CN112834638A - 用于检测脂溶性维生素的试剂盒和检测方法 - Google Patents

用于检测脂溶性维生素的试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于检测脂溶性维生素的试剂盒和检测方法，该试剂盒包括：至少三瓶脂溶性维生素校准品、至少三瓶脂溶性维生素质控品、混合内标蛋白沉淀剂、流动相添加剂以及提取液；至少三瓶脂溶性维生素校准品和至少三瓶脂溶性维生素质控品均为脂溶性维生素的冻干品，脂溶性维生素包括维生素A、维生素E、25‑羟基维生素D2、25‑羟基维生素D3、维生素K1和维生素K2；混合内标蛋白沉淀剂包括含有蛋白沉淀剂、维生素A‑d3内标物、维生素E‑d6内标物、25‑羟基维生素D2‑d3内标物、25‑羟基维生素D3‑d6内标物、维生素K1‑d7内标物和维生素K2‑d7内标物的混合溶液；流动相添加剂包括含有甲酸的甲醇溶液以及含有甲酸的乙腈溶液。本发明能够同时检测多种脂溶性维生素。

Description

用于检测脂溶性维生素的试剂盒和检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及用于检测脂溶性维生素的试剂盒和检测方法。
背景技术
脂溶性维生素是食品中天然存在的微量营养素，可以提供和维持必需的和广泛的生理生化功能。脂溶性维生素为溶于有机溶剂而不溶于水的一类维生素，包括维生素A、维生素E、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素K1和维生素K2。
维生素A是酶的辅基，对生物体的新陈代谢起调节作用，是生长和发育不可或缺的重要营养元素之一。维生素E是生育酚与三烯生育酚的总称，参与脂肪的代谢，维持内分泌的正常机能。维生素D是类固醇衍生物，其活性形式有25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3两种，能够维持正常的钙、磷吸收和代谢，对骨骼的正常发育有及其重要的作用。维生素K1即叶绿基甲萘醌，维生素K2是具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的衍生物。
目前，利用高效液相色谱法可以检测单种脂溶性维生素，但尚未有同时检测多种脂溶性维生素的方法。
发明内容
本发明提供了用于检测脂溶性维生素的试剂盒和检测方法，能够同时检测多种脂溶性维生素。
第一方面，本发明实施例提供了用于检测脂溶性维生素的试剂盒，包括：至少三瓶脂溶性维生素校准品、至少三瓶脂溶性维生素质控品、混合内标蛋白沉淀剂、流动相添加剂以及用于提取待处理样品中的脂溶性维生素的提取液；其中，
所述至少三瓶脂溶性维生素校准品和所述至少三瓶脂溶性维生素质控品均为脂溶性维生素的冻干品，其中，脂溶性维生素包括：维生素A、维生素E、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素K1和维生素K2的冻干品；
所述混合内标蛋白沉淀剂包括：含有蛋白沉淀剂、维生素A-d3内标物、维生素E-d6内标物、25-羟基维生素D2-d3内标物、25-羟基维生素D3-d6内标物、维生素K1-d7内标物和维生素K2-d7内标物的混合溶液；
所述流动相添加剂包括含有甲酸的甲醇溶液以及含有甲酸的乙腈溶液。
本发明中所提供的试剂盒中的脂溶性维生素校准品和脂溶性维生素质控品均为冻干品，均放置于棕色管制西林瓶中，加入水溶液即可复溶，具有即用即溶、使用方便、不易降解以及便于长途运输的优势。
具体地，脂溶性维生素校准品和脂溶性维生素质控品中均含有代替基质，代替基质包括牛血清蛋白，可以有效地减小基质效应，提高检测结果的准确性。
具体地，每一瓶脂溶性维生素校准品之间同一种脂溶性维生素的含量不同，每一瓶脂溶性维生素质控品之间同一种脂溶性维生素的含量也不同。
具体地，所述试剂盒于2℃-8℃条件下，避光密闭储存。
具体地，为了更准确地检测出待测样品中脂溶性维生素的浓度，所述混合内标蛋白沉淀剂中的内标物均为每一种脂溶性维生素的同位素，可以避免在对目标物检测时内标物与目标物发生反应，而影响目标物的检测。
优选地，所述蛋白沉淀剂包括：乙醇溶液和/或甲醇溶液。
具体地，所述混合内标蛋白沉淀剂中的蛋白沉淀剂既可以用于溶解维生素A-d3内标物、维生素E-d6内标物、25-羟基维生素D2-d3内标物、25-羟基维生素D3-d6内标物、维生素K1-d7内标物和维生素K2-d7内标物，同时又可以更好地去除杂质，对目标物进行提纯。所述蛋白沉淀剂包括单一的乙醇溶液、单一的甲醇溶液或者乙醇溶液与甲醇溶液任意比例混合后的溶液。
优选地，所述流动相添加剂包括：含有4％-10％甲酸的甲醇溶液和含有6％-15％甲酸的乙腈溶液。
针对流动相添加剂中的甲酸来说，4％-10％是指4％至10％范围内的任一比例，比如，含有4％、5％、6％、7％、8％、9％以及10％的甲酸。
针对流动相添加剂中的甲酸来说，6％-15％是指6％至15％范围内的任一比例，比如，含有6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％以及15％的甲酸。
优选地，为了保证从待测样品中提取的脂溶性维生素浓度，所述提取液包括：含有0.5％-3％乙醇的正己烷溶液或含有0.5％-3％乙醇的甲基叔丁基醚溶液。
针对提取液中的乙醇来说，0.5％-3％是指0.5％至3％范围内的任一比例，比如，含有0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％以及3％的乙醇。
优选地，所述试剂盒进一步包括：
复溶液包括：含有0％-30％水的乙腈溶液。
针对复溶液来说，0％-30％是指0％至30％范围内的任一比例，比如，含有0％、5％、10％、15％、20％和25％以及30％的水。
需要说明的是，脂溶性维生素的检测试剂盒中还包括使用说明书、合格证、内衬、包装盒、EP管、96孔板、热封膜、与试剂盒的使用、储存、运输过程相关的说明中的至少一个，其中，使用说明书中包括下述第二方面中任一项所提供的基于该试剂盒的脂溶性维生素的检测方法的说明。
第二方面，本发明还提供了基于上述第一方面或第一方面的任一可能的实现方式所提供的试剂盒的脂溶性维生素的检测方法，包括：
分别向所述试剂盒中的至少三瓶脂溶性维生素校准品中加入水溶液复溶，得到至少三种浓度的标准工作液；
分别向所述至少三种浓度的标准工作液中加入所述试剂盒中的混合内标蛋白沉淀剂，得到至少三种浓度的标准溶液，其中，所述至少三种浓度的标准溶液中的所述混合内标蛋白沉淀剂的量相同；
利用所述试剂盒中的所述流动相添加剂配制流动相；
利用液质联用仪和所述流动相在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中的每一种脂溶性维生素的浓度以及所述混合内标蛋白沉淀剂中每一种脂溶性维生素的内标物的浓度，拟合每一种脂溶性维生素所对应的标准曲线方程；
利用所述试剂盒中的至少三瓶脂溶性维生素质控品确定所述标准曲线方程的斜率和截距是否分别在预设的范围内；
如果是，对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；
向所述第一上清液内加入萃取剂、所述试剂盒中的提取液和所述混合内标蛋白沉淀剂，涡旋混匀并离心，取离心后的上层溶液作为待测样品；
利用液质联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；
基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中每一种脂溶性维生素的浓度。
需要说明的是，第一上清液包括血清或血浆。
具体地，利用试剂盒中的至少三瓶脂溶性维生素质控品确定标准曲线方程的斜率和截距是否分别在预设的范围内，是利用标准曲线方程对至少三瓶脂溶性维生素质控品进行检测，判断检测得到的脂溶性维生素质控品的浓度是否在脂溶性维生素质控品的真实浓度(靶值)±1.96SD的范围内，如果是，则可用该标准曲线待测样品中的脂溶性维生素的浓度；否则表明该检测结果不准确，需要根据检测得到的脂溶性维生素质控品的浓度和脂溶性维生素质控品的真实浓度对该标准曲线的斜率和截距进行校正。
具体地，至少三种浓度的标准溶液制备方式如下：
分别向试剂盒中的至少三瓶脂溶性维生素校准品中加入水溶液复溶，得到至少三种浓度的标准工作液，然后分别移取至少三种浓度的标准工作液和试剂盒中的混合内标蛋白沉淀剂置于容器(例如，该容器可以选用96孔板以及离心管)中，混合制成至少三种不同浓度的混合溶液，向上述混合溶液中加入萃取剂、试剂盒中的提取液进行涡旋混匀并离心，得到离心后的上层溶液即为标准溶液。
优选地，
所述利用所述试剂盒中的所述流动相添加剂制备流动相，包括：
当所述试剂盒中的所述流动相添加剂包括含有4％-10％甲酸的甲醇溶液和含有6％-15％甲酸的乙腈溶液时，
将含有4％-10％甲酸的甲醇溶液加入到含有甲醇的水溶液中，得到流动相A，并将含有6％-15％甲酸的乙腈溶液加入到含有乙腈的甲醇溶液中，得到流动相B，其中，流动相A和流动相B采用梯度洗脱。
针对流动相添加剂中的甲酸来说，4％-10％是指4％至10％范围内的任一比例，比如，含有4％、5％、6％、7％、8％、9％以及10％的甲酸。
针对流动相添加剂中的甲酸来说，6％-15％是指6％至15％范围内的任一比例，比如，含有6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％以及15％的甲酸。
例如，当试剂盒中的流动相添加剂包括含有8％甲酸的甲醇溶液和含有12％甲酸的乙腈溶液时，将含有8％甲酸的甲醇溶液加入到含有甲醇的水溶液中，得到流动相A，并将含有12％甲酸的乙腈溶液加入到含有乙腈的甲醇溶液中，得到流动相B，其中，流动相A和流动相B采用梯度洗脱。
优选地，流动相A含有0.08％-0.2％甲酸；流动相B含有0.075％-0.1875％甲酸以及25％的乙腈。
针对流动相A中的甲酸来说，0.08％-0.2％是指0.08％至0.2％范围内的任一比例，比如，含有0.08％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％以及0.2％甲酸。
针对流动相B中的甲酸来说，0.075％-0.1875％是指0.075％至0.1875％范围内的任一比例，比如，含有0.075％、0.08、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％以及0.1875％甲酸。
优选地，所述流动相A相和流动相B相采用梯度洗脱，包括：
流动相A与流动相B的体积比包括：
0.00min：92％:8％-100％:0％；3.00min：92％:8％-100％:0％；
3.10min：0％:100％-20％:80％；5.00min：0％:100％-20％:80％；
5.10min：92％:8％-100％:0％；6.00min：92％:8％-100％:0％。
针对流动相A与流动相B在0.00min、3.00min、5.10min以及6.00min的体积比，92％:8％-100％:0％是指92％:8％至100％:0％范围内的任一比例，比如，92％:8％、94％:6％、96％:4％、98％:2％以及100％:0％。
针对流动相A与流动相B在3.10min和5.00min的体积比，0％:100％-20％:80％是指0％:100％至20％:80％范围内的任一比例，比如，0％:100％、5％:95％、10％:90％、15％:85％以及20％:80％。
具体地，若在0.00min-3.00min内，流动相A在流动相中体积占比小于92％时，维生素A、25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的保留时间相对较短，而且分离度较差，影响待测样品的检测准确性；若在3.00min-5.00min内，流动相B相在流动相中体积占比小于80％时，25-羟基维生素D3、维生素K1和维生素K2的出峰时间较晚，导致保留时间增加，对待测样品的分析时间过长。因此，流动相中流动相A和流动相B的体积比包括0.00min：92％:8％-100％:0％；3.00min：92％:8％-100％:0％；3.10min：0％:100％-20％:80％；5.00min：0％:100％-20％:80％；5.10min：92％:8％-100％:0％；6.00min：92％:8％-100％:0％。
具体地，若在3.00min流动相A与流动相B的体积比为98％:2％，3.10min流动相A与流动相B的体积比为0％:100％时，那么在3.00min至3.10min时间段内，流动相A由占比98％逐渐降低至0％，流动相B则由占比2％逐渐增加至100％。
由于流动相A与流动相B在流动相中占比的总和为1，因此，当流动相A在流动相中的占比增加，流动相B在流动相中的占比则相应降低。
优选地，所述检测条件中的液相条件，包括：
柱温包括25-45℃；
流速包括0.6-0.8mL/min。
具体地，液相条件的色谱柱包括但不限于Kinetex XB-C18色谱柱(内径3.0mm×柱长50mm、填料粒径为2.6μm)、Agilent Poroshell 120SB-C18色谱柱(内径3.0mm×柱长50mm、填料粒径为2.7μm)和Agilent Poroshell 120EC-C18色谱柱(内径3.0mm×柱长50mm、填料粒径为2.7μm)。
针对柱温来说，25-45℃是指25℃至45℃范围内的任一温度值，比如，25℃、30℃、35℃、40℃以及45℃。
具体地，温度低于25℃时，脂溶性维生素的色谱峰峰型较差，且维生素K2的分离度较差；温度高于45℃时，在待测样品进样前需要更长的平衡时间达到该柱温温度，而且温度升高，会降低柱压稳定性，甚至会超过色谱柱所能承受的温度，这样会对色谱柱中的填料造成不可逆的损伤，影响待测样品的检测效果。
针对流速来说，0.6-0.8mL/min是指0.6mL/min至0.8mL/min范围内的任一流速，比如，0.6mL/min、0.65mL/min、0.7mL/min、0.75mL/min以及0.8mL/min。
具体地，流速小于0.6mL/min时，目标的响应值较低，会影响待测样品的检测精度；流速越大则柱压越大，不利于色谱柱的长期使用，同时流速大于0.8mL/min会影响六种脂溶性维生素和六种脂溶性维生素的内标物的分离度，影响待测样品的检测准确性。因此，流速选择0.6-0.8mL/min。
优选地，所述检测条件中的质谱条件，包括：
所述液质联用仪采用APCI离子源，多反应监测模式；碰撞气流速：4-10μL/min；加热气温度：150-550℃；喷雾气电压：40-70psi；气帘气压力：20-50psi；放电电流：0-5mA。
针对碰撞气流速来说，6-10μL/min是指6μL/min至10μL/min范围内的任一值，比如，6μL/min、7μL/min、8μL/min、9μL/min以及10μL/min。
针对加热气温度来说，150-550℃是指150℃至550℃范围内的任一值，比如，150℃、200℃、250℃、300℃、350℃、400℃、450℃、500℃以及550℃。
针对喷雾气电压来说，40-70psi是指40psi至70psi范围内的任一值，比如，40psi、45psi、50psi、55psi、60psi、65psi以及70psi。
针对气帘气压力来说，20-50psi是指20psi至50psi范围内的任一值，比如，20psi、25psi、30psi、35psi、40psi、45psi以及50psi。
针对放电电流来说，0-5mA是指0mA至5mA范围内的任一值，比如，0mA、1mA、2mA、3mA、4mA以及5mA。
优选地，每一种脂溶性维生素所对应的标准曲线方程的两个变量分别为：所述标准溶液中该脂溶性维生素的色谱峰面积与该脂溶性维生素的内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中该脂溶性维生素的浓度与该脂溶性维生素的内标物的浓度的比值。
具体地，每一种脂溶性维生素所对应的标准曲线方程包括：维生素A对应第一标准曲线方程，维生素E对应第二标准曲线方程，25-羟基维生素D2对应第三标准曲线方程，25-羟基维生素D3对应第四标准曲线方程，维生素K1对应第五标准曲线方程，维生素K2对应第六标准曲线方程。
具体地，一种脂溶性维生素的色谱峰面积与该脂溶性维生素的内标物的色谱峰面积的比值作为该脂溶性维生素所对应的标准曲线方程的x值(即自变量)时，该脂溶性维生素的浓度与该脂溶性维生素的内标物的浓度的比值作为该标准曲线方程的y值(即因变量)，其他任一脂溶性维生素所对应的标准曲线方程的x值也均为色谱峰面积的比值，y值也均为浓度的比值。
具体地，一种脂溶性维生素的色谱峰面积与该脂溶性维生素的内标物的色谱峰面积的比值作为该脂溶性维生素所对应的标准曲线方程的y值(即因变量)时，该脂溶性维生素的浓度与该脂溶性维生素的内标物的浓度的比值作为该标准曲线方程的x值(即自变量)，其他任一脂溶性维生素所对应的标准曲线方程的y值也均为色谱峰面积的比值，x值也均为浓度的比值。
比如，维生素A的色谱峰面积与维生素A-d3内标物的色谱峰面积的比值作为第一标准曲线方程的x值(即自变量)时，维生素A的浓度与维生素A-d3内标物的浓度的比值作为该标准曲线方程的y值(即因变量)，其他五个标准曲线方程的x值也均为色谱峰面积的比值，y值也均为浓度的比值。
优选地，为了更好地去除杂质，对目标物进行提纯，对第一上清液进行萃取的所述萃取剂包括：甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和正己烷中的至少一种。
具体地，由甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和正己烷中的至少一种作为对第一上清液进行萃取的萃取剂，得到的待测样品的色谱峰均不是前沿峰、拖尾峰，并且色谱峰的峰宽没有出现过宽的情况。并且由于甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和正己烷为常用试剂，容易获得，因此，可以降低对第一上清液进行萃取的难度。
优选地，
所述取离心后的上层溶液作为待测样品，包括：
利用氮气将移取的所述上层溶液液吹干，顺次加入所述试剂盒中的复溶液，在1500-2500rpm的转速下涡旋混合2-6min，并在3500-12000rpm的转速下离心3-12min，取离心后的第二上清液作为待测样品。
具体地，所述上层溶液通过如下操作获得：向第一上清液内加入萃取剂、试剂盒中的提取液和混合内标蛋白沉淀剂，在1500-2500rpm的转速下涡旋混合6-10min，并在3500-12000rpm的转速下离心10-20min，取离心后的上清液作为上层溶液。
具体地，在向第一上清液内加入萃取剂、提取液和混合内标蛋白沉淀剂后，为了使得其混合更均匀，可以涡旋混合，再进行萃取，以通过萃取剂对混合后的第一上清液进行提纯，然后进行离心，取离心后的上层溶液，实现将杂质和目标物分离的目的。由于第一上清液经萃取后目标物的含量较低，因此为了便于检测，可利用氮气进行吹干，以对第二上清液进行浓缩，浓缩后再加入复溶液，并进行涡旋以使复溶液中的目标物分布均匀。
可以理解的是，第一上清液包括血清或血浆，萃取后选择为上层有机相。
针对涡旋转速来说，1500-2500rpm是指1500rpm至2500rpm范围内的任一转速，比如，1500rpm、1600rpm、1800rpm、2000rpm、2200rpm以及2500rpm。
针对加入萃取剂、试剂盒中的提取液和混合内标蛋白沉淀剂之后的涡旋时间来说，6-10min是指，6min至10min范围内的任一时间，比如，6min、7min、8min、9min以及10min。
针对离心转速来说，3500-12000rpm是指3500rpm至12000rpm范围内的任一转速，比如，3500rpm、4000rpm、4500rpm、5000rpm、6000rpm、7000rpm、8000rpm、9000rpm、10000rpm、11000rpm以及12000rpm。
针对加入萃取剂之后的离心时间来说，10-20min是指10min、12min、14min、15min、16min、18min以及20min。
针对加入复溶液后的涡旋时间来说，2-6min是指2min至6min范围内的任一时间，比如，2min、3min、4min、5min以及6min。
针对加入复溶液后的离心时间来说，3-12min是指3min至12min范围内的任一时间，比如，3min、4min、6min、8min、10min以及12min。
具体地，在对待处理样品进行前处理后得到待测样品过程中，用于放置待处理样品的容器可以选用96孔板以及离心管(EP管)。
具体地，由于96孔板在高转速下存在不稳定性，且易使待处理样品发生飞溅、受损、结块，所以，当选用96孔板对待处理样品进行前处理时，涡旋混合转速均为1500-2500rpm，离心时的转速均为3500-4500rpm。比如，利用96孔板对待处理样品进行离心处理，得到离心后的第一上清液，将第一上清液置于96孔板中，向第一上清液内加入萃取剂、试剂盒中的提取液和混合内标蛋白沉淀剂，在2000rpm的转速下涡旋混合8min，并在4000rpm的转速下离心15min，移取离心后的上层溶液，利用氮气将移取的所述上层溶液吹干，顺次加入试剂盒中的复溶液，在2000rpm的转速下涡旋混合4min，并在4000rpm的转速下离心10min，取离心后的第二上清液作为待测样品。
由于96孔板不适用于较高转速，所以，当选用离心管对待处理样品进行前处理时，涡旋混合转速均为1500-2500rpm，离心时的转速均为4500-12000rpm。比如，利用离心管对待处理样品进行离心处理，得到离心后的第一上清液，将第一上清液置于离心管中，向第一上清液内加入萃取剂、试剂盒中的提取液和混合内标蛋白沉淀剂，在2000rpm的转速下涡旋混合5min，并在12000rpm的转速下离心5min，移取离心后的上层溶液，利用氮气将移取的所述上层溶液吹干，顺次加入复溶液，在2000rpm的转速下涡旋混合2min，并在12000rpm的转速下高速离心3min，取离心后的二上清液作为待测样品。
本发明提供了用于检测脂溶性维生素的试剂盒和检测方法，该脂溶性维生素的检测试剂盒中包括：至少三瓶脂溶性维生素校准品、至少三瓶脂溶性维生素质控品、混合内标蛋白沉淀剂、流动相添加剂以及用于提取待处理样品中的脂溶性维生素的提取液，其中，脂溶性维生素校准品和脂溶性维生素质控品均为冻干品，即用即溶解、使用方便、不易降解且便于长途运输，同时利用该试剂盒通过液质联用仪可以实现同时对多种脂溶性维生素含量的快速检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的用于检测脂溶性维生素的试剂盒的示意图；
图2是本发明一实施例提供的脂溶性维生素的检测方法的流程图；
图3是本发明一实施例提供的待测样品中脂溶性维生素的色谱图；
图4是本发明一实施例提供的待测样品中脂溶性维生素内标物的色谱图；
图5是本发明一实施例提供的标准溶液中脂溶性维生素的色谱图；
图6是本发明一实施例提供的标准溶液中脂溶性维生素内标物的色谱图；
图7是本发明一实施例提供的脂溶性维生素的线性关系图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
基于尚未有同时检测多种脂溶性维生素方法的问题，本发明实施例提供了一种用于检测脂溶性维生素的试剂盒，包括：至少三瓶脂溶性维生素校准品、至少三瓶脂溶性维生素质控品、混合内标蛋白沉淀剂、流动相添加剂以及用于提取待处理样品中的脂溶性维生素的提取液；
至少三瓶脂溶性维生素校准品和至少三瓶脂溶性维生素质控品均为脂溶性维生素的冻干品，其中，脂溶性维生素包括维生素A、维生素E、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素K1和维生素K2；
混合内标蛋白沉淀剂包括：含有蛋白沉淀剂、维生素A-d3内标物、维生素E-d6内标物、25-羟基维生素D2-d3内标物、25-羟基维生素D3-d6内标物、维生素K1-d7内标物和维生素K2-d7内标物的混合溶液；
流动相添加剂包括含有甲酸的甲醇溶液以及含有甲酸的乙腈溶液。
本发明提供了用于检测脂溶性维生素的试剂盒和检测方法，该试剂盒中包括：至少三瓶脂溶性维生素校准品、至少三瓶脂溶性维生素质控品、混合内标蛋白沉淀剂、流动相添加剂以及用于提取待处理样品中的脂溶性维生素的提取液，其中，脂溶性维生素校准品和脂溶性维生素质控品均为冻干品，即用即溶解、使用方便、不易降解且便于长途运输，同时利用该试剂盒通过液质联用仪可以实现同时对多种脂溶性维生素含量的快速检测。
下面以几个实施例对用于检测脂溶性维生素的试剂盒进行详细说明。
实施例1：用于检测脂溶性维生素的试剂盒
试剂盒主要组成成分如表1所示：
表1
组成成分 组分标识 剂型 规格
脂溶性维生素校准品 C1、C2、C3、C4、C5、C6 固体 6瓶
脂溶性维生素质控品 QC(L)、QC(M)、QC(H) 固体 3瓶
混合内标蛋白沉淀剂 P14 液体 24mL×1瓶
流动相添加剂A A10 液体 8mL×1瓶
流动性添加剂B B11 液体 5mL×1瓶
提取液 T12 液体 24mL×1瓶
复溶液 F13 液体 12mL×1瓶
具体地，脂溶性维生素校准品和脂溶性维生素质控品在分别加入1mL水复溶后，其中每一种脂溶性维生素的浓度如下所示：
脂溶性维生素校准品C1：维生素A为0.056±0.011μg/mL，维生素E为1.125±0.23μg/mL，25-羟基维生素D2为0.78±0.16ng/mL，25-羟基维生素D3为3.13±0.63ng/mL，维生素K1为0.1±0.02ng/mL，维生素K2为0.1±0.02ng/mL；
脂溶性维生素校准品C2：维生素A为0.113±0.02μg/mL，维生素E为2.25±0.45μg/mL，25-羟基维生素D2为1.56±0.31ng/mL，25-羟基维生素D3为6.25±1.25ng/mL，维生素K1为0.5±0.1ng/mL，维生素K2为0.5±0.2ng/mL；
脂溶性维生素校准品C3：维生素A为0.225±0.02μg/mL，维生素E为4.5±0.5μg/mL，25-羟基维生素D2为3.13±0.31ng/mL，25-羟基维生素D3为12.5±1.3ng/mL，维生素K1为2±0.2ng/mL，维生素K2为2±0.2ng/mL；
脂溶性维生素校准品C4：维生素A为0.45±0.05μg/mL，维生素E为9±0.9μg/mL，25-羟基维生素D2为6.25±0.63ng/mL，25-羟基维生素D3为25±2.5ng/mL，维生素K1为10±1ng/mL，维生素K2为10±1ng/mL；
脂溶性维生素校准品C5：维生素A为0.9±0.1μg/mL，维生素E为18±1.8μg/mL，25-羟基维生素D2为12.5±1.3ng/mL，25-羟基维生素D3为50±5ng/mL，维生素K1为50±5ng/mL，维生素K2为50±5ng/mL；
脂溶性维生素校准品C6：维生素A为1.8±0.2μg/mL，维生素E为36±3.6μg/mL，25-羟基维生素D2为25±2.5ng/mL，25-羟基维生素D3为100±10ng/mL，维生素K1为100±10ng/mL，维生素K2为100±10ng/mL；
脂溶性维生素质控品QC(L)：维生素A为0.2±0.02μg/mL，维生素E为5±0.5μg/mL，25-羟基维生素D2为2±0.2ng/mL，25-羟基维生素D3为6.25±0.63ng/mL，维生素K1为0.3±0.03ng/mL，维生素K2为0.3±0.03ng/mL；
脂溶性维生素质控品QC(M)：维生素A为0.6±0.06μg/mL，维生素E为15±1.5μg/mL，25-羟基维生素D2为5±0.5ng/mL，25-羟基维生素D3为25±2.5ng/mL，维生素K1为1±0.1ng/mL，维生素K2为1±0.1ng/mL；
脂溶性维生素质控品QC(H)：维生素A为1.2±0.12μg/mL，维生素E为30±3μg/mL，25-羟基维生素D2为12.5±1.3ng/mL，25-羟基维生素D3为50±5ng/m，维生素K1为50±5ng/mL，维生素K2为50±5ng/mL；
混合内标蛋白沉淀剂P14：含有0.2μg/mL维生素A-d3内标物、0.5μg/mL维生素E-d6内标物、5ng/mL25-羟基维生素D2-d3内标物、10ng/mL 25-羟基维生素D3-d6内标物、1.5ng/mL维生素K1-d7内标物和1.5ng/mL维生素K2-d7内标物的乙醇混合溶液；
流动相添加剂A(A10)为含有8％甲酸的甲醇溶液；
流动相添加剂B(B11)为含有12％甲酸的乙腈溶液；
提取液T12为含有1％乙醇的正己烷溶液；
复溶液F13为含有10％水的乙腈溶液；
该试剂盒中进一步包括：使用说明书、合格证、内衬、包装盒、EP管、96孔板、热封膜、与试剂盒的使用、储存、运输过程相关的说明中的至少一个。
具体地，该脂溶性维生素的检测试剂盒的示意图如图1所示，其中，脂溶性维生素校准品与脂溶性维生素质控品为冻干品，该冻干品中包括代替基质牛血清蛋白，使用时请按照使用说明书操作，分别加入水溶液复溶后为1mL/瓶；该试剂盒组分均在2～8℃条件下，避光、密闭储存。
需要说明的是，使用说明书上记载有针对实施例2至实施例8的说明。
实施例2：脂溶性维生素的检测方法
本发明实施例提供了基于上述实施例1中的试剂盒的脂溶性维生素的检测方法，如图2所示，包括：
步骤201：分别向试剂盒中的至少三瓶脂溶性维生素校准品中加入水溶液复溶，得到至少三种浓度的标准工作液；
步骤202：分别向至少三种浓度的标准工作液中加入试剂盒中的混合内标蛋白沉淀剂，得到至少三种浓度的标准溶液，其中，至少三种浓度的标准溶液中的混合内标蛋白沉淀剂的量相同；
步骤203：利用试剂盒中的流动相添加剂配制流动相；
步骤204：利用液质联用仪和流动相在预设的检测条件下分别检测每一种标准溶液，获得每一种标准溶液对应的第一检测结果；
步骤205：根据各个第一检测结果、标准溶液中的每一种脂溶性维生素的浓度以及混合内标蛋白沉淀剂中每一种脂溶性维生素的内标物的浓度，拟合每一种脂溶性维生素所对应的标准曲线方程；
步骤206：利用试剂盒中的至少三瓶脂溶性维生素质控品确定标准曲线方程的斜率和截距是否分别在预设的范围内；
步骤207：如果是，对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；
步骤208：向第一上清液内加入萃取剂、试剂盒中的提取液和混合内标蛋白沉淀剂，涡旋混匀并离心，取离心后的上层溶液作为待测样品；
步骤209：利用液质联用仪在检测条件下检测待测样品，获得待测样品的第二检测结果；
步骤210：基于标准曲线方程和第二检测结果，得到待测样品中每一种脂溶性维生素的浓度。
在本发明实施例中，利用用于检测脂溶性维生素的试剂盒可以得到至少三个浓度的脂溶性维生素的标准溶液，通过液质联用仪对含有不同浓度的脂溶性维生素的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，由于标准溶液中含有脂溶性维生素的内标物，因此，基于各种浓度标准溶液中的脂溶性维生素的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到每一个脂溶性维生素的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理可以进行初步提纯，降低杂质对样品检测的干扰。再向离心后的第一上清液中加入萃取剂、试剂盒中的提取液和混合内标蛋白沉淀剂，进行涡旋混匀，进一步提纯，降低杂质对样品检测的干扰。利用液质联用仪在与标准溶液相同的检测条件下进行检测，得到第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中每一种脂溶性维生素的浓度。如此通过试剂盒实现同时对多种脂溶性维生素的快速检测。
下面以几个实施例对脂溶性维生素的检测方法进行详细说明。
实施例3：制备系列浓度的标准溶液
分别向实施例1中的六瓶脂溶性维生素校准品中加入1mL水溶液复溶，得到六种不同浓度的标准工作液，用移液器分别移取六种不同浓度的标准工作液200μL、试剂盒中的混合内标蛋白沉淀剂210μL分别置于96孔板各孔中，混合制成六种不同浓度的混合溶液，并且六种标准溶液中的内标物的量相同，再向上述混合溶液中加入萃取剂、试剂盒中的提取液进行涡旋混匀并离心，得到离心后的上层溶液即为标准溶液。
需要说明的是，不同浓度的标准溶液可按照处理待处理样品时的前处理操作获得，即，萃取剂、提取液、加入萃取剂后的涡旋时间和转速以及离心转速和时间、复溶液、加入复溶液后的涡旋时间和转速以及离心转速和时间均与实施例5中待测样品的前处理保持一致，以消除系统误差，提高检测结果的准确度。
实施例4：拟合标准曲线方程
利用液质联用仪对实施例3中六种标准溶液分别进行检测，得到六种不同浓度的脂溶性维生素的标准溶液的色谱图。
从上述脂溶性维生素的标准溶液色谱图中分别得到六种标准溶液中每一种脂溶性维生素以及混合内标蛋白沉淀剂中每一种脂溶性维生素的内标物分别对应的峰面积，以上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的每一种脂溶性维生素的峰面积与每一种脂溶性维生素的内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y，以上述标准溶液中每一种脂溶性维生素的浓度与每一种脂溶性维生素的内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x，将以上检测所得的不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a、b，权重系数a为标准曲线方程的斜率，权重系数b为标准曲线方程的截距。
上述检测条件包括：
色谱柱：Kinetex XB-C18，填料粒径2.6μm，内径为3.0mm，长度为50mm；
流动相A为含有0.16％甲酸的甲醇溶液；
流动相B为含有0.15％甲酸以及25％乙腈的甲醇溶液。
流动相A与流动相B的体积比：
0.00min：98％:2％；
3.00min：98％:2％；
3.10min：0％:100％；
5.00min：0％:100％；
5.10min：98％:2％；
6.00min：98％:2％；
柱温为30℃；流速为0.6mL/min，进样量为20μL，分析时间为5.5min。
具体地，将试剂盒中的8mL流动相添加剂A(含有8％甲酸的甲醇溶液)加入到392mL甲醇溶液中，得到流动相A；将试剂盒中的5mL流动相添加剂B(含有12％甲酸的乙腈溶液)加入到395mL含有25％乙腈的甲醇溶液中，得到流动相B。
质谱检测条件：
所述液质联用仪采用APCI离子源，多反应监测模式；碰撞气流速：6μL/min；加热气温度：450℃；喷雾气电压：50psi；气帘气压力：40psi；放电电流：2mA。
其中，液相色谱质谱联用仪中的质谱检测器离子对参数如下述表2所示：
表2
物质名称 母离子 子离子 碰撞能
维生素A 269.3 213.2 30eV
维生素E 431.4 165 25eV
25-羟基维生素D2 413.4 337.2 35eV
25-羟基维生素D3 401.2 365.2 27eV
维生素K1 451.2 187 22eV
维生素K2 445.2 187.1 27eV
在本发明实施例中，由表2可以看出，质谱检测中采用定性兼定量的双离子对，这样可以增强脂溶性维生素检测方法的选择性，避免杂质对检测结果的干扰，提高了脂溶性维生素检测方法的稳定性和准确性。
实施例5：待测样品的前处理
5.1取待处理血液至少500μL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液血清或血浆为第一上清液，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。
5.2用移液枪移取200μL步骤5.1中的血清或血浆于96孔板各孔中，然后加入800μL正己烷、210μL实施例1中的混合内标蛋白沉淀剂和200μL实施例1中的提取液后，将96孔板封膜(比如，利用封板膜进行封膜)，并在2000rpm的转速下涡旋混合8min后，再在4000rpm的转速下离心15min后，取离心后的上层溶液(上层有机相)900μL，利用氮气将移取的上层溶液吹干，顺次加入100μL复溶液(含有10％水的乙腈溶液)，在2000rpm的转速下涡旋混合4min，并在4000rpm的转速下离心10min，取离心后的第二上清液20μL作为待测样品。
在本发明实施例中，采用96孔板可以实现待测样品的批量化前处理过程，同时处理多个待测样本，而且96孔板转置自动进样，从而进一步简化了脂溶性维生素的检测流程。
实施例6：待测样品的检测
利用液质联用仪采用实施例4中的检测条件对待测样品进行检测，得到待测样品的色谱图。
从待测样品的色谱图中可以得到待测样品中每一种脂溶性维生素的色谱峰面积和待测样品中每一种脂溶性维生素的内标物的色谱峰面积，将待测样品中的每一种脂溶性维生素的色谱峰面积与每一种脂溶性维生素的内标物的色谱峰面积作为纵坐标y，代入到实施例4的标准曲线方程为y＝a*x+b中，由于权重系数a和b已知，所以可以得出待测样品中每一种脂溶性维生素的浓度。
待测样品中的每一种脂溶性维生素和每一种脂溶性维生素的内标物的色谱图分别如图3和图4所示，其中，每一种脂溶性维生素的保留时间和每一种脂溶性维生素的内标物的保留时间分别如表3所示。
表3
Figure BDA0002871867510000151
图3中图a至图f的横坐标的单位长度均为0.5，图a为维生素A的色谱图，图a的纵坐标的单位长度为5×104；图b为维生素E的色谱图，图b的纵坐标的单位长度为2×104；图c为25-羟基维生素D2的色谱图，图c的纵坐标的单位长度为500；图d为25-羟基维生素D3的色谱图，图d的纵坐标的单位长度为1×104；图e为维生素K1的色谱图，图e的纵坐标的单位长度为1000；图f为维生素K2的色谱图，图f的纵坐标的单位长度为2000。
图4中图a至图f的横坐标的单位长度均为0.5，图a为维生素A-d3内标物的色谱图，图a的纵坐标的单位长度为1×104；图b为维生素E-d6内标物的色谱图，图b的纵坐标的单位长度为2×104；图c为25-羟基维生素D2-d3内标物的色谱图，图c的纵坐标的单位长度为2000；图d为25-羟基维生素D3-d6内标物的色谱图，图d的纵坐标的单位长度为1×104；图e为维生素K1-d7内标物的色谱图，图e的纵坐标的单位长度为2000；图f为维生素K2-d7内标物的色谱图，图f的纵坐标的单位长度为2000。
实施例7：脂溶性维生素的检测方法的检出限和定量限
制备不同浓度的含有六种脂溶性维生素的低浓度样本，分别加入210μL实施例1试剂盒中的混合内标蛋白沉淀剂，加入200μL各个浓度的含有六种脂溶性维生素的低浓度样本，从而制备得到不同浓度的样本，按本实施例5中的前处理及实施例4中的检测条件进行测定，每一种脂溶性维生素的检出限和定量限如表4所示。
表4
物质名称 检出限 定量限
维生素A 0.01μg/mL 0.02μg/mL
维生素E 0.05μg/mL 0.25μg/mL
25-羟基维生素D2 0.5ng/mL 0.6ng/mL
25-羟基维生素D3 0.4ng/mL 0.78ng/mL
维生素K1 0.01μg/mL 0.05μg/mL
维生素K2 0.02μg/mL 0.05μg/mL
由本实施例可知，每一种脂溶性维生素的检出限及定量限均较低，灵敏度较高，对脂溶性维生素含量很低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。
实施例8：脂溶性维生素的检测方法的线性方程的获得和线性关系
将实施例3中六种不同浓度的标准溶液进行液质联用仪按照实施例4中的检测条件进行测定，得到各浓度下脂溶性维生素及内标物的色谱图，其中，标准溶液中的每一种脂溶性维生素和每一种脂溶性维生素的内标物的色谱图分别如图5和图6所示，其中，每一种脂溶性维生素的保留时间和每一种脂溶性维生素的内标物的保留时间分别如表5所示。
表5
Figure BDA0002871867510000161
图5中图a至图f的横坐标的单位长度均为0.5，图a为维生素A的色谱图，图a的纵坐标的单位长度为1×104；图b为维生素E的色谱图，图b的纵坐标的单位长度为1×105；图c为25-羟基维生素D2的色谱图，图c的纵坐标的单位长度为1000；图d为25-羟基维生素D3的色谱图，图d的纵坐标的单位长度为1×104；图e为维生素K1的色谱图，图e的纵坐标的单位长度为1000；图f为维生素K2的色谱图，图f的纵坐标的单位长度为1000。
图6中图a至图f的横坐标的单位长度均为0.5，图a为维生素A-d3内标物的色谱图，图a的纵坐标的单位长度为1×104；图b为维生素E-d6内标物的色谱图，图b的纵坐标的单位长度为5×104；图c为25-羟基维生素D2-d3内标物的色谱图，图c的纵坐标的单位长度为1000；图d为25-羟基维生素D3-d6内标物的色谱图，图d的纵坐标的单位长度为1×104；图e为维生素K1-d7内标物的色谱图，图e的纵坐标的单位长度为500；图f为维生素K2-d7内标物的色谱图，图f的纵坐标的单位长度为1000。
确定各色谱峰峰面积，以每一个脂溶性维生素的色谱峰面积与每一个脂溶性维生素的内标物色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，每一个脂溶性维生素的浓度与每一个脂溶性维生素的内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的六种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b，并且得相关系数c；线性方程的测定结果见表6，线性关系图见图7，其中，图7的横坐标的单位长度为25，纵坐标的单位长度为10。
表6
检测指标 线性范围 线性方程 相关系数
维生素A 0.056-1.8μg/mL Y＝8.689X+0.057 0.9992
维生素E 1.125-36μg/mL Y＝0.749X+0.162 0.9992
25-羟基维生素D2 0.78-25ng/mL Y＝0.179X-0.013 0.9987
25-羟基维生素D3 3.13-100ng/mL Y＝0.055X+0.034 0.9989
维生素K1 0.5-100μg/mL Y＝0.469X+0.017 0.9989
维生素K2 0.5-100μg/mL Y＝0.30X+0.00016 0.9981
表6为一次实施例中的每一种脂溶性维生素的线性关系数据，由表6可知，每一种脂溶性维生素在各自的线性范围内，相关系数R2＞0.9900，线性关系良好。
实施例9：脂溶性维生素的检测方法的回收率和精密度
取实施例3中脂溶性维生素标准工作液配制成高、中、低3种浓度，并加入含有0.25μg/mL维生素A、7.6μg/mL维生素E、1.2ng/mL 25-羟基维生素D2、12.9ng/mL 25-羟基维生素D3、1.2ng/mL维生素K1和0.98ng/mL维生素K2的血清样本，进行加样回收率和精密度实验，按本实施例4中的检测条件进行测定，重复分析测定3次，每一种脂溶性维生素加标回收率如表7。
表7
Figure BDA0002871867510000171
综合上述验证试验和表7可知，本实施例的回收率符合要求，该方法检测血液中每一种脂溶性维生素，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。
由表3和表5可知，待测样品中的脂溶性维生素的保留时间与其标准溶液一致，该方法以脂溶性维生素的同位素作为内标物，使得目标物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。
实施例10：脂溶性维生素的检测试剂盒的均匀性
随机抽取15盒实施例1中所述的试剂盒，按照实施例5中待测样品的前处理及实施例4中的检测条件，按一定排序规律对每盒试剂盒中的脂溶性维生素校准品的每个浓度点测试三个样，C1、C2、C3、C4、C5、C6各浓度点的瓶内变异系数(CV瓶内)和瓶间变异系数(CV瓶间)如表8所示均小于6％，符合行业标准。因此，本发明试剂盒有较好的均匀性。
表8脂溶性维生素校准品均匀性
Figure BDA0002871867510000181
实施例11：脂溶性维生素的检测试剂盒的批内精密度和批间精密度
随机抽取1批次实施例1中所述的试剂盒和实施例5.1中的血清，一次同步处理10个血清样本和脂溶性维生素质控品，按照实施例5中待测样品的前处理及实施例4中的检测条件，测定血清及脂溶性维生素质控品中每一种脂溶性维生素的浓度，其中，血清及脂溶性维生素质控品中每一种脂溶性维生素的浓度如表9所示。
表9
Figure BDA0002871867510000182
由表9可知，脂溶性维生素质控品中每一种脂溶性维生素的检测浓度均在其给定的靶值范围内，而且批内精密度范围为0.92％～3.53％，符合试剂盒企业标准，即出品的试剂盒精密度需达到的标准批内精密度：CV<10％。
随机抽取5个不同批次上述实施例1中的试剂盒和实施例5.1中的血清，分批次同步处理血清、试剂盒中的脂溶性维生素校准品和脂溶性维生素质控品，按照实施例5中待测样品的前处理及实施例4中的检测条件，测定血清及脂溶性维生素质控品中每一种脂溶性维生素的浓度，其中，血清及脂溶性维生素质控品中每一种脂溶性维生素的浓度如表10所示。
表10
Figure BDA0002871867510000191
由表10可知，脂溶性维生素质控品中每一种脂溶性维生素的检测浓度均在其给定的靶值范围内，而且批内精密度范围为0.85％～3.61％，符合试剂盒企业标准，即出品的试剂盒精密度需达到的标准批间精密度：CV<12％
需要说明的是，图3至图6的横坐标均为采集时间(min)，纵坐标均为离子信号强度，且色谱图中缺失的图形不影响本方案的技术内容。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.用于检测脂溶性维生素的试剂盒，其特征在于，包括：至少三瓶脂溶性维生素校准品、至少三瓶脂溶性维生素质控品、混合内标蛋白沉淀剂、流动相添加剂以及用于提取待处理样品中的脂溶性维生素的提取液；其中，
所述至少三瓶脂溶性维生素校准品和所述至少三瓶脂溶性维生素质控品均为脂溶性维生素的冻干品，其中，脂溶性维生素包括维生素A、维生素E、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素K1和维生素K2；
所述混合内标蛋白沉淀剂包括：含有蛋白沉淀剂、维生素A-d3内标物、维生素E-d6内标物、25-羟基维生素D2-d3内标物、25-羟基维生素D3-d6内标物、维生素K1-d7内标物和维生素K2-d7内标物的混合溶液；
所述流动相添加剂包括含有甲酸的甲醇溶液以及含有甲酸的乙腈溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，
所述蛋白沉淀剂包括：乙醇溶液和/或甲醇溶液。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，
所述流动相添加剂包括：含有4％-10％甲酸的甲醇溶液和含有6％-15％甲酸的乙腈溶液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，
所述提取液包括：含有0.5％-3％乙醇的正己烷溶液或含有0.5％-3％乙醇的甲基叔丁基醚溶液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括：
复溶液包括：含有0％-30％水的乙腈溶液。
6.基于权利要求1至5中任一所述的试剂盒的脂溶性维生素的检测方法，其特征在于，包括：
分别向所述试剂盒中的至少三瓶脂溶性维生素校准品中加入水溶液复溶，得到至少三种浓度的标准工作液；
分别向所述至少三种浓度的标准工作液中加入所述试剂盒中的混合内标蛋白沉淀剂，得到至少三种浓度的标准溶液，其中，所述至少三种浓度的标准溶液中的所述混合内标蛋白沉淀剂的量相同；
利用所述试剂盒中的所述流动相添加剂配制流动相；
利用液质联用仪和所述流动相在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中的每一种脂溶性维生素的浓度以及所述混合内标蛋白沉淀剂中每一种脂溶性维生素的内标物的浓度，拟合每一种脂溶性维生素所对应的标准曲线方程；
利用所述试剂盒中的至少三瓶脂溶性维生素质控品确定所述标准曲线方程的斜率和截距是否分别在预设的范围内；
如果是，对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；
向所述第一上清液内加入萃取剂、所述试剂盒中的提取液和所述混合内标蛋白沉淀剂，涡旋混匀并离心，取离心后的上层溶液作为待测样品；
利用液质联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；
基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中每一种脂溶性维生素的浓度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述利用所述试剂盒中的所述流动相添加剂制备流动相，包括：
当所述试剂盒中的所述流动相添加剂包括含有4％-10％甲酸的甲醇溶液和含有6％-15％甲酸的乙腈溶液时，
将含有4％-10％甲酸的甲醇溶液加入到甲醇溶液中，得到流动相A，并将含有6％-15％甲酸的乙腈溶液加入到含有乙腈的甲醇溶液中，得到流动相B，其中，流动相A和流动相B采用梯度洗脱。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
流动相A含有0.08％-0.2％甲酸；
流动相B含有0.075％-0.1875％甲酸以及25％的乙腈；
和/或，
所述流动相A相和流动相B相采用梯度洗脱，包括：
流动相A与流动相B的体积比包括：
0.00min：92％:8％-100％:0％；
3.00min：92％:8％-100％:0％；
3.10min：0％:100％-20％:80％；
5.00min：0％:100％-20％:80％；
5.10min：92％:8％-100％:0％；
6.00min：92％:8％-100％:0％。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述检测条件中的液相条件，包括：
柱温包括25-45℃；
流速包括0.6-0.8mL/min。
10.根据权利要求6至9中任一所述的方法，其特征在于，
所述检测条件中的质谱条件，包括：
所述液质联用仪采用APCI离子源，多反应监测模式；碰撞气流速：4-10μL/min；加热气温度：150-550℃；喷雾气电压：40-70psi；气帘气压力：20-50psi；放电电流：0-5mA；
和/或，
每一种脂溶性维生素所对应的标准曲线方程的两个变量分别为：所述标准溶液中该脂溶性维生素的色谱峰面积与该脂溶性维生素的内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中该脂溶性维生素的浓度与该脂溶性维生素的内标物的浓度的比值；
和/或，
所述萃取剂包括：甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和正己烷中的至少一种；
和/或，
所述取离心后的上层溶液作为待测样品，包括：
利用氮气将移取的所述上层溶液液吹干，顺次加入所述试剂盒中的复溶液，在1500-2500rpm的转速下涡旋混合2-6min，并在3500-12000rpm的转速下离心3-12min，取离心后的第二上清液作为待测样品。
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