CN114755323A - 干血纸片中脂溶性维生素含量的检测方法及试剂盒 - Google Patents

干血纸片中脂溶性维生素含量的检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及维生素检测技术领域，尤其涉及一种干血纸片中脂溶性维生素含量的检测方法及试剂盒。检测方法包括：获得标准曲线方程，将若干个干血纸片加入溶血试剂中混匀，依次加入第一萃取试剂和第二萃取试剂进行萃取，离心后加入复溶液混匀，得到待测样本；利用高效液相色谱‑质谱联用分别对待测样本进行检测，通过标准曲线方程获得脂溶性维生素含量的浓度。溶血试剂为纯水；第一萃取试剂为无水乙醇；第二萃取试剂为正己烷。本发明检测方法的检测限低，灵敏度高，线性良好，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。

Description

干血纸片中脂溶性维生素含量的检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及维生素检测技术领域，尤其涉及一种干血纸片中脂溶性维生素含量的检测方法及试剂盒。
背景技术
维生素A、维生素E和维生素D(以下简称维生素AED)均属于脂溶性维生素，与人体健康息息相关，特别是孕妇和儿童体内维生素AED含量监测尤为重要，三种维生素的共同特点是对人类健康至关重要。但是这三种维生素的稳定性不好，常温和光照条件下会加速其降解，对于样本运输来说要求较高。另外，孕妇和儿童都属于特殊群体，样本采集的难度也会高于正常人。
在检测过程中，干血斑具备采血量少、制备操作简单、生物危险性低、生物稳定性好、运输保存方便等优势，可以更好地应用于临床，不仅减少了对样本量的需求，降低了患者的生理负担，而且便于异地检测。而目前基于液相色谱串联质谱进行干血斑中维生素A、维生素D、维生素E进行检测的方法具有准确度不高的缺陷。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种干血纸片中脂溶性维生素含量的检测方法及试剂盒。
本发明提出一种干血纸片中脂溶性维生素含量的检测方法，至少包括以下步骤：
S1、分别获得维生素A、维生素E的标准曲线方程I或25羟基维生素D3、25羟基维生素D2标准曲线方程II；S2、将若干个干血纸片加入溶血试剂中混匀，依次加入第一萃取试剂和第二萃取试剂进行萃取，离心后加入复溶液I混匀，得到检测维生素A和维生素E的待测样本I；所述溶血试剂中含有内标工作液I；
或，将若干个干血纸片加入溶血试剂中混匀，依次加入第一萃取试剂和第二萃取试剂进行萃取，离心后加入复溶液II混匀，得到检测25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的待测样本II；所述溶血试剂中含有内标工作液II；
优选的，加入所述溶血试剂后，进行涡旋和超声处理；
其中：所述内标工作液I采用无水乙醇配制，含有维生素A和维生素E的同位素内标物；所述内标工作液II中含有25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的同位素内标物；
所述溶血试剂为纯水；
所述第一萃取试剂为无水乙醇；
所述第二萃取试剂为正己烷；
所述复溶液I为无水甲醇；
所述复溶液II为含有0.1v/v％甲酸的70v/v％的甲醇水溶液；
S3、利用高效液相色谱-质谱联用分别对所述待测样本I或待测样本II进行检测，通过所述标准曲线方程I获得维生素A、维生素E的浓度，通过所述标准曲线方程II获得25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的浓度。
可选的，获得所述标准曲线方程I包括：
S11、以同位素标记的维生素A和同位素标记的维生素E为内标物，制备至少三种含有不同浓度维生素A、维生素E的标准溶液I；
S12、利用高效液相色谱-质谱联用分别对所述标准溶液I进行检测；
S13、以上述至少三个标准溶液的维生素A、维生素E峰面积与内标物峰面积的比值作为纵坐标，以标准溶液中维生素A、维生素E的浓度与内标物浓度之比作为横坐标，制作得到所述标准曲线方程I；
获得所述标准曲线方程II包括：
S11’、将至少三种不同浓度的标准工作液滴到空白纸上，静置后打孔得到空白纸片，加入溶血试剂中混匀，依次加入第一萃取试剂和第二萃取试剂进行萃取，离心后加入复溶液II混匀，得到检测25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的标准溶液II；所述溶血试剂中含有内标工作液II；
S12’、利用高效液相色谱-质谱联用分别对所述标准溶液II进行检测；
S13’、以上述至少三个标准溶液的25羟基维生素D3、25羟基维生素D2峰面积与内标物峰面积的比值作为纵坐标，以标准溶液中25羟基维生素D3、25羟基维生素D2的浓度与内标物浓度之比作为横坐标，制作得到所述标准曲线方程II。
可选的，所述内标工作液I中维生素A同位素内标物的含量为1mg/L，维生素E同位素内标物的浓度为10mg/L；
所述内标工作液II中25羟基维生素D2内标物的含量为62.5ng/mL，25羟基维生素D3内标物的浓度为200ng/mL。
可选的，所述内标工作液I采用无水乙醇配制；优选的，配制方法包括：
s1、无水乙醇配制维生素A同位素内标物含量为10000mg/L的标准储备液A；-80℃保存；
s2、无水乙醇配制维生素E同位素内标物含量为1000mg/L的标准储备液B，-80℃保存；
s3、将所述标准储备液A和所述标准储备液B用无水乙醇稀释，得到含维生素A同位素内标物含量为1mg/L和维生素E同位素含量为10mg/L的内标工作液I，-80℃保存；
所述内标工作液II采用体积比为7：3的甲醇：水配制；优选的，配制方法为：
s1、无水甲醇配制25羟基维生素D3内标物浓度为100000ng/mL标准储备液C，-80℃保存；
s2、取浓度为100μg/mL的25-羟维生素D2内标物标准品溶液；
s3、将所述25-羟维生素D2-d3标准品溶液和所述标准储备液C，用体积比为7：3的甲醇：水稀释，得到内标工作液II，-80℃保存。
可选的，检测维生素A和维生素E时：所述若干个干血纸片上负载至少负载16μL全血；
检测25羟基维生素D3和25羟基维生素D2时：所述若干个干血纸片上负载至少负载19.2μL全血。
可选的，在检测维生素A、维生素E时：至少负载16μL全血的干血纸片加入所述溶血试剂100～300μL、优选200μL，依次加入所述第一萃取试剂100～300μL、优选200μL、所述第二萃取试剂200～600μL、优选400μL；萃取结束后取上清300～400μL、优选350μL，加所述复溶液I 50～150μL、优选100μL；
优选的，加入所述溶血试剂先涡旋10～20min、优选15min，然后超声3～8min、优选5min；加入所述第一萃取试剂涡旋20～40秒、优选30秒，加入所述第二萃取试剂涡旋3～8min、优选5min；
更优选的，所述超声的功率为40～80W、优选60W，所述超声的温度为15～25℃；
更进一步优选的，所述涡旋的转速为1500～2500rpm，优选2000rpm。
可选的，在S2中检测25羟基维生素D3和25羟基维生素D2、在S11’中检测空白纸片时；至少负载19.2μL全血的干血纸片或空白纸片中加入所述溶血试剂100～300μL、优选200μL，依次加入所述第一萃取试剂100～300μL、优选200μL、所述第二萃取试剂1000～1400μL、优选1200μL；萃取结束后取上清800～1200μL、优选1000μL，加所述复溶液II 50～150μL、优选100μL；
优选的，加入所述溶血试剂先静置15～25min、优选20min，涡旋3～8min、优选5min，超声3～8min、优选5min；加入所述第一萃取试剂涡旋2～5min、优选3min、加入所述第二萃取试剂涡旋3～8min、优选5min；
更优选的，超声的功率为40～80W、优选60W，所述超声的温度为15～25℃；
更进一步优选的，所述静置后涡旋的转速为500～1500rpm、优选1000rpm，加入所述第一萃取试剂、所述第二萃取试剂后涡旋的转速为1500～2500rpm、优选2000rpm。
可选的，通过高效液相色谱-质谱联用分别对所述待测样本I或标准溶液I进行检时：
分析色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB系列C8液相色谱柱，2.1×50mm，5μm；柱温：28℃；进样量：5μL；
分析色谱柱流动相：A相为纯甲醇，B相为纯水；
分析色谱柱流速：0.2mL/min，
分析色谱柱采用梯度洗脱方式，梯度洗脱条件为：
0～1min，85％A，15％B；
1.01～3min，95％A，5％B；
3.01～5.5min，85％A，15％B；
所述质谱检测器为ESI(+)检测模式，质谱参数为：
离子源温度：350℃；
雾化气气流：10L/min；
雾化气：28psi；
毛细管电压：4000V(+)；
电子倍增器电压：400V。
可选的，通过高效液相色谱-质谱联用分别对所述待测样本II或所述标准溶液II进行检测：
色谱柱为Agilent ZORBAX Extend C18液相色谱柱，2.1mm×50mm，1.8μm，柱温：28℃；进样量：20μL；
分析色谱柱流动相：A相为含有甲酸的水；B相为含有甲酸和乙酸铵的甲醇；优选的，A相中甲酸的体积百分比浓度为0.1％，B相中甲酸的体积百分比浓度为0.1％、乙酸铵的浓度为2.5mM；
分析色谱柱流速：0.3mL/min，
分析色谱柱采用梯度洗脱方式，梯度洗脱条件为：
0～3.2min，15％A，85％B；
3.21～5min，2％A，98％B；
5.01～7min，15％A，85％B；
质谱检测器为ESI(+)检测模式，质谱参数为：
雾化气温度：350℃，
雾化气气流：5L/min，
鞘气温度：350℃，
鞘气流速：11L/min，
雾化气：45psi，
毛细管电压：3500V(+)，
电子倍增器电压：400V。
本发明还提出一种液相色谱串联质谱检测干血纸片中脂溶性维生素含量的试剂盒，至少包括试剂组合I和/或试剂组合II；
所述试剂组合I用于检测维生素A和维生素E含量，至少包括：
(1)内标工作液I；
(2)溶血试剂；
(3)第一萃取试剂；
(4)第二萃取试剂；
(5)复溶液I；
所述试剂组合II用于检测25羟基维生素D3和25羟基维生素D2含量，至少包括：
(1)内标工作液II；
(2)溶血试剂；
(3)第一萃取试剂；
(4)第二萃取试剂；
(5)复溶液II；
所述内标工作液I中含有维生素A和维生素E的同位素内标物；所述内标工作液II中含有25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的同位素内标物；
所述溶血试剂为纯水；
所述第一萃取试剂为无水乙醇；
所述第二萃取试剂为正己烷；
所述复溶液I为无水甲醇；
所述复溶液II为含有0.1v/v％甲酸的70v/v％的甲醇溶液；
优选的，所述试剂组合I还包括：
分析色谱柱流动相：A相为纯甲醇，B相为纯水；
优选的，所述试剂组合II还包括：
分析色谱柱流动相：A相为含有甲酸的水；B相为含有甲酸和乙酸铵的甲醇；优选的，A相中甲酸的体积百分比浓度为0.1％，B相中甲酸的体积百分比浓度为0.1％、乙酸铵的浓度为2.5mM。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本发明的干血纸片中脂溶性维生素含量的检测方法及试剂盒检测进一步降低了检测限和定量限，具体如下表1所示，降低了最低样本量；并且本发明检测方法的重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。
表1
Figure BDA0003562533460000071
附图说明
图1为采用本发明实施例方法检测某一浓度标准溶液I中VA和VE色谱图；
图2为采用本发明实施例方法检测质控样本中VA和VE色谱图；
图3为采用本发明实施例方法检测某一浓度标准溶液II中VD3和VD2色谱图；
图4采用本发明实施例方法检测质控样本中VD3和VD2色谱图；
其中，横坐标“Counts vs.Acquisiton Time(min)”表示的含义为“计数与采集时间(分钟)”。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本公开的上述目的、特征和优点，下面将对本公开的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本公开，但本公开还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本公开的一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例提出一种干血纸片中脂溶性维生素含量的检测方法，脂溶性维生素包括维生素A、维生素E和维生素D，维生素D包括25羟基维生素D2和25羟基维生素D3两种形式。由于维生素A、维生素E和维生素D对分析条件的要求有细微差别，为了进一步提高维生素AED的准确度、降低检测限，本发明实施例提出将维生素A、维生素E与25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3分别进行检测的检测方式。具体可根据检测的需要进行选择同时检测四种脂溶性维生素含量，或仅检测维生素A和维生素E，或仅检测25羟基维生素D2和25羟基维生素D3。检测方式更加灵活，避免无效检测。
在本发明实施例中，维生素A、维生素E的检测方法为：
S1、获得标准曲线方程I；
S2、样本前处理：将若干个干血纸片加入含有溶血试剂中混匀，依次加入第一萃取试剂和第二萃取试剂进行萃取，离心后加入复溶液I混匀，得到检测维生素A和维生素E的待测样本I；溶血试剂中添加有内标工作液I；
其中，内标工作液I采用无水乙醇配制，含有维生素A和维生素E的同位素内标物；溶血试剂为纯水；第一萃取试剂为无水乙醇；第二萃取试剂为正己烷；复溶液I为无水甲醇；
S3、利用高效液相色谱-质谱联用分别对待测样本I进行检测，通过所述标准曲线方程I获得维生素A、维生素E的浓度。
本发明实施例优选的实施方式中，获得标准曲线方程I包括：
S11、以同位素标记的维生素A和同位素标记的维生素E为内标物，制备至少三种含有不同浓度维生素A、维生素E的标准溶液I；
S12、利用高效液相色谱-质谱联用分别对标准溶液I进行检测；该步骤可与待测样本检测同时进行；
S13、以上述至少三个标准溶液的维生素A、维生素E峰面积与内标物峰面积的比值作为纵坐标，以标准溶液中维生素A、维生素E的浓度与内标物浓度之比作为横坐标，制作得到标准曲线I。
本发明实施例经锐意研究发现，在检测通维生素A和维生素E时，过上述前处理方式对干血纸片进行前处理，准确度可以控制在90～115％之间，同时检测样本的干血纸片上负载16μL全血即可满足检测需要。本发明实施例通过筛选实验发现，第一萃取剂采用无水乙醇，检测的准确度高于使用其他有机溶剂，例如甲醇等。第二萃取剂采用正己烷，检测的准确度也高于使用其他有机溶剂。
本发明实施例对前处理的步骤和条件进行了进一步的研究，负载16μL全血的干血纸片加入溶血试剂100～300μL、优选200μL，依次加入第一萃取试剂100～300μL、优选200μL、第二萃取试剂200～600μL、优选400μL；萃取结束后取上清300～400μL、优选350μL，加复溶液I 50～150μL、优选100μL。
如果溶血试剂、第一萃取试剂、第二萃取试剂的添加量过大，不仅造成试剂的浪费，还会增加氮吹的时间；如果上述试剂的添加量太少，不能保证目标物的萃取效果。本发明实施例通过筛选实验发现，溶血试剂、第一萃取试剂、第二萃取试剂采用其他比例，均会对检测的准确性带来不利的影响。
本发明实施例进一步优选的实施方式中，加入溶血试剂先涡旋10～20min、优选15min，然后超声3～8min、优选5min；加入第一萃取试剂涡旋20～40秒、优选30秒，加入第二萃取试剂涡旋3～8min、优选5min；如果涡旋、超声时间太长会增加前处理时间，但是结果上没有太大突破，如果涡旋、超声时间太短，不能保证目标物的提取和萃取效果，既保证目标物提取和萃取效果，又尽量缩短前处理时间，提高检测效率。
更优选的，超声的功率为40～80W、优选60W，温度为常温；涡旋的转速为1500～2500rpm，优选2000rpm。
本发明实施例中，内标工作液I中维生素A同位素内标物的含量为1mg/L，维生素E同位素内标物的浓度为10mg/L。内标工作液I采用无水乙醇配制可以使内标的稳定性更好。维生素A同位素内标物可选用氘代维生素A(VA-d6)；维生素E同位素内标物可选用氘代维生素E(VE-d6)。具体的，内标工作液I的配制方法为：
s1、无水乙醇配制维生素A同位素内标物含量为10000mg/L的标准储备液A；-80℃保存；
s2、无水乙醇配制维生素E同位素内标物含量为1000mg/L的标准储备液B，-80℃保存；
s3、将标准储备液A和标准储备液B用无水乙醇稀释，得到含维生素A同位素内标物含量为1mg/L和维生素E同位素含量为10mg/L的内标工作液I，-80℃保存。
本发明实施例的S3中，通过高效液相色谱-质谱联用对待测样本I和标准溶液I进行检时：
色谱条件具体为：
分析色谱柱采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB系列C8液相色谱柱，具体参数为：2.1×50mm，5μm；柱温：28℃；进样量：5μL；
分析色谱柱流动相：A相为纯甲醇，B相为纯水；
分析色谱柱流速：0.2mL/min；
分析色谱柱采用梯度洗脱方式，梯度洗脱条件为：
0～1min，85％A，15％B；
1.01～3min，95％A，5％B；
3.01～5.5min，85％A，15％B。
选择该流动相和该梯度洗脱方式可以保证目标物与杂质有很好的分离；并且可以尽可能缩短分析时间，保证检测效率。本发明实施例通过筛选实验发现，如不采用该梯度洗脱条件，会对检测的准确性带来不利的影响。质谱条件具体为：
质谱检测器为ESI(+)检测模式：
离子源温度：350℃；
雾化气气流：10L/min；
雾化气：28psi；
毛细管电压：4000V(+)；
电子倍增器电压：400V。
在本发明实施例中，25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3的检测方法为：
S1、获得25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3的标准曲线方程II；
S2、将若干个干血纸片加入溶血试剂中混匀，依次加入第一萃取试剂和第二萃取试剂进行萃取，离心后加入复溶液II混匀，得到检测25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的待测样本II；溶血试剂中含有内标工作液II；
其中：内标工作液II中含有25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的同位素内标物；溶血试剂为纯水；第一萃取试剂为无水乙醇；第二萃取试剂为正己烷；复溶液II为含有0.1v/v％甲酸的70v/v％的甲醇水溶液；
S3、利用高效液相色谱-质谱联用分别对待测样本II进行检测，通过标准曲线方程II获得25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的浓度。
本发明实施例经锐意研究发现，通过本发明实施例中的前处理方式对干血纸片进行前处理，可以保证回收率在90～110％之间。检测样本的干血纸片上负载19.2μL全血即可满足检测需要。
本发明实施例优选的实施方式中，获得标准曲线方程II包括：S11’、将至少三种不同浓度的标准工作液滴到空白纸上，静置后打孔得到空白纸片，加入溶血试剂中混匀，依次加入第一萃取试剂和第二萃取试剂进行萃取，离心后加入复溶液II混匀，得到检测25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的标准溶液II；所述溶血试剂中含有内标工作液II；
S12’、利用高效液相色谱-质谱联用分别对标准溶液II进行检测；
S13’、以上述至少三个标准溶液的25羟基维生素D3、25羟基维生素D2峰面积与内标物峰面积的比值作为纵坐标，以标准溶液中25羟基维生素D3、25羟基维生素D2的浓度与内标物浓度之比作为横坐标，制作得到标准曲线方程II。
本发明实施例优选的实施方式中，述内标工作液II采用体积比为7：3的甲醇：水配制。
配制方法具体为：
s1、无水甲醇配制25羟基维生素D3内标物浓度为100000ng/mL标准储备液C，-80℃保存；
s2、取浓度为100μg/mL的25-羟维生素D2内标物标准品溶液；
s3、将所述25-羟维生素D2-d3标准品溶液和所述标准储备液C，用体积比为7:3的甲醇：水稀释，得到内标工作液II，-80℃保存。
本发明实施例对前处理的步骤和条件进行了进一步的研究，至少负载19.2μL全血的干血纸片或空白纸片中加入溶血试剂100～300μL、优选200μL，依次加入第一萃取试剂100～300μL、优选200μL、第二萃取试剂1000～1400μL、优选1200μL；萃取结束后取上清800～1200μL、优选1000μL，加复溶液II 50～150μL、优选100μL。如果溶血试剂、第一萃取试剂、第二萃取试剂的添加量过大，不仅造成试剂的浪费，还会增加氮吹的时间；如果上述试剂的添加量太少，则不能保证目标物的萃取效果。
本发明实施例进一步优选的实施方式中，加入溶血试剂先静置15～25min、优选20min，涡旋3～8min、优选5min，超声3～8min、优选5min；加入第一萃取试剂涡旋2～5min、优选3min，加入第二萃取试剂涡旋3～8min、优选5min。先静置是为了保证目标物从血纸片中提取和释放出来。如果涡旋、超声时间太长会增加前处理时间，但结果上没有太大突破；如果涡旋、超声时间太短，则不能保证目标物的提取和萃取效果。本发明实施例的前处理条件既可保证目标物提取和萃取效果，又尽量缩短了前处理时间，提高检测效率。
超声步骤的添加可以进一步促进血液成分从干纸片上溶出，提高提取效果。超声的功率为40～80W、优选60W，超声处理时的温度为常温。进一步优选的，静置后涡旋的转速选用低转速，优选为500～1500rpm、优选1000rpm。涡旋采用低转速的目的是为了保证提取试剂与血纸片有足够的接触时间，从而更好的保证提取效果。如果转速太大，会产生很多泡沫，从而影响提取效果。
加入第一萃取试剂、第二萃取试剂后涡旋的转速选用高转速，优选为1500～2500rpm、更优选2000rpm。萃取时候采用高转速是为了保证萃取试剂与目标物的充分混匀，从容保证萃取效率。
本发明实施例优选的实施方式中，内标工作液II中25羟基维生素D2内标物的含量为62.5ng/mL，25羟基维生素D3内标物的浓度为200ng/mL。内标工作液II采用体积比为7：3的甲醇：水配制，既可以保证内标可以充分溶解，又可以保证内标长期储存的稳定性，目前内标在此条件下储存6个月内稳定。
25羟基维生素D2同位素内标物可选用氘代25羟基维生素D2(25-羟维生素D2-d3)；25羟基维生素D3同位素内标物可选用氘代25羟基维生素D2(25-羟维生素D3-d6)。优选的，配制方法为：
s1、无水甲醇配制25羟基维生素D3内标物浓度为100000ng/mL标准储备液C，-80℃保存；
s2、取浓度为100μg/mL的25-羟维生素D2内标物标准品溶液；
将所述25-羟维生素D2-d3标准品溶液和所述标准储备液C，用体积比为7:3的甲醇：水稀释，得到内标工作液II，-80℃保存。
本发明实施例的S3中，通过高效液相色谱-质谱联用对待测样本II或标准溶液II进行检测时：
分析色谱柱为Agilent ZORBAX Extend C18液相色谱柱，具体参数为：2.1mm×50mm，1.8μm；柱温：28℃；进样量：20μL；
分析色谱柱流动相：A相为含有甲酸的水；B相为含有甲酸和乙酸铵的甲醇；优选的，A相中甲酸的体积百分比浓度为0.1％，B相中甲酸的体积百分比浓度为0.1％、乙酸铵的浓度为2.5mM。本发明实施例通过研究发现，选用该特定流动相可保证目标物与杂质的有效分离。
分析色谱柱流速：0.3mL/min，
分析色谱柱采用梯度洗脱方式，梯度洗脱条件为：
0～3.2min，15％A，85％B；
3.21～5min，2％A，98％B；
5.01～7min，15％A，85％B。
本发明实施例通过研究发现，采用该梯度洗脱方式既能保证目标物与杂质的有效分离，又能保证分析时间较短，从而保证检测效率。本发明实施例通过筛选实验发现，如不采用该梯度洗脱条件，会对检测的准确性带来不利的影响。
质谱条件具体为：
质谱检测器为ESI(+)检测模式：离子源温度：350℃，雾化气气流：5L/min，鞘气温度：350℃，鞘气流速：11L/min，雾化气：45psi，毛细管电压：3500V(+)，电子倍增器电压：400V。
实施例1
本实施例用以说明本发明实施例的维生素A和维生素E的检测方法。
一、标准溶液的标定
首先用移液器将至少三种不同浓度的标准工作液90μL、10μL内标工作液分别置于1.5mL离心管中混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为2000rpm涡旋混匀30s后，使用液相色谱质谱联用仪器对上述标准溶液进行检测，得出上述至少三种标准溶液的维生素A、维生素E和内标色谱图，以上述至少三个标准溶液的维生素A、维生素E峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中维生素A、维生素E的浓度与内标浓度之比作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，得到权重系数a和b。
(1)标准工作液的配制：
视黄醇标准品溶液：标准品溶液(100mg/L)，开封后，立即使用。
混合标准品工作液的配制：
1.1视黄醇标准溶液经乙醇稀释得到8mg/L的溶液Α；
1.2α-生育酚储备液经乙醇稀释得到80mg/L的溶液B；
1.3取微量移液器(量程：100～1000μL)，准确吸取溶液Α和溶液B各500μL于1.5mL离心管中，标记L7，1500r/min涡旋混匀1min，其中视黄醇的浓度为4.0mg/L，α-生育酚的浓度为40.0mg/L；
1.4取6支1.5mL离心管，分别编号为L6到L1，取微量移液器(量程：100～1000μL)，吸取500μL乙醇加入L6到L1；
1.5吸取L7工作液500μL，加入L6管，1500r/min涡旋混匀1min；
1.6吸取L6工作液500μL，加入L5管，1500r/min涡旋混匀1min；
1.7吸取L5工作液500μL，加入L4管，1500r/min涡旋混匀1min；
1.8吸取L4工作液500μL，加入L3管，1500r/min涡旋混匀1min；
1.9吸取L3工作液500μL，加入L2管，1500r/min涡旋混匀1min；
1.10吸取L2工作液500μL，加入L1管，1500r/min涡旋混匀1min；
1.11计算各管浓度值，得到视黄醇：0.0625mg/L、0.125mg/L、0.25mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L的标准品工作液，α-生育酚：0.625mg/L、1.25mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的标准品工作液。混合标准品工作液现用现配，无需保存。
(2)内标工作液的配制：
2.1精确称取维生素A同位素内标10mg，用1mL无水乙醇溶解，得到标准储备液A(10000mg/L)，-80℃保存，有效期3个月。
2.2用1mL无水乙醇溶解维生素E同位素内标1mg，得到标准储备液B(1000mg/L)，-80℃保存，有效期3个月。
2.3标准储备液A和标准储备液B用无水乙醇稀释，得到含维生素A同位素内标1mg/L和维生素E同位素10mg/L的内标工作液，-80℃保存，有效期3个月。
二、检测血纸片制备
采血针采集鲜血，直接滴成血点，血片在避光通风处晾干。干血纸片置于-80℃冰箱避光保存。
三、待测样品处理
3.1用移液枪移取内标工作液10μL于1.5mL离心管中，然后加入5个干血纸片点，纯水200μL，涡旋15min(2000rpm)，超声5min(常温，60W)，加入第一萃取试剂：无水乙醇200μL，混匀30s(2000rpm)，加入第二萃取试剂：正己烷400μL，充分混匀5min(2000rpm)，高速离心10min(4℃，15000rpm)，取上清液350μL，常温N2(流量：0.01MPa)吹干，加复溶液I：无水甲醇100μL，混匀1min(2000r pm)，取80μL液至内插管，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述洗脱液进行检测。
四、待测样品的检测
移取待测样品80μL，使用液相色谱质谱联用仪对上述步骤待测样品进行检测，进样量为5μL，得出上述待测的样品中维生素A、维生素E和内标色谱图；将上述色谱图中维生素A、维生素E峰面积与内标物峰面积之比y代入标准曲线方程y＝a*x+b中，通过计算得到待检测样品中维生素A、维生素E浓度与对应内标浓度之比x，内标工作液中每个物质的浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中维生素A、维生素E浓度。
高效液相色谱质谱联用仪为安捷伦；型号/规格：LC-1260/MS6410B高效液相色谱质谱联用仪，所使用的分析色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8 2.1×50mm，5μm，设置柱温为28℃，进样量为5μL，分析色谱柱流动相为纯水和纯甲醇，分析色谱柱流速为0.2mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式；梯度洗脱条件为如表2所示：
表2
Time/min 甲醇/％ 纯水/％
0 85 15
1 85 15
1.01 95 5
3 95 5
3.01 85 15
5.50 85 15
质谱检测器为ESI(+)检测模式，所述质谱参数为：Gas Temp：350℃，Gas Flow：10L/min，Nebuliaer：28psi，Capillary：4000V(+)。EMV：400V。保留时间及条件如表3所示。
表3
物质名称 保留时间/min 母离子 子离子
VA 1.36 269.2 213.2
IS/VA 1.36 272.2 216.2
VE 3.77 430.4 165.1
IS/VE 3.77 436.4 171.1
采用本发明实施例方法检测某一浓度标准溶液I中VA和VE色谱图如图1所示，检测质控样本中VA和VE色谱图如图2所示，质控样本为阴性血液样本的纸血片。
实施例2
本实施例用以说明本发明实施例的维生素D的检测方法。
一、标准溶液的标定
首先用移液器将至少三种不同浓度的标准工作液10μL于血纸片采集卡上静置10min，将整个采血点全部打下于2.0mL离心管中，加入内标工作液10μL，纯水200μL，静置20min，涡旋5min(1000rpm)，超声5min(常温，60W)，加入无水乙醇200μL，混匀3min(2000rpm)，加入正己烷1200μL，充分混匀5min(2000rpm)，高速离心10min(常温，14000rpm)，取上清液1000μL，常温N2(流量：0.01MPa)吹干，加复溶液甲醇：水＝7：3(含0.1％甲酸)100μL，混匀1min(2000rpm)，取80μL液至内插管，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述溶液进行检测，得出上述至少三种标准溶液的25羟基维生素D2、25羟基维生素D3和内标色谱图，以上述至少三个标准溶液的25羟基维生素D2、25羟基维生素D3峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中25羟基维生素D2、25羟基维生素D3的浓度与内标浓度之比作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b。
(1)标准工作液的配制：
羟基维生素D2标准品溶液：标准品溶液(100μg/mL)，开封后，立即使用。
25羟基维生素D3标准品溶液：标准品溶液(50μg/mL)，开封后，立即使用。
标准品工作液的配制：
1.1、取标准品母液各1支，室温下放置30min，平衡至室温；
1.2、取1.5mL离心管2支，标记为B、C管；
1.3、取微量移液器(量程：10～100μL)，准确吸取20μL25-羟基维生素D2母液于B管中；
1.4、取微量移液器(量程：10～100μL)，准确吸取32μL25-羟基维生素D3母液于B管中，
1.5、取微量移液器(量程：100～1000μL)准确吸取980μL甲醇：水＝7:3至B管中，准确吸取968μL甲醇：水＝7：3至C管中，涡旋混匀1min，得到中间液25-羟基维生素D2浓度为1000ng/mL，25-羟基维生素D3浓度为3200ng/mL。
1.6、取1.5mL离心管一支，标记为L8管；
1.7、取微量移液器(量程：100～1000μL)，准确吸取中间液各500μL于L8管中，1500r/min涡旋混匀1min，即得标曲工作液浓度最高点，其中25-羟维生素D2的浓度为500ng/mL，25-羟维生素D3的浓度为1600ng/mL；按照稀释比例，计算各管浓度值，标准品工作液现用现配，无需保存。
25-羟维生素D2各标曲点浓度分别3.90625ng/mL、7.8125ng/mL、15.625ng/mL、31.25ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL；25-羟维生素D3各标曲点浓度分别12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1600ng/mL。
(b)内标工作液的配制：
25-羟维生素D2-d3标准品溶液：标准品溶液(100μg/mL)，开封后，立即使用。
取25-羟维生素D3-d6标准品1支，规格为0.5mg，向瓶中加入1mL甲醇充分溶解，转移到容量瓶中，定容至5mL，得到25-羟维生素D3-d6的内标储备液浓度为100000ng/mL。-80℃保存。
用甲醇：水＝7：3稀释，得到含25-羟维生素D2-d3浓度为62.5ng/mL和25-羟维生素D3-d6浓度为200ng/mL的内标工作液，-80℃保存，有效期6个月。
二、检测血纸片制备
采血针采集鲜血，直接滴成血点，血片在避光通风处晾干，干血纸片置于-80℃冰箱避光保存。
三、待测样品处理
用移液枪移取步骤(b)中所述内标工作液10μL于2.0mL离心管中，然后加入步骤(二)中加6个干血纸片点约19.2μL全血，纯水200μL，静置20min，涡旋5min(1000rpm)，超声5min(常温，60W)，加入无水乙醇200μL，混匀3min(2000rpm)，加入正己烷1200μL，充分混匀5min(2000rpm)，高速离心10min(常温，14000rpm)，取上清液1000μL，常温N2(流量：0.01MPa)吹干，加复溶液甲醇：水＝7：3(含0.1％甲酸)100μL，混匀1min(2000rpm)，取80μL液至内插管，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述洗脱液进行检测。
四、待测样品的检测
移取待测样品80μL，使用液相色谱质谱联用仪对上述步骤待测样品进行检测，进样量为20μL，得出上述待测的样品中25羟基维生素D2、25羟基维生素D3的浓度和内标色谱图；将上述色谱图中25羟基维生素D2、25羟基维生素D3的浓度峰面积与内标物峰面积之比y代入标准曲线方程y＝a*x+b中，通过计算得到待检测样品中25羟基维生素D2、25羟基维生素D3的浓度与对应内标浓度之比x，内标工作液中每个物质的浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中25羟基维生素D2、25羟基维生素D3的浓度。
高效液相色谱质谱联用仪为安捷伦；型号/规格：LC-1260/MS6470A高效液相色谱质谱联用仪，所使用的分析色谱柱为Agilent ZORBAX Extend C18，1.8μm，2.1mm×50mm，设置柱温为28℃，进样量为20μL，分析色谱柱流动相为水(0.1％FA)和甲醇(2.5mM乙酸铵+0.1％FA)，分析色谱柱流速为0.3mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式。
梯度洗脱条件如表4所示：
表4
Time/min 流速mL/min 水(0.1％FA)/％ 甲醇(2.5mM NH<sub>4</sub>AC+0.1％FA)/％
0 0.3 15 85
3.2 0.3 15 85
3.21 0.3 2 98
5 0.3 2 98
5.01 0.3 15 85
7 0.3 15 85
质谱检测器为ESI(+)检测模式，质谱参数为：Gas Temp：350℃，Gas Flow：5L/min，Sheath Gas Temp：350℃，Sheath Gas Flow：11L/min，Nebuliaer：45psi，Capillary：3500V(+)。EMV：400V。保留时间及条件如表5所示。
表5
物质名称 保留时间/min 母离子 子离子 Dwell Fragmentor CE CAV
25-OH-VD2 2.75 413.3 337.2 100 100 5 3
25-OH-VD3 2.51 401.3 365.3 100 110 8 7
25-OH-VD2-d3 2.75 416.3 340 100 100 5 3
25-OH-VD3-d6 2.51 407.3 371.3 100 110 8 7
采用本发明实施例方法检测某一浓度标准溶液I中VD3和VD2色谱图如图3所示，检测质控样本中VD3和VD2色谱图如图4所示，质控样本为阴性血液样本的纸血片。
实施例3
本实施例提出液相色谱串联质谱检测干血纸片中脂溶性维生素物含量的试剂盒。试剂盒的组成如表6所示：
表6
Figure BDA0003562533460000201
实验例1
本实验例用以说明本发明实施例的维生素A和维生素E的检测方法的线性关系和定量限。
用L1点逐级稀释，进样分析，计算信噪比，信噪比＝10:1时的相应浓度确定为定量限。
(1)检测限(LOD)：维生素A：6.0ng/mL；维生素E：0.3ng/mL。
(2)定量限(LOQ)：维生素A：18ng/mL；维生素E：1ng/mL。
(3)线性范围：维生素A在0.009mg/L到0.576mg/L范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9990；维生素E在0.09mg/L到5.76mg/L范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9990。
上述验证试验说明本发明实施例检测方法的检测限低，灵敏度高，线性良好。
实验例2
本实验例用以说明本发明实施例的维生素A和维生素E的检测方法的该方法的回收率和精密度。
干血纸片样本：5张干血纸片(约为16μL全血)+5张空白纸片+16μL无水乙醇+10μL内标；
加标样本：5张干血纸片(约为16μL全血)+5张空白纸片+16μL标准品(分别为L2、L4、L6点)+10μL内标。
按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度分别如表7所示。
表7
Figure BDA0003562533460000211
如表7所示，维生素A、维生素E在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为91.35％～104.93％，相对标准偏差为4.90％～13.18％。说明本发明实施例检测方法的回收率和精密度高，重现性良好，加样回收率高，显著提高了检测结果的准确度。
实验例3
本实验例用以说明本发明实施例的维生素D的检测方法的线性关系和定量限。
用L1点逐级稀释，进样分析，计算信噪比，信噪比＝10:1时的相应浓度确定为定量限。
(1)检测限(LOD)：25羟基维生素D2：0.13ng/mL；25羟基维生素D3：0.42ng/mL。
(2)定量限(LOQ)：25羟基维生素D2：0.39ng/mL；25羟基维生素D3：1.25ng/mL。
(3)线性范围：25羟基维生素D2在0.39ng/mL到50ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9990；25羟基维生素D3在1.25ng/mL到160ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9990。
上述验证试验说明本发明实施例检测方法的检测限低，灵敏度高，线性良好。
实验例4
本实验例用以说明本发明实施例的维生素D的检测方法的回收率和精密度。
干血纸片样本：6张干血纸片(约为19.2μL全血)10μL内标；
加标样本：6张加标(分别为L2、L5、L7点)干血纸片(约为16μL全血)+10μL内标。
按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度分别如表8所示。
表8
Figure BDA0003562533460000221
如表8所示，25羟基维生素D2、25羟基维生素D3在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为91.76％～102.26％，相对标准偏差为1.12％～6.41％。说明本发明实施例检测方法的回收率和精密度高，重现性良好，加样回收率高，显著提高了检测结果的准确度。
对比例1
获得标准曲线方程II的方法为：
1、以同位素标记的25羟基维生素D3和同位素标记的25羟基维生素D2为内标物，制备至少三种不同25羟基维生素D3、25羟基维生素D2浓度的标准溶液II；
2、利用高效液相色谱-质谱联用分别对所述标准溶液II进行检测；
3、以上述至少三个标准溶液的25羟基维生素D3、25羟基维生素D2峰面积与内标物峰面积的比值作为纵坐标，以标准溶液中25羟基维生素D3、25羟基维生素D2的浓度与内标物浓度之比作为横坐标，制作得到标准曲线方程II。
按照实验例4的方法检测回收率，得到实验结果如表9所示。
表9
Figure BDA0003562533460000231
如表9可知，如果标准曲线方程II制备时不加入空白血纸片同步前处理，VD3和VD2的回收率只有70％左右，回收率不合格，不能满足定量检测的要求。
对比例2
按照实施例2方法进行检测，区别在于溶血试剂为甲醇。然后按照实验例4的方法检测回收率，得到实验结果如表10所示。
表10
Figure BDA0003562533460000232
如表10可知，检测25-OH维生素D2和25-OH维生素D3溶血试剂用甲醇的话，回收率不合格，VD3和VD2的回收率只有70％左右，不能满足定量检测的要求。
以上所述仅是本公开的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本公开。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本公开的范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本公开将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种干血纸片中脂溶性维生素含量的检测方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
S1、分别获得维生素A、维生素E的标准曲线方程I或25羟基维生素D3、25羟基维生素D2标准曲线方程II；
S2、将若干个干血纸片加入溶血试剂中混匀，依次加入第一萃取试剂和第二萃取试剂进行萃取，离心后加入复溶液I混匀，得到检测维生素A和维生素E的待测样本I；所述溶血试剂中含有内标工作液I；
或，将若干个干血纸片加入溶血试剂中混匀，依次加入第一萃取试剂和第二萃取试剂进行萃取，离心后加入复溶液II混匀，得到检测25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的待测样本II；所述溶血试剂中含有内标工作液II；
优选的，加入所述溶血试剂后，进行涡旋和超声处理；
其中：
所述内标工作液I采用无水乙醇配制，含有维生素A和维生素E的同位素内标物；所述内标工作液II中含有25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的同位素内标物；
所述溶血试剂为纯水；
所述第一萃取试剂为无水乙醇；
所述第二萃取试剂为正己烷；
所述复溶液I为无水甲醇；
所述复溶液II为含有0.1v/v％甲酸的70v/v％的甲醇水溶液；
S3、利用高效液相色谱-质谱联用分别对所述待测样本I或待测样本II进行检测，通过所述标准曲线方程I获得维生素A、维生素E的浓度，通过所述标准曲线方程II获得25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的浓度。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
所述获得维生素A、维生素E的标准曲线方程I包括：
S11、以同位素标记的维生素A和同位素标记的维生素E为内标物，制备至少三种含有不同浓度维生素A、维生素E的标准溶液I；
S12、利用高效液相色谱-质谱联用分别对所述标准溶液I进行检测；
S13、以上述至少三个标准溶液的维生素A、维生素E峰面积与内标物峰面积的比值作为纵坐标，以标准溶液中维生素A、维生素E的浓度与内标物浓度之比作为横坐标，制作得到所述标准曲线方程I；
所述获得25羟基维生素D3、25羟基维生素D2标准曲线方程II包括：
S11’、将至少三种不同浓度的标准工作液滴到空白纸上，静置后打孔得到空白纸片，加入溶血试剂中混匀，依次加入第一萃取试剂和第二萃取试剂进行萃取，离心后加入复溶液II混匀，得到检测25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的标准溶液II；所述溶血试剂中含有内标工作液II；
S12’、利用高效液相色谱-质谱联用分别对所述标准溶液II进行检测；
S13’、以上述至少三个标准溶液的25羟基维生素D3、25羟基维生素D2峰面积与内标物峰面积的比值作为纵坐标，以标准溶液中25羟基维生素D3、25羟基维生素D2的浓度与内标物浓度之比作为横坐标，制作得到所述标准曲线方程II。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
所述内标工作液I中维生素A同位素内标物的含量为1mg/L，维生素E同位素内标物的浓度为10mg/L；
所述内标工作液II中25羟基维生素D2内标物的含量为62.5ng/mL，25羟基维生素D3内标物的浓度为200ng/mL。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，
所述内标工作液I采用无水乙醇配制；优选的，配制方法包括：
s1、无水乙醇配制维生素A同位素内标物含量为10000mg/L的标准储备液A；-80℃保存；
s2、无水乙醇配制维生素E同位素内标物含量为1000mg/L的标准储备液B，-80℃保存；
s3、将所述标准储备液A和所述标准储备液B用无水乙醇稀释，得到含维生素A同位素内标物含量为1mg/L和维生素E同位素含量为10mg/L的内标工作液I，-80℃保存；
所述内标工作液II采用体积比为7：3的甲醇：水配制；优选的，配制方法包括：
s1、无水甲醇配制25羟基维生素D3内标物浓度为100000ng/mL标准储备液C，-80℃保存；
s2、取浓度为100μg/mL的25-羟维生素D2内标物标准品溶液；
s3、将所述25-羟维生素D2-d3标准品溶液和所述标准储备液C，用体积比为7：3的甲醇：水稀释，得到内标工作液II，-80℃保存。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
检测维生素A和维生素E时：所述若干个干血纸片上负载至少负载16μL全血；
检测25羟基维生素D3和25羟基维生素D2时：所述若干个干血纸片上负载至少负载19.2μL全血。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
在检测维生素A、维生素E时：至少负载16μL全血的干血纸片加入所述溶血试剂100～300μL、优选200μL，依次加入所述第一萃取试剂100～300μL、优选200μL、所述第二萃取试剂200～600μL、优选400μL；萃取结束后取上清300～400μL、优选350μL，加所述复溶液I 50～150μL、优选100μL；
优选的，加入所述溶血试剂先涡旋10～20min、优选15min，然后超声3～8min、优选5min；加入所述第一萃取试剂涡旋20～40秒、优选30秒，加入所述第二萃取试剂涡旋3～8min、优选5min；
更优选的，所述超声的功率为40～80W、优选60W，所述超声的温度为15～25℃；
更进一步优选的，所述涡旋的转速为1500～2500rpm，优选2000rpm。
7.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，
在S2中检测25羟基维生素D3和25羟基维生素D2、在S11’中检测空白纸片时；至少负载19.2μL全血的干血纸片或空白纸片中加入所述溶血试剂100～300μL、优选200μL，依次加入所述第一萃取试剂100～300μL、优选200μL、所述第二萃取试剂1000～1400μL、优选1200μL；萃取结束后取上清800～1200μL、优选1000μL，加所述复溶液II 50～150μL、优选100μL；
优选的，加入所述溶血试剂先静置15～25min、优选20min，涡旋3～8min、优选5min，超声3～8min、优选5min；加入所述第一萃取试剂涡旋2～5min、优选3min、加入所述第二萃取试剂涡旋3～8min、优选5min；
更优选的，超声的功率为40～80W、优选60W，所述超声的温度为15～25℃；
更进一步优选的，所述静置后涡旋的转速为500～1500rpm、优选1000rpm，加入所述第一萃取试剂、所述第二萃取试剂后涡旋的转速为1500～2500rpm、优选2000rpm。
8.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，通过高效液相色谱-质谱联用分别对所述待测样本I或标准溶液I进行检测：
分析色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB系列C8液相色谱柱，2.1×50mm，5μm；柱温：28℃；进样量：5μL；
分析色谱柱流动相：A相为纯甲醇，B相为纯水；
分析色谱柱流速：0.2mL/min，
分析色谱柱采用梯度洗脱方式，梯度洗脱条件为：
0～1min，85％A，15％B；
1.01～3min，95％A，5％B；
3.01～5.5min，85％A，15％B；
所述质谱检测器为ESI(+)检测模式，质谱参数为：
离子源温度：350℃；
雾化气气流：10L/min；
雾化气：28psi；
毛细管电压：4000V(+)；
电子倍增器电压：400V。
9.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，通过高效液相色谱-质谱联用分别对所述待测样本II或所述标准溶液II进行检测：
分析色谱柱为Agilent ZORBAX Extend C18液相色谱柱，2.1mm×50mm，1.8μm，柱温：28℃；进样量：20μL；
分析色谱柱流动相：A相为含有甲酸的水；B相为含有甲酸和乙酸铵的甲醇；优选的，A相中甲酸的体积百分比浓度为0.1％，B相中甲酸的体积百分比浓度为0.1％、乙酸铵的浓度为2.5mM；
分析色谱柱流速：0.3mL/min，
分析色谱柱采用梯度洗脱方式，梯度洗脱条件为：
0～3.2min，15％A，85％B；
3.21～5min，2％A，98％B；
5.01～7min，15％A，85％B；
质谱检测器为ESI(+)检测模式，质谱参数为：
雾化气温度：350℃，
雾化气气流：5L/min，
鞘气温度：350℃，
鞘气流速：11L/min，
雾化气：45psi，
毛细管电压：3500V(+)，
电子倍增器电压：400V。
10.一种液相色谱串联质谱检测干血纸片中脂溶性维生素含量的试剂盒，其特征在于，至少包括试剂组合I和/或试剂组合II；
所述试剂组合I用于检测维生素A和维生素E含量，至少包括：
(1)内标工作液I；
(2)溶血试剂；
(3)第一萃取试剂；
(4)第二萃取试剂；
(5)复溶液I；
所述试剂组合II用于检测25羟基维生素D3和25羟基维生素D2含量，至少包括：
(1)内标工作液II；
(2)溶血试剂；
(3)第一萃取试剂；
(4)第二萃取试剂；
(5)复溶液II；
所述内标工作液I中含有维生素A和维生素E的同位素内标物；所述内标工作液II中含有25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的同位素内标物；
所述溶血试剂为纯水；
所述第一萃取试剂为无水乙醇；
所述第二萃取试剂为正己烷；
所述复溶液I为无水甲醇；
所述复溶液II为含有0.1v/v％甲酸的70v/v％的甲醇溶液；
优选的，所述试剂组合I还包括：
分析色谱柱流动相：A相为纯甲醇，B相为纯水；
优选的，所述试剂组合II还包括：
分析色谱柱流动相：A相为含有甲酸的水；B相为含有甲酸和乙酸铵的甲醇；优选的，A相中甲酸的体积百分比浓度为0.1％，B相中甲酸的体积百分比浓度为0.1％，B相乙酸铵的浓度为2.5mM。
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