料与a)根据本发明的合成木聚糖酶，b)根据本发明的发酵物，c)根据本发明的酶组合物，d)根据本发明的饲料添加剂组合物，e)根据本发明的预混物或f)它们的组合相混合。
在另一个方面，提供了a)根据本发明的合成木聚糖酶，b)根据本发明的发酵物，c)根据本发明的酶组合物，d)根据本发明的饲料添加剂组合物，e)根据本发明的预混物或f)它们的组合用于使含木聚糖材料中阿拉伯聚糖增溶的用途。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本公开所属领域普通技术人员通常理解的含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY(《微生物学和分子生物学词典》)，第20版，John Wiley和Sons,New York(1994)，以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)为本领域技术人员提供本发明中所用多个术语的一般性词典。
本公开文本并不受本文公开的示例性方法和材料的限制，任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于本公开文本的实施方案的实施或试验。数值范围包括限定该范围的数字。除非另外指明，否则分别是，任何核酸序列从左到右以5'至3'取向写出；氨基酸序列从左到右以氨基至羧基取向写出。
本文提供的标题并非对本公开文本的各个方面或实施方案的限制，这些方面或实施方案可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。相应地，下面就要定义的术语通过将说明书作为一个整体来参考会得到更完全的定义。
氨基酸在本文中用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来指代。
本文所用的术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”是同义的。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”是同义的。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求书中，可使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码遵照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature,JCBN)的定义。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一种核苷酸序列编码。
术语的其他定义可在整个本说明书中出现。在更详细地描述示例性的实施方案之前，应理解本公开文本并不限于所描述的具体实施方案，因为这些实施方案当然是可变的。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体的实施方案的目的，并不意在具有限制意义，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限定。
在提供数值范围的情况中，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间数值(至下限的个位的十分之一，除非上下文另有清楚规定)也被具体公开。规定的范围中的任何规定值或中间值与该规定的范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围，被涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中，而且其中任一个、没有一个或两个界限被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本公开中，但依据该规定的范围中的任何被具体排除的界限而定。在规定的范围包括界限中的一个或两个的情况中，排除这些被包括的界限中的任一个或两个的范围，也被包括在本公开中。
必须指出，本文和所附权利要求书中用到的名词既有单数含义也有复数含义，除非上下文另有清楚规定。因此，例如，提到“酶”则包括多个这种候选物质，而提到“饲料”则包括提到一种或多种饲料以及本领域技术人员知道的它们的等同物，以此类推。
本文论述的出版物只是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供。本文的任何内容都不能被解释为承认这些出版物构成本文所附权利要求的现有技术。
例如通常作为动物饲料的能量源、作为生物燃料生产的原料、作为麦芽制造及酿造的成分、或作为小麦谷朊蛋白-淀粉分离工艺的原料而使用的原料不断增加的价格导致了低成本的纤维材料包含在用于这些产业的起始基材中，特别是在动物饲料中使用低成本的纤维副产品。
加入纤维可导致几种不利影响。例如，在动物饲料中添加纤维可引起抗营养作用。在喂养料中，半纤维素和纤维素(包括不溶性阿拉伯聚糖)形成封装(或包埋)营养物质如淀粉和蛋白质的物理屏障，从而抵挡(retaining)动物获取这些营养物质。
半纤维素和纤维素(包括不溶性阿拉伯聚糖(AXinsol))自身也为潜在能量源，原因是其由C5-和C6-糖组成。单C6-糖可被动物用作能量源，而寡C5-糖可通过存在于动物肠道中的微菌群转化为短链脂肪酸(van den Broek等人，2008Molecular Nutrition&FoodResearch,52,146-63)，其短链脂肪酸可被动物肠道吸收和消化。
营养物质因物理屏障降解而从喂养料释放取决于木聚糖酶降解不溶性纤维组分(例如不溶性阿拉伯聚糖(AXinsol))的能力。
在第一方面，本发明提供一种分离的具有木聚糖酶活性的多肽，所述分离的多肽选自：
(a)包含与SEQ ID NO:1具有至少87％同一性的氨基酸序列的多肽；
(b)由与SEQ ID NO:2具有至少87％同一性的多核苷酸编码的多肽；
或者
(c)a)或b)的多肽的片段，其片段具有木聚糖酶活性。
在另一方面，本发明提供一种分离的具有木聚糖酶活性的多肽，所述分离的多肽选自：
(a)包含与SEQ ID NO:1具有至少89％同一性的氨基酸序列的多肽；
(b)由与SEQ ID NO:2具有至少89％同一性的多核苷酸编码的多肽；
或者
(c)a)或b)的多肽的片段，其片段具有木聚糖酶活性。
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的具有木聚糖酶活性的多肽，所述分离的多肽选自：
(a)包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽；
(b)由与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的多核苷酸编码的多肽；
或者
(c)a)或b)的多肽的片段，其片段具有木聚糖酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的具有木聚糖酶活性的多肽，所述分离的多肽选自：
(a)包含与SEQ ID NO:1具有至少94％同一性的氨基酸序列的多肽；
(b)由与SEQ ID NO:2具有至少94％同一性的多核苷酸编码的多肽；
或者
(c)a)或b)的多肽的片段，其片段具有木聚糖酶活性。
在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的具有木聚糖酶活性的多肽，所述分离的多肽选自：
(a)包含与SEQ ID NO:1具有至少98％同一性的氨基酸序列的多肽；
(b)由与SEQ ID NO:2具有至少98％同一性的多核苷酸编码的多肽；
或者
(c)a)或b)的多肽的片段，其片段具有木聚糖酶活性。
根据本发明的多肽可包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No:3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9和SEQ ID No.11。
在一个实施方案中，本发明提供了一种具有木聚糖酶活性的多肽，所述多肽包含与选自下列的一种氨基酸序列具有至少87％同一性的氨基酸序列：SEQ ID No.1、SEQ IDNo:3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9和SEQ ID No.11。
在一个实施方案中，本发明提供了一种具有木聚糖酶活性的多肽，所述多肽包含与选自下列的一种氨基酸序列具有至少93％同一性的氨基酸序列：SEQ ID No.1、SEQ IDNo:3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9和SEQ ID No.11。
在一个实施方案中，本发明提供了一种具有木聚糖酶活性的多肽，所述多肽包含与选自下列的一种氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列：SEQ ID No.1、SEQ IDNo:3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9和SEQ ID No.11。
在一个实施方案中，具有木聚糖酶活性的多肽包含选自下列的氨基酸序列：SEQID No.1、SEQ ID No:3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9和SEQ ID No.11。
在一个具体实施方案中，具有木聚糖酶活性的多肽包含本文示为SEQ ID No.1的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，根据本发明的多肽可由选自下列的氨基酸序列组成：SEQID No.1、SEQ ID No:3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9和SEQ ID No.11。
在一个实施方案中，多肽可由这样的多核苷酸编码：与SEQ ID No.2、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No 10和SEQ ID No.12具有至少87％同一性；或与因遗传密码简并性而不同于SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQID No 10和SEQ ID No.12的多核苷酸具有至少87％同一性。
在另一个实施方案中，多肽可由这样的多核苷酸编码：与SEQ ID No.2、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No 10和SEQ ID No.12具有至少93％同一性；或与因遗传密码简并性而不同于SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQID No 10和SEQ ID No.12的多核苷酸具有至少93％同一性。
在另一个实施方案中，多肽可由这样的多核苷酸编码：与SEQ ID No.2、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No 10和SEQ ID No.12具有至少95％同一性；或与因遗传密码简并性而不同于SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQID No 10和SEQ ID No.12的多核苷酸具有至少95％同一性。
在一个优选的实施方案中，本发明的多肽由选自SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10和SEQ ID No.12的多核苷酸；或因遗传密码简并性而不同于SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No 10和SEQ IDNo.12的多核苷酸编码。
在一个实施方案中，本发明的多肽由包含本文示为SEQ ID No.2的核苷酸序列的多核苷酸或因遗传密码简并性而不同SEQ ID No.2的多核苷酸编码。
适当地，本文提出的核酸或多核苷酸序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或RNA。
在一个实施方案中，本文提出的核酸或多核苷酸序列可为DNA、更优选为cDNA。
在一个实施方案中，本发明提供一种包含本发明多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸有效连接至一个或多个指导表达宿主中多肽产生的控制序列。
还可预期包含本发明的核酸构建体或本发明的多核苷酸的重组表达载体；和包含本发明的核酸构建体或本发明的多核苷酸的宿主细胞(例如重组宿主细胞)；或根据本发明的载体。
在一个实施方案中，提供了一种用于产生本发明的多肽的方法，所述方法包括：(a)在有利于产生多肽的条件下培养包含根据本发明的核酸构建体的宿主细胞；以及(b)回收多肽。
可回收如此产生的多肽。如此产生的多肽可作为发酵物的一部分使用或者可分离和/或纯化以产生分离或纯化的合成木聚糖酶。
在一个优选的实施方案中，回收根据本发明方法生产的合成木聚糖酶。
在一个优选的实施方案中，分离和/或纯化根据本发明方法生产的合成木聚糖酶。
在一些实施方案中，可将合成木聚糖酶直接用作发酵物而无需对酶进行分离和/或纯化。
本发明的宿主细胞可选自细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、丝状真菌细胞和植物细胞。优选地，宿主细胞为细菌或真菌细胞。
在一个实施方案中，优选地合成木聚糖酶为内切木聚糖酶，例如内切-1,4-β-d-木聚糖酶。内切-1,4-β-d-木聚糖酶的分类号为E.C.3.2.1.8。
在一个优选的实施方案中，本发明的多肽在pH 6下于65℃温育10分钟之后具有至少40％的木聚糖酶活性的残留活性。
在一个优选的实施方案中，本发明的多肽在pH 6下于65℃温育10分钟之后具有至少50％的木聚糖酶活性的残留活性。
在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽在pH 6下于61℃温育10分钟之后具有至少80％的木聚糖酶活性的残留活性。
适当地，本发明的多肽在与含0.2mg/ml胃蛋白酶的缓冲溶液在pH 3.5下于40℃的温度温育两小时之后具有至少70％的残留活性。
在一个优选的实施方案中，在包含多肽的饲料经干蒸汽处理以在30秒后达到90℃的目标温度之后，本发明的多肽具有至少60％的残留木聚糖酶活性。
在一个优选的实施方案中，在将包含多肽的饲料于90℃调节30秒后(例如作为制粒工艺的一部分)，本发明的多肽具有至少60％的残留木聚糖酶活性。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的合成木聚糖酶具有大于61℃(优选大于65℃、优选大于69℃、优选大于73℃)的Tm值，其中Tm值测为温育10分钟后获得50％残留活性的温度。
根据本发明的合成木聚糖酶的热稳定性可采用“用于测量热稳定性的测定”(参见下文)测定。
用于测量热稳定性的测定
通过以下来测定合成木聚糖酶的热变性特征：在变化的温度(例如，分别为61、65、69和73℃)下，在25mM MES缓冲液(pH 6.0)中稀释酶样品并预温育10min，并随后通过实施例2所述的木聚糖酶活性测定测量残留活性。将未预温育情况下测得的活性设为100％并相对于其来计算各个温度下各合成木聚糖酶的残留活性。由热变性特征将Tm值计算为获得50％残留活性的温度。
用于测量热稳定性的测定的所有细节可见于实施例2(参见“热稳定性测定”)。
各个合成木聚糖酶的残留活性计算为所测的分别受胁迫(热处理)和未受胁迫(未热处理)的酶样品活性之间的比率：(受胁迫样品的平均空白活性)/(未受胁迫样品的平均空白活性)。
在一个实施方案中，根据本发明，如果合成木聚糖酶具有大于65℃的Tm值，则其被视为热稳定的，其中Tm值为温育10分钟后获得50％残留活性的温度。该Tm值可根据如本文提出的用于测量热稳定性的测定来测定。
在一个实施方案中，根据本发明，如果合成木聚糖酶具有大于69℃的Tm值，则其被视为热稳定的，其中Tm值为温育10分钟后获得50％残留活性的温度。该Tm值可根据如上提出的用于测量热稳定性的测定来测定。
在一个实施方案中，根据本发明，如果合成木聚糖酶具有大于73℃的Tm值，则其被视为热稳定的，其中Tm值为温育10分钟后获得50％残留活性的温度。该Tm值可根据如本文提出的用于测量热稳定性的测定来测定。
合成木聚糖酶(或包含合成木聚糖酶的组合物)的令人惊奇的技术优点在于其显著有利于承受高至约85℃(适宜地高至约90℃)的热处理(例如在制粒过程期间)。热处理可以进行30秒。对于经受此类热处理意指在加热到指定温度之前，添加剂中存在/有活性的酶有至少约40％、适宜地至少50％在其冷却到室温后仍存在/有活性。优选地，在加热到指定温度之前在添加剂中存在和有活性的酶有至少约60％(适宜地至少约70％、适宜地至少约80％)在其冷却到室温后仍存在和有活性。
术语“热稳定性”是酶在相对较高温度下抵抗不可逆失活(通常通过变性)的能力。这意指酶在暴露于所确定温度给定的时间段之后保留指定量的酶活性。
存在许多方法来测定热稳定性。作为示例，相较于使酶在更长时间(数日)内稳定的温度，可在更高的温度下，在无底物条件下将酶样品温育规定的时间段(例如10min或1至30min)。在升高的温度下温育之后，在许可温度例例如30℃(或者25-50℃或甚至至多70℃)下对酶样品的残留活性进行测定。相对于未在升高的温度下温育的酶样品，计算残留活性。
热稳定性也可测定为随温度变化的酶失活。在无底物条件下，在各个温度下将此处酶样品温育规定的时间段(例如10min或1至30min)并在温育之后在许可温度例如30℃(或者25-70℃或甚至更高)下测定残留活性。相对于未在升高的温度下温育的酶样品，计算各个温度下的残留活性。所得的热变性特征(温度相对残留活性)可用于计算获得50％残留活性的温度。该值定义为Tm值。
甚至进一步，热稳定性可测定为随温度变化的酶失活。在无底物条件下，在规定的升高温度(例如76℃)下将此处酶样品温育不同的时间段(例如10秒至30分钟之间)并在温育之后在许可温度例如30℃(或者25-70℃或甚至更高)下测定残留活性。相对于未在升高的温度下温育的酶样品，计算各个温度下的残留活性。所得的失活特征(时间相对残留活性)可用于计算获得50％残留活性的时间。这通常以T1/2表示。
这些是如何测定热稳定性的示例。热稳定性也可通过其它方法测定。优选地，通过使用如本文提出的“用于测量热稳定性的测定”来估计热稳定性。
与热稳定性不同，热活性为随温度变化的酶活性。为了测定热活性，在底物存在下，可将酶样品于不同温度下温育(测定)由测定限定的时间段。如由测定(例如读取反映所形成反应产物的量的OD值)所限定，在温育期间或之后立即获得酶活性。获得最高活性的温度为给定测定条件下的酶的最佳温度。可相对于在最佳温度下获得的活性计算各个温度下所得的活性。在给定测定条件下，这将为酶提供温度特征。
在本申请中，热稳定性不同于热活性。
在一些实施方案中，具有木聚糖酶活性的酶，例如本发明的GH10木聚糖酶(例如经修饰GH10木聚糖酶)或其片段应在约5至6的pH之间具有良好的木聚糖酶活性。
优选地，具有木聚糖酶活性的酶，例如根据本发明的GH10木聚糖酶(例如经修饰GH10木聚糖酶)或其片段在约pH 4至8之间，适宜地在pH4.6至7之间保留大于70％的最大活性。
在一些实施方案中，例如在饲料应用中，具有木聚糖酶活性的酶，例如根据本发明的GH10木聚糖酶(例如经修饰GH10木聚糖酶)或其片段优选地在pH 4.9至6之间保留大于70％的最大活性。
不受理论的束缚，pH也可对酶效力和功效有重要影响。对于饲料应用，特别是本发明的木聚糖酶的pH特征有益于在小肠(中性条件下)中的活性。
本发明还提供了包含本发明的多肽或根据本发明的发酵物的酶组合物或饲料添加剂组合物。
本发明还提供了一种预混物，该预混物包含本发明的多肽或根据本发明的发酵物、或本发明的酶组合物、或根据本发明的饲料添加剂组合物和/或至少一种矿物质。
在一些实施方案中，根据本发明的饲料添加剂组合物或根据本发明的预混物还包含一种或多种选自下列的酶：蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))和/或淀粉酶(包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、G4-形成淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3))。
可在用于降解含木聚糖材料中含阿拉伯聚糖材料的方法中使用根据本发明的合成木聚糖酶或包含其的发酵物、或包含其的酶组合物。
适当地，阿拉伯聚糖可为不溶性阿拉伯聚糖(AXinsol)。
在一个实施方案中，含木聚糖材料选自下列的一者或多者：饲料或喂养料；饲料组分；谷物基材料；麦芽浆；麦芽汁；麦芽；发芽大麦；助剂，大麦麦芽浆；和谷类面粉。
在一个实施方案中，阿拉伯聚糖被溶解而不会增大反应培养基的粘度。
在本发明的一个实施方案中，饲料或喂养料或饲料组分包括玉米、DDGS(例如cDDGS)、小麦、麦麸或它们的组合或者由这些物质组成。
在一个优选的实施方案中，饲料或喂养料为玉米基喂养料。
根据本发明的合成木聚糖酶可与一种或多种选自下列的酶组合使用：内切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)；纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、纤维素酶(E.C.3.2.1.74)、地衣多糖酶(E.C.3.2.1.73)、脂酶(E.C.3.1.1.3)、脂质酰基转移酶(通常归类为E.C.2.3.1.x)、磷脂酶(E.C.3.1.1.4、E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)、植酸酶(例如6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.3.8)、淀粉酶、α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、其它木聚糖酶(E.C.3.2.1.8、E.C.3.2.1.32、E.C.3.2.1.37、E.C.3.2.1.72、E.C.3.2.1.136)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)、半纤维素酶、蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))、脱支酶、角质酶、酯酶和/或甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。
根据本发明的合成木聚糖酶可与一种或多种选自下列的酶组合使用：蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))和/或淀粉酶(包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、G4-形成淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3))。
在一个实施方案中，根据本发明的方法和用途包括：对受试者施用根据本发明的合成木聚糖酶、或根据本发明的包含合成木聚糖酶的发酵物、或根据本发明的包含合成木聚糖酶的酶组合物、或根据本发明的包含合成木聚糖酶的饲料添加剂组合物、或根据本发明的包含合成木聚糖酶的预混物或根据本发明的包含合成木聚糖酶的喂养料。
在一个实施方案中，本发明的方法或用途为小麦谷朊蛋白-淀粉分离工艺(或其一部分)。
在另一个实施方案中，本发明的方法或用途为生物燃料(例如生物乙醇)或生化物质(例如生物基异戊二烯)生产工艺(或其一部分)。
在另一个实施方案中，本发明的方法或用途为麦芽制造或酿造工艺(或其一部分)。
适当地，本发明构想通过根据本发明的方法生产发酵饮料，例如啤酒。
优选地对本文提出的多肽序列和核酸序列两者进行分离。
本发明的木聚糖酶优选为GH10木聚糖酶。换句话讲，木聚糖酶可具有范围为32-39kDa的分子量并且/或者木聚糖酶的催化域由八倍体β/α圆筒状结构组成(如在Harris等人1996–Acta.Crystallog.Sec.D 52,393-401中提出)。
在本发明的一个方面，本发明的木聚糖酶是糖苷水解酶(GH)家族10的木聚糖酶。术语“糖苷水解酶(GH)家族10的”意指所考虑的木聚糖酶被归入或可被归入GH家族10。
蛋白质相似性搜索(Protein similarity searches)(例如在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD＝Web&PAGE_TYPE＝BlastHome中蛋白质blast)可确定未知序列是否属于术语GH10木聚糖酶家族成员，特别是GH家族可基于关键区域中的序列同源性分类。此外或另选地，为了确定未知蛋白质序列是否为GH10家族内的木聚糖酶蛋白质，不仅可关于序列相似性/同源性/同一性进行评估，还可关于3D结构类似性进行评估。GH家族的分类通常基于3D折叠。将预测未知蛋白质序列的3D折叠的软件是HHpred(http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred)。这种用于预测蛋白质结构的软件的效用依赖于采用已知结构用作模板对同源序列进行鉴定。其效果很好，因为结构比一级序列分叉(diverge)的更慢。当相同家族的蛋白质的序列分叉到不能识别的程度时，它们可具有极类似的结构。
在实施过程中，可将未知序列粘贴到FASTA格式的软件中(http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred)。进行该操作后，可提交搜索。搜索的输出将示出具有已知3D结构的序列的列表。为了确认未知序列实际上为GH10木聚糖酶，GH10木聚糖酶可见于具有>90的概率的同系物列表内。并非所有识别为同系物的蛋白质将特征化为GH10木聚糖酶，但是一些将特征化为GH10木聚糖酶。后者蛋白质是这样的蛋白质：具有已知结构以及将其鉴定为木聚糖酶的生物化学特征。前者无GH10木聚糖酶的生物化学特征。一些参考文献描述了此种方案，例如J.(2005)HMM-HMM comparison-Bioinformatics的Protein homology detection,21,951-960(doi:10.1093/bioinformatics/bti125)和J,Biegert A，和Lupas AN.(2005)The HHpred interactive server for proteinhomology detection and structure prediction-Nucleic Acids Research 33,W244--W248(网页服务器发布)(doi:10.1093/nar/gki40)。
根据Cazy网站(http://www.cazy.org/)，家族10糖苷水解酶可为如下特征：
已知活性：内切-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；内切-1,3-β-木聚糖酶(EC3.2.1.32)；番茄皂甙酶(tomatinase)(EC 3.2.1.-)
机制：保留
异种集团：GH-A
催化剂亲核物质/碱基:谷氨酸(实验)
催化剂质子供体:谷氨酸(实验)
3D结构状况：(β/α)8
本发明的GH10木聚糖酶可具有催化域，分子量在32-39kDa范围内。本发明的GH10木聚糖酶的催化域的结构由八倍体β/α圆筒状组成(Harris等人1996–Acta.Crystallog.Sec.D 52,393-401)。
三维结构可用于大量的家族GH10酶，首先实现的是浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)木聚糖酶A(Derewenda等人，J Biol Chem 1994年8月19日；269(33)20811-4)、粪肥纤维单胞菌(C.fimi)内切聚糖酶Cex(White等人Biochemistry 1994年10月25日；33(42)12546-52)和纤维弧菌(Cellvibrio japonicus)Xyn10A(先前的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)亚种木聚糖酶A)(Harris等人，Structure1994年11月15日；2(11)1107-16.)。作为异种集团GHA的成员，其具有典型(α/β)8TIM桶折叠，所述(α/β)8TIM桶折叠具有位于β-链4(酸/碱基)和7(亲核物质)的C末端的两个关键活性位点谷氨酸(Henrissat等人，Proc Natl Acad Sci U S A 1995年7月18日；92(15)7090-4)。
如本文所用，术语“GH10木聚糖酶”意指这样的多肽：其具有木聚糖酶活性，并且具有具有位于β-链4(酸/碱基)和7(亲核物质)的C末端的两个关键活性位点谷氨酸的(α/β)8TIM桶折叠。
在一个实施方案中，根据本发明的合成木聚糖酶能够降解(或降解)含木聚糖材料，特别是阿拉伯聚糖，特别是不溶性阿拉伯聚糖(AXinsol)。
如本文所用，术语“基本上由…组成”意指可存在未指定的组分，如果受权利要求书保护的组合物的特征因而未受到显著影响的话。
术语“由…组成”意指特定成分的比例必须总计为100％。
本文所用术语“包含”可在一些实施方案中修改以指基本上由…组成或由…组成(两者均具有更为受限的含义“包含”)
在一个实施方案中，不溶性含阿拉伯聚糖材料不为小麦秸秆。
如本文所用的术语“其片段”意指活性片段。换句话讲，片段具有木聚糖酶活性。适宜的片段可与片段所来源的全长合成木聚糖酶具有相同的木聚糖酶活性。另选地，与片段所来源的合成木聚糖酶相比，片段可具有改进的活性(例如增强的特异性，特定活性、pH或温度特征)。此外，片段必须保留合成木聚糖酶(它是其片段)的热稳定性能。
在一个实施方案中，片段为片段所来源的合成木聚糖酶的全长的至少60％。
在一个实施方案中，片段为片段所来源的合成木聚糖酶的全长的至少75％。
在一个实施方案中，片段为片段所来源的合成木聚糖酶的全长的至少85％。
在一个实施方案中，片段为片段所来源的合成木聚糖酶的全长的至少95％。
在一个实施方案中，片段为片段所来源的合成木聚糖酶的全长的至少98％。
在一个实施方案中，片段为一个或多个选自SEQ ID No.1、SEQ ID No:3、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9和SEQ ID No.11的序列的片段。
在一个实施方案中，根据本发明的合成木聚糖酶a)包含本文示为SEQ ID No.1、SEQ ID No:3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9或SEQ ID No.11的氨基酸序列，或者b)包含与本文示为SEQ ID No.1、SEQ ID No:3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9或SEQ ID No.11的氨基酸序列有至少96％、优选至少98.5％、优选至少99％同一性的氨基酸序列，或者c)包含本文示为SEQ ID No.1、SEQ ID No:3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQID No.9或SEQ ID No.11的合成木聚糖酶的全长的至少85％的片段。
用途
本发明的合成木聚糖酶可适用于任何一种下列应用：
a)动物喂养料中的添加剂；和/或
b)动物的饲料补充剂；和/或
c)分解谷物基材料(例如其可为全谷物或部分谷物)。分解产物(例如葡萄糖)可用作用于任何发酵工艺例如生物燃料(例如生物乙醇)生产或其它产品例如生化物质(例如生物基异戊二烯)生产的原料。因此，在一个实施方案中，本发明涉及生物燃料(例如生物乙醇)的生产以及增强谷物基材料在生物燃料工业中的利用；和/或
d)谷物(例如小麦)谷朊蛋白-淀粉分离工业。一种或多种所得产物可为淀粉(例如经纯化的淀粉)和/或谷朊蛋白和/或纤维和/或水溶性的(例如水溶性戊聚糖)。在一个实施方案中，本发明涉及淀粉和/或谷朊蛋白的生产；和/或
e)例如通过分解谷物基材料(例如发芽大麦)来改良麦芽制造及酿造，和/或
f)降解AXsol或AXinsol的分解产物，以确保反应混合物的粘度未增大和/或使粘度降低；和/或
g)例如在生物燃料(例如生物乙醇)生产工艺中降解谷物基材料时降低粘度。
在一个实施方案中，本发明的合成木聚糖酶用于喂养料。优选地，喂养料包含玉米或为玉米基喂养料。
在一个实施方案中，本发明的合成木聚糖酶用于麦芽制造及酿造。
在另一个实施方案中，本发明的合成木聚糖酶用于小麦谷朊蛋白-淀粉分离。
在另一个实施方案中，本发明的合成木聚糖酶用于分解谷物基材料并可为生物燃料(例如生物乙醇)生产工艺的一部分。
优点
本文提出的新型合成木聚糖酶相较于已知木聚糖酶具有诸多优点。
此外，本发明的合成木聚糖酶特别是热稳定性的。这在一些应用中提供了显著优势。具体地，在饲料应用中，酶可经受热处理，例如在制粒过程期间。因此，酶需要能够在此种处理后维持其活性。本发明的合成木聚糖酶特别是并且出乎意料地是热稳定的。具体地，已发现本发明的合成木聚糖酶在制粒工艺之后具有极高的回收率(例如残留活性)。
适当地，合成木聚糖酶具有大于65℃的Tm值，其中Tm值为温育10分钟后获得50％残留活性的温度。
此外，改善的热稳定性在降解淀粉期间也是极为有利的，该过程在液化期间于升高的温度下进行(约85-95℃)。热稳定性允许在该步骤期间添加酶。
此外或另选地，已发现合成木聚糖酶意料不到地具有较高的胃蛋白酶耐受性。
胃蛋白酶是由动物在消化系统的第一个部分中分泌的消化率蛋白酶。胃蛋白酶可降解蛋白质，这使得蛋白质可用作动物的营养物。外源酶(即添加至饲料中的酶)也是蛋白质，并且如果它们易于受胃蛋白酶降解，则它们会被降解。这在大多数情况下会破坏酶活性。因此，极为有利的是合成木聚糖酶具有胃蛋白酶耐受性。
如本文提出的合成木聚糖酶和本发明的合成木聚糖酶也意料不到地有利于增溶戊聚糖。
如本文提出的合成木聚糖酶和本发明的合成木聚糖酶意料不到地有利于增溶AXinsol。
令人惊奇地，已发现本发明的合成木聚糖酶尤其有利于降解广谱基材玉米、小麦、DDGS等，特别是玉米和玉米基基材，特别是小麦(包括小麦基的)产品和玉米(包括玉米基产品)两者中的含木聚糖材料例如阿拉伯聚糖(例如AXinsol)。这与先前已知的酶形成对比，先前已知的酶通常在增溶玉米或玉米基基材的AXinsol中处于劣势，或者在小麦-和玉米基基材两者中效率不高。
此外，本发明的合成木聚糖酶不仅可尤其有利于分解(增溶)AXinsol，而且还有效地分解(或降解)可溶性聚合物。由于能够有效地(快速)分解(降解)可溶性聚合物(由溶解AXinsol获得)，得到了降低的粘度。这后一种作用在一些受权利要求书保护的应用中是必要的。
通常，常规的木聚糖酶可分解AXinsol，但是将导致产生的聚合物产物增加，这导致混合物的粘度增大。此种增大的粘度在许多应用中很不利。
发现本发明的合成木聚糖酶以及如本文所述的合成木聚糖酶不仅分解(溶解)得自包括玉米、小麦、DDGS等，特别是小麦(包含小麦基的)产品和玉米(包括玉米基产品)两者的宽泛基材范围的不溶性阿拉伯聚糖(AXinsol)，而且还有效地分解由此溶解的聚合物以确保粘度未升高和/或确保粘度降低。
在一些实施方案中，本发明的以及如本文所述的合成木聚糖酶能够降解AXsol或AXinsol的分解产物，以确保反应混合物的粘度未增大和/或使粘度降低。
具体地，本发明的合成木聚糖酶特别有效地降解玉米和玉米基基材中的含木聚糖材料，例如阿拉伯聚糖(例如AXinsol)。
多种用于喂养料来增溶戊聚糖的商业化木聚糖酶是GH11酶。本领域的技术人员认为，与GH11木聚糖酶相比，GH10木聚糖酶无法强效增溶戊聚糖，特别是AXinsol。已令人惊奇地发现，本文所公开的一种或多种合成木聚糖酶(GH10木聚糖酶)特别有利于增溶广谱基材(包括玉米基基材)中的AXinsol。令人惊奇地，本发明人发现本发明的(以及本文提出的)合成木聚糖酶在增溶戊聚糖方面的能力优于商用GH11木聚糖酶。
合成木聚糖酶有效地增溶得自玉米和玉米基基材的AXinsol的事实是非常有利的，原因是例如相较于其它谷类食物如小麦和黑麦，玉米保留更多不可溶形式的AX。因此，仅仅能够降解AXinsol的木聚糖酶可示出例如对玉米-大豆食料喂养的动物的显著有益效果。
GH10木聚糖酶如此有利于增溶谷类食物特别是玉米或玉米基基材中的AXinsol完全出乎意料。
本发明的合成木聚糖酶能够有效地(快速)降解由AXinsol增溶所产生的或存在于谷物基材料中的聚合物和/或低聚物。这导致了本文提出的合成木聚糖酶出人意料的优势：其尤其有利于在多个应用中保持较低粘度或降低粘度，例如喂养料；麦芽制造及酿造；谷物基产生的葡萄糖，例如用于对生物燃料和/或生化物质(例如生物基异戊二烯)进一步加工；或小麦谷朊蛋白-淀粉分离工业以例如生产淀粉。
本发明的一个优点在于改善了小麦谷朊蛋白-淀粉分离。
本发明的酶尤其有效地增强受试者的性能或改善饲料中原料的消化性和/或改善受试者的饲料效率。
含木聚糖材料
本发明的合成木聚糖酶(或包含本发明的合成木聚糖酶的组合物)可用于降解任何含木聚糖材料。
在一个实施方案中，含木聚糖材料为任何包含阿拉伯聚糖的植物材料。
在一个实施方案中，含木聚糖材料为任何包含不溶性阿拉伯聚糖(AXinsol)的植物材料。
在一个实施方案中，含木聚糖材料为喂养料或饲料组分。
在一个实施方案中，含木聚糖材料为谷物基材料(包括全谷物或部分谷物或发芽谷物，例如发芽大麦)。当方法涉及生物燃料生产(例如生物乙醇生产)时，则优选含木聚糖材料为谷物基材料。
在另一个实施方案中，含木聚糖材料可为大麦麦芽或麦芽浆、或发芽的大麦、或它们的组合。
在另一个实施方案中，含木聚糖材料可为谷类面粉(例如小麦、燕麦、黑麦或大麦面粉)。当方法涉及谷朊蛋白-淀粉分离工艺时，优选含木聚糖材料为谷类面粉(例如小麦、燕麦、黑麦或大麦面粉)。
分解或降解
本发明的或如本文所公开的酶(或包含酶的组合物)可用于分解(降解)AXinsol或AXsol或者AXinsol的降解产物。
术语“分解”或“降解”与水解同义。
增溶/降解
本发明涉及一种降解含木聚糖材料(优选含阿拉伯聚糖材料，优选含不溶性阿拉伯聚糖(AXinsol)材料)以产生水溶性戊聚糖(其可为聚合、低聚或单体的)的方法。
该方法可在本文描述为戊聚糖增溶或阿拉伯聚糖增溶或AXinsol增溶或AXinsol降解。
在一个实施方案中，本发明涉及一种降解(或分解)不溶性阿拉伯聚糖(AXinsol)的方法。这也可称为不溶性阿拉伯聚糖的增溶和/或戊聚糖的增溶。
在本发明的另一个实施方案中，该方法涉及降解(例如分解)由不溶性阿拉伯聚糖降解所得的聚合物。
阿拉伯聚糖(AX)
如本文所用，术语“阿拉伯聚糖”(AX)意指由木聚糖主链(1,4-连接的木糖单元)与L-阿拉伯呋喃糖(L-阿拉伯糖，为其5-原子环形式)组成的多糖，该L-阿拉伯呋喃糖在整个链上随机地通过1α→2和/或1α→3键与木糖单元连接。阿拉伯聚糖为存在于植物的初生和次生细胞壁两者中的半纤维素。阿拉伯聚糖可存在于谷物例如小麦、玉米(玉蜀黍)、黑麦和大麦的麸皮中。
发现阿拉伯聚糖(AX)与植物细胞壁密切相关，其中其充当连接植物细胞壁和组织的各种结构单元的胶，从而给予其结构强度和刚度两者。
如本文所用，术语“戊聚糖”是在完全水解下获得戊糖的任一类碳水化合物。
因为木糖和阿拉伯糖(阿拉伯聚糖的组分)均为戊糖，所以阿拉伯聚糖通常归类为戊聚糖。
在几种最重要的饲料原料(包括小麦和玉米)中，AX为主要的非淀粉多糖(NSP)级分。
其在植物性材料内的丰度、位置以及分子结构使得AX对饲料消化性造成严重的负面影响，有效地降低了AX所存在的原料的营养价值。这使得AX成为抗营养因素，降低畜产品效率。
此外，在例如麦芽制造、酿造、生物燃料制造的过程中，AX可在例如试图分解植物材料时具有严重的负面影响，有效地降低在植物原料中得到的底物量。
AX也可保持大量的水(其可称为其水分保持能力)——这可使得可溶性阿拉伯聚糖导致(高)粘度——这在多种应用中很不利。
如本文所用，术语“半纤维素”意指植物细胞壁的多糖组分而非纤维素。如本文所用，术语“半纤维素”可意指通过稀释的碱性溶液分离的植物细胞壁的多糖。半纤维素占木本植物组织几乎三分之一的碳水化合物。半纤维素的化学结构由长链的多种戊糖、己糖及其对应的糖醛酸组成。半纤维素可存在于水果、植物茎和谷壳中。木聚糖为由具有1β→4键的D-木糖单元组成的戊聚糖的示例。
水不溶性阿拉伯聚糖(AXinsol)
水不溶性阿拉伯聚糖(AXinsol)也称为水不可提取的阿拉伯聚糖(WU-AX)，占植物材料干物质的较大比例。
在小麦中，AXinsol可占干物质的6.3％。在小麦麸和小麦DDGS中，AXinsol可占干物质约20.8％或13.4％(w/w)。
在黑麦中，AXinsol可占干物质的5.5％。
在玉米中，AXinsol可占干物质的3.5-6％(例如5.1％)。在玉米DDGS中，AXinsol可占干物质的10-20％(例如12.6％)。
AXinsol使营养物质截留在饲料中。大量可充分消化的营养物质例如淀粉和蛋白质保持包裹在细胞壁材料簇中或与AX的侧链连接。这些俘获的营养物质将不可用于小肠的消化和后续吸收。
水溶性阿拉伯聚糖(AXsol)
水溶性阿拉伯聚糖(AXsol)(也称为水可提取的阿拉伯聚糖(WE-AX))可在生物燃料生产、生化物质生产、碳水化合物处理和/或麦芽制造和/或酿造和/或饲料中引发一些问题，因为其可由于AXsol的水分保持能力而导致粘度增大。
在饲料中，AXsol可具有抗营养作用，特别是在单腹中，因为其可导致肠内容物的粘度显著增大，这是由于AXsol特别的水分保持能力。增加粘度可影响饲料消化和营养物质使用，因为其可妨碍饲料与消化酶和胆汁盐适当地混合并且/或者其减缓了营养物质的利用和吸收并且/或者其刺激了后肠中的发酵。
在小麦中，AXsol可占干物质的1.8％。在小麦麸和小麦DDGS中，AXsol可占干物质约1.1％或4.9％(w/w)。
在黑麦中，AXsol可占干物质的3.4％。
在大麦中，AXsol可占干物质的0.4-0.8％。
在玉米中，AXsol可占干物质的0.1-0.4％(例如0.1％)。在玉米DDGS中，AXinsol可占干物质的0.3-2.5％(例如0.4％)。
然而，除了存在于植物材料中AXsol的量之外，当木聚糖酶增溶植物材料中的AXinsol时，这可释放为植物材料的AXsol含量作出贡献的戊聚糖和/或低聚物。
本文所公开的经修饰木聚糖酶的一个显著优点在于其具有增溶AXinsol的能力而不会增大粘度。目前据信未形成高分子量的产物。
AXsol的分解可降低粘度。
AXsol的分解可释放营养物质。
粘度
本发明可用于确保粘度不会增大和/或用于以任何方法降低粘度，其中AXsol的水分保持能力导致粘度不期望的增大。
本发明涉及确保粘度不会增大并且/或者通过分解(降解)AXsol或通过分解(降解)由增溶AXinsol所产生的聚合物和/或低聚物来降低粘度。
不受理论的束缚，由于能够有效地(快速)分解(降解)由溶解AXinsol获得的可溶性聚合物(例如低聚物)，可避免粘度不期望的增大并且/或者可获得降低的粘度。如本文所用，术语“有效地”意指酶能够降解通过增溶AXinsol形成的聚合物(例如低聚物)，该速度比降解(或增溶)AXinsol更快。
降低粘度在如本文提出的许多应用中具有优势。
用于生物乙醇工业的木聚糖酶的一个示例为XylathinTM。
用于小麦谷朊蛋白-淀粉分离工业的木聚糖酶的一个示例为ShearzymeTM。
在本发明的一个实施方案中，本文提出的木聚糖酶为降粘度剂。
一般来讲，首先将小麦(或其它谷物)干磨以麸皮和胚芽与胚乳分离，所述胚乳被碾磨成面粉。然后通过小麦淀粉分离工艺将该胚乳粉进一步分为几种商业价值不同的产物流。主要目的在于产生由15-40μm的较大豆状颗粒组成的精炼级A-淀粉。第二流B-淀粉由较不纯的淀粉颗粒组成，其呈球形并且较小(1-10μm)。(C.C.Maningat,P.A.Seib,S.D.Bassi,K.S.Woo,G.D.Lasater,“Starch”书中的第10章(2009)441-451,Wheat starch:production,properties,modification and uses)。分离的小麦淀粉形成关于食品和非食品应用两者的生产改性淀粉的原料。活性谷朊蛋白(Vital gluten)为小麦分离工艺中的第三增值产物。分离的小麦谷朊蛋白的活力由形成面包制作所需的粘弹性网络的能力确定。在烘焙期间，活性谷朊蛋白包封形成于生面团制备的二氧化碳，并随后使面包体积增大(Anne van der Borght,Hans Goesaert,Wim S.Veraverbeke,Jan A.Delcour,Journal ofCereal Science 41(2005)221-237,Fractionation of wheat and wheat flour intostarch and gluten:overview of the main processes and the factors involved.)。其因此通常用于富集用于制作面包的面粉，从而实现改良的面包制品。谷朊蛋白的其它市场包括在素食、肉、鱼或禽肉制品中作为添加剂，包括在宠物食品工业；谷物早餐；或酱油中的那些。由于其热塑性和良好的成膜性能，谷朊蛋白也用于非食品市场如粘合剂(L.Day,M.A.Augustin,I.L.Batey,C.W.Wrigley,Trends in Food Science&Technology 17(2006)82-90,Wheat-gluten uses and industry needs.)。
可使用本文提出的合成木聚糖酶在将谷类面粉(例如小麦、燕麦、黑麦或大麦面粉)分离成淀粉和谷朊蛋白级分的过程中降低粘度(或不增大粘度)并且通过降解妨碍谷朊蛋白凝聚的低聚糖来改善分离。
在麦芽制造和/或酿造期间，麦芽制作及酿造中的麦芽汁粘度、和大麦麦芽浆以及大麦麦芽的粘度可导致显著的缺点。本发明涉及降低麦芽汁、大麦麦芽浆、大麦麦芽、或它们的组合的粘度(或不增大粘度)。
饲料或喂养料
本发明的合成木聚糖酶或饲料添加剂组合物可用作饲料或用于制备饲料。
本文所用的术语“饲料(feed)”与“喂养料(feedstuff)”同义。
优选地，本发明的含阿拉伯聚糖材料为喂养料，或喂养料的成分、或饲料组分。
取决于用途和/或应用模式和/或施用模式，饲料可呈溶液形式或呈固体形式或呈半固体形式。
在用作饲料(例如功能饲料)或用于饲料(例如功能饲料)制备时，本发明的酶或组合物可与如下中的一者或多者结合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。
在一优选的实施方案中，将本发明的酶或饲料添加剂组合物与饲料组分混合以形成喂养料。
本文所用的术语“饲料组分”意指喂养料的全部或部分。喂养料的部分可意指喂养料的一种成分或喂养料的一种以上(例如2种或3种或4种)成分。在一个实施方案中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物成分。
优选地，饲料可以是草料或其预混物、复合饲料或其预混物。在一个实施方案中，可将根据本发明的饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分混合或将其混合至复合饲料的预混物或混合至草料(fodder)、草料组分或草料的预混物中。
如本文所用的术语“草料”意指提供给动物(而非动物必须自己觅食)的任何食物。草料涵盖经切割的植物。
术语草料包括青贮饲料、压制和制丸的饲料、油和混合日粮以及发芽谷物及豆类。
草料可获自一种或多种选自下列的植物：玉米(玉蜀黍)、苜蓿(紫花苜蓿)、大麦、牛角花、芸苔属、Chau moellier、羽衣甘蓝、油菜籽(卡诺拉)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、萝卜、三叶草、杂种车轴草、红三叶草、地三叶草、白三叶草、羊茅草、雀麦草、稷、燕麦、高粱、大豆、树(对于树-干草为无顶树枝条)、小麦和豆类。
术语“复合饲料”意指以粗粉、丸粒、球丸(nut)、饼或碎屑形式的商业饲料。复合饲料可由多种原料和添加剂共混而来。根据目标动物的具体需求配制这些共混物。
复合饲料可以是提供所有每日所需营养物质的完全饲料、提供日粮(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供额外的微量营养物质(例如矿物质和维生素)的补充剂。
用于复合饲料中的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、小麦、加拿大油菜粗粉、菜籽粉、羽扇豆、大豆、高粱、燕麦和大麦。
合适的是，本文所提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，所述微量成分为例如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于掺和进商业日粮内的组合物。
本发明的任何喂养料可包含一种或多种选自如下的饲料材料：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦、黑小麦以及它们的组合)和/或大粒谷物例如玉蜀黍或高粱；b)得自谷类食物的副产品，例如玉米蛋白粉、湿饼(特别是玉米基湿饼)、干酒糟(DDG)(特别是玉米基干酒糟(cDDG))、含可溶物干酒糟(DDGS)(特别是玉米基含可溶物干酒糟(cDDGS))、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)得自如下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
在一个实施方案中，喂养料包括玉米、DDGS(例如cDDGS)、小麦、麦麸或它们的组合或者由这些物质组成。
在一个实施方案中，饲料组分可为玉米、DDGS(例如cDDGS)、小麦、麦麸或它们的组合。
在一个实施方案中，喂养料包括玉米、DDGS(例如cDDGS)或它们的组合或者由这些物质组成。
在一个实施方案中，饲料组分可为玉米、DDGS(例如cDDGS)或它们的组合。
本发明的喂养料可含有至少30重量％、至少40重量％、至少50重量％或至少60重量％的玉米和大豆粉或玉米及全脂大豆、或者小麦粉或向日葵粉。
本发明的喂养料可包含约5至约40％玉米DDGS。对于家禽——喂养料平均可包含约7至15％玉米DDGS。对于猪类(猪)——喂养料可包含平均5至40％玉米DDGS。
本发明的喂养料可包含玉米(作为单一谷物)，在这种情况下喂养料可包含约35％至80％玉米。
在包含混合谷物例如包含例如玉米和小麦的喂养料中，喂养料可包含至少10％玉米。
另外或作为另一选择，本发明的喂养料可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产品以提供高纤维喂养料。高纤维饲料材料的示例包括：小麦、大麦、黑麦、燕麦，来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、玉米麸质饲料、湿饼、干酒糟(DDG)、含可溶物干酒糟(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣。一些蛋白质源也可视为高纤维：获自例如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花的蛋白质。
在一个实施方案中，本发明的喂养料包含至少一种高纤维材料和/或至少一种选自下列的高纤维饲料材料的至少一种副产品：例如含可溶物干酒糟(DDGS)——特别是cDDGS、湿饼、干酒糟(DDG)——特别是cDDG、麦麸和小麦。
在一个实施方案中，本发明的喂养料包含至少一种高纤维材料和/或至少一种选自下列的高纤维饲料材料的至少一种副产品：例如含可溶物干酒糟(DDGS)——特别是cDDGS、麦麸和小麦。
在本发明中，饲料可为以下项一者或多者：复合饲料和预混物，包括丸粒、坚果或(牲畜)饲用饼；作物或作物残茬：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、干椰子肉、稻草、糠、糖用甜菜废物；鱼粉；肉粉和骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；低聚糖；糖渍饲用植物：青贮饲料；海草；种子和谷物，整体地或通过压碎、碾磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。
在一些实施方案中，本发明中的术语“饲料”涵盖宠物食品。宠物食品是旨在由宠物食用的植物或动物材料，例如狗食品或猫食品。宠物食品(例如狗和猫食品)可以干燥形式(例如用于狗的磨碎食物)或湿罐装形式。猫食品可含有氨基酸牛磺酸。
在一些实施方案中，本发明中的术语“饲料”涵盖鱼食物。鱼食物通常含有使养殖鱼保持健康所需的主要营养物质、痕量元素和维生素。鱼食物可以是小片、丸粒或片的形式。压成丸粒的形式(其中的一些快速沉降)经常用于较大鱼或底饲物种。一些鱼食物还含有诸如β胡萝卜素或性激素之类的添加剂，以人工增强观赏性鱼的颜色。
在一些实施方案中，本发明中的术语“饲料”涵盖鸟食物。鸟食物包括用于喂鸟器中以及用于饲喂宠物鸟的食物。通常，鸟食物由多种种子组成，但也可涵盖板油(牛或羊脂肪)。
如本文所用，术语“接触”是指将本发明的酶(或包含酶的组合物)间接或直接施加至产品(例如饲料)中。可使用的施加方法的示例包括但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品、通过将饲料添加剂组合物与产品混合而直接施加、将饲料添加剂组合物喷涂至产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物的制剂中。
在一个实施方案中，优选将本发明的饲料添加剂组合物与产品(例如喂养料)混合。另选地，喂养料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。
对于一些施加而言，重要的是，使组合物在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表面。这使得组合物能赋予如下有利特性中的一者或多者：性能益处。
可施加本发明的合成木聚糖酶(或包含合成木聚糖酶的组合物)以使产品(例如喂养料或喂养料的原始成分)散布、包覆和/或浸渍有控制量的所述酶。
在一个优选的实施方案中，使本发明的酶(或包含酶的组合物)均匀化以产生粉末。
在一另选的优选实施方案中，将本发明的酶(或包含酶的组合物)配制成如WO2007/044968(称作TPT颗粒)或WO1997/016076或WO1992/012645中所述的颗粒，将这些文献以引用方式并入本文中。
在另一优选的实施方案中，在将饲料添加剂组合物配制成颗粒时，这些颗粒包含包覆在蛋白质芯上的水合屏障盐。这种盐包衣的优点在于使耐热性改善、使保藏稳定性改善和保护免受其他原本会不利影响该酶的饲料添加剂的影响。
优选地，用于盐包衣的盐在20℃下具有大于0.25的水活度或大于60％的恒定湿度。
优选地，盐包衣包含Na2SO4。
制备本发明的酶(或包含酶的组合物)的方法还可包括将粉末制粒的另外步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可迫使粉末或包含粉末的混合物通过模具，并将所得的料条切成可变长度的合适丸粒。
任选地，制丸步骤可包括在形成丸粒之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调理机中，例如带蒸汽喷射的混合机。将混合物在调理机中加热至指定温度，例如从60℃至100℃，典型的温度可为70℃、80℃、85℃、90℃或95℃。停留时间可由几秒变至几分钟、甚至几小时。如5秒钟、10秒钟、15秒钟、30秒钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。
应当理解，本发明的酶(或包含酶的组合物)适于添加至任何适当的饲料材料中。
技术人员会认识到，不同的动物要求不同的喂养料，甚至同一种动物也可能要求不同的喂养料，这取决于饲养该动物的目的。
任选地，喂养料还可含有额外的矿物质(例如钙)和/或额外的维生素。
优选地，喂养料为玉米大豆粉混合物。
在一个实施方案中，优选地，饲料不是宠物食品。
在另一个方面，提供了生产喂养料的方法。喂养料通常在饲料磨机中生产，在磨机中首先将原料研磨成合适的粒度，然后与适当的添加剂混合。喂养料随后可以作为糊料或粒料制备；后者通常涉及这样的方法：将温度升高至目标水平，然后使饲料通过模具以制备出特定大小的粒料。让丸粒冷却。随后，可添加液体添加剂诸如脂肪和酶。喂养料的制备还可涉及额外的步骤，其包括在制丸之前的挤出或膨胀–特别是通过可包括至少使用蒸汽的合适技术来进行。
喂养料可为用于单腹动物的喂养料，例如家禽(例如，肉鸡、下蛋鸡、肉用种鸡、火鸡、鸭、鹅、水禽)、和猪类(所有年龄类别)、反刍动物例如牛(例如，奶牛或公牛(包括牛犊))、马、绵羊、宠物(例如，狗、猫)或鱼(例如，无胃鱼、胃鱼、淡水鱼例如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼如锦鲤鱼、海鱼如黑鲈、和甲壳类动物例如虾、贻贝和扇贝)。优选地，将喂养料用于家禽。
玉米基喂养料
在一个优选的实施方案中，喂养料可为玉米基喂养料。如本文所用，术语“玉米基喂养料”意指包含玉米(玉蜀黍)或玉米副产物或由这些物质组成的喂养料。
优选地，玉米基喂养料包含玉米或玉米副产物作为主要成分。例如，玉米基喂养料可包含至少35％玉米或玉米副产物，例如至少40％玉米或玉米副产物、例如至少50％玉米或玉米副产物、例如至少60％玉米或玉米副产物、例如至少70％玉米或玉米副产物、例如至少80％玉米或玉米副产物、例如至少90％玉米或玉米副产物、例如至少100％玉米或玉米副产物。
在一些实施方案中，玉米基喂养料可包含玉米或玉米副产物作为次要成分；在该情况下喂养料可补充有玉米或玉米副产物。仅以举例的方式，喂养料可包含例如补充有玉米或玉米副产物的小麦。
当玉米或玉米副产物为喂养料的次要成分时，玉米或玉米副产物为喂养料的至少5％、优选至少10％、优选至少20％、优选至少30％。
为了避免歧义，如本文所用术语“玉米(corn)”与玉米(maize)例如玉蜀黍(Zeamays)同义。
在一个实施方案中，玉米的副产物可为玉米含可溶物干酒糟(cDDGS)或玉米湿饼或玉米干酒糟(DDG)或玉米蛋白粉或玉米麸质饲料或它们的组合。
在一个实施方案中，优选地，本发明的含阿拉伯聚糖材料包括玉米副产物，例如玉米含可溶物干酒糟(cDDGS)或玉米湿饼或玉米干酒糟(DDG)或玉米蛋白粉或玉米麸质饲料或它们的组合。
小麦基喂养料
在一个优选的实施方案中，喂养料可为小麦基喂养料。如本文所用，术语“小麦基喂养料”意指包含小麦或小麦副产物或由这些物质组成的喂养料。
优选地，小麦基喂养料包含小麦或小麦副产物作为主要成分。例如，小麦基喂养料可包含至少40％小麦或小麦副产物、例如至少60％小麦或小麦副产物、例如至少80％小麦或小麦副产物、例如至少90％小麦或小麦副产物、例如100％小麦或小麦副产物。
在一些实施方案中，小麦基喂养料可包含小麦或小麦副产物作为次要成分；在该情况下喂养料可补充有小麦或小麦副产物。仅以举例的方式，喂养料可包含例如补充有小麦或小麦副产物的小麦。
当小麦或小麦副产物为喂养料的次要成分时，小麦或小麦副产物为喂养料的至少5％、优选至少10％、优选至少20％、优选至少30％。
在一个实施方案中，小麦副产物可为例如小麦麸皮、小麦麦麸、小麦纤维。
麸皮为谷物的坚硬外层并由结合的糊粉与果皮组成。其与胚芽一起为全谷物的主要部分，并且通常在细粮生产中作为研磨的副产物而产生。当从谷物除去麸皮时，谷物丧失部分其营养价值。麸皮存在于任何谷粒中并可由任何谷粒研磨而来，这些谷粒包括稻、玉米(玉蜀黍)、燕麦、大麦和粟。麸皮尤其富含于膳食纤维和必需脂肪酸中并包含显著量的淀粉、蛋白质、维生素和膳食矿物质。
小麦麦麸为小麦麸皮的粗颗粒和细颗粒以及得自“碾磨尾部”的小麦粉头、麦芽精、面粉和碎屑的细颗粒。
小麦麦麸为人类食物和动物饲料的廉价中间副产物。在一个实施方案中，优选地，本发明的含阿拉伯聚糖材料包含小麦麸皮和/或小麦麦麸。
湿饼、干酒糟(DDG)和含可溶物干酒糟(DDGS)
在通过谷物蒸馏工业所用的方法从酵母发酵的谷物或谷物混合物中蒸馏除去乙醇之后，湿饼、干酒糟和含可溶物干酒糟为获得的产物。
将得自蒸馏的釜馏物(例如包含水、谷物剩余物、酵母细胞等)分离为“固体”部分和液体部分。
固体部分称为“湿饼”并且可作为动物饲料原样使用。
液体部分(部分地)蒸发成浆(可溶性)。
当将湿饼干燥时，其为干酒糟(DDG)。
当将湿饼与浆(可溶性)一起干燥时，其为含可溶物干酒糟(DDGS)。
湿饼可用于乳牛场作业以及肉牛饲养场。
经干燥DDGS可用于牲畜(例如乳牛、牛和猪)饲料和家禽饲料。
玉米DDGS是用于乳牛的极佳蛋白质源。
玉米蛋白粉
在一个方面，玉米副产物可为玉米蛋白粉(CGM)。
CGM为玉米研磨工业的粉末状副产物。CGM例如在动物饲料中具有实用性。其可用作饲料例如宠物食品、牲畜饲料和家禽饲料的廉价蛋白质源。其特别是氨基酸半胱氨酸的优良来源，但是必须与其它蛋白质如赖氨酸相平衡。
饲料添加剂组合物
本发明的饲料添加剂组合物和/或包含它们的喂养料可以任何合适的形式使用。
本发明的饲料添加剂组合物可以固体或液体制剂或其另选形式使用。固体制剂的示例包括散剂、糊剂、大丸粒、胶囊剂、丸粒、片剂、粉剂和颗粒剂，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的示例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液剂、混悬剂和乳剂。
在一些应用中，可将本发明的饲料添加剂组合物与饲料混合或施用于饮用水中。
在一个方面，本发明涉及一种制备饲料添加剂组合物的方法，包括使如本文提出的木聚糖酶与饲料可接收载体、稀释剂或赋形剂混合，并(任选地)封装。
预混物
可使喂养料和/或饲料添加剂组合物与至少一种矿物质和/或至少一种维生素混合。由此得到的组合物可在本文称为预混物。
麦芽制造及酿造
本发明的合成木聚糖酶(或包含合成木聚糖酶的组合物)可用于麦芽制造及酿造。
大麦谷物包含1.7至4.1％(w/w)水可提取的β-葡聚糖和总共3.6至6.4％(w/w)β-葡聚糖(Anderson,M.A.,Cook,J.A.,&Stone,B.A.,Journal of the Institute ofBrewing,1978,84,233-239；Henry,J.,Journal of the Science of Food andAgriculture,1985,36,1243)。
小麦谷物包含0.1至0.8％(w/w)水可提取的β-葡聚糖和总共0.6至1.4％(w/w)β-葡聚糖(Anderson,M.A.等人(1978)同上)。
阿拉伯聚糖(AXsol)和β-葡聚糖的有效水解很重要，因为此类化合物可涉及到制备问题，例如麦芽汁粘度(Ducroo,P.&Frelon,P.G.,Proceedings of the EuropeanBrewery Convention Congress,Zurich,1989,445；R.J.&Voragen,A.G.J.,Journal of the Institute of Brewing,1993,99,243)以及可滤性和浑浊形成(Coote,N.&Kirsop,B.H.1976.,Journal of the Institute of Brewing,1976,82,34；Izawa,M.,Kano,Y.&Kanimura,M.1991.Proceedings Aviemore Conference on Malting,brewingand Distillling,1990,427)。
本发明提供一种在麦芽制造及酿造期间水解阿拉伯聚糖(例如AXinsol和AXsol)的方法，其中使小麦粒、大麦粒或它们的组合、或部分小麦和/或大麦粒与本发明的合成木聚糖酶混合。
在一个方面，本发明可涉及一种作为饮料的食品组合物，包括但不限于包含根据本发明的合成木聚糖酶的发酵饮料，例如啤酒和葡萄酒。
在另一个方面，本发明可涉及一种作为饮料的食品组合物，包括但不限于包含根据本发明的合成木聚糖酶的发酵饮料，例如啤酒和葡萄酒。
在本发明的语境中，术语“发酵饮料”意指包括由包括发酵工艺例如微生物发酵(例如细菌和/或酵母发酵)的方法所产生的任何饮料。
在本发明的一个方面，发酵饮料为啤酒。术语“啤酒”意指包括通过发酵/酿造含淀粉植物材料而产生的任何发酵麦芽汁。通常，啤酒由麦芽或作为含淀粉植物材料的辅料、或麦芽与辅料的任何组合产生。如本文所用，术语“麦芽”被理解为任何发芽的谷类谷粒，如发芽的大麦或小麦。
如本文所用，术语“辅料”是指不是麦芽例如大麦或小麦粉的任何含有淀粉和/或糖的植物材料。作为辅料的示例，可以提及可用作淀粉来源的材料，例如普通玉米糁、精制玉米糁、制啤酒用研磨酵母、稻米、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘培谷类、谷类片、黑麦、燕麦、玉米(玉蜀黍)、马铃薯、木薯、木薯粉和糖浆例如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖浆、大麦和/或小麦糖浆等等。
如本文所用，术语“麦芽浆”(例如如本文所用，与麦芽制造及酿造相关)是指任何含有淀粉和/或糖的植物材料如谷粉(例如包括压碎的大麦麦芽、压碎的大麦)和/或其他辅料或它们的组合的含水浆料，随后与水混合以分离成麦芽汁和废糟。
如本文所用，术语“麦芽汁”是指在淀粉糖化过程中对谷粉进行提取后未发酵的液体流出物(run-off)。
在另一方面，本发明涉及一种制备发酵饮料例如啤酒的方法，其包括使本发明的合成木聚糖酶与麦芽或辅料混合。
啤酒的示例包括：全麦芽啤酒、根据“纯净法(Reinheitsgebot)”酿造啤酒、爱尔啤酒、IPA、陈贮啤酒、苦啤酒、发泡酒(次级啤酒)、三级啤酒、干啤、薄啤酒、淡啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒、波特啤酒、黑啤酒、陶特啤酒、麦芽酒、无醇啤酒、无醇麦芽酒等，而且包括另选的谷物和麦芽饮料，例如果味麦芽饮料例如柑橘味(如柠檬-、橙-、酸橙味)，或浆果风味的麦芽饮料、酒调味麦芽饮料例如伏特加-、浪姆酒-、或特奎拉酒-风味的麦芽酒、或咖啡味的麦芽饮料如咖啡味麦芽酒等。
谷物基材料的分解(例如用于生物燃料生产)
可使用本发明的或如本文所公开的合成酶(或包含合成酶的组合物)在由例如谷物基材料进行谷物加工期间分解(降解)AXinsol和AXsol。谷物基材料可为全谷物(例如全小麦、大麦、黑麦、黑小麦或玉米粒或它们的混合物)或部分全谷物、或它们的混合物。
在一个实施方案中，可使用本发明的或如本文所公开的合成酶(或包含合成酶的组合物)来分解(降解)谷物基材料或全谷物中的AXinsol和AXsol。
为了避免歧义，全谷物可通过机械方式破碎。
谷物基材料可分解或降解为葡萄糖。葡萄糖可随后用作任何发酵工艺例如生物燃料(例如生物乙醇)生产和/或生化物质(例如生物基异戊二烯)生产的原料。
谷物基材料可为用于生物燃料(例如生物乙醇)生产工艺的原料。
现今，大多数燃料乙醇由经研磨、淀粉酶处理(以将淀粉水解为糖)、发酵以及蒸馏的玉米(玉蜀黍)粒制得。虽然已在降低乙醇生产成本方面取得重大进展，但仍然存在着巨大挑战。仍然需要改进的技术来降低用于乙醇生产的生物燃料原料的成本。例如，在谷物基乙醇生产中，阿拉伯聚糖的降解可增大淀粉的易获性。
本发明提供了一种用于分解半纤维素例如阿拉伯聚糖——特别是AXinsol和AXsol的合成木聚糖酶。
仅以举例的方式，在欧洲燃料醇工业中，小粒谷类如小麦、大麦和黑麦为常见的原材料，而在US中则主要使用玉米。小麦、大麦和黑麦基本上包含淀粉、高含量非淀粉多糖聚合物(NSP)，如纤维素、β-葡聚糖和半纤维素。
用于表示不同NSP的比率对于每种饲料是不同的。下表示出相较于一些其它饲料，小麦、大麦和黑麦中不同量的NSP。
表1：存在于不同的饲料中的非淀粉多糖(NSP)(g kg -1 干物质)
1非纤维素多糖：戊聚糖、(阿拉伯)木聚糖及其它半纤维素
NSP可赋予谷物麦芽浆较高的粘度。高粘度对乙醇生产有负面影响，因为其将限制可在酿造中使用的固体浓度并且其将降低工艺的能量效率。此外，在整个工艺中存在的残留半纤维素可导致在换热器和蒸馏设备中结垢。当麦芽浆冷却至发酵温度(32℃)时，观察到高粘度的最大影响。这就解释了为什么需要在冷却步骤之前于工艺的任何地方降低粘度。
在本发明的一个实施方案中，用于降解谷物基材料的方法包括使如本文所公开的合成木聚糖酶尽早地在生物燃料(例如生物乙醇)生产工艺中混合，例如优选地在工艺开始时谷物基材料混合期间。在工艺的早期阶段添加如本文所公开的经修饰木聚糖酶的一个优点在于酶打破初始粘度。
在本发明的一个实施方案中，用于降解谷物基材料的方法包括在液化、糖化、发酵之前或期间，糖化和发酵的同时，发酵之后或它们的组合使如本文所公开的合成木聚糖酶混合。
在本发明的一个实施方案中，用于降解谷物基材料的方法包括在液化期间(例如混合之后的高温步骤)使如本文所公开的合成木聚糖酶混合。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及在例如生物燃料(例如生物乙醇)生产工艺中降解谷物基材料时降低粘度。
当例如在生物乙醇生产工艺中降解谷物基材料时，使用本文提出的合成木聚糖酶来降低粘度有多种益处；
·可在工艺中使用更高水平的干物质麦芽浆
·可获得固体含量更高的最终浆
·热传递更好，能量需求更低
·蒸发器结垢减少，从而降低清洁成本
·最终乙醇收率增大
·DDGS(副产物)质量改善
·在釜馏物分离期间(在蒸馏之后)固体和液体部分之间更好的分
离。更低的粘度增大分离效率。
本发明的另一个显著优点在于用于生物燃料生产的本文所述合成木聚糖酶还可导致得自该工艺的(副)产物，例如湿饼、干酒糟(DDG)或含可溶物干酒糟(DDGS)得到改善。因此，本发明的一个优点在于，由于湿饼、DDG和DDGS是生物燃料(例如生物乙醇)生产的(副)产物，所以使用本发明可导致这些(副)产物的质量得到改善。例如，在生物燃料生产过程期间，(副)产物中的阿拉伯聚糖可以已被溶解。
谷物(例如小麦)谷朊蛋白-淀粉分离
可使用本发明的或如本文所公开的合成木聚糖酶(或包含合成木聚糖酶的组合物)在小麦淀粉和谷朊蛋白分离期间分解(降解)AXinsol和AXsol。
在小麦麸皮和胚乳与胚芽的初始分离之后，分级为淀粉和谷朊蛋白级分的小麦胚乳粉在工业上得到大规模应用，以获得高质量的A淀粉和副产物B淀粉和活性谷朊蛋白。
在本发明中，谷类面粉(例如小麦粉)的降解产物为淀粉(高质量A淀粉)。
此外，还产生了副产物B淀粉和活性谷朊蛋白。然后对各个单独产物进行进一步加工，以补充或改进市场需要的食品特征。
存在文献所述的工业使用的几种小麦分离方法。这些工业工艺主要区别在于提供给分离设备(离心机、水力旋流器、或筛网)的面粉-水混合物的形式、或初始反应条件如温度和施加的剪切作用(Abdulvahit Sayaslan,Lebensm.-Wiss.U.-Technol 37(2004)499-515,Wetmilling of wheat flour:industrial processes and small-sacale testmethods)。
在用于将谷类面粉(例如小麦粉)分离为淀粉和谷朊蛋白级分的方法中，该方法包括使谷类面粉(例如小麦粉)、水和合成木聚糖酶混合。谷类面粉、水和合成木聚糖酶可同时或顺次混合。在一些实施方案中，可使谷类面粉(例如小麦粉)和水在与合成木聚糖酶混合之前先进行混合。
一般来讲，在约20-45℃温度下将谷类面粉(例如小麦粉)混合成生面团或面糊(在35至63％干固体之间变化)。然后通过以下步骤进一步加工混合物：
1)使混合物静置一段时间(约30分钟)，随后用筛网、离心机或水力旋流器从混合物中洗去淀粉，以从谷朊蛋白中分离淀粉乳，或者
2)向混合物施加剪切力，任选地进一步稀释混合物，然后通过水力旋流器、或2-或3-相沉降式离心机来分离小麦粉。
如本文所用，术语“干固体”意指基于干重的浆液的总固体(溶解的和未溶解的)(以％计)。
在本发明的一个实施方案中，受权利要求书保护的方法或用途可包括在约20℃至约45℃温度下使小麦粉混合的步骤以形成35-63％干固体的生面团或面糊，并从谷朊蛋白中分离淀粉。
本发明的方法可进一步包括：
a)使混合物静置约30分钟，随后用筛网、离心机或水力旋流器从混合物中洗去淀粉，以从谷朊蛋白中分离淀粉乳；或者
b)向混合物施加剪切力并任选地进一步稀释混合物，使用水力旋流器、或2-或3-相沉降式离心机来从谷朊蛋白中分离淀粉。
本发明提供了通过在面粉和水的初始混合步骤期间按照用于小麦淀粉分离的上述各种方法适当地添加如本文提出的合成木聚糖酶来改善淀粉和谷朊蛋白的分离。分离通过在初始混合步骤期间添加合成木聚糖酶得到改善，这是因为粘度降低以及干扰谷朊蛋白颗粒的AXsol和/或AXinsol被水解。通过降解这些多糖和低聚糖，谷朊蛋白附聚增强，从而改善了谷朊蛋白收率(S.A.Frederix,C.M.Courtin,J.A.Delcour,J.Cereal Sci.40(2004)41-49,Substrate selectivity and inhibitor sensitivity affect xylanasefunctionality in wheat flour gluten-starch separation)。
本发明的一个优点在于导致较高的A淀粉收率和/或更优质量的谷朊蛋白(例如更优质量的活性谷朊蛋白)。
本发明的一个优点在于改善了小麦谷朊蛋白-淀粉分离。
评估谷朊蛋白质量的一个方式是通过监测谷朊蛋白附聚。当通过捏合生面团或混合面糊来施用一定量的级分时，谷朊蛋白颗粒趋于附聚为较大颗粒，形成聚合物网络，称为“活性谷朊蛋白”。可将“活性谷朊蛋白”添加到食品中以改善焙烤制品的特性，例如生面团强度、储存寿命和面包体积(L.Day,M.A.Augustin,I.L.Batey and C.W.Wrigley；Wheat-gluten uses and industry needs；Trends in Food Science&Technology 17(2006)82-90)。
在烘焙工业中，采用Glutomatic通过ICC标准分析No.155(AACC38-12)来测定小麦面中谷朊蛋白的质量和量。在该设备中，由与少量2％NaCl溶液(4.2-4.8ml)混合的小麦粉(10.0克)形成生面团。在20秒的混合步骤之后，生面团不断被捏合，同时采用在室温(约22℃)下在约70ml/分钟的流速下通过混合杯泵送的2％NaCl溶液洗涤5分钟。在该洗涤步骤期间，收集含有淀粉的洗涤水并且谷朊蛋白颗粒在Glutomatic筛架内形成谷朊蛋白团块。
谷朊蛋白的质量通过评估谷朊蛋白附聚来测定。这通过在包含小筛网的专用离心机中离心谷朊蛋白团块进行。对通过该筛网的谷朊蛋白颗粒(较小谷朊蛋白)进行称重并对谷朊蛋白总量进行称重。谷朊蛋白指数计算为(总湿谷朊蛋白-较小的湿谷朊蛋白)/总湿谷朊蛋白。谷朊蛋白附聚提高越大，小谷朊蛋白级分将越小，并且谷朊蛋白指数值越高。理论最大值为100％的高谷朊蛋白指数表明高质量的谷朊蛋白团块。
对谷朊蛋白的量进行定量的另一个值为干谷朊蛋白收率(％)。该值通过用总干谷朊蛋白克数除以用于实验的干面粉总量来计算。回收的干谷朊蛋白越多，分离就越好。
该工业测定目前适于模拟用于工业的生面团分离工艺。
剂量
优选地，合成木聚糖酶以约500XU/kg至约16,000XU/kg含木聚糖材料(例如喂养料)、更优选约750XU/kg饲料至约8000XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)、优选约1500XU/kg饲料至约3000XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)、优选约2000XU/kg饲料至约2500XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)、并甚至更优选约1000XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)至约4000XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)的范围存在于含木聚糖材料(例如饲料)中。
在一个实施方案中，合成木聚糖酶以多于约500XU/kg含木聚糖材料(例如喂养料)、适宜地多于约600XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)、适宜地多于约700XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)、适宜地多于约800XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)、适宜地多于约900XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)、适宜地多于约1000XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)、适宜地多于约2000XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)、适宜地多于约2500XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)、适宜地多于约3000XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)存在于含木聚糖材料(例如饲料)中。
在一个实施方案中，合成木聚糖酶以约2000XU/kg至约2500XU/kg的浓度存在于含木聚糖材料(例如喂养料)中。
在一个实施方案中，合成木聚糖酶以少于约16,000XU/kg含木聚糖材料(例如喂养料)、适宜地少于约8000XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)、适宜地少于约7000XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)、适宜地少于约6000XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)、适宜地少于约500XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)、适宜地少于约4000XU/kg含木聚糖材料(例如饲料)存在于含木聚糖材料(例如饲料)中。
优选地，合成木聚糖酶可以以约100XU/g至约320,000XU/g组合物，更优选约300XU/g组合物至约160,000XU/g组合物，并甚至更优选约500XU/g组合物至约50,000XU/g组合物，并甚至更优选约500XU/g组合物至约40,000XU/g组合物的范围存在于饲料添加剂组合物中。
在一个实施方案中，合成木聚糖酶以超过约100XU/g组合物、适宜地超过约200XU/g组合物、适宜地超过约300XU/g组合物、适宜地超过约400XU/g组合物、适宜地超过约500XU/g组合物存在于饲料添加剂组合物中。
在一个实施方案中，合成木聚糖酶以低于约320,000XU/g组合物、适宜地低于约160,000XU/g组合物、适宜地低于约50,000XU/g组合物、适宜地低于约40,000XU/g组合物、适宜地低于约30000XU/g组合物存在于饲料添加剂组合物中。
木聚糖酶活性可以以在pH 5.0下用AZCL-阿拉伯聚糖(天青精-交联的小麦阿拉伯木聚糖，Xylazyme片剂，Megazyme)作为底物测得的木聚糖酶单位(XU)表示。由内切-(1-4)-β-D-木聚糖酶(木聚糖酶)水解产生水溶性染色片段，并且释放这些的速度(在590nm处吸光度增大)可与酶活性正相关。在标准反应条件(40℃、McIlvaine缓冲液中5分钟反应时间、pH5.0)下，相对于酶标准品(Danisco木聚糖酶，购自Danisco Animal Nutrition)来测定木聚糖酶单位(XU)。
标准酶的木聚糖酶活性测定为在pH 5.3和50℃下每分钟从燕麦-斯佩尔特小麦-木聚糖底物释放的还原糖端基的量。还原糖端基与3,5-二硝基水杨酸反应并且反应产物的形成可测为在540nm处吸光度的增大。酶活性相对于木糖标准曲线(还原糖当量)进行定量。一个木聚糖酶单位(XU)为在5.3和50℃下每分钟释放0.5μmol还原糖当量的标准酶的量。
在一个实施方案中，合适地，使用上述E.C.分类对酶进行分类，并且E.C.分类指示在本文所教导的测定法中进行测试以测定1XU时具有该活性的酶。
优选地，在小麦淀粉分离工艺的混合步骤中，合成木聚糖酶以约0.01kg/MT DS生面团或面糊至约0.60kg/MT DS、更优选约0.05kg/MT DS至约0.45kg/MT DS生面团或面糊，并甚至更优选约0.10kg/MT DS至约0.25kg/MT DS生面团或面糊的范围存在于生面团或面糊中。
在一些实施方案中(特别是小麦淀粉分离实施方案中)，合成木聚糖酶的用量可在约0.019g蛋白质/MT DS小麦粉(其等同于0.019mg/kg DS)至约119g蛋白质/MT DS小麦粉(其等同于119mg/kg DS)的范围内——其中DS意指干固体含量并且MT意指公吨。
在一些实施方案中(特别是小麦淀粉分离实施方案中)，合成木聚糖酶的用量可为约1.19g蛋白质/MT DS小麦粉(其等同于约1.19mg/kg DS)——其中DS意指干固体含量并且MT意指公吨。
在一些实施方案中(特别是小麦淀粉分离实施方案中)，合成木聚糖酶的用量可在约9至约120000单位/kg小麦粉，适宜地约500-2400单位/kg小麦粉，适宜地约900-1200单位/kg小麦粉的范围内(其中1单位定义为在下文提出的桦木测定条件下，每分钟需要产生1微摩尔木糖还原糖等效物的酶量)。
桦木测定
采用得自桦木的1％木聚糖(Sigma 95588)或得自小麦粉的1％阿拉伯聚糖(Megazyme P-WAXYM)作为底物来测定酶的木聚糖酶活性。在50℃下，测定在50mM柠檬酸钠(pH 5.3)、0.005％吐温-80缓冲液中进行10分钟。
释放的还原糖通过与3,5-二硝基水杨酸反应并测量540nm处的吸光度来定量。酶活性相对于木糖标准曲线来定量。在该测定中，一个木聚糖酶单位(XU)定义为在测定条件下每分钟产生1微摩尔的木糖还原糖当量所需的酶量。
在一些实施方案中(特别是降解谷物基材料中)，合成木聚糖酶的用量可在约0.29g蛋白质/MT DS小麦(其等同于0.29mg/kg DS)至约0290/g蛋白质/MT DS小麦(其等同于290mg/kg DS)的范围内。
在一些实施方案中(特别是降解谷物基材料中)，木聚糖酶的用量可为2.9g/蛋白质/MT DS小麦(其等同于2.9mg/kg DS)。
在一些实施方案中(特别是降解谷物基材料中)，木聚糖酶的用量可在约22至约285000单位/kg，适宜地约1100至约5700单位/kg，适宜地约2200至约2850单位/kg的范围内(其中1单位定义为在上文提出的桦木测定条件下，每分钟需要产生1微摩尔木糖还原糖等效物的酶量)。
根据本发明的合成酶和/或包含合成酶的组合物可设计用于一次给予或设计用于每日使用(例如饲喂)。
待用于本发明的合成酶和/或包含合成酶的组合物的最佳量将取决于待处理的产品和/或产品与组合物的接触方法和/或其预期用途。
用于组合物中的合成酶的量应为足以有效的量。
用于组合物的合成酶的量应为足够量，以有效地且足够保持有效地例如改善饲喂含有该组合物的饲料产品的动物的性能。该有效的时间长度应延伸最多至至少利用该产品(例如饲料添加剂组合物或含有其的饲料)的时间。
制剂
在一个实施方案中，可将合成酶配制为液体、干粉或颗粒。
干粉或颗粒可通过本领域技术人员已知的手段，例如，在顶喷式流化床包覆器中、在Wurster型底喷式流化床(buttom spray Wurster)中或通过转鼓制粒(例如高剪切制粒)、挤出、衣锅包衣或在微成分混合器中制备。
对于一些实施方案而言，可包覆(例如囊封)合成酶。
在一个实施方案中，包衣保护合成木聚糖酶免受热影响并且可视为防热剂。
在一个实施方案中，将饲料添加剂组合物配制成干粉或颗粒，如WO2007/044968(称为TPT颗粒)或WO1997/016076或WO1992/012645中所述(将参考文献中的每一者以引用方式并入本文中)。
在一个实施方案中，可将饲料添加剂组合物配制成用于饲料组合物的颗粒，其包括：芯活性剂；和至少一个包衣，在选自如下中的一种或多种的条件后，颗粒的活性剂保留至少50％活性、至少60％活性、至少70％活性、至少80％活性：a)饲料制丸工艺，b)蒸汽加热的饲料预处理工艺，c)储存，d)作为未经制丸混合物中的成分储存，和e)作为包含至少一种选自如下的化合物的饲料基础混合物或饲料预混物中的成分储存：痕量矿物质、有机酸、还原糖、维生素、氯化胆碱以及产生酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混物的化合物。
关于颗粒，至少一个包衣可包含构成颗粒的至少55w/w％的水分水合材料；和/或至少一个包衣可包括两个包衣。该两个包衣可为水分水合包衣和水分屏障包衣。在一些实施方案中，水分水合包衣可为颗粒的25w/w％至60w/w％之间并且水分屏障包衣可为颗粒的2w/w％至15w/w％之间。水分水合包衣可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精而水分屏障包衣可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。
颗粒可使用饲料制丸工艺制备并且饲料预处理工艺可在70℃至95℃之间进行最多数分钟，例如85℃至95℃之间。
在一个实施方案中，可将饲料添加剂组合物配制成用于动物饲料的颗粒，其包括：芯；活性剂，在储存之后及在该颗粒作为一种成分的蒸汽加热制粒工艺之后，颗粒的活性剂保留至少80％活性；水分屏障包衣；和水分水合包衣，其为颗粒的至少25％w/w，该颗粒在蒸蒸汽加热制粒工艺之前具有小于0.5的水活性。
颗粒可具有选自聚合物和树胶的水分屏障包衣并且水分水合材料可为无机盐。水分水合包衣可为颗粒的25w/w％至45w/w％之间并且水分屏障包衣可为颗粒的2w/w％至10w/w％之间。
颗粒可使用蒸汽加热制丸工艺制备，该工艺可在85℃至95℃之间进行最多数分钟。
在一些实施方案中，可用稀释剂(例如淀粉粉末、石灰石或诸如此类)稀释酶。
在一个实施方案中，合成酶或包含合成酶的组合物处于适于食用的液体制剂中，优选地，该液体食用物含有如下中的一者或多者：缓冲剂、盐、山梨醇和/或甘油。
在另一个实施方案中，可通过将一种或多种酶施加(例如喷涂)于载体基材(例如碾碎的小麦)上来配制合成酶或包含合成酶的组合物。
在一个实施方案中，根据本发明的合成酶或包含合成酶的组合物可配制为预混物。仅举个例子，该预混物可包含一种或多种饲料组分，例如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。
在一个实施方案中，可将用于本发明的合成酶与至少一种选自如下中的至少一者的生理学上可接受的载体一起配制：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。
封装
在一个实施方案中，对根据本发明的合成酶和/或包含其的组合物(例如
饲料添加剂组合物)和/或预混物和/或饲料或喂养料进行包装。
在一个优选的实施方案中，将饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料或喂养料包装于袋(例如纸袋)中。
在一另选的实施方案中，可将饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料或喂养料密封在容器中。可使用任何合适的容器。
形式
本发明的合成酶或包含合成酶的组合物(例如饲料添加剂组合物)及其他组分和/或包含它们的喂养料可以任何合适的形式使用。
本发明的合成酶或包含合成酶的组合物(例如饲料添加剂组合物)可以固体或液体制剂或其另选形式使用。固体制剂的示例包括散剂、糊剂、大丸剂、胶囊剂、丸剂、片剂、丸剂、胶囊剂、胚珠、溶液或悬液、粉剂和颗粒剂，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的示例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液剂、混悬剂和乳剂。
包含合成酶的组合物可含有矫味剂或着色剂，用于即刻释放、延迟释放、调节释放、持续释放、脉冲释放或受控释放的应用。
以举例的方式，如果本发明的组合物以固体例如粒料形式使用，则其还可包含一种或多种：赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐；制粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶；还可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石粉。
用于制备这些形式的营养上可接受的载体的示例包括(例如)水、盐溶液、醇、有机硅(silicone)、蜡、石油凝胶、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、香水油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚(petroethral)脂肪酸酯、羟甲基-纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
用于这些形式的优选赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milksugar)或高分子量聚乙二醇。
对于水性混悬剂和/或酏剂而言，可将本发明的组合物与各种甜味剂或矫味剂、着色物质或染料、与乳化剂和/或助悬剂以及与稀释剂(例如水、丙二醇和甘油)以及它们的组合进行组合。
受试者
如本文所用，术语“受试者”意指待施用或已施用根据本发明的合成木聚糖酶或根据本发明的饲料添加剂组合物或包含所述根据本发明的饲料添加剂组合物的喂养料的动物。
本文所用的术语“受试者”意指动物。
在一个实施方案中，受试者是哺乳动物、鸟、鱼或甲壳类动物，包括(例如)家畜或驯养动物(例如宠物)。
在一个实施方案中，“受试者”是家畜。
如本文所用的术语“家畜”是指任何农场动物。优选地，家畜是以下项的一者或多者：反刍动物例如牛(例如，奶牛或公牛(包括牛犊))、单胃动物例如家禽(包括仔鸡、雏鸡和火鸡)、猪(包括仔猪)、鸟、水生动物例如鱼、无胃鱼、胃鱼、淡水鱼例如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼如锦鲤、海鱼例如黑鲈、和甲壳类动物(例如虾、贻贝和扇贝)、马(包括赛马)、绵羊(包括羔羊)。
在另一个实施方案中，“受试者”是驯养动物或宠物或维持于动物园环境中的动物。
本文所用的术语“驯养动物或宠物或维持于动物园环境中的动物”是指任何相关动物，包括犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、啮齿类动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠)、鸟、鱼(包括淡水鱼和海鱼)和马。
性能
本文所用的“动物性能”可通过动物的饲料效率和/或增重和/或通过饲料转化率和/或通过饲料中的营养物质的消化率(例如氨基酸消化率)和/或饲料中的可消化能或代谢能和/或通过氮保留量和/或通过动物避免坏死性肠炎的负面影响的能力和/或通过受试者的免疫应答来测定。
优选地，“动物性能”通过饲料效率和/或动物的增重和/或饲料转化率来测定。
所谓“改善的动物性能”，其意指与不包含本发明的饲料添加剂组合物的饲料相比，由于使用所述饲料添加剂组合物，受试者中的饲料效率增加和/或增重增加和/或饲料转化率降低和/或饲料中的营养物质或能量的消化率改善和/或氮保留量改善和/或免疫应答改善。
优选地，所谓“改善的动物性能”，其意指饲料效率增加和/或增重增加和/或饲料转化率降低。
如本文所用，术语“饲料效率”是指在一段时间期间不限量饲喂动物或对其饲喂指定量的饲料时每单位饲料的增加的体量。
所谓“增加的饲料效率”，其意指与在不存在根据本发明的饲料添加剂组合物的情况下饲喂的动物相比，在饲料中使用所述饲料添加剂组合物导致每单位摄入饲料的增重增加。
饲料转化率(FCR)
本文所用的术语“饲料转化率”是指饲喂给动物以使动物重量增加规定量的饲料量。
改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。
所谓“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”，其意指在饲料中使用饲料添加剂组合物导致动物体重增加指定量时所需饲喂给动物的饲料量低于在该饲料不包含所述饲料添加剂组合物时使动物体重增加相同量时所需的饲料量。
营养物质消化率
本文所用的营养物质消化率意指从胃肠道或胃肠道的指定区段(例如小肠)消失的营养物质的分数。营养物质消化率可测量为所施用给受试者的与受试者粪便中所出来的之间的差值、或所施用给受试者的与所保留在胃肠道指定区段(例如回肠)上的消化物中的之间的差值。
如本文所用营养物质消化率可借助于在一段时间期间排泄物的总集测量为所摄取的营养物质与所排泄的营养物质之间的差值；或者采用不被动物吸收的惰性标记，并允许研究者计算在整个胃肠道或一段胃肠道中消失的营养物质的量。这种惰性标记可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可表示为营养物质在饲料中的百分比，或表示为可消化的营养物质的质量单位/饲料中的营养物质的质量单位。
本文所用的营养物质消化率涵盖淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。
本文所用的能量消化率意指所消耗的饲料总能量减去粪便的总能量，或所消耗的饲料总能量减去动物胃肠道指定区段(例如回肠)上的剩余消化物的总能量。本文所用的代谢能是指表观代谢能，且意指所消耗的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中含有的总能量。能量消化率和代谢能可测量为总能量的摄取与粪便中排泄的或胃肠道指定区段中存在的消化物中的总能量之间的差值，其使用与测量营养物质的消化率相同的方法，针对氮排泄进行适当校正以计算饲料的代谢能。
与其他组分的组合
本发明的合成木聚糖酶可与其他的组分组合使用。
在一个实施方案中，本发明的合成木聚糖酶可与益生菌或直接饲喂微生物(DFM)例如直接饲喂细菌结合使用。
本发明的组合包括本发明的合成木聚糖酶或包含该合成木聚糖酶的组合物例如饲料添加剂组合物，以及适于人或动物食用且能够为食用者提供医学或生理学益处的另一组分。
在一个实施方案中，“另一种组分”可为一种或多种另外的酶(例如另外的饲料酶或麦芽制造及酿造酶、或谷物加工酶或小麦谷朊蛋白-淀粉分离酶)。
用于本发明中的合适的额外酶可为选自如下的酶中的一者或多者：内切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)；纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、纤维素酶(E.C.3.2.1.74)、地衣多糖酶(E.C.3.2.1.73)、脂酶(E.C.3.1.1.3)、脂质酰基转移酶(通常归类为E.C.2.3.1.x)、磷脂酶(E.C.3.1.1.4、E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)、植酸酶(例如6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.3.8)、淀粉酶、α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、其它木聚糖酶(E.C.3.2.1.8、E.C.3.2.1.32、E.C.3.2.1.37、E.C.3.2.1.72、E.C.3.2.1.136)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)、半纤维素酶、蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))、脱支酶、角质酶、酯酶和/或甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。
在一个实施方案中(特别是用于饲料应用)，其它组分可为一种或多种选自以的酶：淀粉酶(包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、G4-形成淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3))；和/或蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))和/或植酸酶(例如6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.38))。
在一个实施方案中(特别是用于饲料应用)，其它组分可为
淀粉酶(例如α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1))和蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62))的组合。
在一个实施方案中(特别是用于饲料应用)，其它组分可为β-葡聚糖酶，例如内切-1,3(4)-β-木聚糖酶(E.C.3.2.1.6)。
在一个实施方案中(特别是用于饲料应用)，其它组分可为植酸酶(例如，例如6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.38)。
在一个实施方案中(特别是用于饲料应用)，其它组分可为甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。
在一个实施方案中(特别是用于饲料应用)，其它组分可为脂酶(E.C.3.1.1.3)、脂质酰基转移酶(通常归类为E.C.2.3.1.x)、或磷脂酶(E.C.3.1.1.4、E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)、适宜的脂酶(E.C.3.1.1.3)。
在一个实施方案中(特别是用于饲料应用)，其它组分可为蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))。
在一个实施方案中，附加组分可为稳定剂或乳化剂或粘合剂或载体或赋形剂或稀释剂或崩解剂。
本文所用的术语“稳定剂”定义为保持产品(例如饲料产品)免于随时间推移而变化的成分或成分的组合。
本文所用的术语“乳化剂”是指防止乳液分离的成分(例如饲料成分)。乳液是两种不混溶的物质，一种以小滴存在，包含于另一者中。乳液可以由水包油构成，其中小滴或分散相为油而连续相为水；或由油包水构成，其中水变成分散相而连续相为油。也可通过使用乳化剂使泡沫(其是液包气)和混悬液(其为液固混悬液)稳定。
本文所用的术语“粘合剂”是指经通过物理或化学反应将产品结合在一起的成分(例如饲料成分)。例如，在“胶凝”期间，水被吸收，从而提供结合效果。然而，粘合剂可吸收其他液体(例如油)，从而将其保持在产品中。在本发明上下文中，粘合剂将通常用于固体或低水分产品(例如烘焙产品：甜点、甜甜圈、面包等等)中。制粒粘合剂的示例包括如下中的一种或多者：聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、麦芽糖、明胶和阿拉伯胶。
“载体”意指适于施用酶的材料且包括本领域已知的任何该材料，例如任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、稳定剂等等，其为无毒的并且并不以有害方式与组合物的任何组分相互作用。
本发明提供用于制备组合物(例如饲料添加剂组合物)的方法，包含将本发明的酶与至少一种选自如下中的至少一者的生理学上可接受的载体混合：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。
赋形剂的示例包括如下中的一种或多者：微晶纤维素和其他纤维素、乳糖(lactose)、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、甘氨酸、淀粉、乳糖(milk sugar)和高分子量聚乙二醇。
崩解剂的示例包括如下中的一种或多者：淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐。
稀释剂的示例包括如下中的一种或多者：水、乙醇、丙二醇和甘油以及它们的组合。
其他的组分可同时(例如当它们混合在一起时或者甚至当它们通过不同的途径递送时)或者依序(例如它们可通过不同的途径递送)用于本发明的木聚糖酶。
优选地，在将本发明的饲料添加剂组合物与另一组分混合时，DFM保持为活的。
在一个实施方案中，优选地，根据本发明的饲料添加剂组合物不包含铬或有机铬。
在一个实施方案中，优选地，根据本发明的饲料添加剂不含有葡聚糖酶。
在一个实施方案中，优选地，根据本发明的饲料添加剂不含有山梨酸。
分离的
在一个方面，优选根据本发明的氨基酸序列、或核酸、或酶为分离的形式。术语“分离的”意指序列或酶或核酸至少实质上不含所述序列、酶或核酸在自然界中天然与之相关联或在自然界中存在的至少一种其他组分。本发明的序列、酶或核酸可以实质上不含所述物质原本与之相关联的一种或多种污染物的形式提供。因此，例如，其可基本上不含一种或多种潜在污染性的多肽和/或核酸分子。
纯化的
在一个方面，优选地根据本发明的序列、酶、或核酸为纯化的形式。术语“纯化的”意指给定组分以高水平存在。理想的是该组分为组合物中存在的主要组分。优选地，其以至少约90％、或至少约95％或至少约98％的水平存在，所述水平是相对于所考虑总组合物以干重/干重计来测定的。
核苷酸序列
本发明的范围涵盖编码具有本文所限定的特定性质的蛋白质的核苷酸序列。
本文所用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(诸如其部分)。核苷酸序列可为基因组起源的或者合成或重组起源的，其可以是双链的或单链的而无论是代表有义链还是反义链。
与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选地，其意指DNA，更优选地，意指编码本发明的cDNA序列。
在一个实施方案中，术语“核苷酸序列”是指cDNA。
在一个优选的实施方案中，当与本发明的范围本身有关以及当为本发明的范围本身所涵盖时，核苷酸序列不包括处于其天然环境中时或其连接至其也存在于其/它们的天然环境中的天然结合的序列时的根据本发明的天然核苷酸序列。为了易于指代，我们应该称该优选的实施方案为“非天然核苷酸序列”。就这一点而言，术语“天然核苷酸序列”意指处于其天然环境中并且在有效连接至其天然与之相关联的整个启动子时的整个核苷酸序列，该启动子也处于其天然环境中。然而，本发明的范围所涵盖的氨基酸序列可在核苷酸序列在其天然生物体中表达后分离和/或纯化。优选地，然而，本发明的范围所涵盖的氨基酸序列可由核苷酸序列在其天然生物体中表达，但其中该核苷酸序列不处于在该生物体中其与之天然结合的启动子的控制之下。
通常，由本发明的范围所涵盖的核苷酸序列使用重组DNA技术制备(即重组DNA)。然而，在本发明的另选实施方案中，核苷酸序列可用本领域所熟知的化学方法整体或分部分地合成(参见Caruthers MH等人，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等人，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
核苷酸序列的制备
编码具有如本文所限定的特定性质的蛋白质或适于修饰的蛋白质的核苷酸序列可从产生所述蛋白质的任何细胞或生物体鉴别和/或分离和/或纯化。多种方法是核苷酸序列鉴别和/或分离和/或纯化领域所熟知的。举个例子，一旦已鉴别和/或分离和/或纯化合适的序列后即可使用PCR扩增技术来制备更多条序列。
举另一个例子，可用来自产生酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该酶的氨基酸序列是已知的话，可合成标记寡核苷酸探针并用于从由生物体制备的基因组文库鉴别酶编码克隆。另选地，可将含有与另一已知酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针用于鉴别酶编码克隆。在后一种情况下，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。
另选地，酶编码克隆可通过这样来鉴别：将基因组DNA的片段插入表达载体(如质粒)中，用所得的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将转化细菌接种于含有酶底物(即阿拉伯聚糖)的琼脂板上，从而使得表达该酶的克隆能被鉴别。
在另一个另选方案中，编码该酶的核苷酸序列可以通过已确立的标准方法合成制备，例如由Beucage S.L.等人，(1981)Tetrahedron Letters22，第1859-1869页所述的亚磷酰胺方法，或Matthes等人，(1984)EMBO J.3，第801-805页所述的方法。在亚磷酰胺方法中，合成寡核苷酸，例如在自动DNA合成仪中，将其纯化、复性、连接并克隆入适当的载体中。
核苷酸序列可以为混合的基因组起源和合成起源、混合的合成起源和cDNA起源或混合的基因组起源和cDNA起源，根据标准技术通过连接合成起源、基因组起源或cDNA起源的片段制备(视情况而定)。每一连接的片段对应于整个核苷酸序列的各个部分。DNA序列还可使用特定引物通过聚合酶链反应(PCR)制备，例如如US 4,683,202或Saiki R K等人，(Science(1988)239，第487-491页)中所述。
氨基酸序列
本发明的范围还涵盖具有如本文所限定的特定性质的酶的氨基酸序列。
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”是同义的。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”是同义的。
氨基酸序列可从合适的来源制备/分离，或者其可通过合成制备或者其可通过利用重组DNA技术制备。
优选地，当与本发明的本身范围有关或当由本发明的本身范围所涵盖时，氨基酸序列不是天然的酶。就这一点而言，术语“天然的酶”意指处于其天然环境中并且在其已由其天然核苷酸序列表达时的整个酶。
序列同一性或序列同源性
本发明还涵盖与具有本文所限定的特定性质的多肽的氨基酸序列具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列或编码这种多肽的任何核苷酸序列(下文称为“同源序列”)的用途。在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可等同于“同一性”。
该同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应该提供和/或编码保留该酶的功能活性和/或增强该酶的活性的多肽。
在本说明书的语境中，在一些实施方案同源序列意指包括这样的氨基酸或核苷酸序列，其可与主题序列有至少97.7％同一性、优选至少98或99％同一性。
在一些实施方案中，同源序列意指包括这样的氨基酸或核苷酸序列，其可与主题序列有至少85％同一性、优选至少90或95％同一性。
通常，同源物将包含与例如主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本发明的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。
在一个实施方案中，同源序列意指包括这样的氨基酸序列或核苷酸序列，其与主题序列相比有一个或数个添加、缺失和/或取代。
在本说明书的语境中，“主题序列”是指根据本发明的核苷酸序列或多肽/氨基酸序列。
优选地，使用SEQ ID No.1在序列对比中作为主题序列对关于多肽序列的序列同一性百分比进行测定。在一个实施方案中，多肽主题序列选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9或SEQ ID No.11。
优选地，使用SEQ ID No.2在序列对比中作为主题序列对关于核苷酸序列的序列同一性百分比进行测定。在一个实施方案中，核苷酸序列的主题序列可选自SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10或SEQ ID No.12。
“亲本核酸”或“亲本氨基酸”分别意指编码或译码亲本多肽的核酸序列或氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及本文示出其氨基酸序列的蛋白质或通过在亲本蛋白质的氨基酸序列中取代、删除或添加一个或数个氨基酸例如2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸，或更多个氨基酸例如10个或多于10个氨基酸而衍生自该(亲本)蛋白质并具有亲本蛋白质活性的蛋白质。
合适地，氨基酸序列的同一性程度是在至少20个连续氨基酸上、优选在至少30个连续氨基酸上、优选在至少40个连续氨基酸上、优选在至少50个连续氨基酸上、优选在至少60个连续氨基酸上，优选在至少100个连续氨基酸上、优选在至少200个连续氨基酸上测定。
在一个实施方案中，本发明涉及编码本文示出其氨基酸序列的蛋白质或编码通过在亲本蛋白质的氨基酸序列中取代、删除或添加一个或数个氨基酸例如2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸，或更多个氨基酸例如10个或多于10个氨基酸而衍生自该(亲本)蛋白质并具有亲本蛋白质活性的蛋白质的核酸序列(或基因)。
在本说明书的语境中，在一个实施方案同源序列或外源序列意指包括这样的核苷酸序列，其可与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)有至少97.7％同一性，优选至少98或99％同一性。
在另一个实施方案中，同源序列意指包括这样的核苷酸序列，其可与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)有至少85％同一性，优选至少90或95％同一性。
通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本发明的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。
同源性比较可通过眼，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可计算两条或更多条序列之间的同源性百分数或同一性百分数。
同源性百分数或同一性百分数可在连续的序列上计算，即将一条序列与另一条序列进行比对，并将一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“无空位(ungapped)”比对。通常，这种不产生空位的比对仅在相对短数目的残基范围内进行。
尽管这是十分简单和可靠的方法，但其未考虑到，例如在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致同源性百分数或同一性百分数大为降低。因此，大多数序列比较方法被设计产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失，从而不会不当地减损整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。
然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋给“空位罚分”使得对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多空位的序列比对更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gapcost)”，其对空位的存在征收相对较高的成本，对空位中每一个后续的残基征收较少的罚分。这是最通常使用的空位评分系统。高的空位罚分将当然会产生具有较少空位的最佳比对结果。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。
最大同源性百分数或同一性百分数的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。进行这种比对的合适计算机程序是Vector NTI(英杰公司(InvitrogenCorp.))。可进行序列比较的软件的示例包括但不限于例如：BLAST软件包(参见Ausubel等人，1999，Short Protocols in Molecular Biology，第4版，第18章))、BLAST 2(参见FEMSMicrobiol Lett 1999 174(2):247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)、FASTA(Altschul等人，1990J.Mol.Biol.403-410)和AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于离线和在线搜索(参见Ausubel等人，1999年，第7-58页至7-60页)，例如GenomeQuest搜索工具(www.genomequest.com)。
尽管最终的同源性百分数或同一性百分数也可按同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无(all-or-nothing)的成对比较。相反，通常使用标度化相似性评分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离向每一成对比较赋予分值。常用的这种矩阵的一个示例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(更多细节请参见用户手册)。对于一些应用而言，优选的是使用Vector NTI软件包的各默认值。
另选地，同源性百分数可用Vector NTI(Invitrogen Corp.)中的多比对特征来计算，该特征基于类似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988)，Gene 73(1),237-244)。
一旦该软件产生了最佳比对，则有可能计算同源性百分数，优选序列同一性百分数。该软件通常进行这种计算作为序列比较的一部分，并产生数值结果。
当测定序列同一性时应该使用空位罚分(Gap Penalties)，然后优选地将如下参数用于成对比对：
在一个实施方案中，可使用采用上面限定的空位罚分和空位延伸组的CLUSTAL。
适宜地，关于核苷酸序列或蛋白质序列的同一性程度是在至少20个连续核苷酸/氨基酸上，优选在至少30个连续核苷酸/氨基酸上，优选在至少40个连续核苷酸/氨基酸上，优选在至少50个连续核苷酸/氨基酸上，优选在至少60个连续核苷酸/氨基酸上，优选在至少100个连续核苷酸/氨基酸上测定。
适宜地，关于核苷酸序列的同一性程度是在至少100个连续核苷酸上，优选在至少200个连续核苷酸上，优选在至少300个连续核苷酸上，优选在至少400个连续核苷酸上，优选在至少500个连续核苷酸上，优选在至少600个连续核苷酸上，优选在至少700个连续核苷酸上，优选在至少800个连续核苷酸上测定。
适宜地，关于核苷酸序列的同一性程度可在本文提出的整个序列上测定。
适宜地，关于核苷酸序列的同一性程度可在本文提出为SEQ ID No.2或SEQ IDNo.4或SEQ ID No.6或SEQ ID No.8或SEQ ID No.10或SEQ ID No.12的整个序列上测定。适宜地，关于核苷酸序列的同一性程度可在如本文提出为SEQ ID No.2的整个序列上测定。
合适地，关于蛋白质(氨基酸)序列的同一性程度是在至少100个连续氨基酸上、优选在至少200个连续氨基酸上、优选在至少300个连续氨基酸上测定。
合适地，关于氨基酸或蛋白质序列的同一性程度可在本文提出的整个序列上测定。
适宜地，关于氨基酸或蛋白质序列的同一性程度可在本文提出为成熟序列例如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9或SEQ ID No.11的整个序列上测定。适宜地，关于氨基酸或蛋白质序列的同一性程度可在本文提出为SEQ IDNo.1的整个序列上测定。
在本说明书的语境中，术语“查询序列”意指与主题序列比对以证实其是否落在本发明的范围内的同源序列或外源序列。因此，此类查询序列可例如为现有技术序列或第三方序列。
在一个优选的实施方案中，通过全局比对程序对序列进行比对，并且序列同一性通过由程序识别出精确匹配的数量，再将该数量除以主题序列的长度而计算得到。
在一个实施方案中，查询序列和主题序列之间的序列同一性程度通过如下步骤确定：1)通过任何合适的比对程序，使用默认计分矩阵和默认空位罚分，将所述两个序列进行对比，2)识别精确匹配的数量，其中精确匹配是比对程序已于比对过程中在两个受比对序列中的给定位置上识别出相同的氨基酸或核苷酸的情况，以及3)将精确匹配的数量除以主题序列的长度。
在另一个优选的实施方案中，全局比对程序选自CLUSTAL和BLAST(优选BLAST)，并且序列同一性通过由程序识别出精确匹配的数量，再将该数量除以主题序列的长度而计算得到。
序列还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或置换，所述缺失、插入或置换导致功能等同的物质。可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行有意的氨基酸置换。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有类似亲水性值的含不带电的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
可以例如根据下表进行保守置换。第二列中同一区组内的氨基酸，优选第三列中同一行内的氨基酸可以彼此置换：
本发明还涵盖可能出现的同源置换(在本文中，置换和取代都用来指现有的氨基酸残基与另选的残基的交换)，即对等置换，如碱性对碱性，酸性对酸性，极性对极性等。非同源置换也可能出现，即从一类残基置换成另一类残基，或另选地涉及到加入非天然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。
还可以用非天然氨基酸进行置换，包括：α*和α-二取代的*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化物衍生物(如三氟酪氨酸*、对Cl-苯丙氨酸*、对Br-苯丙氨酸*、对I-苯丙氨酸*)、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、对硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物(如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*)、L-Phe(4-氨基)#、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苄基)*。为了上面论述的目的(与同源性或非同源性置换相关)，符号*用于指衍生物的疏水性质，而#用于指衍生物的亲水性质，#*指两亲特性。
变体氨基酸序列可包括可在序列的任何两个氨基酸残基之间插入的合适的间隔基团，这些间隔基团除了氨基酸间隔物如甘氨酸或或β-丙氨酸残基外还包括烷基基团如甲基、乙基丙基基团。变异的另外的形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为了避免疑惑，“类肽”用于指其中α-碳取代基处于残基的氮原子而不是α-碳上的变体氨基酸残基。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ等人，PNAS(1992)89(20),9367-9371和Horwell DC,TrendsBiotechnol.(1995)13(4),132-134。
在一个实施方案中，用于本发明的木聚糖酶可包含示为SEQ ID No.1、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9或SEQ ID No.11的多肽序列以及保守取代的至少一个氨基酸。
适当地，可存在至少2个保守取代，例如至少3个或至少4个或至少5个。
适当地，可存在少于15个保守取代，例如少于12个、少于10个、或少于8个或少于5个。
用于本发明的核苷酸序列可在它们中包括合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸作出的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3'和/或5'端添加吖啶或多聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解本文所描述的核苷酸序列可以通过本领域可用的任何方法修饰。可进行这种修饰以便增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涵盖与本文给出的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的用途。如果序列与其片段互补，则该序列可用作探针来鉴别其他生物体中的相似编码序列等等。
不与本发明的序列100％同源但属于本发明的范围之内的多核苷酸可以多种方式获得。本文描述的序列的其他变体可例如通过用探针探测(probing)从一系列个体(例如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获得。此外，可获得其他同源物并且这种同源物及其片段一般将能够选择性杂交至本文所列序列中所示的序列。这种序列可通过这样获得：从其他动物物种制备cDNA文库或基因组DNA文库，在中等至高严格性条件下用包含随附的序列表中的序列中的任一条的全部或部分的探针，探测这些文库。类似的考虑用来获得本发明的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。
变体和株系/物种同源物还可用简并PCR获得，简并PCR将使用被设计来靶向变体和同源物内这样的序列的引物，所述序列编码本发明序列内的保守氨基酸序列。保守序列可例如通过比对来自数种变体/同源物的氨基酸序列来预测。序列比对可以用本领域已知的计算机软件来进行。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。
简并PCR中使用的引物将含有一个或多个简并位置，并将在比用于以单序列引物从已知序列克隆序列的那些严格性条件低的严格性条件下使用。
另选地，这种多核苷酸可通过对已表征的序列进行定点诱变来获得。在例如需要沉默密码子序列改变来优化多核苷酸序列在其中表达的特定宿主细胞的密码子偏好的情形中，这可能是有用的。其他序列改变可能是期望的以便引入限制性酶识别位点，或以改变多核苷酸编码的多肽的性质或功能。
本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于产生引物(例如PCR引物)、另选的扩增反应的引物、探针(例如用放射性或非放射性标记通过常规手段标记上显示标记(revealinglabel)的探针)，或者可将多核苷酸克隆进载体中。这种引物、探针和其他片段的长度将为至少15个，优选至少20个，例如至少25、30或40个核苷酸，并且也为本文所用的术语本发明多核苷酸所涵盖。
根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针可重组产生、合成产生或通过本领域技术人员可用的任何手段产生。它们还可以通过标准技术克隆。
通常，引物将通过合成手段产生，涉及所需的核酸序列的逐步制备，一次一个核苷酸。利用自动化技术完成该工艺的技术是本领域轻易获得的。
较长的多核苷酸通常将用重组手段产生，例如用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。引物可被设计为含有合适的限制性酶识别位点，使得可将扩增的DNA克隆进合适的克隆载体中。
氨基酸编号
在本发明中，可采用用于本发明的木聚糖酶中氨基酸残基位置的特定编号。通过将样品木聚糖酶的氨基酸序列与本发明的木聚糖酶(具体地为SEQ ID No.1)进行比对，可以将编号分配给所述样品木聚糖酶中的氨基酸残基位置，其对应于本发明的SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的氨基酸残基位置或编号。
杂交
本发明还涵盖与本发明的核酸序列互补的序列或能够杂交至本发明的序列或杂交至与本发明序列互补的序列的序列。
本文所用的术语“杂交”应包括“一条核酸链与互补链通过碱基配对接合的过程”以及在聚合酶链反应(PCR)技术中所进行的扩增过程。
本发明还涵盖能杂交至与本文给出的序列互补的序列的核苷酸序列或其任何片段或衍生物的用途。
术语“变体”还涵盖与能够杂交至本文给出的核苷酸序列的序列互补的序列。
优选地，术语“变体”涵盖与这样的序列互补的序列：所述序列能够在严格条件(例如50℃和0.2xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH 7.0})下与本文给出的核苷酸序列杂交。
更优选地，术语“变体”涵盖与这样的序列互补的序列：所述序列能够在高度严格条件(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠pH 7.0})下与本文给出的核苷酸序列杂交。
本发明还涉及可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的核苷酸序列。
本发明还涉及这样的核苷酸序列，该核苷酸序列与可杂交至本发明的核苷酸序列(包括本文给出的那些序列的互补序列)的序列互补。
优选地，杂交在本文提出的整个序列上进行分析。
酶的表达
可将用于本发明的核苷酸序列掺入重组体复制型载体中。该载体可用于在相容宿主细胞中和/或从相容宿主细胞复制和表达核苷酸序列(以蛋白质/酶形式)。
可用控制序列，例如控制序列控制表达。
由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列产生的蛋白质可被分泌或者可包含在细胞内，这取决于所使用的序列和/或载体。编码序列可被设计具有信号序列，该信号序列引导编码该物质的序列穿过特定的原核或真核细胞膜分泌。
表达载体
术语“表达载体”意指能够在体内或体外进行表达的构建体。
优选地，将表达载体掺入合适的宿主生物体的基因组中。术语“掺入”优选涵盖稳定的掺入基因组中。
本发明的核苷酸序列可存在于载体中，在该载体中该核苷酸序列有效连接至调控序列，该调控序列能够提供由合适的宿主生物体表达该核苷酸序列。
可将用于本发明的载体转化进如下文所述的合适宿主细胞中以提供本发明的多肽的表达。
载体(例如质粒、粘粒或噬菌体载体)的选择将通常取决于待将其引入的宿主细胞。
用于本发明的载体可含有一种或多种可选标记基因-如赋予抗生素抗性，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。另选地，该选择可通过共转化来完成(如WO91/17243中所描述的)。
载体可在体外用于例如产生RNA，或用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。
因而，在进一步的实施方案中，本发明提供通过如下步骤制备本发明的核苷酸序列的方法：将本发明的核苷酸序列引入复制型载体内，将该载体引入相容的宿主细胞内，并在引起该载体复制的条件下培养该宿主细胞。
该载体可另外包含使得该载体能在所考虑的宿主细胞中复制的核苷酸序列。这种序列的示例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起始区。
调控序列
在一些应用中，用于本发明的核苷酸序列有效连接至调控序列，该调控序列能够提供核苷酸序列的表达，例如通过所选择的宿主细胞表达。举个例子，本发明涵盖包含有效连接至这样一种调控序列的本发明核苷酸序列的载体，即该载体是表达载体。
术语“有效连接”是指“邻接”，其中所描述的各组分处于使得它们能以其预期的方式发挥功能的关系。调控序列“有效连接”至编码序列是以使得该编码序列的表达能在与该控制序列相容的条件下实现的方式连接。
术语“调控序列”包括启动子和增强子以及其他表达调节信号。
术语“启动子”是以本领域的标准意义使用，例如RNA聚合酶结合位点。
编码本发明的酶的核苷酸序列的增强表达也可以通过选择异源调控区(例如，启动子、分泌引导区和终止子区)来实现。
优选地，根据本发明的核苷酸序列有效连接至至少一个启动子。
其他启动子还可用于引导本发明的多肽的表达。
适用于引导核苷酸序列在细菌、真菌或酵母宿主中转录的启动子的示例是本领域所熟知的。
启动子可额外包括用于确保或用于增加在合适宿主中的表达的特征物。例如，所述特征物可以是保守区，例如Pribnow盒或TATA盒。
构建体
术语“构建体”(其与诸如“结合物”、“盒”和“杂交体”之类的术语同义)包括直接或间接连接至启动子的用于根据本发明的用途的核苷酸序列。
间接连接的示例是在启动子和本发明的核苷酸序列中间提供合适的间隔基团如内含子序列，例如Sh1-内含子或ADH内含子。与本发明相关的术语“融合的”同样如此，其包括直接或间接连接。在一些情况下，该术语不涵盖这样的编码蛋白质的核苷酸序列的天然组合：其通常与野生型基因启动子相关联并且当它们二者均处于其天然环境中时。
该构建体可甚至还含有或表达标记，该标记使得能对该遗传构建体进行选择。
对于某些应用，优选的是，本发明的构建体至少包含有效连接至启动子的本发明的核苷酸序列。
宿主细胞
与本发明有关的术语“宿主细胞”包括包含所述核苷酸序列或上述表达载体并用于重组产生具有本文所限定的特定性质的蛋白质的任何细胞。
在一个实施方案中，生物体是表达宿主。
因而，本发明的另一个实施方案提供用表达本发明的蛋白质的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。细胞将选择为与所述载体相容，并且可以例如是原核(例如细菌)、真菌或酵母细胞。
合适的细菌宿主生物体的示例是革兰氏阳性或革兰氏阴性菌物种。
在一个实施方案中，本文提出的木聚糖酶表达于表达宿主里氏木霉(Trichodermareesei)中。
在一些实施方案中，本文提出的木聚糖酶的表达宿主可为以下真菌表达宿主中的一种或多种：镰刀菌种(如尖孢镰孢菌)；曲霉属(Aspergillus)物种(例如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(A.oryzae)、构巢曲霉(A.nidulans)、或泡盛曲霉(A.awamori))或木霉属(Trichoderma)物种(例如里氏木霉)。
在一些实施方案中，表达宿主可为以下细菌表达宿主中的一种或多种：链霉菌属(Streptomyces)物种或芽孢杆菌属(Bacillus)物种(例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))。
合适宿主细胞例如酵母和真菌宿主细胞的使用可提供翻译后修饰(例如豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸的磷酸化)，可能需要这些用于给本发明的重组表达产物赋予最佳的生物学活性。
生物体
与本发明有关的术语“生物体”包括任何生物体，其可包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，并且/或者其中启动子可允许在存在于该生物体中时根据本发明的核苷酸序列表达。
在一个实施方案中，生物体是表达宿主。
合适的生物体可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。
与本发明有关的术语“转基因生物体”包括任何生物体，其包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，并且/或者其中启动子可允许根据本发明的核苷酸序列在该生物体内表达。优选地，所述核苷酸序列掺入生物体的基因组中。
术语“转基因生物体”不涵盖处于其天然环境中且当它们处于它们的天然启动子(也处于其天然环境中)的控制之下时的天然核苷酸编码序列。
因而，本发明的转基因生物体包括包含如下中的任一种或如下的组合的生物体：编码根据本发明的多肽的核苷酸序列、根据本发明的构建体、根据本发明的载体、根据本发明的质粒、根据本发明的细胞、根据本发明的组织或它们的产物。
例如，转基因生物体可还包含处于异源启动子的控制下的编码本发明的多肽的核苷酸序列。
宿主细胞/生物体的转化
如较早指出的，宿主生物体可以是原核或真核生物体。适宜的原核宿主的示例包括大肠杆菌(E.coli)、链霉菌属(Streptomyces)物种和芽孢杆菌属物种例如枯草芽孢杆菌。
有关原核生物宿主的转化的教导在本领域的文献中有充分记载，例如参见Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，1989,Cold SpringHarbor Laboratory Press)。如果使用原核生物宿主，则该核苷酸序列可能需要适当地进行修饰后再进行转化，例如通过去除内含子来进行修饰。
可用本领域已知的多种方法转化丝状真菌细胞，例如涉及原生质体形成和原生质体转化以及随后的以已知的方式再生细胞壁的方法。使用曲霉菌作为宿主微生物在EP 0238 023中进行了描述。
原核、真菌和酵母的转化对本领域的技术人员而言是公知的。
宿主生物体可以是真菌例如霉菌。合适的这种宿主的示例包括属于以下各属的任何成员：木霉属(Trichoderma)(例如里氏木霉)、嗜热真菌属(Thermomyces)、枝顶孢属(Acremonium)、镰孢属(Fusarium)、曲霉菌属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)、链孢霉属(Neurospora)等。
在一个实施方案中，宿主生物体可以是真菌。在一个优选的实施方案中，宿主生物体属于木霉属例如里氏木霉。
培养和生产
用本发明的核苷酸序列转化的宿主细胞可在有利于产生所编码的多肽并且有利于从细胞和/或培养基回收所述多肽的条件下培养。
用于培养细胞的培养基可以是适合于培养所考虑的宿主细胞和获得所述多肽的表达的任何常规培养基。
由重组细胞产生的蛋白质可展示在细胞的表面。
蛋白质可从宿主细胞分泌并且可方便地用熟知的工序从培养基回收。
分泌
通常，期望蛋白质从表达宿主分泌进培养基中，从培养基可更容易回收蛋白质。根据本发明，可根据所需的表达宿主选择分泌引导序列。杂交体信号序列也可用于本发明的该方面。
大规模应用
在本发明的一个优选实施方案中，氨基酸序列用于大规模应用。
优选地，在培养宿主生物体后氨基酸序列以1g/升至约100g/升总细胞培养物体积的量生产。
适当地，在培养宿主生物体后氨基酸序列可以以30g/升至约90g/升总细胞培养物体积的量生产。
一般的重组DNA方法技术
除非另外指明，否则本发明采用常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力之内。这些技术在文献中进行了解释。参见例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:A LaboratoryManual，第2版，第1-3册，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.等人(1995和定期增刊；Current Protocols in Molecular Biology，第9、13和16章，JohnWiley&Sons,New York,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree，和A.Kahn,1996,DNA Isolation andSequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；M.J.Gait(编辑),1984,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,Irl Press；以及D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis andPhysical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Press。这些一般性文本中的每一个以引用方式并入本文。
测定
活性测定
在牛血清白蛋白(BSA)存在下，测定木聚糖酶对于小麦WE-AX(水可提取的阿拉伯聚糖)的木聚糖酶活性。当对可溶性阿拉伯聚糖呈活性的木聚糖酶在底物中水解β1-4-键时，还原性端基的量增大。通过热和碱性条件，还原性端基与无色PAHBAH(4-对-羟基苯甲酸酰肼)反应，由此被PAHBAH氧化并在410nm处测定吸光度(Lever,1972.AnalyticalBiochemistry 47,273-279)。
缓冲液与试剂：
100mM醋酸钠(NaAc)，pH 5.0，0.10％BSA；将9.6g三水合醋酸钠溶解于800ml去离子水中，并用浓乙酸将pH调节至5.0。随后，用去离子水补加至1000ml。将1.0g BSA(SigmaAldrich，A7906)溶解于1000ml100mM NaAc(pH 5.0)中。
WE-AX，阿拉伯聚糖底物0.5％，pH 5.0：将0.5g水溶性小麦阿拉伯聚糖(Megazyme，43厘沲的高粘度，P-WAXYH)用5ml 96％乙醇润湿，并添加95ml 100mM NaAc(pH 5.0)。在搅拌的同时将溶液加热至沸腾，随后在搅拌的同时冷却至室温(RT)。
PAHBAH工作液：制备三种溶液：1)0.5M氢氧化钠(NaOH)：500ml去离子水中10.0g氢氧化钠；2)0.5M HCl：500ml去离子水中20.8ml 37％HCl；3)5％PAHBAH原液；将25.0gPAHBAH(4-羟基苯甲酰肼，Sigma H9882)溶解于500ml 0.5M HCl中。使溶液避光保护并储存于4℃下。在临用前，通过用0.5M NaOH稀释PAHBAH原液五次来制备PAHBAH工作液。
程序：
采用Biomek分配机械手(Beckman Coulter,USA)在MTP(测定贮备板和测定板；96孔透明聚苯乙烯微孔板，Corning,Cat.no.9017；PCR板；VWR,Eu.目录号211-0297；读取板；Kisker Biotech,Cat.No.G080-F)中制备所有稀释液。
1.在测定贮备板中用147μl 100mM NaAc(pH 5.0)、0.1％BSA缓冲液稀释3μl酶样品(浓度范围为40-65μg/ml)。
2.使得自测定贮备板的25μl样品与测定板中的150μl WE-AX底物混合。
3.在30℃和1150rpm下温育测定板并在iEMS摇动器(Thermo Scientific)中摇动15分钟。
4.在温育结束后，使得自测定板的45.4μl反应混合物与PCR板中的135μlPAHBAH工作液混合。
5.在95℃下使PCR板在PCR仪(Tetrad 2，peltier热循环仪，Bio-Rad)中温育5分钟并随后冷却至20℃10秒。
6.将100μl样品转移至读板中并且在微板读板器(Molecular Devices)上于410nm处读取板。
所有合成木聚糖酶的活性计算为三次平行测定的平均值减去包含100mM NaAc(pH5.0)、0.1％BSA缓冲液且无酶的空白。
热稳定性测定
缓冲液与试剂：
1％Tween80：用9ml MES缓冲液(pH 6.0)溶解1g Tween80(Sigma P-8074)，随后用MES缓冲液(pH 6)将其再稀释10次。
25mM MES缓冲液(pH 6.0)，0.00125％Tween 80：25mM MES缓冲液(pH 6.0)：将4.88g MES(2-(N-吗啉)-乙磺酸)溶解于800ml去离子水中，并用NaOH将pH调节至6.0。添加1.25ml 1％Tween80，之后添加去离子水至1000ml。
程序：
在升高的温度下，通过在25mM MES缓冲液、0.00125％Tween80(pH 6.0)中温育蛋白质浓度为约1μg/ml(范围：0.8-1.3μg/ml)的合成木聚糖酶10分钟来测定合成木聚糖酶的热稳定性。如在活性测定中所述(步骤2-6)，在温育结束之后测定经热处理的合成木聚糖酶的残留活性。
各个合成木聚糖酶的残留活性计算为三次平行测定的平均值减去包括25mM MES缓冲液、0.00125％Tween80(pH 6.0)而不加酶的空白。残留活性计算为所测经热处理样品的活性与所测未在升高的温度下温育的相同样品的活性之间的比率。
胃蛋白酶耐受性测定
在缓冲溶液中pH 3.5下于40℃测试合成木聚糖酶耐受胃蛋白酶降解的能力。
通过在40℃和1150rpm下，在iEMS摇动器(Thermo scientific)中使合成木聚糖酶在包含0.2g/l胃蛋白酶的100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.5)中温育2小时来测定合成木聚糖酶耐受胃蛋白酶降解的能力。如在活性测定中所述(步骤2-6)，在温育结束后测定合成木聚糖酶的残留活性。
缓冲液与试剂：
100mM甘氨酸缓冲液，pH 3.5：将7.52g甘氨酸溶解于800ml去离子水中，并用HCl将pH调节至pH 3.5。随后，用去离子水补加至1000ml。0.2mg/ml胃蛋白酶溶液：将0.2g胃蛋白酶(Sigma，P-7000)溶解于1000ml 100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.5)中。
各个合成木聚糖酶残留活性计算为三次平行测定的平均值减去包含0.2mg/ml胃蛋白酶溶液而无酶的空白。各个合成木聚糖酶的残留活性计算为所测经胃蛋白酶处理的样品活性与在活性测定中用未经处理样品所测的活性之间的比率。
增溶测定
缓冲液与试剂：
100mM MES缓冲液，pH 6.0：将19.52g MES(2-(N-吗啉)-乙磺酸)溶解于800ml去离子水中，并用NaOH将pH调节至6.0。随后，用去离子水补加至1000ml。
玉米DDGS底物溶液，10％：通过在600rpm下搅拌15min使粒度<212μm的cDDGS在100mM MES缓冲液(pH 6.0)中水化。在刚终止搅拌之后，如果存在由cDDGS中酸残留物所引起的pH下降，则对pH进行调节。将190μl/孔cDDGS底物转移到底物板中，使其在-20℃下储存备用。
程序：
采用Biomek分配机械手(Beckman Coulter,USA)在MTP(底物板和收集板；96孔透明聚苯乙烯微孔板，Corning,Cat.no.9017；过滤板；0.2μm PVDF膜，Corning，目录号3504；半深孔板：薄型1.2ml方形存储板，目录号AB-1127，Thermo Scientific)中制备所有稀释液。
1.将10μl酶样品(150μg/ml的表观浓度)添加至预制底物板中。
2.在40℃下在iEMS中温育240分钟；
3.使得自经温育底物板的170μl样品转移到过滤板中。
4.将过滤板置于收集板的顶部，并在1666xg下离心10min。
5.在进一步分析之前，使收集板储存于-20℃。
6.用半深孔板中的900μl超纯水稀释得自收集板的100μl，并且使其在转移至Skalar装置之前在摇床上混合2分钟。
戊聚糖的定量
根据Rouau&Surget(1994,Carbohydrate Polymers,24,123-132)所述的方法使用连续流动注入装置(SKALAR系统)来测定引入溶液的C5糖(戊糖)总量。用CH3COOH和HCl的混合物处理上清液以将多糖水解为单糖。添加间苯三酚(1,3,5-三羟基苯)以与单戊糖和单己糖反应，从而形成有色复合物。通过测量550nm与510nm(作为基准波长)处的吸光度，用木糖标准曲线(50-400μg木糖/ml)计算溶液中的戊糖浓度。不同于戊糖-间苯三酚复合物，己糖-间苯三酚复合物的吸光度在这些波长下是恒定的。将葡萄糖(0.3％)添加至间苯三酚溶液中以创建恒定葡萄糖信号并进一步确保无己糖的干涉作用。
结果可表示为性能指数(PI)，其计算为在分别添加和不添加合成木聚糖酶的情况下温育cDDGS之后值之间的比率：(在用合成木聚糖酶温育后溶液中C5-糖总量)/(在不存在酶情况下温育后溶液中C5-糖总量)。
制粒工艺以及在包含多肽的饲料于90℃调节30秒之后(例如作为制粒工艺的一部 分)残留的木聚糖酶活性的测定
在制粒过程期间，酶可配制在基材例如小麦上，并且可配制到预混物例如玉米/大豆饲料混合物(例如61.1％玉米、31.52％Hipro Soya 48、4.00％大豆油、0.40％碳酸氢钠、0.25％维生素/矿物质Leghennen、0.20％外消旋甲硫氨酸、1.46％磷酸二钙、1.16％石灰石)中。
木聚糖酶可以按确保实现最终目标剂量例如20 000XU/kg饲料的含量包含在内。可通过使配制在基材例如小麦上、配制到饲料混合物(粗粉)例如10kg玉米/大豆饲料混合物中并混合特定时间例如10min的一种或多种酶混合来制备预混物。
可将预混物添加至饲料例如110kg饲料中，并在调节之前混合特定时间例如10min。在制粒之前，通常在90℃下将包含酶的饲料调节30秒。
如本文所用，术语“调节的”或“调节”意指使饲料/酶混合物混合并经干蒸汽处理以在30秒后达到90℃的目标温度。
可通过将饲料/酶混合物置于混合器例如阶式混合器(例如KAHL混合器，长度130cm，直径30cm，速度155rpm)中进行调节。
就300kg/h而言，停留时间为约30秒，计算如下：
容量：300kg/h-83.3g/秒。
所测阶式混合器中的填充物：2500g。
阶式混合器中的停留时间：2500g：83.3g/秒。＝30秒。
安装在阶式混合器侧面的可为带有一个水排出器和蒸汽可从其引至粗粉(例如饲料混合物)或饲料/酶混合物中的3个蒸汽阀的歧管。
该系统中的蒸汽可以由高压锅炉提供，例如Dan Stoker锅炉(最大容量400kg蒸汽/h)。测试可在2ato过压下进行并且可经由控制蒸汽加至阶式混合器的减压阀引导蒸汽。歧管上的三个阀门可用于微调期望的粗粉(例如饲料混合物)或饲料/酶混合物温度。通过加入1％蒸汽，粗粉(例如饲料混合物)或饲料/酶混合物温度增加14℃。
在调节之后，饲料/酶混合物可成型为丸粒。丸粒可在具有 模具的Simon Heesen压丸机中形成。容量设定为300kg/小时并与计量螺杆相适应。在阶式混合器中通过蒸汽将粗粉/预混物加热至65至95℃的目标温度。蒸汽量可通过减压阀和歧管进行调控。对于各个温度水平，在8-10min制粒后，样品首先在建立操作时获取。
压丸机可为带有7.5kW电机的Simon Heesen，labor型(单辊)。模具内径：173mm，压力辊高度：50mm，压力辊直径：140mm。压丸机：500rpm以及标称容量：300kg/h。
可在压丸之后获取样品。例如在带有打孔底部的分区冷却箱中对其进行冷却，通风器：1500m3空气/h。
在用得自小麦的天青精交联的阿拉伯聚糖作为底物分析样品中的木聚糖酶活性之前，用Perten实验室磨机研磨包含木聚糖酶的饲料混合物(粗粉)和所得饲料丸粒。使5.0g的研磨样品与50ml McIlvaine缓冲液(pH5.0)混合，并在磁力搅拌器上搅拌10min。使提取物过滤后通过玻璃纤维过滤器。使100μl提取物与400μl McIlvaine缓冲液(pH 5.0)混合并在50℃下平衡2min。添加60mg Xylazyme片剂(Megazyme，Ireland)以引发反应并使样品在50℃下温育60分钟，然后通过添加5ml的2％三(羟甲基)-氨基甲烷(Sigma,T-1503)终止反应。用涡旋混合溶液，使其静置5分钟，然后在再次混合后于3500rpm下离心10分钟。在590nm处测定上清液的吸光度。一式两份测定各个样品。
使用根据空白(无酶)粗粉和90℃饲料得到的木聚糖酶标准曲线对木聚糖酶活性进行定量。包含木聚糖酶的粗粉样品的活性设为100％并且相对于其来计算90℃条件下的饲料丸粒中合成木聚糖酶的残留活性。
现在将仅以举例的方式，参照如下附图和实施例来描述本发明。
实施例
实施例1—合成木聚糖酶的产生
质粒构建
经由从头基因合成(GeneArt GmbH,Germany)产生示为SEQ ID No.2、4、6、8、10和12的编码合成木聚糖酶的基因。然后厂商经由Gateway重组技术(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)将合成木聚糖酶克隆到目的载体pTTT-pyr2中。所得的表达合成木聚糖酶的质粒pTTTpyr2-synXyn_VAR(图13)在大肠杆菌DH5a菌株中进行扩增，纯化，测序，独立排列在96MTP中并用于如进一步描述的真菌转化。表达载体包含允许目标基因的强诱导型表达的里氏木霉cbhI启动子和终止子区，使得转化体在基本培养基(具有乙酰胺且无尿苷)上生长的构巢曲霉amdS和里氏木霉pyr2选择性标记物。质粒由于里氏木霉衍生的端粒区而自主维持于真菌细胞中。复制质粒的使用导致转化的频率增大并避开了在整合性真菌转化中观察到的基因座依赖性表达问题。
真菌菌株、生长培养基和转化
使用PEG-原生质体方法使表达质粒(5-10μl)转化到缺失主要纤维素酶和木聚糖酶2的里氏木霉菌株中(Δcbh1Δcbh2Δegl1Δegl2Δegl3Δegl4Δegl5Δegl6Δbgl1Δman1Δxyn2Prdiv:iRNAxyn1xyn3:amdS pyr2-)。内源性木聚糖酶1和3背景的另外下调通过以下来进一步实现：将干扰iRNA靶盒引入宿主菌株基因组以关闭xyn1和xyn3同时表达。所有高通量转化使用Biomek机械手(Beckman Coulter,USA)在24孔MTP形式中机器人式进行。根据预先确定的布局排列的96孔MTP中的具有合成木聚糖酶的质粒得自厂商。包含约1μg的DNA和5×106原生质体(总体积为50μl)的转化混合物用200μl的25％PEG溶液处理，用1倍体积的1.2M山梨醇/10mM Tris、pH7.5/10mM CaCl2溶液稀释，使其自动化重新布置到24孔MTP中并与包含1M山梨醇和10mM NH4Cl的1ml的3％琼脂糖基本培养基混合。在转化体生长之后，合并各个孔的孢子并在具有包含乙酰胺的MM的新鲜24孔MTP上修补(repatched)以用于额外的选择性压力。在形成孢子后，收获得到孢子并将其用于接种24孔MTP形式或摇瓶中的液体培养物，生产培养基如下：37g/L葡萄糖、1g/L槐糖、9g/L酪蛋白氨基酸、10g/L(NH4)2SO4、5g/L KH2PO4、1g/L CaCl2x2H2O、1g/L MgSO4×7H2O、33g/L1,4-哌嗪双(丙磺酸)、pH5.5、2.5ml/L的400X里氏木霉痕量元素(175g/L柠檬酸、200g/L FeSO4×7H2O、16g/L ZnSO4×7H2O、3.2g/L CuSO4×5H2O、1.4g/L MnSO4×H2O、0.8g/L硼酸)。添加1ml的生产培养基以在24孔MTP中产生合成木聚糖酶。对于摇瓶，体积按比例增大。
在200rpm摇动下，将板在28℃和80％湿度下培养6天。通过在2500rpm下离心10分钟收获得到细胞，并采用Millipore真空系统使其过滤通过Millipore Multiscreen过滤板。培养上层清液通过真空过滤收获得到并用于测定其性能以及表达水平。
通过采用MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)在Novex 10％Bis-Tris凝胶上进行PAGE电泳来测定整个液体培养基样品的蛋白质特征。用SimplyBlue SafeStain(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)显影多肽带。
对于较大规模生产，发酵在6升的耐高压持续搅拌反应器中进行。用孢子接种摇瓶并在摇动下于28℃温育3天，摇瓶培养基如下：5g/L(NH4)2SO4、4.5g/L KH2PO4、1g/L MgSO4×7H2O、14.4g/L柠檬酸×1H2O、1g/L CaCl2×2H2O、27.5g/L葡萄糖、1滴消泡剂(EROL DF6000K)。用NaOH(2M)将pH调节至5.5并在122℃下将培养基高压消毒20分钟。在冷却后，添加2.5ml/L的400X里氏木霉痕量元素(175g/L柠檬酸、200g/L FeSO4×7H2O、16g/L ZnSO4×7H2O、3.2g/L CuSO4×5H2O、1.4g/L MnSO4×H2O、0.8g/L硼酸)。使用得自摇瓶的细胞来接种包含以下生物反应器培养基的生物反应器：4.7g/L KH2PO4、1g/L MgSO4×7H2O、4.3g/L(NH4)2SO4、45g/L葡萄糖、0.7g/L CaCl2×2H2O、0.3g/L消泡剂(EROL DF6000K)、2.5ml/L的400X里氏木霉痕量元素(175g/L柠檬酸、200g/L FeSO4×7H2O、16g/L ZnSO4×7H2O、3.2g/LCuSO4×5H2O、1.4g/L MnSO4×H2O、0.8g/L硼酸)。将温度控制于34℃；通过添加20％氢氧化铵来连续控制pH。通过改变搅动速度来使溶解的氧气控制为最低40％饱和度。测定废气二氧化碳和氧气含量。当初始葡萄糖耗尽时，开始葡萄糖/槐糖的定量给料。与此同时，降低温度至并控制于28℃，增大pH至并控制于4.5。在140小时后，终止发酵。从罐中除去发酵液，并通过过滤移除细胞。在分离细胞后，通过超滤来浓缩滤液。最后，将浓缩物无菌过滤并用于制粒稳定性研究。
实施例2——合成木聚糖酶性能
除了生物效力优良之外(例如对动物性能有积极效果)，用于商业应用例如饲料应用的新木聚糖酶产品还需要具有优良的产品特征，包括加工稳定性。
已鉴定出合成多肽具有木聚糖酶活性。发现合成多肽有热稳定性。已发现合成木聚糖酶在经历制粒工艺之后具有较高的回收率(残留活性)。合成木聚糖酶能够降解DDGS(例如玉米DDGS-并由此增溶玉米)的WU-AX(水不可提取的阿拉伯聚糖)。此外，发现合成多肽对胃蛋白酶降解有抗性。
饲料中合成木聚糖酶的目的在于通过使更多的不溶性纤维消化并进入溶液来使喂养料的能量利用率最大化，由此使得更多的营养物质可用并因此产生更多的可发酵非淀粉多糖(NSP)。
除了较高的生物效力之外(例如对动物性能有积极效果)，本文提出的新木聚糖酶产品还具有优良的产品特征，包括热稳定性、针对热处理的稳定性(例如制粒)和/或胃蛋白酶抗性。
在一系列测试中对合成木聚糖酶进行测试，详情见下文材料和方法部分。
材料和方法
归一化
基于活性对合成木聚糖酶进行归一化。分别使粗制样品稀释20和130倍，并且采用活性测定以及具有以下浓度的商用木聚糖酶标准曲线来测定活性：0、10、20、30、40、50、60和70μg/ml。用25mM乙酸钠、250mM NaCl(pH 4.0)稀释样品。采用20倍稀释液对表观浓度小于1000μg/ml的样品进行定量，同时采用130倍稀释液对剩余样品进行定量。随后，在孔体积为210μl的微滴定板(MTP)(规格化板)中用25mM乙酸钠、250mM NaCl(pH 4.0)将合成木聚糖酶粗制样品稀释至150μg/ml的表观浓度。用107μl 25mM乙酸钠、250mM NaCl(pH 4.0)将53μl的归一化样品稀释至50μg/ml的表观浓度。
定量
使用Criterion Gel系统对规格化板中的样品进行定量。在加入酶后，使Laemmli样品缓冲液(Bio-rad#161-0737)与二硫苏糖醇(DTT)(Bio-rad#161-0611)和MilliQ水混合至50％Laemmli样品缓冲液和50mM DTT的最终浓度。使70μl Laemmli样品缓冲液混合物与得自规格化板的10μl样品充分混合，与由被25mM乙酸钠、250mM NaCl(pH 4.0)稀释至下列浓度的纯化商用木聚糖酶制定的标准曲线相平行：120、160、200、240、280和320μg/ml。
除了各个合成木聚糖酶的色氨酸数量与Mw的比率之外，表1还给出了分子量(Mw)、色氨酸数量。通过校正商业木聚糖酶的表观浓度来计算各个木聚糖酶的浓度，这通过乘以商业木聚糖酶的色氨酸数量与Mw的比率除以合成木聚糖酶的色氨酸数量与Mw的比率来实现。规格化板中所有合成木聚糖酶样品的浓度测定为120-200μg/ml的范围。
MW #W #W/MW
SynXyn72 32593 7 0.02147
SynXyn80 33103 7 0.02114
SynXyn85 32929 7 0.02125
SynXyn89 32854 7 0.02130
SynXyn92 32894 7 0.02128
SynXyn93 32894 7 0.02128
商用木聚糖酶 33254 8 0.02406
表1各个合成木聚糖酶的Mw和色氨酸数量与Mw的比率
活性测定
在牛血清白蛋白(BSA)存在下，测定木聚糖酶对于小麦WE-AX(水可提取的阿拉伯聚糖)的合成木聚糖酶活性。当对阿拉伯聚糖呈活性的木聚糖酶在底物中水解β1-4-键时，还原性端基的量增大。通过热和碱性条件，还原性端基与无色PAHBAH(4-对-羟基苯甲酸酰肼)反应，由此被PAHBAH氧化并在410nm处测定吸光度(Lever,1972,AnalyticalBiochemistry,47,273-279)。
缓冲液与试剂：
100mM醋酸钠(NaAc)，pH 5.0，0.10％BSA；将9.6g三水合醋酸钠溶解于800ml去离子水中，并用浓乙酸将pH调节至5.0。随后，用去离子水补加至1000ml。将1.0g BSA(SigmaAldrich，A7906)溶解于1000ml100mM NaAc(pH 5.0)。
WE-AX，阿拉伯聚糖底物0.5％，pH 5.0：将0.5g水溶性小麦阿拉伯聚糖(Megazyme，43厘沲的高粘度，P-WAXYH)用5ml 96％乙醇润湿，并添加100ml 100mM NaAc(pH 5.0)。在搅拌下将溶液加热至沸腾，随后在搅拌下冷却至室温(RT)。
PAHBAH工作液：制备三种溶液：1)0.5M氢氧化钠(NaOH)：500ml去离子水中10.0g氢氧化钠；2)0.5M HCl：500ml去离子水中20.8ml 37％HCl；3)5％PAHBAH原液；将25.0gPAHBAH(4-羟基苯甲酰肼，Sigma H9882)溶解于500ml 0.5M HCl中。溶液避光保护并储存于4℃。在临用前，通过用0.5M NaOH稀释PAHBAH原液五次来制备PAHBAH工作液。
程序：
采用Biomek分配机械手(Beckman Coulter,USA)在MTP(测定贮备板和测定板；96孔透明聚苯乙烯微孔板，Corning,Cat.no.9017；PCR板；VWR,Eu.目录号211-0297；读取板；Kisker Biotech,Cat.No.G080-F)中制备所有稀释液。
1.在测定贮备板中用147μl 100mM NaAc(pH 5.0)、0.1％BSA缓冲液稀释3μl酶样品(浓度范围为40-65μg/ml)。
2.使得自测定贮备板的25μl样品与测定板中的150μl WE-AX底物混合。
3.在30℃和1150rpm下温育测定板并在iEMS摇动器(Thermo Scientific)中摇动15分钟。
4.在温育结束后，使得自测定板的45.4μl反应混合物与PCR板中的135μlPAHBAH工作液混合。
5.在95℃下使PCR板在PCR仪(Tetrad 2，peltier热循环仪，Bio-Rad)中温育5分钟并随后冷却至20℃10秒。
6.将100μl样品转移至读板中并且在微板读板器(Molecular Devices)上于410nm处读取板。
所有合成木聚糖酶的活性计算为三次平行测定的平均值减去包含100mM NaAc(pH5.0)、0.1％BSA缓冲液且无酶的空白。
热稳定性测定
缓冲液与试剂：
1％Tween80：用9ml MES缓冲液(pH 6.0)溶解1g Tween80(Sigma P-8074)，随后用MES缓冲液(pH 6)将其再稀释10次。
25mM MES缓冲液(pH 6.0)，0.00125％Tween 80：25mM MES缓冲液(pH 6.0)：将4.88g MES(2-(N-吗啉)-乙磺酸)溶解于800ml去离子水中，并用NaOH将pH调节至6.0。添加1.25ml 1％Tween80，之后添加去离子水至1000ml。
程序：
在升高的温度下通过在25mM MES缓冲液、0.00125％Tween80(pH6.0)中温育蛋白质浓度为约1μg/ml(范围：0.8-1.3μg/ml)的合成木聚糖酶10分钟来测定合成木聚糖酶的热稳定性。如在活性测定中所述(步骤2-6)，在温育结束之后测定经热处理的合成木聚糖酶的残留活性。
各个合成木聚糖酶活性计算为三次平行测定的平均值减去包括25mM MES缓冲液、0.00125％Tween80(pH 6.0)而不加酶的空白。残留活性计算为所测经热处理样品的活性与所测未在升高的温度下温育的相同样品的活性之间的比率。
胃蛋白酶耐受性测定
在缓冲溶液中pH 3.5下于40℃测试合成木聚糖酶耐受胃蛋白酶降解的能力。
通过在40℃和1150rpm下，在iEMS摇动器(Thermo scientific)中使合成木聚糖酶在包含0.2g/l胃蛋白酶的100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.5)中温育2小时来测定合成木聚糖酶耐受胃蛋白酶降解的能力。如在活性测定中所述(步骤2-6)，在温育结束后测定合成木聚糖酶的残留活性。
缓冲液与试剂：
100mM甘氨酸缓冲液，pH 3.5：将7.52g甘氨酸溶解于800ml去离子水中，并用HCl将pH调节至pH 3.5。随后，用去离子水补加至1000ml。0.2mg/ml胃蛋白酶溶液：将0.2g胃蛋白酶(Sigma，P-7000)溶解于1000ml 100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.5)中。
各个合成木聚糖酶的活性计算为三次平行测定的平均值减去包含0.2mg/ml胃蛋白酶溶液而无酶的空白。各个合成木聚糖酶的残留活性计算为所测经胃蛋白酶处理的样品活性与在活性测定中用未经处理样品所测的活性之间的比率。
增溶测定
缓冲液与试剂：
100mM MES缓冲液，pH 6.0：将19.52g MES(2-(N-吗啉)-乙磺酸)溶解于800ml去离子水中，并用NaOH将pH调节至6.0。随后，用去离子水补加至1000ml。
玉米DDGS底物溶液，10％：通过在600rpm下搅拌15min使粒度<212μm的cDDGS在100mM MES缓冲液(pH 6.0)中水化。在刚终止搅拌之后，由于cDDGS中的酸残留物导致pH下降，所以对pH进行调节。将190μl/孔cDDGS底物转移到底物板中，使其在-20℃下储存备用。
程序：
采用Biomek分配机械手(Beckman Coulter,USA)在MTP(底物板和收集板；96孔透明聚苯乙烯微孔板，Corning,Cat.no.9017；过滤板；0.2μm PVDF膜，Corning，目录号3504；半深孔板：薄型1.2ml方形存储板，目录号AB-1127，Thermo Scientific)中制备所有稀释液。
1.将10μl酶样品(150μg/ml的表观浓度)添加至预制底物板中。
2.在40℃下在iEMS中温育240分钟；
3.使得自经温育底物板的170μl样品转移到过滤板中。
4.将过滤板置于收集板的顶部，并在1666xg下离心10min。
5.在进一步分析之前，使收集板储存于-20℃。
6.用半深孔板中的900μl超纯水稀释得自收集板的100μl，并且使其在转移至Skalar装置之前在摇床上混合2分钟。
戊聚糖的定量
根据Rouau&Surget(1994,Carbohydrate Polymers,24,123-132)所述的方法使用连续流动注入装置(SKALAR系统)来测定引入溶液的C5糖(戊糖)总量。用CH3COOH和HCl的混合物处理上清液以将多糖水解为单糖。添加间苯三酚(1,3,5-三羟基苯)以与单戊糖和单己糖反应，从而形成有色复合物。通过测量550nm与510nm(作为基准波长)处的吸光度，用木糖标准曲线(50-400μg木糖/ml)计算溶液中的戊糖浓度。不同于戊糖-间苯三酚复合物，己糖-间苯三酚复合物的吸光度在这些波长下是恒定的。将葡萄糖(0.3％)添加至间苯三酚溶液中以创建恒定葡萄糖信号并进一步确保无己糖的干涉作用。
结果表示为性能指数(PI)，其计算为在分别添加和不添加合成木聚糖酶的情况下温育cDDGS之后值之间的比率：(在用合成木聚糖酶温育后溶液中C5-糖总量)/(在不存在酶情况下温育后溶液中C5-糖总量)。
制粒稳定性
在Technological Institute(Kolding,Denmark)进行实地制粒试验。各个木聚糖酶可配制在小麦上并混入玉米/大豆饲料混合物(61.1％玉米、31.52％Hipro Soya 48、4.00％大豆油、0.40％碳酸氢钠、0.25％维生素/矿物质Leghennen、0.20％外消旋甲硫氨酸、1.46％磷酸二钙、1.16％石灰石)中。
木聚糖酶以达到20 000XU/kg饲料的最终目标而包含在内。通过使配制在小麦上的木聚糖酶混入10kg玉米/大豆饲料混合物中并混合10分钟来制备预混物。然后在调节之前将预混物添加至110kg饲料中并混合10分钟。在制粒之前，在90℃下将包含酶的饲料调节30秒。如本文所用，术语“调节”意指使饲料/酶混合物混合并经干蒸汽处理以在30秒后达到90℃的目标温度。
通过将饲料/酶混合物置于阶式混合器(即KAHL混合器，长度130cm，直径30cm，速度155rpm)中进行调节。
就300kg/h而言，停留时间为约30秒，计算如下：
容量：300kg/h-83.3g/秒。
所测阶式混合器中的填充物：2500g。
阶式混合器中的停留时间：2500g：83.3g/秒。＝30秒。
安装在阶式混合器侧面的为带有一个水排出器和蒸汽从其引至粗粉(例如饲料混合物)或饲料/酶混合物中的3个蒸汽阀的歧管。
该系统中的蒸汽由高压Dan Stoker锅炉(最大容量400kg蒸汽/h)提供。测试在2ato过压下进行并且可经由控制蒸汽加至阶式混合器的减压阀引导蒸汽。歧管上的三个阀门可用于微调期望的粗粉(例如饲料混合物)或饲料/酶混合物温度。通过加入1％蒸汽，粗粉(例如饲料混合物)或饲料/酶混合物温度增加14℃。
在调节之后，饲料/酶混合物成型为丸粒。丸粒在具有模具的Simon Heesen压丸机中形成。容量设定为300kg/小时并与计量螺杆相适应。在阶式混合器中通过蒸汽将粗粉加热至65至95℃的目标温度。蒸汽量通过减压阀和歧管进行调控。对于各个温度水平，在8-10min制粒后，样品首先在建立操作时获取。
压丸机为带有7.5kW电机的Simon Heesen，labor型(单辊)。模具内径：173mm，压力辊高度：50mm，压力辊直径：140mm。压丸机：500rpm以及标称容量：300kg/h。
在压丸之后获取样品。例如在带有打孔底部的分区冷却箱中对其进行冷却，通风器：1500m3空气/h。
在用得自小麦的天青精交联的阿拉伯聚糖作为底物分析样品中的木聚糖酶活性之前，用Perten实验室磨机研磨包含木聚糖酶的饲料混合物(粗粉)和所得饲料丸粒。使5.0g的研磨样品与50ml McIlvaine缓冲液(pH5.0)混合，并在磁力搅拌器上搅拌10min。使提取物过滤后通过玻璃纤维过滤器。使100μl提取物与400μl McIlvaine缓冲液(pH 5.0)混合并在50℃下平衡2min。添加60mg Xylazyme片剂(Megazyme，Ireland)以引发反应并使样品在50℃下温育60分钟，然后通过添加5ml的2％Tris(Sigma,T-1503)终止反应。用涡旋混合溶液，使其静置5分钟，然后在再次混合后于3500rpm下离心10分钟。在590nm处测定上清液的吸光度。一式两份测定各个样品。
使用根据空白(无酶)麦芽浆和90℃饲料得到的标准曲线对木聚糖酶活性进行定量。在McIlvaine缓冲液(pH 5.0)中提取小麦配制的SynXyn92木聚糖酶10分钟，以获得160U/ml的浓度。使提取物过滤通过玻璃纤维过滤器，此后将0、200、400、600、800和1000μl提取物添加至5.0g的研磨空白麦芽浆样品和90℃饲料中。如以上提取方法中所述，测定这些标准样品的木聚糖酶活性。
包含木聚糖酶的粗粉样品的活性设为100％并且相对于其来计算90℃条件下的饲料丸粒中合成木聚糖酶的残留活性。
结果
本文提出的合成木聚糖酶有利于体外降解得自cDDGS的WU-AX(水不可提取的阿拉伯聚糖)，在pH 5下具有可接受的特定活性，是热稳定的并在pH 3.5下抗胃蛋白酶降解(在2小时温育之后具有至少70％的残留活性)。就本文命名为synXyn92的合成酶而言，测定饲料加工稳定性，并且认为饲料加工稳定性较高(在90℃处理具有至少80％的残留活性)。
表2：本文列出合成木聚糖酶在所选择的温度(61℃、65℃或71℃)下温育10分钟后的残留活性，在胃蛋白酶存在下温育2h后的残留活性和戊聚糖增溶PI。认为PI大于1.5的合成木聚糖酶能够降解得自cDDGS的WU-AX。
表3示出成对比对的序列同一性(表示为百分比)。使用Indonesia软件组计算同一性百分比，其也用于编制序列对比。通过将最短多肽的相同氨基酸的数目除以氨基酸数目来计算同一性百分比。
在Danish Technological Institute用标准程序来测定加工稳定性(饲料粒化稳定性的形式)，并且描述于材料和方法部分中的制粒稳定性。SynXyn92在制粒后的残留活性为84％。在制粒之后，80％的回收率被视为是完全回收。
当在活性测定中测试时，本文命名为SynXyn 92、SynXyn85、SynXyn89、SynXyn72、SynXyn80和SynXyn93的合成序列也给出了肯定应答。当在活性测定中提及的条件下分析时，导致OD(410nm)>0.7的多肽被视为具有木聚糖酶活性。
实施例3——小麦粘度降低
与主要使用玉米的US相对比，在欧洲燃料醇工业中，小粒谷类如小麦、大麦和黑麦为常见的原材料。这些小粒谷类基本上包含淀粉、高含量非淀粉多糖聚合物(NSP)，如纤维素、β-葡聚糖和半纤维素。
用于表示不同NSP的比率对于每种饲料是不同的。表1示出相较于一些其它饲料，小麦、大麦和黑麦中不同量的NSP。
表1：存在于不同的饲料中的非淀粉多糖(g kg-1干物质)1,2
1Bach Knudsen，K.E.，1997.Carbohydrate and lignin contents of plantmaterials used in animal feeding.Anim.Feed Sci.Technol.,67(4):319-338
2Englyst,H.N.,Anderson,V.和Cummings,J.H.,1983.Starch and non-starchpolysaccharides in some cereal foods.J.Sci.Food Agric.,34:1434–1440.
3非纤维素多糖：戊聚糖、(阿拉伯)木聚糖及其它半纤维素
NSP赋予谷物麦芽浆较高的粘度。高粘度对乙醇生产有负面影响，因为其将限制可在酿造中使用的固体浓度并且其将降低工艺的能量效率。此外，在整个工艺中存在的残留半纤维素可导致在换热器和蒸馏设备中结垢。当麦芽浆冷却至发酵温度(32℃)时，观察到高粘度的最大影响。这就解释了为什么需要在冷却步骤之前于工艺的任何地方降低粘度。根据所用方法，酶需要在60℃和/或85℃下工作。
可在乙醇生产工艺的不同阶段：混合和/或糖化/发酵中添加降粘度酶。优选地，在混合中添加酶以打破初始粘度。
在乙醇生产工艺中使用降粘度酶有多种益处；
·可在工艺中使用更高的干物质麦芽浆
·可获得固体含量更高的最终浆
·热传递更好，能量需求更低
·蒸发器结垢减少，从而降低清洁成本
·最终乙醇收率增大
·DDGS的质量改善
方法
使用得自Perten Instruments的快速粘度分析仪(RVA 4500)来测定小麦麦芽浆的粘度特征。根据以下方案来制备该小麦麦芽浆：
如下制备60克的30％DS(“原样”34.65％)小麦浆液(同时在两个RVA上运行)：
-称取20.80克的小麦
-在100ml玻璃烧杯中，称取39.20克的自来水并添加137μl 4N H2SO4
-将小麦添加至水中并采用顶置式搅拌器在最大速度(约500rpm)下搅拌5分钟
-将25.0克的浆液转移到RVA杯中，添加稀释50倍的酶并使RVA开始运行(检查起始pH是否为约5.3)
-在RVA运行结束时检查pH(5.6-5.7)
在各个实验中(25克浆液)，木聚糖酶用量为25μg蛋白质(每8.66g“原样”小麦)，对应于2.9μg蛋白质/g原样”小麦。CL用量为0.15kg/MT“原样”小麦(2.2AAU/g“原样”或2.6AAU/g DS)。
在RVA中模拟标准小麦液化。在60℃下进行20分钟预处理，之后在85℃下进行30分钟液化步骤。在预处理和液化之后，使浆液冷却至32℃以测定发酵条件下的粘度。液化pH保持在5.3-5.7之间。
在该实验中，SynXyn93的性能相较于已知木聚糖酶具有粘度降低的特性(阳性对照)。
数据示于图16中。
这些数据示出SynXyn93酶在预处理步骤(60℃)期间不具有活性，但在液化步骤(85℃)中具有活性。在85℃的液化步骤期间粘度继续降低，表明SynXyn93在该升高的温度下具有显著的活性。SynXyn93的最终活性比空白低52-55％。
进行后续实验，其中在液化温度(85℃)下而非在工艺开始时添加木聚糖酶。这样做可表明SynXyn93的热稳定性得到改善。对于这些运行，使用具有注入孔的特定心轴，使得能够在RVA运行期间添加酶。当达到液化温度(85℃)时(22分钟处理时间)使心轴停止1分钟并添加木聚糖酶。注入孔用50μl软化水冲洗并在23分钟处理时间时使心轴再次开始旋转。在这些运行中，在工艺开始时添加CL。
*在预处理中未添加木聚糖酶，因此预期值与空白相同
数据示于图17中。
这些数据证实，SynXyn93相较于阳性对照酶热稳定性增大。SynXyn93示出相较于空白粘度降低54-60％，而阳性对照酶仅为40-41％。对于SynXyn93，当在工艺开始或85℃添加时，性能并无差异。另一方面，当在85℃而非在工艺开始添加时，阳性对照酶显著受到影响：粘度降低(相比于空白)由63％降至41％。因此在这种情况下，SynXyn93的最终粘度低于阳性对照酶。
上面说明书中提及的所有出版物均以引用的方式并入本文。对本领域的技术人员将显而易见的是，可在不背离本发明的范围和实质的条件下对所描述的本发明方法和系统作出各种修改和变型。尽管本发明已结合特定的优选实施方案进行了说明，但应该理解受权利要求书保护的本发明不应该不当地受限于这些特定的实施方案。实际上，生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的对所描述的本发明实施方式的各种修改旨在落入如下权利要求书的范围内。

Claims (37)

1.一种分离的具有木聚糖酶活性的多肽，所述多肽选自：
(a)包含与SEQ ID NO:1具有至少87％同一性的氨基酸序列的多肽；
(b)由与SEQ ID NO:2具有至少87％同一性的多核苷酸编码的多肽；或者
(c)a)或b)的多肽的片段，其片段具有木聚糖酶活性。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含选自下列的氨基酸序列：SEQ IDNo.1、SEQ ID No:3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9和SEQ ID No.11。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的多肽，其中所述多肽由选自下列的氨基酸序列组成：SEQ ID No.1、SEQ ID No:3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9和SEQ ID No.11。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽由选自下列的多核苷酸编码：SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10和SEQ IDNo.12。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽，其中所述多肽为内切-1,4-β-木聚糖酶。
6.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽在pH 6下于65℃温育10分钟之后具有至少50％的木聚糖酶活性的残留活性，并且/或者在pH 6下于61℃温育10分钟之后具有至少80％的木聚糖酶活性的残留活性。
7.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽在与含0.2mg/ml胃蛋白酶的缓冲溶液在pH 3.5下于40℃的温度温育两小时之后具有至少70％的残留活性。
8.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中在包含所述多肽的饲料经干蒸汽处理以在30秒后达到90℃的目标温度之后，所述多肽具有至少60％(优选至少80％)的木聚糖酶活性的残留活性。
9.一种分离的包含编码权利要求1-16中任一项所述的多肽的核苷酸序列的多核苷酸(例如cDNA)。
10.一种分离的包含与SEQ ID NO:2具有至少87％同一性的多核苷酸的多核苷酸(例如cDNA)；或者一种分离的因遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.2的多核苷酸。
11.一种分离的选自下列的多核苷酸(例如cDNA)：SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10和SEQ ID No.12，或者一种分离的因遗传密码的简并性而不同于SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10和SEQ IDNo.12的多核苷酸。
12.一种包含权利要求9至11中任一项所述的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸有效连接至一个或多个指导表达宿主中所述多肽产生的控制序列。
13.一种包含权利要求12所述的核酸构建体的重组表达载体。
14.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含权利要求8-11中任一项所述的多核苷酸、权利要求12所述的核酸构建体、或权利要求13所述的载体。
15.一种用于生产权利要求1-8中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括：(a)在有利于产生所述多肽的条件下培养包含根据权利要求12所述的核酸构建体的宿主细胞；以及(b)回收所述多肽。
16.根据权利要求15所述的方法，其中对所述多肽进行回收。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所产生的多肽是分离的和/或纯化的。
18.一种通过权利要求15至17中任一项所述的方法生产的发酵物。
19.一种通过权利要求15至17中任一项所述的方法生产的多肽。
20.一种宿主细胞，所述宿主细胞已经用编码权利要求1-8中任一项所述的多肽的多核苷酸、权利要求8-11中任一项所述的多核苷酸、权利要求12所述的核酸构建体、或权利要求13所述的载体进行转化。
21.一种酶组合物，所述酶组合物包含根据权利要求1-8中任一项所述的多肽、或根据权利要求18所述的发酵物、或根据权利要求19所述的多肽。
22.一种饲料添加剂组合物，所述饲料添加剂组合物包含根据权利要求1-8中任一项所述的多肽、或根据权利要求18所述的发酵物、或根据权利要求19所述的多肽。
23.一种预混物，所述预混物包含根据权利要求1-8中任一项所述的多肽、或根据权利要求18所述的发酵物、或根据权利要求19所述的多肽、或根据权利要求21所述的酶组合物、或根据权利要求22所述的饲料添加剂组合物以及至少一种维生素和/或至少一种矿物质。
24.根据权利要求22所述的饲料添加剂组合物或根据权利要求23所述的预混物，所述饲料添加剂组合物或所述预混物还包含一种或多种选自下列的酶：淀粉酶(包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、G4-形成淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3))；和/或蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))和/或植酸酶(例如6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.38))。
25.一种饲料(或喂养料)，其包含根据权利要求1-8中任一项所述的多肽、或根据权利要求18所述的发酵物、或根据权利要求19所述的多肽、或根据权利要求21所述的酶组合物、或根据权利要求22或权利要求24所述的饲料添加剂组合物、或根据权利要求23或权利要求24所述的预混物。
26.一种制备喂养料的方法，所述方法包括使饲料组分与根据权利要求1-8中任一项所述的多肽、或根据权利要求18所述的发酵物、或根据权利要求19所述的木聚糖酶、或根据权利要求21所述的酶组合物、或根据权利要求22或权利要求24所述的饲料添加剂组合物、或根据权利要求23或权利要求24所述的预混物相混合。
27.一种用于降解含木聚糖材料中含阿拉伯聚糖材料的方法，所述方法包括使所述含木聚糖材料与根据权利要求1-8中任一项所述的多肽、或根据权利要求18所述的发酵物、或根据权利要求19所述的木聚糖酶、或根据权利要求21所述的酶组合物、或根据权利要求22或权利要求24所述的饲料添加剂组合物、或根据权利要求23或权利要求24所述的预混物相混合。
28.根据权利要求1-8中任一项所述的多肽、或根据权利要求18所述的发酵物、或根据权利要求19所述的木聚糖酶、或根据权利要求21所述的酶组合物、或根据权利要求22或权利要求24所述的饲料添加剂组合物、或根据权利要求23或权利要求24所述的预混物用于使含木聚糖材料中阿拉伯聚糖增溶的用途。
29.根据权利要求27或28中任一项所述的方法或用途，其中所述阿拉伯聚糖是不溶性阿拉伯聚糖(AXinsol)。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法或用途，其中所述含木聚糖材料选自下列中的一者或多者：饲料或喂养料；饲料组分；谷物基材料；麦芽浆；麦芽汁；麦芽；发芽大麦；助剂，大麦麦芽浆；和谷类面粉。
31.根据权利要求30中任一项所述的方法或用途，其中所述饲料或喂养料或饲料组分包括玉米、DDGS(诸如cDDGS)、小麦、麦麸或它们的组合或者由这些物质组成。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的方法或用途，其中所述饲料或喂养料为玉米基喂养料。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的方法或用途，其中所述多肽与选自下列的酶中的一种或多种组合使用：内切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)；纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、纤维素酶(E.C.3.2.1.74)、地衣多糖酶(E.C.3.2.1.73)、脂酶(E.C.3.1.1.3)、脂质酰基转移酶(通常归类为E.C.2.3.1.x)、磷脂酶(E.C.3.1.1.4、E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)、植酸酶(例如6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.3.8)、淀粉酶、α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、其它木聚糖酶(E.C.3.2.1.8、E.C.3.2.1.32、E.C.3.2.1.37、E.C.3.2.1.72、E.C.3.2.1.136)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)、半纤维素酶、蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))、脱支酶、角质酶、酯酶和/或甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。
34.根据权利要求27至33中任一项所述的方法或用途，所述方法或用途包括对受试者施用根据权利要求1-8中任一项所述的多肽、或根据权利要求18所述的发酵物、或根据权利要求19所述的木聚糖酶、或根据权利要求21所述的酶组合物、或根据权利要求22或权利要求24所述的饲料添加剂组合物、或根据权利要求23或权利要求24所述的预混物、或根据权利要求25所述的喂养料。
35.根据权利要求27至33中任一项所述的方法或用途，其中所述方法或用途为小麦谷朊蛋白-淀粉分离工艺(或其一部分)。
36.根据权利要求27至33中任一项所述的方法或用途，其中所述方法或用途为生物燃料(例如生物乙醇)或生化物质(例如生物基异戊二烯)生产工艺(或其一部分)。
37.根据权利要求27至33中任一项所述的方法或用途，其中所述方法或用途为麦芽制造或酿造工艺(或其一部分)。
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