CN110927310A - 同时检测微量血中25羟基-维生素d3和25羟基-维生素d2含量的方法 - Google Patents

同时检测微量血中25羟基-维生素d3和25羟基-维生素d2含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了同时检测微量血中25羟基‑维生素D3和25羟基‑维生素D2含量的方法。基于特定的液相条件，利用高效液相串联质谱仪分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，各标准溶液中均含有浓度已知的25羟基‑维生素D3及D2的标准品及内标物；根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到标准曲线方程；将混合内标工作液添加到经处理至少0.2mL待检测血液而得到的血液样本中，经样本前处理以得到待测样本；同样检测待测样本得到其色谱图；根据待测样本的色谱图和各个标准曲线方程，计算血液样本中25羟基‑维生素D3及D2的含量。本发明能够更加快速的同时检测微量血中该两种维生素的含量。

Description

同时检测微量血中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量 的方法
技术领域
本发明涉及临床化学技术领域，特别涉及同时检测微量血中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的方法。
背景技术
维生素D又称抗佝偻病维生素，为固醇类衍生物，其家族成员中最重要的成员是25羟基-维生素D3(胆钙化醇)和25羟基-维生素D2(麦角钙化醇)，皆为脂溶性维生素。当其缺乏时，会产生维生素D缺乏症，主要表现为骨骼病变，同时伴有肌肉松弛，非特异性神经精神症状、生长迟缓，免疫力低下及相应的血浆生化改变；严重缺乏时，会形成抗维生素D佝偻病、软骨营养不良、老年人骨质疏松症等。产生病症的机理是维生素D缺乏时肠道对钙、磷吸收减少，血中钙、磷浓度下降，从而引起全身性钙、磷代谢失常，致使钙盐不能正常的沉着在骨骼的生长部分，最终形成骨骼畸形。
25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2临床上主要用于治疗维生素D缺乏症，预防儿童佝偻病、老年人骨质疏松症、肾性骨病、甲状旁腺素缺少症以及癫痫患者使用苯巴比妥导致的骨症。其作用机理是促进小肠黏膜刷状缘对钙的吸收及肾小管重吸收磷，提高血钙、血磷浓度，协同甲状旁腺激素(PTH)、降钙素(CT)，促进旧骨释放磷酸钙，维持及调节血浆钙、磷正常浓度，促使钙沉着于新骨形成部位，使枸橼酸盐在骨中沉积，促进骨钙化及成骨细胞功能和骨样组织成熟。
维生素D缺乏症为一种小儿常见病，而对于婴幼儿特别是新生儿以及其他存在静脉穿刺的人群来说，末梢采血就显得尤为重要。
目前已有针对婴幼儿血液中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的检测方法。比如，同时检测人末梢血中25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2含量的方法，公开号为CN110208435A，但其分析时间较长，为5.0min。
发明内容
本发明提供了同时检测微量血中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的方法，能够更加快速的同时检测微量血中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的含量。
为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明提供了同时检测微量血中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的方法，包括：
利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的25羟基-维生素D3的标准品及内标物、25羟基-维生素D2的标准品及内标物，不同标准溶液中同一标准品的浓度不同；
根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到25羟基-维生素D3的标准曲线方程和25羟基-维生素D2的标准曲线方程；
将一定量的混合内标工作液添加到一定量的血液样本中，并进行样本前处理以得到待测样本；其中，所述血液样本经处理至少0.2mL待检测血液而得到，所述混合内标工作液中含有浓度已知的25羟基-维生素D3的内标物和25羟基-维生素D2的内标物；
利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样本，得到待测样本的色谱图；
根据待测样本的色谱图和拟合得到的各个标准曲线方程，计算所述血液样本中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的含量；
其中，所述检测条件中的液相条件包括：Kinetex F5色谱柱，色谱柱的长度为50mm、内径为3.0mm、填料粒径为2.6μm，流动相A为含体积比为0.05％-0.25％的甲酸、浓度为0.5-2.5mmol/L的甲酸铵的水，流动相B为甲醇，分析时间为3.8-4.5min，柱温为25-40℃，进样量为0.1-30μL，流速为0.3-0.5mL/min。
优选地，所述液相条件包括：洗脱方式为等度洗脱；
流动相A为含体积比为0.1％的甲酸、浓度为1mmol/L的甲酸铵的水；
流动相A与流动相B的体积比为20:80。
优选地，所述液相条件包括：柱温为30℃，进样量为20μL，流速为0.4mL/min。
优选地，所述检测条件中的串联质谱条件包括：采用电喷雾离子源ESI，正离子扫描模式，选择反应监测模式，Gas Temp为250-350℃，Gas Flow为3-8L/min，NebuLizer为35-50psi，Sheath Gas Temp为300-400℃，Sheath Gas Flow为8-14L/min，Capillary为3000-4000V，Delta EMV(+)为300-600V。
优选地，所述串联质谱条件包括：Gas Temp为300℃，Gas Flow为5L/min，NebuLizer为40psi，Sheath Gas Temp为350℃，Sheath Gas Flow为10L/min，Capillary为3500V，Delta EMV(+)为600V。
本发明提供了同时检测微量血中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的方法。基于特定的液相条件，利用高效液相串联质谱仪分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，各标准溶液中均含有浓度已知的25羟基-维生素D3及D2的标准品及内标物；根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到标准曲线方程；将混合内标工作液添加到经处理至少0.2mL待检测血液而得到的血液样本中，经样本前处理以得到待测样本；同样检测待测样本得到其色谱图；根据待测样本的色谱图和各个标准曲线方程，计算血液样本中25羟基-维生素D3及D2的含量。本发明能够更加快速的同时检测微量血中该两种维生素的含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的一种同时检测血液中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的方法的流程图；
图2是本发明一实施例提供的25羟基-维生素D3的化学结构式；
图3是本发明一实施例提供的25羟基-维生素D2的化学结构式；
图4是本发明一实施例提供的一标准溶液中25羟基-维生素D3的色谱图；
图5是本发明一实施例提供的一标准溶液中25羟基-维生素D3的同位素内标的色谱图；
图6是本发明一实施例提供的一待测样本中25羟基-维生素D3的色谱图；
图7是本发明一实施例提供的一待测样本中25羟基-维生素D3的同位素内标的色谱图；
图8是本发明一实施例提供的一标准溶液中25羟基-维生素D2的色谱图；
图9是本发明一实施例提供的一标准溶液中25羟基-维生素D2的同位素内标的色谱图；
图10是本发明一实施例提供的一待测样本中25羟基-维生素D2的色谱图；
图11是本发明一实施例提供的一待测样本中25羟基-维生素D2的同位素内标的色谱图；
图12是本发明一实施例提供的25羟基-维生素D3的线性关系图；
图13是本发明一实施例提供的25羟基-维生素D2的线性关系图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本发明实施例提供了一种同时检测微量血中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的方法，可以包括以下步骤：
步骤101：利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的25羟基-维生素D3的标准品及内标物、25羟基-维生素D2的标准品及内标物，不同标准溶液中同一标准品的浓度不同。
本发明实施例中，所述检测条件中的液相条件包括：Kinetex F5色谱柱，色谱柱的长度为50mm、内径为3.0mm、填料粒径为2.6μm，流动相A为含体积比为0.05％-0.25％的甲酸、浓度为0.5-2.5mmol/L的甲酸铵的水，流动相B为甲醇，分析时间为3.8-4.5min，柱温为25-40℃，进样量为0.1-30μL，流速为0.3-0.5mL/min。
比如，流动相A中，甲酸的体积比的取值可以为0.05、0.1、0.15、0.2或0.25，甲酸铵的浓度的取值可以为0.5、1.0、1.5、2.0或2.5；分析时间的取值可以为3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4或4.5，优选为3.8min；柱温的取值可以为25、30、35或40；进样量的取值可以为0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30；流速的取值可以为0.35、0.40、0.45或0.5。
步骤102：根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到25羟基-维生素D3的标准曲线方程和25羟基-维生素D2的标准曲线方程。
步骤103：将一定量的混合内标工作液添加到一定量的血液样本中，并进行样本前处理以得到待测样本；其中，所述血液样本经处理至少0.2mL待检测血液而得到，所述混合内标工作液中含有浓度已知的25羟基-维生素D3的内标物和25羟基-维生素D2的内标物。
步骤104：利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样本，得到待测样本的色谱图。
步骤105：根据待测样本的色谱图和拟合得到的各个标准曲线方程，计算所述血液样本中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的含量。
详细地，在检测25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2这一检测项目上，KinetexF5色谱柱的耐受性强。使用色谱柱规格为3.0×50mm 2.6μm的Kinetex F5色谱柱，并结合上述其他色谱条件进行检测时，具有分析时间短、批次间保留时间好、分离效果的重复性好、色谱柱的寿命长等特点。
本发明实施例中，利用高效液相质谱联用法，来检测血液中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的含量，结合人体血液中这2种维生素的含量变化区间，通常仅需较少量的血液即可实现检测，故待检测血液优选的可取自人体的末梢血。由于血液需求量较少，故本发明实施例中的应用场景和应用对象均有所拓展，比如可以适应于婴儿、老人等体内血量较少的特殊群体，以便采样末梢血。当然，本发明实施例同样可以适用于已有静脉血或静脉血经使用后剩余量不多的应用场景。比如，已有静脉血时，即无需重复采样末梢血。
此外，有研究发现，婴幼儿体内存在VD3(即25羟基-维生素D3)的同型异构体VD3-epi，该物质的存在会干扰25羟基-维生素D3检测的准确性。而本发明实施例可以实现色谱条件下25羟基-维生素D3与其同型异构体的分离，从而大大提高了婴幼儿检测结果的准确性，可以为临床医生提供更加可靠的报告。
在本发明一个实施例中，所述液相条件包括：洗脱方式为等度洗脱；流动相A为含体积比为0.1％的甲酸、浓度为1mmol/L的甲酸铵的水；流动相A与流动相B的体积比为20:80。
本发明实施例中，洗脱方式为等度洗脱，使得检测方法的稳定性更好，从而更加有益于临床样本的检测。此外，在保证检测效果的前提下，流动相的配制简单不繁琐，有利于实际检测的应用。
在本发明一个实施例中，所述液相条件包括：柱温为30℃，进样量为20μL，流速为0.4mL/min。
在本发明一个实施例中，所述检测条件中的串联质谱条件包括：采用电喷雾离子源ESI，正离子扫描模式，选择反应监测模式，Gas Temp为250-350℃，Gas Flow为3-8L/min，NebuLizer为35-50psi，Sheath Gas Temp为300-400℃，Sheath Gas Flow为8-14L/min，Capillary为3000-4000V，Delta EMV(+)为300-600V。
优选地，所述串联质谱条件包括：Gas Temp为300℃，Gas Flow为5L/min，NebuLizer为40psi，Sheath Gas Temp为350℃，Sheath Gas Flow为10L/min，Capillary为3500V，Delta EMV(+)为600V。
本发明实施例利用高效液相质谱联用法来实现检测，考虑到同位素内标物能避免质谱的基质效应，故优选地，上述内标物可以为同位素内标物。
请参考图2和图3，图2示出了25羟基-维生素D3的化学结构式，图3示出了25羟基-维生素D2的化学结构式。
通常情况下，标准曲线方程的建立至少需要三个坐标点，以保证所建立方程的准确性，故需要预先配制至少三个标准溶液，从而可以根据各个标准溶液检测所得到的色谱图，拟合出25羟基-维生素D3的标准曲线方程和25羟基-维生素D2的标准曲线方程。
详细地，以25羟基-维生素D3为例，拟合得到的25羟基-维生素D3的标准曲线方程通常可以为y＝k×x+b。其中，x、y这两个变量，分别可以为各个标准溶液的色谱图中，25羟基-维生素D3的标准品与相应内标物的峰面积比值，以及，各个标准溶液中，25羟基-维生素D3的标准品与相应内标物的浓度比值。如此，根据待测样本的色谱图中，25羟基-维生素D3与其内标物的峰面积比值，以及待测样本中该内标物的浓度，代入标准曲线方程即可计算出待测样本中25羟基-维生素D3的浓度。据此，可相应获得血液样本中25羟基-维生素D3的浓度。当然，这一实现方式同样适用于25羟基-维生素D2。
通常情况下，取至少0.2mL待检测血液后，通过对待检测血液进行处理，比如在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得到血清或血浆，即得到上述血液样本。血清或血浆样本置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。得到血液样本后，即可作前处理，以得到相应可直接上样的待测样本。
在本发明一个实施例中，样本前处理的实现过程可以包括：
(1)用移液枪移取10μL混合内标工作液于2mL的离心管中，然后加入50-100μL血液样本；
(2)加入一定量的沉淀蛋白试剂，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合2-5min；
(3)加入一定量的萃取剂，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合3-10min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min；
(4)移取一定量的离心后上清液至干净的1.5mL离心管中，将盛有上清液的1.5mL离心管转移至氮气吹干装置上，将上清液吹干；
(5)移取一定量的复溶液至上清吹干的1.5mL离心管中，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合1-3min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min，移取上清液即为待测样本。
比如，可以移取90μL的上清液作为待测样本。
优选地，样本前处理中，沉淀蛋白试剂为无水乙醇，蛋白沉淀剂的量为100-300μL；萃取试剂为正己烷，萃取试剂的量为1000-1400μL；复溶液为65-75％的甲醇水溶液，且甲醇水溶液中含0.05％-0.15％的甲酸，复溶液的量为50-200μL。
举例来说，无水乙醇的用量取值可以为100、150、200、250或300；正己烷的用量取值可以为1000、1100、1200、1300或1400；复溶液中，甲醇的体积取值可以为65、70或75，甲酸含量的取值可以为0.05、0.1或0.15，复溶液用量的取值可以为50、100、150或200。
在本发明一个实施例中，在所述分别检测至少三个标准溶液之前，进一步包括：
制备至少三个标准工作液，标准工作液中含有浓度已知的25羟基-维生素D3标准品和25羟基-维生素D2标准品，且25羟基-维生素D3标准品的浓度在25-1600ng/mL中，25羟基-维生素D2标准品的浓度在7.8-500ng/mL中；
利用移液器移取10μL标准工作液、10μL所述混合内标工作液置于离心管中，再移取加入80μL稀释液；
将该离心管在1500-2000rpm的转速下涡旋混匀1-2min后，移取上清液以得到标准溶液；
其中，得到的至少三个标准溶液中，25羟基-维生素D3标准品的浓度为0.3125ng/mL、0.625ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL中的至少三个，25羟基-维生素D2标准品的浓度为0.098ng/mL、0.195ng/mL、0.39ng/mL、0.78ng/mL、1.5625ng/mL、3.125ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL中的至少三个。
详细地，可以结合检测的人群、待检测血液的用量，以及人体内25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的大致含量范围，来设定线性范围，以保证大部分的临床样本检测结果落在可报告范围内。
优选地，稀释液为65-75％的甲醇水溶液。
优选地，标准溶液的个数为8个。
综上所述，本发明实施例提供的这一同时检测微量血中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的方法，是将内标法与高效液相色谱质谱联用法相结合，使干扰因素大大减少，且特异性强、灵敏度高、检测结果更为准确，同时分析时间缩短。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明并不仅限于下述实施例。
实施例1
本发明实施例用于获取标准曲线方程。
1.1标准储备液的配制
标准储备液A：将购买得到的25羟基-维生素D3标准液(有证参考物质，溶剂为纯甲醇)转移至2mL冻存管，得到标准储备液A(100μg/mL)，并在-80℃条件下保存，有效期为一年。
标准储备液B：将购买得到的25羟基-维生素D2标准液(有证参考物质，溶剂为纯甲醇)转移至2mL冻存管，得到标准储备液B(50μg/mL)，并在-80℃条件下保存，有效期为一年。
1.2内标储备液的配制
内标储备液C：取25羟基-维生素D3-d6标准品0.5mg置于5mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容至5mL，得到内标标准储备液C，并在-80℃条件下保存，有效期为1年。
内标储备液D：将购买得到的25羟基-维生素D2-d3标准液(溶剂为纯甲醇)转移至2mL冻存管，得到内标标准储备液D(102μg/mL)，并在-80℃条件下保存，有效期为1年。
1.3检测用仪器
安捷伦6470。
有大量的临床检测数据证明，安捷伦6470的耐受性强，具体表现在维护周期长。考虑到频繁的关机维护对于质谱仪器来说太繁琐，而且严重影响工作效率，故使用安捷伦6470来检测25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的含量在临床检测行业具有优势。
1.4质谱条件
采用ESI，正离子扫描模式，选择反应监测模式，Gas Temp为300℃，Gas Flow为5L/min，NebuLizer为40psi，Sheath Gas Temp为350℃，Sheath Gas Flow为10L/min；Capillary为3500V，Delta EMV(+)为600V。
基于此，质谱条件的其他参数请参考下述表1。
表1
物质名称 Precursor Ion Product Ion Dwell Fragmentor CE CAV
25-OH-VD3 401.3 365.3 150 110 8 7
25-OH-VD3-d6 407.3 371.3 150 110 8 7
25-OH-VD2 413.3 337.3 150 100 5 3
25-OH-VD2-d3 416.3 340.3 150 100 5 3
表1中，25-OH-VD3为25羟基-维生素D3，25-OH-VD2为25羟基-维生素D2。
1.5液相条件
1.5.1色谱柱
飞诺美公司的Kinetex F5色谱柱，色谱柱的长度为50mm、内径为3.0mm、填料粒径为2.6μm。
1.5.2流动相
流动相A：含体积比为0.1％的甲酸及浓度为1mmol/L的甲酸铵的水；
流动相B：甲醇。
1.5.3洗脱方式
采用梯度洗脱，洗脱过程如下述表2所示：
表2
Time/min 流动相A/％ 流动相B/％
0.00 20 80
3.8 20 80
1.5.4其他
分析时间为3.8min；柱温为30℃；进样量为20μL；流速为0.4mL/min。
1.6标准工作液的配制
标准工作液：取适量标准储备液A、标准储备液B，用70％的甲醇水溶液进行稀释混合，得到含有3.125-400ng/mL 25羟基-维生素D3、0.98-125ng/mL 25羟基-维生素D2的八个标准工作液，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月。
本发明实施例中，八个标准工作液中，25羟基-维生素D3标准品的浓度分别为3.125ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL；25羟基-维生素D2标准品的浓度分别为0.98ng/mL、1.95ng/mL、3.9ng/mL、7.8ng/mL、15.625ng/mL、31.25ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL。
可见，这八个标准工作液中，各个标准品的浓度不同且依次递增。
1.7混合内标工作液的配制
混合内标工作液：取适量内标储备液C和内标储备液D，用70％的甲醇水溶液进行稀释，得到含150ng/mL的25羟基-维生素D3-d6、50ng/mL的25羟基-维生素D2-d3的混合内标工作液，-80℃保存，避光，有效期1年。
1.8标准溶液的配制
对于每一个标准工作液，用移液器移取10μL标准工作液和10μL混合内标工作液分别置于离心管中，再移取加入80μL稀释液(甲醇：水＝7:3)，然后在2000rpm的转速下涡旋混匀1min后，取上清液作为待检测的标准溶液。
如此，针对八个标准工作液，可以得到八个标准溶液。八个标准溶液中，25羟基-维生素D3的浓度分别为0.3125ng/mL、0.625ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL，25羟基-维生素D2的浓度分别为0.098ng/mL、0.195ng/mL、0.39ng/mL、0.78ng/mL、1.5625ng/mL、3.125ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL。
1.9检测标准溶液，生成标准曲线方程
得到各个标准溶液后，即可利用高效液相串联质谱仪对八个标准溶液分别进行检测，对应得到各个标准溶液的色谱图。
请参考图4、图5、图8和图9，图4示出了一标准溶液中25羟基-维生素D3标准品的色谱图，图5示出了一标准溶液中25羟基-维生素D3的同位素内标物(即上述25羟基-维生素D3-d6标准品)的色谱图；图8示出了一标准溶液中25羟基-维生素D2标准品的色谱图，图9示出了一标准溶液中25羟基-维生素D2的同位素内标物(即上述25羟基-维生素VD2-d3标准品)的色谱图。
从标准溶液的色谱图中，可以得到25羟基-维生素D3标准品、25羟基-维生素D2标准品的色谱峰面积和各个内标物的色谱峰面积，然后结合各个标准溶液中标准品和内标物的已知浓度，即可得到25羟基-维生素D3的标准曲线方程和25羟基-维生素D2的标准曲线方程。
请参考图12和图13，图12示出了得到的25羟基-维生素D3线性关系图，图13示出了得到的25羟基-维生素D2线性关系图。根据线性关系图，可以得到下述表3。
表3
Figure BDA0002299127620000131
由表3可知，25羟基-维生素D3在2.5-160ng/mL的线性范围内，相关系数R2＞0.9900，表示线性关系良好；25羟基-维生素D2在0.78-50ng/mL的线性范围内，相关系数R2＞0.9900，表示线性关系良好。基于这两个标准曲线方程来计算血液中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量时，准确性高，误差小。
得到标准曲线方程后，即可对血液样本作前处理，以得到待测样本，进而在相同检测条件下，对待测样本进行检测，结合得到的标准曲线方程，即可得到血液样本中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的含量。
实施例2
本发明实施例用于检测末梢血中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的含量。
2.1获取血液样本
血液样本经处理至少0.2mL待检测血液而得到。得到血液样本后，即可作前处理，以得到相应可直接上样的待测样本。
2.2血液样本前处理
用移液枪移取10μL混合内标工作液于2mL的离心管中，然后加入20μL血液样本，再加入200μL的无水乙醇，在2000rpm的转速下涡旋混合3min后，加入1200μL的正己烷，在2000rpm的转速下涡旋混合5min后，再在12000rpm的转速下高速离心10min，移取1000μL离心后上清液至干净的1.5mL离心管中，将盛有上清液的1.5mL离心管转移至氮气吹干装置上，将上清液吹干，移取100μL的含0.1％甲酸和70％甲醇的水溶液，至上清吹干的1.5mL离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合1min后，再在12000rpm的转速下高速离心5min，移取90μL上清液即为待测样本。
2.3待测样本检测
在实施例1的检测条件下，使用同一高效液相串联质谱仪对待测样本进行检测，得到待测样本的色谱图。
请参考图6、图7、图10和图11，图6示出了待测样本中25羟基-维生素D3的色谱图，图7示出了待测样本中25羟基-维生素D3的同位素内标物(即25羟基-维生素D3-d6标准品)的色谱图，图10示出了待测样本中25羟基-维生素D2的色谱图，图11示出了待测样本中25羟基-维生素D2的同位素内标物(即上述25羟基-维生素VD2-d3标准品)的色谱图。
请参考图4至图7，待测样本中25羟基-维生素D3的保留时间与标准溶液中25羟基-维生素D3标准品的保留时间相一致，以25羟基-维生素D3的同位素标记物为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜、特异性强、准确度和灵敏度高。
请参考图8至图11，待测样本中25羟基-维生素D2的保留时间与标准溶液中25羟基-维生素D2标准品的保留时间相一致，以25羟基-维生素D2的同位素标记物为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜、特异性强、准确度和灵敏度高。
2.4待测样本中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的计算
根据待测样本的色谱图中，25羟基-维生素D3、25羟基-维生素D2和各个内标物的色谱峰面积，以及待测样本中各个内标物的已知浓度，对应代入上述2个标准曲线方程，即可计算出待测样本中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的含量。
实施例3
本发明实施例用于测定定量限和检测限。
选择低浓度的质控样本，用生理盐水做不同程度的稀释，从而制备得到不同浓度的血液样本稀释液，并按实施例2中的血液样本前处理方式及测定条件，对这些血液样本稀释液进行测定。经检测发现，25羟基-维生素D3、25羟基-维生素D2的检测限和定量限如下所示：
25羟基-维生素D3
(1)检测限(LOD)：0.05ng/mL。
(2)定量限(LOQ)：0.15ng/mL。
25羟基-维生素D2
(1)检测限(LOD)：0.03ng/mL。
(2)定量限(LOQ)：0.09ng/mL。
由本实施例可知，25羟基-维生素D3的检测限可低至0.05ng/mL，定量限可低至0.15ng/mL，25羟基-维生素D2的检测限可低至0.03ng/mL，定量限可低至0.09ng/mL，灵敏度很高，可以提高低浓度样本的平行性，增强准确度。
由于灵敏度高，故本发明实施例对待检测血液的样本量的要求会更加的宽泛，从而提高样本检测的整体准确度。此外，本发明实施例对25羟基-维生素D3或25羟基-维生素D2含量很低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。
实施例4
本发明实施例用于测定回收率和精密度。
分别取含25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的标准工作液，配制成高、中、低3种浓度，进行加样回收率和精密度实验，按实施例2中的检测方法进行测定，分析测定3批次，25羟基-维生素D3、25羟基-维生素D2的回收率和精密度如表4所示。
表4
Figure BDA0002299127620000161
可以看出，25羟基-维生素D2、25羟基-维生素D3在低、中、高的3个添加水平范围内，平均回收率为96.86％～105.14％，重现性良好，加样回收率良好，精密度为0.24％～3.25％，检测结果的准确度较高，可消除系统误差。
对比例1
同时检测人末梢血中25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2含量的方法，公开号为CN110208435A。
一、液相分析
在对比例1中，使用安捷伦公司的Poroshell 120-PFP色谱柱，色谱柱的长度为50mm、内径为3.0mm、填料粒径为2.7μm；流动相为含体积比为0.05％-0.25％甲酸的水，和，含体积比为0.05％-0.25％甲酸及浓度为0.5mmol/L-2.5mmol/L的甲酸铵的甲醇；分析时间为5.0min；柱温为20℃-30℃；进样量为0.1μl-30μl；流速为0.55mL/min-0.65mL/min。
基于该液相条件，25-羟基维生素D3及其同位素内标物的保留时间在3.3min，25-羟基维生素D2及其同位素内标物的保留时间在3.5-3.6min之间，分析时间为5.0min。
而本发明实施例中，使用飞诺美公司的Kinetex F5色谱柱，色谱柱的长度为50mm、内径为3.0mm、填料粒径为2.6μm，流动相A为含体积比为0.05％-0.25％的甲酸、浓度为0.5-2.5mmol/L的甲酸铵的水，流动相B为甲醇，分析时间为3.8-4.5min，柱温为25-40℃，进样量为0.1-30μL，流速为0.3-0.5mL/min。
基于该液相条件，25-羟基维生素D3及其同位素内标物的保留时间在2.7-2.8min之间，25-羟基维生素D2及其同位素内标物的保留时间在2.9-3.0min之间，分析时间可以为3.8min。
首先，在检测25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2这一检测项目上，与Poroshell120-PFP色谱柱相比，本发明实施例中所用的Kinetex F5色谱柱的耐受性更强，具体表现在批次间保留时间及分离效果的重复性更好，色谱柱的寿命也更长，这些对于临床检测来说都是非常重要的因素。
再者，本发明实施例中各个目标峰的保留时间，均分别小于对比例1中相应目标峰的保留时间，使得本发明实施例中的分析时间小于对比例1中的分析时间，分析时间缩短。
此外，本发明实施例中的流动相去掉了甲醇中的甲酸铵，减少了配制流动相的繁琐性，有利于实际检测的应用。
二、洗脱方式
在对比例1中，洗脱方式为梯度洗脱，而本发明实施例中，采用等度洗脱。
本发明实施例通过将洗脱方式改为等度洗脱，使得检测方法的稳定性更好，更加有益于临床样本的检测。
三、检测灵敏度
在对比例1中，25-羟基维生素D3的检测限为1.67ng/mL，定量限为5ng/mL；25-羟基维生素D2的检测限为0.27ng/mL，定量限为0.8ng/mL。
而本发明实施例中，25-羟基维生素D3的检测限为0.05ng/mL，定量限为0.15ng/mL；25-羟基维生素D2的检测限为0.03ng/mL，定量限为0.09ng/mL。
可以看出，本发明实施例的检测限和定量限均更低，检测方法的灵敏度更高，使得对样本量的要求可以更加的宽泛，样本检测的整体准确度更高。
四、检测准确度
在对比例1中，请参考该对比例1中的图6，该图6示出了一待测样品中25-羟基维生素D3的色谱图。该色谱图中，25-羟基维生素D3的保留时间在约3.3min，其同型异构体VD3-epi的保留时间在约3.55min，两色谱峰间分离不够完全，存在一定程度的交叉，使得25-羟基维生素D3与其同型异构体VD3-epi的分离效果不够理想，分离程度欠佳。
而本发明实施例中，请参考图6，图6同样示出了一待测样品中25-羟基维生素D3的色谱图。该色谱图中，25-羟基维生素D3的保留时间在2.7-2.8min之间，其同型异构体VD3-epi的保留时间在2.9-3.0min，两色谱峰间完全分离、无交叉，使得25-羟基维生素D3与其同型异构体VD3-epi的分离效果理想，分离程度佳。
可以看出，本发明实施例对25-羟基维生素D3与其同型异构体VD3-epi的分离效果更好，从而使得检测准确度更高。
综上所述，与对比例1相比，本发明实施例的分析时间更短，分离度更好，色谱柱的耐受更强，检测灵敏度更高，检测准确度更高，在临床检测领域更具优势。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.同时检测微量血中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2含量的方法，其特征在于，包括：
利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的25羟基-维生素D3的标准品及内标物、25羟基-维生素D2的标准品及内标物，不同标准溶液中同一标准品的浓度不同；
根据各个标准溶液的色谱图，拟合得到25羟基-维生素D3的标准曲线方程和25羟基-维生素D2的标准曲线方程；
将一定量的混合内标工作液添加到一定量的血液样本中，并进行样本前处理以得到待测样本；其中，所述血液样本经处理至少0.2mL待检测血液而得到，所述混合内标工作液中含有浓度已知的25羟基-维生素D3的内标物和25羟基-维生素D2的内标物；
利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样本，得到待测样本的色谱图；
根据待测样本的色谱图和拟合得到的各个标准曲线方程，计算所述血液样本中25羟基-维生素D3和25羟基-维生素D2的含量；
其中，所述检测条件中的液相条件包括：Kinetex F5色谱柱，色谱柱的长度为50mm、内径为3.0mm、填料粒径为2.6μm，流动相A为含体积比为0.05％-0.25％的甲酸、浓度为0.5-2.5mmol/L的甲酸铵的水，流动相B为甲醇，分析时间为3.8-4.5min，柱温为25-40℃，进样量为0.1-30μL，流速为0.3-0.5mL/min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述液相条件包括：洗脱方式为等度洗脱；
流动相A为含体积比为0.1％的甲酸、浓度为1mmol/L的甲酸铵的水；
流动相A与流动相B的体积比为20:80。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述液相条件包括：柱温为30℃，进样量为20μL，流速为0.4mL/min。
4.根据权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于，
所述检测条件中的串联质谱条件包括：采用电喷雾离子源ESI，正离子扫描模式，选择反应监测模式，Gas Temp为250-350℃，Gas Flow为3-8L/min，NebuLizer为35-50psi，Sheath Gas Temp为300-400℃，Sheath Gas Flow为8-14L/min，Capillary为3000-4000V，Delta EMV(+)为300-600V。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述串联质谱条件包括：Gas Temp为300℃，Gas Flow为5L/min，NebuLizer为40psi，Sheath Gas Temp为350℃，Sheath Gas Flow为10L/min，Capillary为3500V，Delta EMV(+)为600V。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022067533A1 (zh) * 2020-09-29 2022-04-07 北京和合医学诊断技术股份有限公司 一种同时检测微量血液中维生素k1和维生素k2的方法
CN114441674A (zh) * 2022-01-17 2022-05-06 天津国科医工科技发展有限公司 维生素d的痕量检测方法及试剂盒
CN114755323A (zh) * 2022-03-24 2022-07-15 北京和合医学诊断技术股份有限公司 干血纸片中脂溶性维生素含量的检测方法及试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060228809A1 (en) * 2005-04-06 2006-10-12 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting vitamin D metabolites by mass spectrometry
CN106442761A (zh) * 2016-08-30 2017-02-22 北京和合医学诊断技术股份有限公司 同时检测血液中维生素a和25‑羟基维生素d的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060228809A1 (en) * 2005-04-06 2006-10-12 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting vitamin D metabolites by mass spectrometry
CN106442761A (zh) * 2016-08-30 2017-02-22 北京和合医学诊断技术股份有限公司 同时检测血液中维生素a和25‑羟基维生素d的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KEVIN D. CASHMAN 等: "Dietary vitamin D2 – a potentially underestimated contributor to vitamin D nutritional status of adults?", 《BRITISH JOURNAL OF NUTRITION》 *
禹松林 等: "改良超高效液相色谱串联质谱法测定25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D", 《检验医学》 *
陈晓红 等: "同位素稀释-超快速液相色谱-串联质谱法测定血清中25-羟基维生素D", 《卫生研究》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022067533A1 (zh) * 2020-09-29 2022-04-07 北京和合医学诊断技术股份有限公司 一种同时检测微量血液中维生素k1和维生素k2的方法
US11747349B2 (en) 2020-09-29 2023-09-05 Beijing Harmony Health Medical Diagnostics Co., Ltd. Method for simultaneously detecting vitamin K1 and vitamin K2 in traces of blood
CN114441674A (zh) * 2022-01-17 2022-05-06 天津国科医工科技发展有限公司 维生素d的痕量检测方法及试剂盒
CN114755323A (zh) * 2022-03-24 2022-07-15 北京和合医学诊断技术股份有限公司 干血纸片中脂溶性维生素含量的检测方法及试剂盒

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