CN112557539A - 一种同时测定血浆中维生素a、维生素e和25-羟基维生素d的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同时测定血浆中维生素A、维生素E和25‑羟基维生素D的方法，采用液相色谱串联质谱法进行检测,检测的色谱条件如下：色谱柱：F5色谱柱；流动相：流动相A为含体积分数为0.1%甲酸和1mM甲酸铵的甲醇溶液；B为体积分数为0.1%的甲酸水溶液；梯度洗脱程序为：0‑2.7min，78%A；2.71‑4.00min，97%A，4.01‑4.8min，78%A。本发明方法高效准确、线性范围广、重现性良好，而且样本使用量少、患者依从性好、检测成本低，具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种同时测定血浆中维生素A、维生素E和25-羟基维生素D的方法。
背景技术
维生素又名维他命，是维持人体生命活动必须的微量营养物质。维生素种类多、性质差异悬殊，按溶解性可分为脂溶性和水溶性两大类，脂溶性维生素包括维生素A、D、E等，其缺乏会导致营养性疾病的发生。
例如，维生素A是构成视觉细胞中感受弱光的视紫红质的组成成分，缺乏时影响暗适应能力，会导致夜盲症、眼部炎症等。维生素D能够调节人体的钙、磷体内平衡，缺乏会导致少儿佝偻病和成年人的软骨病。25羟基维生素D是维生素D在体内的主要存在形式，其中，3-epi-25-(OH)-VD3是 25(OH)VD3的同分异构体，但不具有生理活性，检测过程中若不能有效分离该物质，将造成25(OH)VD3的检测结果偏高。维生素E具有抗氧化、免疫调节、控制炎症、基因表达和认知能力的调控等作用,缺乏会导致代谢失常、免疫力下降、新生儿溶血性贫血等。
脂溶性维生素的传统检测方法有比色法、紫外失活分光光度法、荧光法及微生物法等。这些方法只能测定某一种维生素的含量，操作步骤复杂，血浆样本量大,且结果不稳定,干扰因素多,因此需要建立一种灵敏、准确、快速的分析方法。
现有技术中，有使用液相色谱-串联质谱(LS-MS/MS)同时测定多种脂溶性维生素的报道，如李金蓉等，液质联用定量血清中维生素D、A、E的方法，国际检验医学杂志，2019,40:876-881报道了一种定量检测血清中脂溶性维生素的方法；公开号为CN105158394A的专利申请公开了一种同时检测血清中多种脂溶性维生素的方法。这些方法均未见有效分离3-epi-25-(OH)-VD3，而且存在血清使用量较多，不利于婴幼儿采血分析；或检测的维生素线性范围不够宽，若患者体内浓度过低，则难以准确检测等问题。
因此，急需开发准确、低样本量的脂溶性维生素检测方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种利用高效液相色谱串联质谱法，同时测定血浆中维生素A、维生素E和25-羟基维生素D的方法。
本发明提供了一种同时测定血浆中多种脂溶性维生素的方法，采用液相色谱串联质谱法进行检测，检测的色谱条件如下：
色谱柱：F5色谱柱；
流动相：流动相A为含体积分数为0.1％甲酸和1mM甲酸铵的甲醇溶液； B为体积分数为0.1％的甲酸水溶液；
梯度洗脱程序为：0-2.7min，78％A；2.71-4.00min，97％A，4.01-4.8min， 78％A。
其中，所述脂溶性维生素为维生素A、维生素E、25-羟基维生素D2、25- 羟基维生素D3和/或3-epi-25-羟基维生素D3。
其中，所述色谱柱的规格为：长度50mm，内径3mm，填料粒径2.6μm；优选的色谱柱型号为Phenomenex Kinetex F5色谱柱。
其中，质谱条件为：离子源：ESI；雾化气流量：3L/min；加热气流量： 5L/min；接口温度：350℃；DL温度：150℃；加热块温度：450℃；干燥气流量：15L/min。
其中，操作步骤如下：
a.供试品溶液制备：取待检血浆，加入乙醇、正己烷，萃取后离心，取上清液，氮气吹干，加入70％甲醇复溶，备用；
b.标准品溶液制备：取各维生素标准品，乙醇溶解，混合，稀释，备用；
c.分别将供试品溶液、标准品溶液进行液相色谱串联质谱法检测；
d.根据检测结果计算得到各自脂溶性维生素成分含量。
其中，步骤a中，乙醇溶解时，加入内标溶液；待检血浆与乙醇的体积比为1:3。
其中，步骤a中，待检血浆与正己烷的体积比为1:140。
其中，步骤b中，所述稀释的溶液为体积分数为70％的甲醇水溶液。
其中，步骤c中，检测时的进样量为20μL。
本发明方法，可以同时检测维生素A、E和25-羟基维生素D，并且可以有效分离25-(OH)-VD3与其同分异构体3-epi-25-(OH)-VD3，检测结果准确可靠；且样本使用量少，仅需要10μL血浆，可针对婴幼儿采血困难时采集指尖血检测，患者依从性好，线性范围广、重现性好，具有良好的临床应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1本发明方法的色谱图
图2本发明方法检测25-(OH)-VD3与3-epi-25-(OH)-VD3的结果
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
实施例1本发明测定方法
1、维生素标准品的制备
维生素的详细信息如下：
(1)标准储备液的配制：
标准储备液A：精确称取视黄醇标准品10mg，用乙醇溶解，并定容于 10mL，-80℃保存。
标准储备液B：精确称取α-生育酚标准品10mg，用乙醇溶解，并定容于 10mL，-80℃保存。
(2)标准校正液的配制：
维生素A：从储备液A吸取此标准溶液20μL，用无水乙醇定容，混匀。
在325nm波长下测定吸光值，结合标准比吸光系数按照公式(1)(2) 计算出标准溶液的实际浓度。避光操作。
采用以下公式(1)(2)计算：
稀释倍数＝10000×5mL/20μL……………………(2)
式中：CX—待标定的标准溶液的实际浓度值；g/100mL
A—325nm处测定的待标定标准溶液的吸光度平均值；
E—维生素A的1％比吸光系数＝1835
维生素E：从储备液B吸取此标准溶液20μL，置5mL容量瓶中，用无水乙醇定容，混匀。
采用以下公式(1)(2)计算：
稀释倍数＝10000×5mL/20μL……………………(2)
式中：CX—待标定的标准溶液的实际浓度值；g/100mL
A—294nm处测定的待标定标准溶液的吸光度平均值；
E—维生素E的1％比吸光系数＝71
(3)标准工作液的配制
VAE标准工作液的制备：储备液A稀释得到16μg/mL的溶液与储备液B 稀释得到160μg/mL的溶液等比混合，得VA和VE的最高点分别为8μg/mL 和80μg/mL。对半稀释，得到VA浓度为0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、 1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL；VE浓度为1.25μg/mL、2.5 μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL。
25(OH)VD3和25(OH)VD2混合标准品工作液的制备：准确量取16.33μL 25-OH-VD3储备液和10.20μL 25-OH-VD2储备液，加入973.5μL甲醇：水 (7:3)溶液稀释，得到25-OH-VD3和25-OH-VD2的最高点分别为1600μg/L 和500μg/L。对半稀释，得到25-OH-VD3浓度分别为6.25ng/mL、12.5ng/mL、 25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL；25-OH-VD2浓度分别为1.95ng/mL、3.9ng/mL、7.8ng/mL、15.625ng/mL、31.25ng/mL、62.5 ng/mL、125ng/mL。
(4)标准内标溶液
标准内标储备液的配制
标准储备液C(200μg/mL)：精确称取维生素A同位素内标2mg，用乙醇溶解，并定容于10mL，-80℃保存。
标准储备液D(500μg/mL)：用2mL无水乙醇溶解维生素E同位素内标(共1mg)，-80℃保存。
25(OH)VD3-d6内标0.5mg，加入5mL甲醇溶液溶解，得到 25(OH)VD3-d6的内标储备液浓度为100μg/mL。
内标工作液的配制
VAE内标工作液：从储备液C稀释得到0.225μg/mL的储备液，从储备液D稀释得到2.25μg/mL的储备液，稀释液是乙醇，两者等比混合，得到含维生素A同位素内标0.1125μg/mL和维生素E同位素1.125μg/mL的内标工作液，-80℃保存。
VD内标工作液：从25(OH)VD3-d6和25(OH)VD2-d3的储备液和母液进行稀释，稀释液为甲醇：水(7:3)，得到25(OH)VD3-d6和25(OH)VD2-d3 的内标工作液分别为100ng/mL和17.5ng/mL，-80℃保存。
2、供试血浆样品的制备
用多通道移液器移取50μL无水乙醇内标【VAE内标工作液-VD内标工作液-无水乙醇(10:10:30)】于96孔板中，加入10μL血浆，加入1400μL 正己烷，170℃封膜4s，振荡5min(2500转/分钟)，以达到充分萃取的目的，离心15min(4000转/分钟)，取上清液1200μL到96孔板，氮气吹干，加入100μL70％甲醇，170℃封膜4s，振荡1min(2500转/分钟)进样，每次进样量20μL。
3、维生素含量的测定
(1)色谱条件：
流动相：甲醇，含0.1％甲酸和1mM甲酸铵(A)；0.1％甲酸-水(B)
色谱柱：PhenomenexKinetex2.6μmF550x3.0mm
梯度条件：0-2.7min,78％A；2.71-4.00min,97％A；4.01-4.8min,78％A，进样量20μL。
(2)质谱条件：
离子源：ESI；雾化气流量：3L/min；加热气流量：5L/min；
接口温度：350℃；DL温度：150℃；加热块温度：450℃；
干燥气流量：15L/min。
质谱参数如下：
4、请给出样品中各自维生素含量的计算方法
上机检测，软件计算所得浓度即为血浆中VA，VE，25(OH)VD2和 25(OH)VD3的浓度。检测色谱图见图1。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：
试验例1本发明方法学验证
1、试剂与仪器
试剂：甲醇：Merck,HPLC；乙醇：科隆,HPLC；正己烷：Fisher,HPLC；水：屈臣氏
仪器：岛津高效液相色谱串联质谱仪8050CL。
2、标准曲线的建立
标曲配制过程：VAE标准工作液-VAE内标工作液-VD标准工作液-VD 内标工作液-稀释剂(1:1:1:1:6)混合，得VAED标曲。其中稀释剂为甲醇- 水(70:30)，上机检测。
参数：见维生素含量的测定(1)色谱条件和(2)质谱条件。
定量限和检测限试验、加标回收率试验、精密度试验按常规方法进行。
3、线性关系考察
结果如下：
VA在0.125μg/mL到8μg/mL范围内，相关系数R2﹥0.99；
VE在1.25μg/mL到80μg/mL范围内，相关系数R2﹥0.99；
25(OH)VD3在6.25ng/mL到392ng/mL范围内，相关系数R2﹥0.99；
25(OH)VD2在1.95ng/mL到122.5ng/mL范围内，相关系数R2﹥0.99。
可见，本方法测定四种维生素成分在各自质量浓度范围内线性关系良好 (R2﹥0.99)，说明本发明方法线性范围广，准确度高。
4、定量限和检测限试验
重复测定20个空白样本，计算检测限为均值加3倍SD值；定量限计算检测限为均值加10倍SD值。
结果如下：
定量限(LOQ)：VA为0.058μg/mL；VE为0.767μg/mL；25(OH)VD3 为4.04ng/mL；25(OH)VD2为1.71ng/mL。
检测限(LOD)：VA为0.017μg/mL；VE为0.276μg/mL；25(OH)VD3 为3.35ng/mL；25(OH)VD2为1.01ng/mL。
可见，本方法测定四种维生素成分的定量限和检测限浓度低，说明本发明方法准确有效。
5、加标回收率和方法精密度试验
VA母液浓度检测：取母液7.5μL，加入7mL乙醇混匀后在325nm处测量其吸光度。重复测量两次，每次读取三次数值，取平均数。
VE母液浓度检测：取母液75μL，加入7mL乙醇混匀后在294nm处测量其吸光度。重复测量两次，每次读取三次数值，取平均数。
本低样本平均分成4分，其中一份不加标，另外三份分别加入低、中、高不同浓度标准品，计算加标回收率。
结果见表1-4。
表1 VA回收率范围和精密度结果
| 加标量 | 1μg/mL | 2μg/mL | 3μg/mL |
| 回收率 | 98.69％ | 103.03％ | 92.47％ |
| 精密度 | 4.17％ | 4.69％ | 0.97％ |
表2 VE回收率范围和精密度结果
| 加标量 | 6.3μg/mL | 10.5μg/mL | 15.7μg/mL |
| 回收率 | 96.05％ | 105.34％ | 102.73％ |
| 精密度 | 3.84％ | 8.61％ | 7.00％ |
表3 25(OH)VD2回收率范围和精密度结果
| 加标量 | 24.5ng/mL | 49ng/mL | 98ng/mL |
| 回收率 | 104.72％ | 106.49％ | 96.42％ |
| 精密度 | 2.80％ | 1.97％ | 1.00％ |
表4 25(OH)VD3回收率范围和精密度结果
| 加标量 | 49ng/mL | 98ng/mL | 196ng/mL |
| 回收率 | 110.96％ | 106.19％ | 99.61％ |
| 精密度 | 1.19％ | 0.85％ | 0.85％ |
可见，使用本发明方法，样品回收率较高，各成分的相对标准偏差均远远小于10％，稳定性良好，说明本发明方法准确度高。
6、仪器精密度试验
将处理好的同一个样本在相同条件下重复进样5次，依据测量值考察仪器的精密度。结果见表5。
表5仪器精密度数据统计
可见，仪器精密度良好，重复性好。
试验例2本发明方法分离25-(OH)-VD3及其同分异构体
3-epi-25-(OH)-VD3标准品购买自Cerilliant，货号E086。
将取待测样本分为两份，其中一份加入3-epi-25-(OH)-VD3使其浓度为 50ng/mL。对两份样本分别检测25-(OH)-VD3浓度，重复检测4次，比较检测值，确认在含有最多50ng/mL浓度的3-epi-25-(OH)-VD3时仍能保证检测的准确性。
检测参数同实施例1。
结果见表6和图2。
表6 25-(OH)-VD3检测结果(单位：ng/mL)
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 重复4 | |
| 正常样本 | 18.361 | 19.296 | 18.862 | 19.109 |
| 加入同分异构体的样本 | 19.404 | 18.039 | 19.882 | 19.337 |
可见，无论是否加入同分异构体3-epi-25-(OH)-VD3，25-(OH)-VD3的测定结果均较一致，说明二者可以有效分离，本发明方法测定25-(OH)-VD3时可以排除样本中的3-epi-25-(OH)-VD3干扰。
发明人在实际工作中，发现婴幼儿体内大量存在3-epi-25-(OH)-VD3，而现有文献报道的脂溶性维生素检测方法无法将其与25-(OH)-VD3分离。本发明方法通过特定的五氟苯基柱色谱柱与色谱、质谱参数配合，可以有效分离 3-epi-25-(OH)-VD3同分异构体，测定结果准确可靠。
综上，本发明方法可以同时检测维生素A、E和25-羟基维生素D，并且可以有效分离25-(OH)-VD3与其同分异构体3-epi-25-(OH)-VD3，结果准确可靠，而且样本使用量少、患者依从性好、检测成本低，具有良好的临床应用前景。
Claims (9)
1.一种同时测定血浆中多种脂溶性维生素的方法，其特征在于，采用液相色谱串联质谱法进行检测，检测的色谱条件如下：
色谱柱：F5色谱柱；
流动相：流动相A为含体积分数为0.1%甲酸和1mM甲酸铵的甲醇溶液；B为体积分数为0.1%的甲酸水溶液；
梯度洗脱程序为：0-2.7min，78%A；2.71-4.00min，97%A，4.01-4.8min，78% A。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述脂溶性维生素为维生素A、维生素E、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3和/或3-epi-25-羟基维生素D3。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述色谱柱的规格为：长度50mm，内径3mm，填料粒径2.6μm；优选的色谱柱型号为Phenomenex Kinetex F5色谱柱。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
质谱条件为：离子源：ESI；雾化气流量：3L/min；加热气流量：5L/min；
接口温度：350℃；DL温度：150℃；加热块温度：450℃；
干燥气流量：15L/min。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于：操作步骤如下：
a.供试品溶液制备：取待检血浆，加入乙醇、正己烷，萃取后离心，取上清液，氮气吹干，加入70%甲醇复溶，备用；
b.标准品溶液制备：取各维生素标准品，乙醇溶解，混合，稀释，备用；
c.分别将供试品溶液、标准品溶液进行液相色谱串联质谱法检测；
d.根据检测结果计算得到各自脂溶性维生素成分含量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
步骤a中，乙醇溶解时，加入内标溶液；待检血浆与乙醇的体积比为1:3。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
步骤a中，待检血浆与正己烷的体积比为1:140。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
步骤b中，所述稀释的溶液为体积分数为70%的甲醇水溶液。
9.根据权利要求5-8任意一项所述的方法，其特征在于：步骤c中，检测时的进样量为20μL。
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