CN113390976B - 一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的检测试剂盒及其检测方法，通过将甲醇、乙腈、异丙醇与内标准品工作液混合制成内标溶液，并在内标溶液中添加乙酸铵，从而简单高效地完成样品前处理，无需任何额外的样品富集等操作，即可显著提高血清样品中维生素A、E、K1、K2的回收率，并使经过前处理后的样品更加稳定，大幅提高血清中脂溶性维生素的检测灵敏度；而且配置的内标溶液非常稳定，可长期保存，随用随取，使检测过程更加简便高效，检测成本更低，检测结果更加准确和稳定。同时本发明还提供了乙酸铵用于制备内标溶液的用途。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析技术领域，具体而言，涉及一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
维生素A(VA)又称视黄醇，具有维持正常视觉、维护上皮组织、促进骨骼正常生长发育的功能。人体内VA不足会导致干眼病、夜盲症和皮肤过度角化等营养缺乏症。25-羟基维生素D是调节人体钙磷代谢的重要因子，协调骨钙的动员或沉积、尿钙的吸收或排泄，维持体内血钙水平的稳定，对骨骼发育塑形、肌肉神经传导效应及细胞活动、信息传递等生命活动至关重要。儿童缺乏表现为佝偻病，成人缺乏表现为骨软化、骨质疏松；过量会引起钙的吸收增加，导致高钙血症。维生素E(VE)是一组以立体异构体存在的生育酚类物质，其中以α-生育酚活性最强。VE能促进性激素分泌，提高男性和女性的生育能力，能防止自由基或氧化剂对细胞膜的损伤，具有预防动脉粥样硬化、心血管系统疾病和更年期综合症的生理作用，VE缺乏时会出现睾丸萎缩和上皮细胞变性，致孕育异常。维生素K主要的生理作用是参与凝血酶原及凝血因子的合成，人体缺乏VK会导致凝血时间延长，严重者有出血倾向，在某些因素的影响下(如感染、腹泻等)甚至有颅内出血的风险，其中维生素K1是肝脏合成因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ所必须的物质，在临床上应用于凝血酶过低症、维生素K1缺乏症、新生儿自然出血症的防治以及梗阻性黄疸、胆瘘、慢性腹泻等所致出血，香豆素类、水杨酸钠等所致的低凝血酶原血症；维生素K2是维生素K唯一具有生物活性的形式，多用于加速凝血、维持凝血时间、治疗维生素K缺乏引起的出血症，也有用于其他保健途径的报道。因此，脂溶性维生素的检测可评估患者体内的脂溶性维生素的营养状况。对脂溶性维生素缺乏或过量的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助诊断的意义。
目前国内外有关血清中脂溶性维生素的测定方法报道很多，常见的方法有：层析法、分光光度法、气相色谱法、液相色谱法，在众多的方法中，液相色谱法或液相串联质谱法为测定脂溶性维生素的首选方法，以往方法存在操作过程复杂、干扰因素多、特异性差、分析时间长、灵敏度不高、定性定量准确性差且重现性较差的问题，这主要都是因为样品前处理过程繁琐、回收率不高、稳定性差所造成的。
现有的脂溶性维生素样品前处理方法主要是采用液液提取(如CN106504947A)和固液萃取方法(如CN110763788A)，需经稀释、多次萃取、旋转蒸发、氮气吹干、净化等多个步骤，过程繁琐，需大量的人工操作，而且液液提取难以实现高通量和自动化，固液萃取虽然能实现高通量，但其中样品萃取过程主要依靠SLE板来完成，耗材成本高。
目前也有不少采用蛋白沉淀法进行血清和血浆中脂溶性维生素样品测定的样品前处理的相关专利申请，如CN111999397A、CN110487943B等，但普遍存在回收率不高而导致灵敏度偏低的问题，有些甚至在蛋白沉淀后，还需要进一步萃取，才能进行后续的检测分析，使临床检测需要更多的人工操作，不利于临床的推广和使用。
因此迫切需要一种操作简单、处理效率高、回收率高、成本低、人工工作量小等优点的脂溶性维生素样品前处理方法，使其可以克服现有方法的以上不足和缺陷，从而使高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的方法具备更高的灵敏度，检测过程更加简便高效，并能保证检测结果的准确性和稳定性。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的检测试剂盒及其检测方法，通过将甲醇、乙腈、异丙醇与内标准品工作液混合制成内标溶液，并在内标溶液中添加乙酸铵，从而简单高效地完成样品前处理，无需任何额外的样品富集等操作，即可显著提高血清样品中脂溶性维生素的回收率，降低样品前处理的成本，从而大幅提升血清中脂溶性维生素检测的灵敏度；而且配置的内标溶液非常稳定，可长期保存，随用随取，使检测过程更加简便高效，检测成本更低，检测结果更加准确和稳定。
一方面，本发明提供了一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括标准样品、质控样品、内标溶液、液相色谱流动相和耗材；所述内标溶液包括内标准品工作液、甲醇、乙腈和异丙醇。
本发明所述的脂溶性维生素为维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K1、维生素K2中的任意一种或多种。通过高效液相色谱串联质谱法对上述六种脂溶性维生素进行检测，按照保留时间相近进行分组，质谱在不同的时间进行分段采集，可以进一步提高维生素K1、维生素K2的检测灵敏度。
现有的样品前处理过程中，内标溶液和前处理试剂都是分开配制，分两次加入并混合，给样品前处理过程带来更多的人工操作。
研究小组经过大量实验，令人惊喜地发现，将甲醇、乙腈和异丙醇等溶液直接与内标准品工作液混合成优化的内标溶液体系，加入样品中混匀，既可发挥内标的作用，还可实现对样品中目标物质的纯化提取，而且该内标溶液体系对样品中的脂溶性维生素的选择性和溶解性非常高，完全不需要冷冻干燥或液液萃取后氮吹等富集过程，分离沉淀物杂质后可直接进样检测，并能显著提升检测灵敏度，简化了操作过程，而且所用试剂为成本较低的常规化学试剂，降低了检测成本。
通过对制得的内标溶液进行稳定性评价，研究证明，本发明提供的内标溶液非常稳定，可长期保存，随取随用，非常方便。
进一步地，所述内标溶液还包括添加剂，所述添加剂为甲酸、氟化铵、甲酸铵、乙酸铵、2,6-二叔丁基对甲酚中的任意一种或多种。
在内标溶液中加入添加剂，可发挥协同效应，进一步提升样品中脂溶性维生素的提取收率。
进一步地，所述添加剂为乙酸铵；所述内标准品工作液包含待测脂溶性维生素的内标。
研究证明，当添加剂为乙酸按时，协同效应最明显，对样品中脂溶性维生素的提取收率最高。
进一步地，所述甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为5～75％:5～75％:5～75％，所述乙酸铵的含量为10～50mM。
进一步地，所述甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为70～75％:15～25％:5～10％，所述乙酸铵的含量为40～50mM。
进一步地，所述内标准品工作液与40～50mM乙酸铵(70～75％甲醇+15～25％乙腈+5～10％异丙醇)溶液的体积比为1:124；所述内标工作液为含有VA1-d6、VD3-d6、VD2-d6、VK1-d4和VE-d6中的一种或多种的同位素内标溶液。
其中VA1-d6为维生素A的内标，VD3-d6为维生素D3的内标，VD2-d6为维生素D2的内标，VK1-d4为维生素K1和维生素K2的内标，VE-d6为维生素E的内标。
大量实验证明，本发明提供的内标溶液体系，在室温下可稳定存放两年以上。
本发明提供的内标溶液的配方及比例关系，对样品中的脂溶性维生素的选择性和溶解性、液质参数的提高都有较高的贡献，为提高检测方法的灵敏度也都有作出了相当大的贡献。
进一步地，所述耗材为低吸附96孔进样板。
进一步地所述标准样品为：含有标准浓度的维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K1、维生素K2中的任意一种或多种的溶液，采用阴性空白人血清作为基质配制；所述质控样品为：含有低中高三个不同水平浓度的血清基质样品；所述液相色谱洗脱液包括流动相A和流动相B，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸甲醇溶液。
采用流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸甲醇溶液进行检测时，灵敏度高，使用50uL血清时，6种脂溶性维生素的标曲最低浓度点(S1)完全满足最低定量的要求。
进一步地，所述标准样品的制备包括以下步骤：以阴性空白人血清作为空白基质，加入维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K1、维生素K2中的任意一种或多种标准溶液，配制系列已知浓度的脂溶性维生素标准品。
进一步地，质控品的制备包括以下步骤：以血清作为基质，加入维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K1、维生素K2中的任意一种或多种标准溶液，配制低(L)、中(M)、高(H)三个浓度的脂溶性维生素质控样品。
采用阴性空白人血清配制标准品及血清配制质控品，降低了人血清样品检测时的基质效应，提高了标准曲线的准确性及可靠性。
另一方面，本发明提供了一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的方法，所述方法采用如上所述的检测试剂盒进行检测；包括样品制备、样品前处理、样品检测；其中，所述样品前处理包括以下步骤：取50μL样品至96孔板，加入150～350μL内标溶液涡旋混匀，600～1000rpm震荡10min，离心分离，取上清液200μL于低吸附96孔板中，待测。
本发明提供的检测方法样品用量少，仅50uL，降低了临床采血难度。
样品前处理过程中，样品和内标溶液的体积比为1∶3～1∶7。
使用低吸附96孔板进样，可降低脂溶性维生素被进样板吸附的风险，提高检测结果的精密度和准确度。
大量研究证明，在优化的内标溶液体系基础上，使用低吸附进样板，可降低目标物质被进样板吸附的风险，提高脂溶性维生素提取后的稳定性，保证了检测结果的精密度和准确度。
进一步地，其中所述内标溶液体积为250μL。
进一步地，所述样品检测包括液相色谱和串联质谱检测，采用梯度洗脱；串联质谱，采用大气压化学电离离子源(APCI)和正离子多反应监测扫描模式(MRM)，并根据保留时间进行分段采集。
进一步地，所述梯度洗脱时间需7min，梯度洗脱程序为：
| 时间(min) | 流动相A％ | 流动相B％ | 流速(ml/min) |
| 0.00 | 60.0 | 40.0 | 0.70 |
| 4.50 | 10.0 | 90.0 | 0.70 |
| 5.00 | 0.0 | 100.0 | 0.70 |
| 6.70 | 0.0 | 100.0 | 0.70 |
| 6.71 | 60.0 | 40.0 | 0.70 |
| 7.00 | 60.0 | 40.0 | 0.70 |
采用以上洗脱条件，可以排除血清基质对6种脂溶性维生素检测的干扰，保证了检测的准确性。检测时间短，整个检测时间7.0min左右，缩短了样品检测时间，采用特定梯度洗脱程序进行梯度洗脱，保证了样品分离效果，通过质谱实现6种脂溶性维生素的同时精准检测，大大缩短了单个样品的检测时间，有效降低分析成本，而且可报告范围广，可准确分析6种脂溶性维生素浓度异常的血清样品。
进一步地，高效液相色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱，流动相流速为0.70mL/min，柱温在40℃。
进一步地，所述的质谱条件为：
进一步地，所述的质谱条件为：用于检测的6种脂溶性维生素及其内标的母离子/子离子对质荷比(m/z)如下表所示：
进一步地，具体的质谱分段采集方式为：维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3为第一组，维生素E、维生素K1、维生素K2为第二组；或维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E为第一组，维生素K1、维生素K2为第二组。
进一步地，所述方法还包括样品分析，主要步骤为：绘制标准曲线，计算回收率、基质效应、精密度，及计算待测人血清样品中脂溶性维生素的浓度。
再一方面，本发明提供了乙酸铵用于制备内标溶液的用途，所述内标溶液用于高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的样品前处理。
进一步地，所述脂溶性维生素为维生素A、维生素E、维生素K1、维生素K2中的一种或多种。
本发明具有以下有益效果：
(1)提供了一种新型的内标溶液体系，既可发挥内标的作用，还可实现对样品中目标物质的纯化提取，而且对样品中的脂溶性维生素(特别是维生素A、E、K1、K2)的选择性和溶解性非常高，完全不需要冷冻干燥或液液萃取后氮吹等富集过程，分离沉淀物杂质后可直接进样检测，并能显著提升检测灵敏度，简化了操作过程；
(2)本发明配制内标溶液所用试剂为成本较低的常规化学试剂，降低了检测成本；
(3)本发明提供的内标溶液非常稳定，可长期保存，随取随用，非常方便，使检测过程更加简便高效；
(4)在优化的内标溶剂体系基础上，使用低吸附进样板，可降低目标物质被进样板吸附的风险，提高脂溶性维生素提取后的稳定性，保证了检测结果的精密度和准确度；
(5)采用阴性空白人血清配制标准品及血清配制质控品，降低了人血清样品检测时的基质效应，提高了标准曲线的准确性及可靠性；
(6)采用流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸甲醇溶液，灵敏度高；
(7)检测时间短，整个检测时间7.0min左右，采用特定梯度洗脱程序进行梯度洗脱，保证了样品分离效果，通过质谱分时间段检测，进一步提高维生素K1、K2的检测灵敏度，实现6种脂溶性维生素的同时精准检测，大大缩短了单个样品的检测时间，有效降低了分析成本；
(8)样品用量少，仅50uL，降低临床采血难度；
(9)可报告范围广，可准确分析6种脂溶性维生素浓度异常的血清样品；
(10)维生素A、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、维生素E、维生素K1、维生素K2的灵敏度最高分别可达到0.4ng/mL、0.7ng/mL、0.3ng/mL、3ng/mL、10pg/ml和6pg/mL。
附图说明
图1是实施例1中对按照标样S1系列浓度并以阴性空白人血清为基质配制的待测样品进行检测获得的检测图谱
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本实施例中使用的试剂均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1：样品制备、前处理、检测、分析
一、样品制备
1、标准曲线和质控样品的配制
将维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K1、维生素K2标准品配制成混合溶液，作为标准工作液和质控工作液的储备液，再分别与阴性空白人血清和阴性血清按1:49的体积比混合，配制标准曲线和质控样品。
6种脂溶性维生素在标准品中具有10个系列浓度(S1～S10)，如表1所示：
表1、6种脂溶性维生素在标准品中的10个系列浓度(S1～S10)
6种脂溶性维生素在质控品中具有低(L)、中(M)、高(H)三个系列浓度，如表2所示：
表2、6种脂溶性维生素在质控品中的三个系列浓度
| ng/ml | 维生素A | 25羟基维生素D2 | 25羟基维生素D3 | 维生素E | 维生素K1 | 维生素K2 |
| L | 144 | 7.2 | 10.8 | 1800 | 0.36 | 0.36 |
| M | 480 | 24.0 | 36.0 | 6000 | 1.20 | 1.20 |
| H | 1440 | 72.0 | 108.0 | 18000 | 3.60 | 3.60 |
2、内标溶液的配制
(1)内标准品工作液的配制
配制混合内标准品工作液，维生素A-d6、25-羟基维生素D2-d3、25-羟基维生素D3-d6、维生素E-d6、维生素K-d4的浓度分别为3.0、1.0、1.0、20和0.025μg/mL。
(2)内标溶液的配制
分别量取750ml甲醇、150ml乙腈和100ml异丙醇，配置成含75％甲醇，15％乙腈和10％异丙醇的混合溶液，再称取3.85g乙酸铵，配置成含有50mM乙酸铵，5％甲醇，15％乙腈和10％异丙醇的混合溶液A。
取2ml内标准品工作液加入248ml混合溶液A内，配制成内标准品工作液与混合溶液A的比例为1：124内标溶液。
本实施例虽然选用乙酸铵作为添加剂，但经多次实验证明，添加剂也可选用甲酸、氟化铵、甲酸铵或2,6-二叔丁基对甲酚，同样能够发挥提高样品中脂溶性维生素提取率的协同效果。
二、样品前处理
样品包括待测人血清、标准品、质控品，都采用如下方法处理：
(1)取50μL标准品/质控品/待测人血清，加入到96孔深孔板中；
(2)加入250μL内标溶液，1000rpm震荡10min；
(3)在4,000rpm离心10min，取上清液200μL于干净的低吸附96孔板中，样品待测。
三、样品检测
取40μL样品进液相色谱质谱联用系统分析，具体分析条件如下：
液相色谱串联质谱系统：AB SCIEX Triple Quad 4500MD；色谱柱：PhenomenexLuna C18(3μm,50×2.0mm)；流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：0.1％甲酸甲醇；流速：0.7mL/min；柱温：40℃；进样器温度：15℃；进样量：40μL。
洗脱梯度如表3所示：
表3、洗脱梯度
| 时间(min) | 流动相A％ | 流动相B％ | 流速(ml/min) |
| 0.00 | 60.0 | 40.0 | 0.70 |
| 4.50 | 10.0 | 90.0 | 0.70 |
| 5.00 | 0.0 | 100.0 | 0.70 |
| 6.70 | 0.0 | 100.0 | 0.70 |
| 6.71 | 60.0 | 40.0 | 0.70 |
| 7.00 | 60.0 | 40.0 | 0.70 |
6种维生素的保留时间如下：维生素A的保留时间为2.84min，25羟基维生素D2的保留时间为2.75min，25羟基维生素D3的保留时间为2.69min，维生素E和维生素K2的保留时间为5.03min，维生素K1的保留时间为5.69min。
如图1所示，样品通过超高压液相色谱分离后，不同的脂溶性维生素在不同洗脱时间出峰，并且被质谱选择反应监控模式检测到，从而检测其含量。
液相色谱上分离出的6种脂溶性维生素进入到质谱进行检测，利用采用大气压力化学离子源(APCI)和多反应监测扫描模式(MRM)检测6种脂溶性维生素的含量，并绘制标准曲线图。
质谱分段采集方式为：维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3为第一组，维生素E、维生素K1、维生素K2为第二组。
质谱检测条件如表4所示：
表4、质谱检测条件
每个待测物的母离子/子离子对质荷比、正离子模式优化去簇电压、碰撞电压、碰撞室射出电压等如表5所示：
表5、待测物的母离子/子离子对质荷比等参数
可以通过选择反应监控检测到的离子对，以及对应的保留时间，来确定脂溶性维生素的检测，并通过各种脂溶性维生素的内标进行定量。
样品通过液相色谱分离后，不同的脂溶性维生素在不同洗脱时间出峰，并且被质谱多反应监测模式检测到，从而检测其含量。按照标样S1系列浓度，以阴性空白人血清为基质配制待测样品进行检测，检测图谱如图1所示。由图1可见，按照本实施例提供的方法，可以同时准确检测6种脂溶性维生素。
四、数据处理及分析
1、绘制标准曲线
标准曲线图以6种脂溶性维生素标准品浓度为横坐标，以与6种脂溶性维生素其各自内标峰面积比为纵坐标，进行线性回归，获得标准曲线，标准曲线及相关系数如表6所示。
表6标准曲线回归方程及相关系数
| 物质 | 线性及线性相关系数 |
| VA | y＝0.05055*x+0.09145(r＝0.99845) |
| 25(OH)VD2 | y＝0.04916*x+0.1723(r＝0.99906) |
| 25(OH)VD3 | y＝0.05218*x+0.27584(r＝0.99920) |
| VE | y＝0.04822*x+0.13845(r＝0.99898) |
| VK1 | y＝0.05207*x+0.19085(r＝0.99553) |
| VK2 | y＝0.05064*x+0.2871(r＝0.99721) |
2、计算准确度、精密度和基质效应
(1)准确度&精密度
使用低、中、高浓度质控样品(L、M、H)中待测物与其内标峰面积比，代入建立的6种各自的维生素标准曲线中，计算得到质控样品中6种脂溶性维生素的浓度，再计算出至少3个分析批的每种质控样品的准确度和精密度结果，其接受标准为测定值均值和理论值间的准确度在85.0％～115.0％之间，且精密度(CV)≤15％。三次精密度测试，三个浓度(L、M、H)，准确度在91.2％～110.5％之间，批间精密度(CV)在1.46％～9.25％之间，符合要求。
(2)基质效应
基质效应通过比较各浓度质控水平的纯溶液样品与其对应添加入基质空白和血清空白后待测物的响应得到(基质和血清样品需减去本底响应)，基质效应在85％-115％之间时表明该基质对待测物测定的影响可忽略。如存在基质效应，各浓度质控水平的基质效应应接近。内标归一化的基质因子在95％-106％之间，CV在1.75％～8.76％之间，符合要求。
3、计算待测人血清样品中6种脂溶性维生素的浓度
质谱检测得到脂溶性维生素与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血清中脂溶性维生素的含量。
实施例2：不同内标溶液体系的长期放置稳定性评价结果对比
本实施例按照实施例1提供的内标溶液配制方法，配制含有6种脂溶性维生素内标的内标溶液，并采用如表7所示的不同的内标溶液体系成分，分别进行稳定性测试，稳定性测试是指放入48℃恒温箱中六个月，观察内标溶液是否出现浑浊、变质等异常现象，并比较经稳定性考察的内标溶液与新配制内标溶液是否有区别，通过实施例1提供的检测方法，检测其中内标成分是否发生浓度偏差，以及用于样品前处理后对目标待测物回收率的是否发生偏差，取标准曲线最低浓度点(S1)进液相色谱质谱联用系统分析，由于每种脂溶性维生素的考察结果基本一致，这里仅以含量最低的维生素K1的内标浓度偏差和提取率偏差进行举例证明；同时还考察了室温下长期保存的保质期；考察结果如表7所示。
表7、不同内标溶剂体系的长期放置稳定性评价结果对比
由表7可见，当内标溶液中同时含有乙酸铵、甲醇、乙腈和异丙醇四种成分时，构建的内标溶液体系是最稳定的，48℃恒温箱中六个月后，与新配制内标溶液几乎无区别，保质期达两年以上；而当内标溶液中仅含有乙酸铵、甲醇和乙腈或甲醇、乙腈和异丙醇三种成分时，稳定性明显下降，与新配制内标溶液进行检测时，偏差快速上升；当内标溶液中仅含有甲醇、乙腈，或是甲醇和乙腈时，则稳定性较差，甚至需要即配即用，使样品前处理过程较繁琐。
可见本发明提供的内标溶液体系非常稳定，进行样品前处理时仅需向样品中加入内标溶液，一步混合即可完成前处理，而且内标溶液可提前配置，随用随取，非常方便，大大简化了前处理的步骤，具有格外明显的优越性，为血清中脂溶性维生素的临床检测带来了极大地便利，非常值得推广应用。
实施例3：采用不同内标溶液体系的检测结果对比
本实施例按照实施例1提供的内标溶液配制方法，配制含有5种脂溶性维生素内标的内标溶液，采用如表8所示的不同的内标溶液体系成分，并按照实施例1提供的步骤方法完成样品制备和前处理后，取标准曲线最低浓度点(S1)进液相色谱质谱联用系统分析，测得S1样品中6种脂溶性维生素的峰面积如表8所示：
表8、采用不同内标溶液体系的检测结果对比
由表8可以看出，采用本实施例提供的内标溶液体系50mM乙酸铵(75％甲醇+15％乙腈+10％异丙醇)时，检测到的维生素A、E、K1和K2的峰面积明显提升，虽然对25-羟基维生素D2和D3的峰面积略有下降，但是对于检测维生素A、E、K1和K2具有积极意义，尤其是对于在人血清样品中的浓度水平较低的维生素K1和K2，以及对于同时检测包含维生素K1和K2的6种脂溶性维生素具有积极意义。
维生素K的临床检测参考区间仅为0.13-1.39ng/mL，因此对检测方法的样品前处理回收率和检测灵敏度要求非常高，在同时检测6种脂溶性维生素的方法中，需特别关注维生素K的检测灵敏度。现有的一些样品前处理方法虽然能满足同时检测样品中的多种脂溶性维生素，但是对维生素K1和K2的回收率却偏低，导致维生素K1和K2的检测灵敏度受限制，临床上难以对同时对包含维生素K1和K2的6种脂溶性维生素是否缺乏进行很准确的判断。
由表8可知，纯甲醇对维生素K的提取率偏低，无法满足临床检测的灵敏度要求，采用乙腈或甲醇乙腈的混合溶液，可显著提高维生素K的提取效率。由于待测物均为脂溶性维生素，根据相似相溶原理，在萃取体系中引入异丙醇，可进一步提高维生素A、E、K1、K2的提取率；同时在此基础上，再添加乙酸铵、甲酸铵或2,6-二叔丁基对甲酚，则能起到明显的协同效应，使维生素A、E和K的提取率，尤其是乙酸铵，协同效应尤为明显；因此内标溶液体系的最佳选择为50mM乙酸铵(75％甲醇+15％乙腈+10％异丙醇)。
采用本实施例提供的内标溶液体系，不仅简化了前处理的操作，而且还明显提高人血清中维生素A、E和K(尤其是含量最低的维生素K1和K2)的回收率，使后续的高效液相色谱串联质谱检测结果更加准确，灵敏度更高，使得对血液样品中多种脂溶性维生素的检测能力同时满足临床的参考区间的实际需求。采用本实施例提供的内标溶液体系50mM乙酸铵(75％甲醇+15％乙腈+10％异丙醇)进行前处理后，并经后续的高效液相色谱串联质谱检测验证，对维生素A、25羟基维生素D2、25羟基维生素D3、维生素E、维生素K1、维生素K2的灵敏度最高分别可达到0.4ng/mL、0.7ng/mL、0.3ng/mL、3ng/mL、10pg/ml和6pg/mL。
实施例4：内标溶液体系中组分的比例关系对检测结果的影响
本实施例按照实施例1提供的内标溶液配制方法，配制含有6种脂溶性维生素内标的内标溶液，内标溶液体系成分包括乙酸铵、甲醇、乙腈和异丙醇，采用如表9所示的不同比例关系，并按照实施例1提供的步骤方法完成样品制备和前处理后，取标准曲线最低浓度点(S1)进液相色谱质谱联用系统分析，测得S1样品中6种脂溶性维生素的峰面积如表9所示：
表9、采用不同组分比例关系的内标溶剂体系的检测结果对比
由表9可见，乙酸铵浓度低至20mM时，内标溶液体系对脂溶性维生素的提取率都出现一定程度的下降，因此乙酸铵浓度优选应维持在40～50mM；同理，当甲醇含量高至80％或低至15％时，内标溶液体系对脂溶性维生素的提取率也都出现不同程度的下降；当乙腈或异丙醇过高或过低时，同样对脂溶性维生素的提取率也都出现不同程度的下降；因此，经过大量实验证明，内标溶液体系中的成分组成比例优选为40～50mM乙酸铵(70～75％甲醇+15～25％乙腈+5～10％异丙醇)。
实施例5：样品与内标溶液的体积比对检测结果的影响
本实施例按照实施例1提供的内标溶液配制方法，配制含有6种脂溶性维生素内标的内标溶液，内标溶液体系成分包括50mM乙酸铵(75％甲醇+15％乙腈+10％异丙醇)，采用如表10所示的内标溶液与待测样品的不同体积比，并按照实施例1提供的步骤方法完成样品制备和前处理，取标准曲线最低浓度点(S1)进液相色谱质谱联用系统分析，测得S1样品中6种脂溶性维生素的峰面积如表10所示：
表10、不同样品与内标溶液的体积比的检测结果对比
由表10可见，内标溶液与样品的不同体积比中的不同含量，也会对样品中6种脂溶性维生素的提取率产生明显的影响：当内标溶液与样品的体积比为1:1时，沉淀剂的投料量不足以完全沉淀蛋白，待测脂溶性维生素的提取效率降低，且杂质分离效果较差，检测过程受基质效应的影响显著，从而影响检测灵敏度；当内标溶液与样品的体积比为1:9时，样本被过度稀释，使响应值下降，从而影响检测灵敏度。因此样品与内标溶液的体积比优选为1:3～1:7，最优选为1:5。
实施例6：不同内标溶剂体系及进样板的稳定性结果对比
本实施例按照实施例1提供的内标溶液配制方法，配制含有5种脂溶性维生素内标的内标溶液，采用如表11所示的不同的内标溶液体系成分，并按照实施例1提供的步骤方法完成样品制备和前处理后，并放置在进样器中12小时以上，进液相色谱质谱联用系统分析，检测临床样品中维生素K1，与处理后直接进样的浓度偏差如表11所示：
表11、不同内标溶剂体系及进样板的稳定性结果对比
维生素K1是6种脂溶性维生素中极性最弱的分析物，具有较强的吸附性。当其从血清基质中被内标液提取分离出来后，会逐渐吸附到进样板表面上，进而影响检测的灵敏度和准确度。
由表11可见，比较采用相同进样板的不同内标溶液体系，当采用对维生素K1溶解性好的溶剂体系(70％甲醇+25％乙腈+5％异丙醇+50mM乙酸铵)可在一定程度上削弱维生素K1被进样板吸附的风险，使其对维生素K1检测的浓度偏差明显降低；再进行不同进样板的对比可以发现，使用低吸附板存放提取所得的进样溶液，也可显著提高维生素K1检测结果的稳定性，因此优选为低吸附进样板。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (6)
1.一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的检测试剂盒，其特征在于，由标准样品、质控样品、内标溶液、液相色谱流动相和耗材组成；所述内标溶液由内标标准品工作液、甲醇、乙腈、异丙醇和乙酸铵组成，所述内标标准品工作液由含有VA1-d6、VD3-d6、VD2-d6、VK1-d4和VE-d6的同位素内标溶液组成；所述甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为70~75%:15~25%:5~10%，所述乙酸铵的浓度为40~50mM；所述脂溶性维生素为维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K1和维生素K2。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述内标标准品工作液与40~50mM乙酸铵的甲醇-乙腈-异丙醇溶液的体积比为1:124；所述甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为70~75%:15~25%:5~10%；所述耗材包括低吸附96孔板。
3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述标准样品为：含有标准浓度的维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K1和维生素K2，采用阴性空白人血清作为基质配制；所述质控样品为：含有低中高三个不同水平浓度的血清基质样品；液相色谱洗脱液包括流动相A和流动相B，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸甲醇溶液。
4.一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的方法，其特征在于，采用如权利要求1-3任一项所述的检测试剂盒进行检测；包括样品制备、样品前处理、样品检测；其中，所述样品前处理包括以下步骤：取50μL样品至96孔板，加入150~350μL内标溶液涡旋混匀，600~1000rpm震荡10min，离心分离，取上清液200μL于低吸附96孔板中，用高效液相色谱串联质谱检测。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，内标溶液体积为250μL；质谱分析时采用分时间段采集的方式。
6.一种混合物用于制备可稳定放置两年以上，并能用于样品前处理的脂溶性维生素样品内标溶液的用途，其特征在于，所述混合物由内标标准品工作液、甲醇、乙腈、异丙醇和乙酸铵组成，所述内标标准品工作液为含有VA1-d6、VD3-d6、VD2-d6、VK1-d4和VE-d6的同位素内标溶液；所述甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为70~75%:15~25%:5~10%，所述乙酸铵的浓度为40~50mM，所述脂溶性维生素为维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E、维生素K1和维生素K2。
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