CN111269958A - 添加在饲料中木聚糖酶的测定方法 - Google Patents
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Abstract
发明涉及饲料领域，具体涉及添加在饲料中木聚糖酶的测定方法。该方法将待测饲料样品预冷经乙酸缓冲液透析，然后测定酶活。本发明所述添加在饲料中木聚糖酶的微量测定方法通过饲料样品的预处理，避免了木聚糖酶在提取过程中失活，降低了木聚糖酶检测下限，消除了干扰背景的影响，因此能够准确测定添加在饲料中木聚糖酶含量。
Description
技术领域
本发明涉及饲料领域，具体涉及添加在饲料中木聚糖酶的测定方法。
背景技术
2009年发布了饲用木聚糖酶活性测定方法的国家标准GB/T 23874-2009。1个木聚糖酶活性单位定义为：在37℃和pH为5.5的条件下每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中释放出1μmol还原糖所需要的木聚糖酶的数量。
现有测定方法(GB/T23874-2009)中，“DNS法”测定木聚糖酶含量的原理为：木聚糖酶在一定温度和pH条件下，水解木聚糖，生成寡糖和单糖，还原性的寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂发生显色反应，在波长540nm下进行比色测定。具体过程为：取待反应液(酶浓度约0.04U/mL～0.10U/mL)2.0mL，37℃水浴预热10分钟，加入已预热至37℃的木聚糖溶液2mL，37℃精确水解30分钟，加入5mLDNS试剂，沸水浴加热5分钟，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL。以标准曲线的空白调零，在分光光度计540nm波长处测定样品空白和样品溶液的吸光值，根据实测吸光值计算木聚糖酶的活性。该方法适用于作饲料添加剂用的木聚糖酶产品，不适用于添加有木聚糖酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料，样品最低检出量为10U/g。
但是，用于测定添加在饲料中的木聚糖酶时，饲料中的木聚糖酶酶活约为1.0U/g饲料，远远低于该方法的检测下限。并且，该方法直接测定配合饲料中的木聚糖酶活性，空白对照组与反应组吸光度OD540超过1.5，远远超出了方法的测定最高值，而且二者无明显差异。
目前木聚糖酶大多是从细菌或真菌中得到，大量的木聚糖酶分离纯化后性质鉴定表明，不同来源的木聚糖酶在分子量、等电点、最适温度和pH值上都有着明显的不同，并且在对底物的选择性上也有区别。
用GB/T23874-2009测定不同来源的木聚糖酶，检测结果变异系数较大，无法准确测定，因此，需要有一种快速、简便，具有高度特异性、灵敏度、准确度的方法，测定木聚糖酶的活性以及添加在饲料中的木聚糖酶的活性，将会更有利于科学合理地制作配方，促进木聚糖酶产业的发展。
发明内容
为了解决上述问题，提出并完成了本发明。
本发明的目的是提供一种添加在饲料中木聚糖酶的测定方法。
根据本发明的添加在饲料中木聚糖酶的测定方法包括以下步骤：
(1)制备试样溶液，将待测饲料样品预冷至4℃，粉碎过筛，充分混匀后准确称取样品加入乙酸缓冲液，待测饲料样品与乙酸缓冲液的质量体积比1:10，在4℃环境下搅拌，过滤，弃去初滤液，取过滤液移入透析袋进行透析，
其中，所述透析的条件为：置于4℃预冷的透析外液乙酸缓冲液中，透析外液体积为透析样液的10倍，透析时间为20小时，透析10小时需换一次透析外液，透析后准确量取体积；
(2)测定酶活，取透析液，37℃水浴预热10分钟，加入已预热至37℃的等体积木聚糖溶液，37℃水解30分钟，加入5mL DNS试剂，沸水浴加热5分钟，冷却至室温，加水定容，
以标注木聚糖酶标准曲线的标准空白调零，在分光光度计540nm波长处测定样品空白和样品溶液的吸光值，用直线回归方程计算木聚糖酶的活性，根据实测吸光值通过以下公式计算待测饲料样品中的木聚糖酶的活性
式中，C为根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，F为试样溶液反应前的总稀释倍数，m为试样重量。
根据本发明的添加在饲料中木聚糖酶的测定方法，其中，1000mL乙酸缓冲液的配方为：8.20g无水乙酸钠,0.5g牛血清白蛋白，pH值5.50。
本发明发现木聚糖酶与饲料中的某些成分的亲和性，导致酶的溶解不全，引起测定的误差，用GB/T23874-2009测定不同来源的木聚糖酶检测结果变异系数较大，存在测定误差，还存在饲料中的一些金属离子等会使木聚糖酶失活的问题，饲料中的木聚糖酶酶(1.0U/g饲料)远远低于现有方法的检测下限((10U/g)的问题。本发明的技术方案解决了上述技术问题。
本发明的有益效果是：本发明的添加在饲料中木聚糖酶的微量测定方法与现有技术对加酶饲料的测定方法(用标准(GB/T 23874-2009)方法)相比存在以下不同：
第一，消除了饲料中的还原糖对木聚糖酶水解反应的影响。
第二、乙酸缓冲液中加入了0.5％的牛血清白蛋白(BSA)，在提取过程中，保护了酶蛋白活性，避免了饲料中的金属离子等对酶蛋白分子的影响。
本发明所述添加在饲料中木聚糖酶的微量测定方法通过饲料样品的预处理，避免了木聚糖酶在提取过程中失活，降低了木聚糖酶检测下限，消除了干扰背景的影响，因此能够准确测定添加在饲料中木聚糖酶含量。
具体实施方式
下面通过具体的实验测定过程来说明本发明。
1.试剂和溶液
在具体实施方式中所用试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯和符合GB/T6682中规定的三级水。
1.1乙酸钠溶液，0.1mol/L：称取乙酸钠8.20g，加水溶解，定容至100mL。
1.2乙酸溶液，0.1mol/L:吸取冰醋酸0.60mL，加水溶解，定容至100mL。
1.3乙酸缓冲液，c(CH3COONa)＝0.1mol/L:称取8.20g无水乙酸钠,0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000mL烧杯中，加入900mL水搅拌溶解，用冰乙酸调节pH值至5.50±0.01，再转移至1000mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度；如果pH值偏离5.50，用乙酸钠溶液(1.1)或乙酸溶液(1.2)调节至5.50。室温下存放2个月内有效；
1.4木聚糖溶液为100mg/mL：称取木聚糖(Sigma X0627)1.00g，加入0.32g氢氧化钠，再加入90mL水，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至木聚糖完全溶解，停止加热继续搅拌30分钟。用乙酸缓冲液定容至100mL。如果pH值偏离5.50，用乙酸钠溶液(1.1)或乙酸溶液(1.2)调节至5.50。使用前适当摇匀，4℃避光保存，有效期为12小时。
1.5氢氧化钠溶液，200g/L：称取氢氧化钠20.00g，加水溶解，定容至100mL。
1.6 DNS试剂:称取3，5-二硝基水杨酸3.15g，加水500mL，搅拌3-5秒，水浴至45℃。然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液(1.5)，同时不断搅拌，知道溶液澄清透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃).再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃器过滤。取滤液，存贮在棕色瓶中，避光保存，室温下存放7天后方可使用，有效期为180天。
1.7标准木聚糖酶(标明准确活性单位和类型)，参考国标GB/T 23874-2009饲用木聚糖酶活性的测定分光光度法测定酶活。
2.仪器和设备
实验室常用仪器设备
2.1分析天平：感量0.1mg
2.2恒温水浴：(37±0.1)℃
2.3分光光度计：有10mm比色皿，可在540nm下测定吸光度。
2.4磁力搅拌器。
2.5涡流式混合物。
2.6酸度计：精确至小数点后2位。
2.7电磁炉。
3.试样制备
3.1饲料样品：按照国标GB/T 14699.1的规则进行采样，取有代表性饲料样品用四分法将试样缩分至500g，配合饲料需粉碎通过0.45mm标准筛，装入密封器，防止试样成分变化。
3.2空白饲料：为不添加酶制剂的饲料样品(3.1)，取样及处理同饲料样品方法.
实施例1
1.测定步骤
1.1标准曲线
准确称取一定量的标准木聚糖酶(参考国标GB/T 23874-2009对标注饲用木聚糖酶的限定)，精确至0.0001g，于50mL容量瓶中，用乙酸缓冲液溶解并定容至刻度，做两次稀释，使木聚糖酶活性大约为0.20U/mL左右，当日配制。
将上述木聚糖酶按表1用缓冲液进行稀释，需要准确计算木聚糖酶的浓度，与样品一起反应测定：
1.1.1标准空白：吸取补步骤“1.3”配制的乙酸-乙酸钠缓冲液4.0mL，加入DNS(1.6)5.0mL，沸水浴加热5分钟，自来水冷去至室温，定容至25.0mL。
1.1.2标准：分别吸取表1所示的已知不同酶液2.0mL，分别加入到刻度试管中，再分别加入2.0mL上述乙酸-乙酸钠缓冲液和5.0mLDNS试剂(参考“1.6”)，电磁振荡3-5秒，沸水浴加热5分钟，然后用自来水冷却到室温，再用蒸馏水定容至25Ml.以标准空白调零，在540nm处侧测定吸光度。
以木聚糖酶浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，列出直线回归方程(y＝ax+b)。
表1
2.2试样溶液的制备
2.2.1样品处理：将饲料样品预冷至4℃，全部粉碎，采取间断式粉碎，防止粉碎时饲料发热，通过0.45mm的标准筛，充分混匀后准确称取样品50.00g，加入500mL乙酸缓冲液，在4℃环境下磁力搅拌45分钟，过滤，弃去初滤液50mL，取过滤液100mL完全准确移入透析袋中，置于4℃预冷的透析外液(乙酸缓冲液)中，透析外液体积约为透析样液的10倍，透析时间为20小时，透析10小时需换一次透析外液。透析后准确量取体积并记录。
2.2.2已知酶液配制：取一已知酶配制成酶活为0.06U/mL的酶液。取100mL进行透析、测定。(方法同样品组)
2.2.3空白饲料+已知酶：准确称取不添加酶制剂的空白饲料样品50.00g，量入上述经透析、测定的已知酶液500mL，在4℃环境下磁力搅拌45分钟，过滤(弃去初滤液50mL)，取过滤液100mL完全准确移入透析袋中，置于4℃预冷的透析外液(乙酸缓冲液)中，透析外液体积约为透析酶液的10倍，透析时间为20小时(透析10小时需换一次透析外液)。透析后准确量取体积并记录。
2.3反应
具体测定过程：
2.3.1样品空白：取透析液2.0mL，37℃水浴预热10分钟，加入5mL DNS试剂(1.6)，电磁振荡3-5秒，加入已预热至37℃的木聚糖溶液(1.4)2mL，37℃精确水解30分钟，沸水浴加热5分钟，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL。
2.3.2样品：取透析液2.0mL，37℃水浴预热10分钟，加入已预热至37℃的木聚糖溶液(1.4)2mL，37℃精确水解30分钟，加入5mL DNS试剂(1.6)，沸水浴加热5分钟，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL。
以标准曲线的标准空白(1.1.1)调零，在分光光度计540nm波长处测定样品空白和样品溶液的吸光值，根据实测吸光值计算木聚糖酶的活性。
在反应过程中，从加入木聚糖溶液开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，37℃水解30min。
2.4样品测定
以标准曲线的空白调零，在分光光度计540nm波长处测定样品空白和样品溶液的吸光值，用直线回归方程计算木聚糖酶的活性；
4.5结果计算和表示
4.5.1木聚糖酶活性计算：
式中：C-----根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性；
F-----试样溶液反应前的总稀释倍数；
m----试样重量；
2.5.2结果表示
两个平行样品的测定结果用算式平均值表示，保留整数。
2.5.3重复性
同一样品两个平行测定的相对偏差，添加木聚糖酶的各种饲料样品不大于10％。
以下是本发明的方法对于不同类型饲料样品，添加1.0U/g饲料的木聚糖酶，经过测定得到的结果。
检验已知酶在样品提取、透析、测定过程中是否有损失。具体计算步骤为：
已知酶回收率(％)＝(A1-A2)/A3×100％
A1：已知酶液与饲料(体积/质量)为10：1进行提取、透析后的测定值(U/mL)
A2：乙酸缓冲液与饲料(体积/质量)为10：1进行提取、透析后的测定值(U/mL)
A3：已知酶液进行透析后的测定值(U/mL)
饲料样品酶活(U/g饲料)＝A2×稀释倍数×(透析后体积/透析前体积)
计算已知酶添加到饲料中是否与理论添加量相符：已知酶回收率允许误差不大于10％；同一个样品两个平行测定值的相对偏差不大于10％。
表2添加在配合饲料(仔猪料、中大猪料、鸡料、鸭料、草鱼料)中1.0U/g饲料木聚糖酶的测定结果
表2中仔猪料、中大猪料、鸡料、鸭料、草鱼料按照饲料配方，由饲料厂提供，主要成分是玉米、豆粕、玉米蛋白粉、鱼粉、油脂、磷酸氢钙、白石粉、赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、维生素、微量元素等。
由上述测定结果可知，本发明的方法在不同的配合饲料中，测定的结果与理论值相符，变异系数≤5.5％，重复性好。在不同配合饲料的空白料中已知酶回收率高，与理论值基本一致，准确性高。
本发明方法消除了还原糖对测定的干扰、降低了木聚糖酶检测下限、消除了饲料中金属离子等对木聚糖酶的失活影响、用添加已知酶来检验该测定方法的可行性与准确性，变异系数较小(CV％≤10％)，而且有比较好的重复性和准确性。
Claims (2)
1.一种添加在饲料中木聚糖酶的测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)制备试样溶液，将待测饲料样品预冷至4℃，粉碎过筛，充分混匀后准确称取样品加入乙酸缓冲液，待测饲料样品与乙酸缓冲液的质量体积比1:10，在4℃环境下搅拌，过滤，弃去初滤液，取过滤液移入透析袋进行透析，
其中，所述透析的条件为：置于4℃预冷的透析外液乙酸缓冲液中，透析外液体积为透析样液的10倍，透析时间为20小时，透析10小时需换一次透析外液，透析后准确量取体积；
(2)测定酶活，取透析液，37℃水浴预热10分钟，加入已预热至37℃的等体积木聚糖溶液，37℃水解30分钟，加入5mL DNS试剂，沸水浴加热5分钟，冷却至室温，加水定容，
以标注木聚糖酶标准曲线的标准空白调零，在分光光度计540nm波长处测定样品空白和样品溶液的吸光值，用直线回归方程计算木聚糖酶的活性，根据实测吸光值通过以下公式计算待测饲料样品中的木聚糖酶的活性
式中，C为根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，F为试样溶液反应前的总稀释倍数，m为试样重量。
2.根据权利要求1所述的添加在饲料中木聚糖酶的测定方法，其特征在于，1000mL乙酸缓冲液的配方为：8.20g无水乙酸钠,0.5g牛血清白蛋白，pH值5.50。
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