CN105158394B

CN105158394B - 一种同时检测血液样品中多种脂溶性维生素的方法

Info

Publication number: CN105158394B
Application number: CN201510581956.XA
Authority: CN
Inventors: 冯振; 景叶松; 弭兆元
Original assignee: Jinan Ying Sheng Bioisystech Co Ltd
Current assignee: SHANDONG YING SHENG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2015-09-14
Filing date: 2015-09-14
Publication date: 2016-04-27
Anticipated expiration: 2035-09-14
Also published as: CN105158394A

Abstract

本发明公开了一种同时检测血液样品中多种脂溶性维生素的方法，首先通过简单的液液萃取方法对生物样本进行前处理，然后进入色谱分离及质谱检测，针对每种维生素分别选择一对定性离子和一对定量离子，以各种维生素的相对保留时间和定性离子对作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量。同时，本方法应用三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真。本发明首次实现了应用LC-MS技术对一份血清样本中的六种脂溶性维生素同时检测的目的，减小了干扰物影响，该方法操作简便快速分析时间仅4.8min，高通量、成本低，有效监测人体内脂溶性维生素水平，对维生素的合理、安全补充具有指导意义，易于临床推广及普及。

Description

一种同时检测血液样品中多种脂溶性维生素的方法

技术领域

本发明属于维生素的检测领域，具体涉及一种同时检测血液样品中多种脂溶性维生素的方法。

背景技术

维生素是生物生长和代谢所必需的微量营养物质，分为脂溶性和水溶性维生素两类，缺乏时生物不能正常生长，并导致维生素缺乏症的发生。维生素A、25(OH)D2、25(OH)D3、E、K1、K2均属于脂溶性维生素，人体缺乏该六种维生素时会表现出不同的症状：维生素A缺乏会导致夜盲症、眼部炎症等；维生素D缺乏会导致儿童佝偻病、成人骨质软化病、老人骨质疏松症等；维生素E缺乏会导致新生儿溶血性贫血、神经系统疾病等；维生素K缺乏会导致凝血功能障碍、血液凝固时间延长和出血等。

在国外，维生素是最主要的营养保健品，维生素对维持人体健康的作用有充分的科学依据，深入人心。根据统计，维生素在美国保健品市场占有主要份额。随着国际维生素市场对中国乃至亚洲市场的不断冲击，以及国内科研单位和企业在维生素行业取得的科研成果和技术突破，我国公民自身的保健意识不断增强。但是，由于缺乏科学的指导，维生素产品的使用现状很混乱，一些人群为了提高身体各项技能，不惜花重金在保健品上，盲目补充维生素，补充过量对身体也是一种伤害。如何了解人体是否需要补充所必需的四类脂溶性维生素，只有通过检测体内各种维生素的真实状态，根据检测结果有针对性的调整需要的维生素，检测是科学评估和个性化使用维生素唯一的依据。

目前，常用的维生素检测方法主要包括酶联免疫分析法、化学免疫发光法、高效液相色谱法(HPLC)和超高效液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)等。免疫法检测时所用的抗体，也可识别其它维生素衍生物，且抗体抗原反应通常不足100％，因此结果差异较大，特异性较差，应用于临床检测可靠性不高，尤其是对于检测含量较低的维生素。液相色谱法由于检出限有限，主要用于维生素含量较高的样品测定，一般只能进行单组份或含量较高的几个组分的同时测定。目前的液相色谱-质谱法只能对一种或两种维生素做定性分析，由于血浆/血清成分复杂，且维生素含量较低，在进行定量分析时，杂质严重影响检测结果的准确性，所以为了降低检测时的基质效应，使用者都是对不同的维生素逐个检测分析，这样存在以下的缺点：检测成本较高，而且操作复杂，耗费的时间较长，检测需要的血量较多。目前还没有一种能够同时检测血清/血浆中多种脂溶性维生素的有效方法。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种同时检测血液样品中多种脂溶性维生素的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种同时检测血液样品中多种脂溶性维生素的方法，采用LC-MS方法。

优选所述血液样品是血浆或血清，更优选为血清。

优选所述的多种脂溶性维生素为维生素A、25(OH)D2、25(OH)D3、E、K1或K2中的任意两种或两种以上。

更优选所述的多种脂溶性维生素为维生素A、25(OH)D2、25(OH)D3、E、K1和K2。

本发明中LC-MS的条件为：

色谱条件：流动相为A：甲醇，B：含甲酸的水；梯度洗脱。

质谱条件：正离子电喷雾离子化的多离子反应监测。

优选色谱条件：色谱柱：C18柱(KinetexC1850×2.1mm，2.6μm，phenomenex)，柱温：45℃；流动相A：甲醇，流动相B：体积分数0.1％甲酸的水；梯度洗脱条件(如表1)：0～2min，60％A，2～3min，75％A，3～3.5min，98％A，3.5～4.0min，98％A，4～4.8min，60％A，流速0.5mL/min，进样量，20μL。

表1梯度洗脱条件

时间(min)	A相比例(％)	B相比例(％)
			0	60	40
2	75	25
			3	98	2
3.5	98	2
			4.0	60	40
4.8	stop	stop

优选质谱条件：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，雾化气：60kPa，加热气：50kPa，气帘气：20kPa，喷雾电压：5000V，去溶剂温度：550℃。

MRM质谱参数如表2：

表2MRM质谱参数

同时检测血清中六种脂溶性维生素的方法，步骤如下：

(1)样品处理：向血清样本中加入无水乙醇，再加入正己烷，震荡后离心，取正己烷层至样品瓶中，吹干，将样品复溶于70％v/v甲醇水溶液中，0.2μm滤膜过滤，获得待测样本；所述的血清、无水乙醇、正己烷体积比为1:2:5或1:1.5:5，血清与70％甲醇水溶液的体积比为2:1；

(2)标准工作液的配制：以甲醇配制100μg/mL各维生素标准品储备液，然后用5％m/vBSA(牛血清白蛋白)甲醇溶液制备6个梯度(维生素A：50、100、200、400、800、1600ng/mL；维生素25(OH)D2、25(OH)D3：2.5、10、20、50、100、200ng/mL；维生素E：1、5、10、15、20、25μg/mL；维生素K1、K2：0.05、0.1、0.5、1、2、4ng/mL)的混合标准溶液分装于1.5mL棕色瓶中，-20℃保存备用；

(3)LC-MS检测：将待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离后，采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，对待测物质进行定性与定量检测；

所述脂溶性维生素为：维生素A、25(OH)D2、25(OH)D3、E、K1和K2。

一种同时检测血液样品中多种脂溶性维生素试剂盒，具有6个梯度(维生素A：50、100、200、400、800、1600ng/mL；维生素25(OH)D2、25(OH)D3：2.5、10、20、50、100、200ng/mL；维生素E：1、5、10、15、20、25μg/mL；维生素K1、K2：0.05、0.1、0.5、1、2、4ng/mL)的混合标准溶液，无水乙醇，正己烷，70％甲醇水溶液，甲醇，体积分数0.1％甲酸的水、质控品。

所述试剂盒在血清中同时检测维生素A、25(OH)D2、25(OH)D3、E、K1和K2中的应用。

应用标准品制作标准曲线，以标准溶液浓度为X轴，标准品峰面积为Y轴；进行线性回归分析得回归方程。将相应维生素峰面积代入标准曲线方程，分别计算血清样品中六种脂溶性的浓度。

上述方法中包括质控品：含有三个水平的低、中、高浓度质控血清，质控品由人工血清添加混合维生素标准物质制得，并通过检测确定靶值。

本发明的有益效果：

本发明通过对样本前处理方法和超高效液相色谱-质谱条件的优化，建立了一种同时检测血液样品中多种脂溶性维生素的方法，特别是同时测定血清中维生素A、25(OH)D2、25(OH)D3、E、K1、K2的方法。采用本发明可以同时检测人血清中六种脂溶性维生素A、25(OH)D2、25(OH)D3、E、K1、K2的含量，并进行精确的定性和定量分析，是一种样本处理简单、通量高、结果可靠的检测方法。

本发明中使用的提取方法，可以较多的去除杂质，降低检测时的基质效应，且操作简单快捷，可以灵敏的检测出各种维生素的含量，尤其是人体内含量较低的维生素K。

维生素A、25(OH)D2、25(OH)D3、E、K1、K2是人体内重要的脂溶性维生素，任何一种维生素的缺乏都会导致相应的疾病。本发明可以同时检测这六种维生素，一是降低了检测成本，二是节省时间，三是减少采集被检测人的血量，四是可以对多种维生素的补充提供依据。

本发明用超高效液相色谱-质谱法检测血清中六种脂溶性维生素，特异性强，灵敏性高，通量高，结果客观易于分析，尤其适合临床普及应用。基于该方法的试剂盒不仅可以对营养性疾病患者进行病因诊断，还可以对潜在的维生素缺乏者进行用药指导，减少盲目补充维生素的现象发生。

本发明的方法针对每种维生素分别选择一对定性离子和一对定量离子，以各种维生素的相对保留时间和定性离子对作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量。同时，本方法应用三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真。

本发明首次实现了应用LC-MS技术对一份血清样本中的六种脂溶性维生素同时检测的目的，用两对离子分别进行定量和定性保证了检测物的特异性，降低了干扰物影响，该方法操作简便快速分析时间仅4.8min，通量高、成本低，有效监测人体内脂溶性维生素水平，对维生素的合理、安全补充具有指导意义，易于临床推广及普及。

附图说明

图1为本发明实施例1的维生素A的色谱图；

图2为本发明实施例1的维生素25(OH)D2的色谱图；

图3为本发明实施例1的维生素25(OH)D3的色谱图；

图4为本发明实施例1的维生素E的色谱图；

图5为本发明实施例1的维生素K1的色谱图；

图6为本发明实施例1的维生素K2的色谱图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

(1)制备待测样本

向血清样本中加入无水乙醇沉淀蛋白，再加入正己烷萃取，漩涡震荡后离心，取正己烷层至样品瓶中，经氮气吹干，将样品复溶于70％v/v甲醇水溶液中，0.2μm滤膜过滤，获得待测样本。

其中，所述的血清、无水乙醇、正己烷体积比为1:2:5，血清与复溶液的体积比为2:1。

(2)超高效液相色谱-质谱检测

待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离，液相色谱参考条件：

色谱柱：C18柱(KinetexC1850×2.1mm，2.6μm，phenomenex)

柱温：45℃

进样体积：20μl

流速：0.5ml/min

流动相A：甲醇

流动相B：0.1％甲酸的水

梯度洗脱条件：

质谱参数参考条件：

采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式

雾化气：60kPa

加热气：50kPa

气帘气：20kPa

喷雾电压：5000V

去溶剂温度：550℃

MRM质谱参数如下：

(3)计算结果

标准工作液的配制：以甲醇配制100μg/mL各维生素标准品储备液，其中维生素K1、K2溶解时间较长，要逐步溶解，方可溶好。然后用5％BSAm/v(牛血清白蛋白)甲醇溶液制备6个梯度的混合标准溶液分装于1.5mL棕色瓶中，-20℃保存备用，标准品需参与样本提取。

如图1，用本发明方法测定50～1600ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本维生素A含量为351ng/mL。

如图2，用本发明方法测定2.5～200ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本维生素25(OH)D2含量为19ng/mL。

如图3，用本发明方法测定2.5～200ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本维生素25(OH)D3含量为56ng/mL。

如图4，用本发明方法测定1～25μg/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本维生素E含量为15.3μg/mL。

如图5，用本发明方法测定0.05～4ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本维生素K1含量为1.2ng/mL。

如图6，用本发明方法测定0.05～4ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本维生素K2含量为0.9ng/mL。

实施例2

样本血清来自医院确诊为维生素D缺乏的患者。

具体步骤同实施例1，所述的血清、无水乙醇、正己烷体积比为1:2:5。

通过计算，患者的维生素25(OH)D2、25(OH)D3含量显著低于健康人群含量。

实验证明，本发明样本处理简单，通量高，成本低，可以同时检测人体内六种脂溶性维生素，具有非常重要的意义。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种同时检测血液样品中六种脂溶性维生素的方法，其特征是：采用LC-MS，所述血液样品是血浆或血清，所述的六种脂溶性维生素为维生素A、25（OH）D2、25（OH）D3、E、K1和K2，色谱条件：色谱柱：KinetexC1850×2.1mm，2.6μm，phenomenex，柱温：45℃；流动相A：甲醇，流动相B：体积分数0.1%甲酸的水；梯度洗脱条件：0-2min，60％A，2-3min，75％A，3-3.5min，98％A，3.5-4.0min，98％A，4-4.8min，60％A，流速0.5mL/min，进样量，20μL；质谱条件：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，雾化气：60kPa，加热气：50kPa，气帘气：20kPa，喷雾电压：5000V，去溶剂温度：550℃。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤如下：

（1）样品处理：向血液样品中加入无水乙醇，再加入正己烷，震荡后离心，取正己烷层至样品瓶中，吹干，将样品复溶于70%v/v甲醇水溶液中，0.2μm滤膜过滤，获得待测样本；所述的血液样品、无水乙醇、正己烷体积比为1:2:5或1:1.5:5，血液样品与70%甲醇水溶液的体积比为2:1；

（2）标准工作液的配制：以甲醇配制各维生素标准品储备液，然后用BSA甲醇溶液制备不同梯度的混合标准溶液分装后，-20℃保存备用；

（3）LC-MS检测：将待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离后，对待测物质进行定性与定量检测。

3.如权利要求2所述的方法，其特征是：所述血液样品为血清。

4.如权利要求2所述的方法，其特征是：所述BSA甲醇溶液浓度为5%m/v。

5.一种同时检测血液样品中六种脂溶性维生素的试剂盒，其特征是：具有不同梯度的混合标准溶液，无水乙醇，正己烷，70%甲醇水溶液，甲醇，体积分数0.1%甲酸的水、质控；所述六种脂溶性维生素为维生素A、25（OH）D2、25（OH）D3、E、K1和K2。