CN114878708B - 一种检测5种鹅膏肽类、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法 - Google Patents
一种检测5种鹅膏肽类、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供一种检测5种鹅膏肽类毒素、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法，该方法通过实验条件的优化，首次建立了超高效液相色谱‑质谱、质谱法同时测定蘑菇中3种鹅膏毒肽和2种鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺含量的方法，检测灵敏度高，回收率均值为71.8%~117%，相对标准偏差（RSD）为1.73%~9.92%，本方法的重现性和准确度均理想，满足实际样品的分析要求，为突发公共卫生事件处置提供科学依据。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种检测5种鹅膏肽类、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法。
背景技术
蘑菇属于大型真菌，包括野生食用菌和药用菌，其中少数为毒蘑菇。毒蘑菇含不同类型致害毒素。19世纪60年代，人类首次从毒蝇鹅膏菌Amanita muscaria(L.)发现有毒毒素。目前已报道了毒蘑菇含九大类毒素：鹅膏毒环肽、单甲基肼毒素、丝膜菌毒素、毒蝇碱、鹅膏蕈氨酸、鬼伞菌素、裸盖菇素和脱磷酸裸盖菇素、胃肠道刺激剂以及亚稀褶黑菇毒素。毒蘑菇毒素致毒症状分为胃肠型、神经型、溶血型、肝脏损害型、呼吸与循环衰竭型和光过敏性皮炎型等6大中毒症状。
鹅膏肽类毒素是导致蘑菇中毒死亡的主要毒素，深受人们关注，对此发展出了诸多检测方法，包括显色法，色谱质谱法，免疫检测法等。但实际应用中还存在一些问题，显色法虽然简单快速但是灵敏度低，检测对象有限。免疫检测法简单且灵敏度高，但检测毒素种类少且只能定性，应用范围有限。色谱-质谱法的效果最佳，不仅灵敏度高，检测对象广，还能定性定量。但是除了鹅膏肽类，还存在其他蘑菇毒素能够导致中毒，而目前用色谱-质谱法对鹅膏肽类及其他蘑菇毒素同时检测的方法较少。
之前的研究表明，鹅膏肽类毒素常采用反相色谱法进行保留，而神经精神型蘑菇毒素多采用亲水作用进行保留。但部分神经精神型毒素极性差异较大，具备在反相色谱上保留的能力。同时T3色谱柱比传统C18增加了极性基团修饰，显著增强对极性分子的反相保留能力，因此存在将鹅膏肽类和神经精神型毒素同时保留在反相色谱上的实验基础。在前处理部分，我们考虑了色胺类蘑菇毒素容易形成阳离子化合物而鹅膏肽类毒素易被反相保留，故主要选取具有阳离子交换和非极性双重性的固相萃取小柱作为净化材料。最终，我们建立了一种能同时检测5种鹅膏肽类(3种鹅膏毒肽和2种鬼笔毒肽)、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服发生蘑菇中毒时，蘑菇中含有多种类型毒素，常规检测方法无法覆盖检出的问题，提供一种快速有效检测食品中5种鹅膏肽类、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的定性定量检测方法。
一种5种鹅膏肽类、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的检测方法，包括如下步骤：
(1)标准溶液的配制
将α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺毒素标准品配制成标准储备液、使用液；将内标脱磷裸盖菇素-d10、蟾蜍色胺-d4配制成内标使用液。
(2)标准曲线的制作
吸取上述标准使用液适量，用空白样品基质配制成系列浓度的标准工作液，经UPLC-MS/MS分析，以5种鹅膏肽类毒素以定量离子峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线，脱磷裸盖菇素与蟾蜍色胺以定量离子峰面积与对应内标的峰面积比值为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线。
(3)样品前处理
称取蘑菇干粉样品，进行前处理，得带测定的样品，其中，前处理的方法包括：
将蘑菇干粉用甲醇超声提取，旋蒸至干，复溶；用强阳离子交换固相萃取小柱净化后，氮气吹干、定容、涡旋混匀、离心取上清，得待测定的样品。
(4)测定
a、色谱条件：
反相色谱柱：HSS T3 1.8μm,2.1×100mm或等效柱；柱温：40℃；进样体积：10μL；流动相A：含0.1％甲酸的5mmoL乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈，梯度洗脱程序如下表1。
表1梯度洗脱程序
b、质谱条件
离子源为电喷雾离子源，采用正离子模式，多离子反应监测，雾化气流量：3L/min；加热气流量：15L/min；接口温度：400℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；干燥气流量：3L/min。α-鹅膏毒肽等七种物质和2种内标的定性定量离子及碰撞能量见表2。
表2 7种蘑菇毒素及2种内标物监测的主要质谱参数
注：带*的为定量离子对
c、定量/定性测定。
进一步地，标准溶液的配制方法具体包括：
配制标准储备液：分别配制浓度为100μg/mL的α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素的标准储备溶液和浓度为250μg/mL的蟾蜍色胺-d4的标准储备溶液；
配制标准中间液：利用上述标准储备溶液分别配制浓度为10.0μg/mL的α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素、蟾蜍色胺、脱磷裸盖菇素-d10和蟾蜍色胺-d4的标准中间溶液；
配制混合标准使用液：将上述α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺标准中间溶液混合并定容，所有毒素的浓度均为1.00μg/mL，即为混合毒素标准使用溶液。将上述配制得到的脱磷裸盖菇素-d10和蟾蜍色胺-d4的标准中间溶液混合并定容，所有毒素的浓度均为1.00μg/mL，即为混合内标标准使用溶液。
进一步地，标准曲线的制作过程中，空白样品基质为不含所测蘑菇毒素的香菇样品，经上述样品前处理步骤处理后使用。
进一步地，在所述样品前处理过程中，净化材料采取强阳离子交换固相萃取小柱或混合型弱阳离子小柱、混合型阳离子萃取小柱等萃取柱，定容溶液为0.05％抗坏血酸水溶液。
进一步地，在步骤4)c中，所述定量测定具体包括：将前处理得到的待测定的样品注入UPLC-MS/MS进行测定，测得样液中目标化合物的色谱峰面积，内标化合物的色谱峰面积，根据标准工作曲线，计算样品溶液中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的浓度，再根据公式计算出样品中毒素的含量。
进一步地，在步骤4)c中，所述定性测定具体包括：前处理后得到的待测定样品中的目标化合物，以保留时间和特征离子与定量离子所对应的色谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样中目标化合物和保留时间与标准工作溶液中目标化合物保留时间的相对偏差小于20％；样品特征离子的相对丰度与浓度相当混合标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过如下表3的规定，则可判断样品中存在相应的被测物。
表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差
通过对蘑菇样品加标试验发现，蘑菇组织中含有多种蛋白，糖类和其他重要组成部分，样品提取不充分的话，会严重影响后续检测，造成待测目标化合物检出限变高的情况。本发明的检测方法中，提出对蘑菇干粉基质进行超声提取，通过按0.2g样品加入含0.3％(V/V)甲酸的10mL甲醇，不仅有效去除了基质干扰，而且目标化合物均回收率也较为理想。同时发现，脱磷裸盖菇素容易受环境影响降解，添加适量的抗坏血酸溶液可防止其降解。
本发明的上述检测方法中，由于考虑到本方法包含外标法定量和样品基质效应，所以采用空白样品提取液添加不同浓度的目标化合物配制成混合标准工作液，克服样品的基质效应，提高定性，定量的准确性和可靠性。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明通过对实验条件的优化，首次建立了超高效液相色谱-质谱/质谱法测定蘑菇中5种鹅膏肽类(3种鹅膏毒肽和2种鬼笔毒肽)、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法。该方法能有效避免出现假阴性、假阳性，有效克服了基质干扰和减少样品前处理造成的损失，确保定性定量的准确性。在前处理部分，我们考虑了色胺类蘑菇毒素容易形成阳离子化合物而鹅膏肽类毒素易被反相保留，故主要选取具有阳离子交换作用的非极性净化填料用于固相萃取小柱的装填。同时T3色谱柱比C18柱增加了极性基团的修饰，显著增强对极性分子的反相保留能力，因此存在将鹅膏肽类和神经精神型毒素同时保留在反相色谱上的实验基础。通过验证，该方法的精密度和准确度能够满足检测工作。同时将本方法与国家市场监管总局补充检验方法《蘑菇中α-鹅膏毒肽等6种蘑菇毒素的测定》(BJS202008)相比，鹅膏毒肽和鬼笔毒肽的检测结果无显著差异，同时还能额外检测脱磷裸盖菇素与蟾蜍色胺。本方法7种毒素的回收率均值为71.8％～117％，相对标准偏差(RSD)为1.73％～9.92％(n＝6)，说明本方法的重现性和准确度均理想，满足实际样品的分析要求。
附图说明
图1固相萃取净化淋洗条件优化图(A为两种淋洗方案的回收率比较；B为两种淋洗方案中脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺峰面积比较)。
图2固相萃取净化的洗脱条件优化图。
图3本方法与BJS202008法检测绒毡鹅膏的比较图。
图4本方法条件下鹅膏肽类毒素在50μg/kg浓度下的MRM色谱图。
图5本方法条件下脱磷裸盖菇素、蟾蜍色胺在20μg/kg浓度下的MRM色谱图。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
本发明实施例中使用的试剂：
乙酸铵(CNW，LC-MS级)、甲酸(CNW，LC-MS级)、甲酸(DUKSAN，优级纯)、氨水(国药，优级纯)、乙腈(Thermofisher，LC-MS级)、甲醇(默克，LC-MS级)、抗坏血酸(天津光复精细化工研究所，化学纯)；水为GB/T 6682规定的一级水；HLB基质分散固相萃取柱(60mg/3mL，沃特世)、SCX基质分散固相萃取柱(60mg/3mL，安捷伦)、Oasis WCX基质分散固相萃取小柱(60mg/3mL，沃特世)、Oasis MCX基质分散固相萃取小柱(60mg/3mL，沃特世)；α-AMA、β-AMA、γ-AMA、PCD、PHD 5种毒素均来自美国ENZO公司，1mg/瓶。蟾蜍色胺购自阿尔塔公司，1mL/瓶子(100μg/mL)；脱磷裸盖菇素(1mg)、脱磷裸盖菇素-d10(100μg/mL)、蟾蜍色胺-d4(2.5mg)均购自加拿大TRC公司；香菇粉(市场自购)；鹅膏毒素阳性蘑菇样(致命鹅膏、裂皮鹅膏及香菇粉混合粉末，致命鹅膏与裂皮鹅膏由中国疾控中心鉴定提供，福建省疾控中心制备)。
10％抗坏血酸溶液：取1.00g抗坏血酸粉末溶于9mL超纯水，充分涡旋混匀；
0.05％抗坏血酸溶液：移取50μL 10％抗坏血酸溶液于10mL去离子水中，充分涡旋混匀；
0.3％甲酸/甲醇溶液：移取150μL甲酸于50mL甲醇中，混匀溶解。
0.3％甲酸水溶液：移取150μL甲酸于50mL纯水中，混匀溶解。
0.1％甲酸水溶液：移取50μL甲酸于50mL纯水中，混匀溶解。
5％氨水甲醇：移取2.5mL氨水于47.5mL甲醇中，混匀溶解。
本发明实施例中使用的设备：
岛津LCMS-8060NX，液相系统为LC-30AD；AllegraX-15R高速离心机(美国Beckman公司)；G-560E型漩涡混合器(美国Scientific Industries公司)；KQ-500DE型和KQ3200DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CP 225D电子天平(准确至0.001mg，德国Sartorius公司)；YP202电子天平(准确至0.001g，上海精密科学仪器有限公司)；EFAA-DC24氮吹仪(上海安谱实验科技股份有限公司)；RE801旋转蒸发仪(日本Yamato公司)；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精密科学仪器有限公司)；高速粉碎机(上海精胜科学仪器有限公司)；干果机(佛山市安斯莱电器有限公司)。
实施例1
检测蘑菇中7种蘑菇毒素的方法，包括如下步骤
1)样品前处理
1、称样：准确称取0.200g蘑菇样品于15mL塑料离心管中，准确加入混合内标使用液(1.00μg/mL)10μL，涡旋混匀。
2、提取：加入5mL 0.3％甲酸/甲醇溶液，涡旋混匀，超声提取15min，以转速为9000r/min，离心10min。转移上清液至15mL离心管中，再次向蘑菇干粉残渣中加入5mL0.3％甲酸/甲醇溶液，涡旋混匀，重复提取一次，离心后合并提取液，向提取液中添加50μL10％抗坏血酸溶液。
3、浓缩：将提取液于40℃旋蒸至尽干，加入2mL 0.3％甲酸水(含0.05％抗坏血酸)淋洗鸡心瓶内壁数次。
4、净化：所有含有甲酸的溶液均含有0.05％抗坏血酸，将提取液转入事先用3mL乙腈、3mL0.3％甲酸水依次活化平衡好的固相萃取柱，依次用0.3％甲酸水和0.1％甲酸水各1mL淋洗柱子，弃去淋洗液；然后用2mL 5％氨水甲醇洗脱。
5、复溶：将洗脱液于40℃氮吹至尽干后，再准确加入1.00mL0.05％抗坏血酸溶液溶解残余物，以12000r/min转速离心5min，小心地取上清液至进样瓶中，供UPLC/MS/MS分析。
2)制备标准溶液
1、单一标准储备液的配制
5种鹅膏肽类及脱磷裸盖菇素标准品储备液制备(100μg/mL)：分别准确称取适量(精确至0.01mg)上述标准品于6支10mL容量瓶中，用甲醇溶解、定容至10mL，充分混匀。折算为100％纯品的质量，计算浓度为100μg/mL，得到单一毒素标准储备液，于-20℃冰箱中放置保存。
蟾蜍色胺-d4储备液制备(250μg/mL)：准确称取适量(精确至0.01mg)标准品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解、定容至10mL，充分混匀。折算为100％纯品的质量，计算浓度为250μg/mL，得到单一毒素标准储备液，于-20℃冰箱中放置保存。
2、标准中间液的配制
5种鹅膏肽类混合标准中间液制备(10.0μg/mL)：分别准确移取上述5种鹅膏肽类毒素标准储备液各1.00mL于同一支10mL容量瓶中，加入甲醇稀释，定容至10mL，充分摇匀，配制成浓度为10.0μg/mL的5种毒素混合标准中间液，封紧后于-20℃冰箱中保存。
脱磷裸盖菇素标准品中间液制备(10.0μg/mL)：准确移取1.00mL上述标准储备液于10mL容量瓶中，加入甲醇稀释，定容至10mL，充分摇匀，配制成浓度为10.0μg/mL的标准中间液，封紧后于-20℃冰箱中保存。
蟾蜍色胺-d4标准中间液制备(10.0μg/mL)：准确移取400μL上述标准储备液于10mL容量瓶中，加入甲醇稀释，定容至10mL，充分摇匀，配制成浓度为10.0μg/mL的标准中间液，封紧后于-20℃冰箱中保存。
蟾蜍色胺和脱磷裸盖菇素-d10标准中间液制备(10.0μg/mL)：分别准确移取1.00mL标准品于2支10mL容量瓶中，用甲醇溶解、定容至10mL，充分混匀。计算浓度为10μg/mL，得到单一标准中间液，于-20℃冰箱中放置保存。
3、标准工作液的配制(1.00μg/mL)
分别准确取1.00mL上述7种毒素标准中间液于同一支10mL容量瓶中、分别准确移取1.00mL上述2种内标中间液于同一支10mL容量瓶中，加入甲醇稀释，定容至10mL，充分摇匀，分别配制成浓度为1.00μg/mL的7种混合标准使用液和1.00μg/mL的2种毒素内标混合使用液。
3)标准工作曲线的制作
蘑菇样品标准工作曲线：在试管中分别按标准曲线的浓度加入20μL、40μL、80μL、100μL、200μL、300μL、400μL和500μL混合标准使用液，每管添加10μL混合内标使用液，加入空白基质标准液至体积为1.0mL，混匀后于14000r/min离心5min后取上清液经UPLC-MS/MS分析。低浓度标准浓度点则将标准使用液稀释成100ng/mL后，在试管中分别加入1μL、4μL、10μL、20μL、40μL、100μL稀释后的标准使用液，每管添加10μL混合内标使用液，加入空白基质标准液至1.0mL，混匀后于14000r/min离心5min后取上清液经UPLC-MS/MS分析。
4)色谱条件
T3反相色谱柱：HSS T3 1.8μm,2.1×100mm或等效柱；柱温：40℃；进样体积：10μL；流动相A：5mmoL乙酸铵水溶液(含0.1％甲酸)；流动相B：乙腈；详细梯度洗脱条件如表1。
表1高效液相色梯度洗脱条件
5)质谱条件
雾化气流量：3L/min；加热气流量：15L/min；接口温度：400℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；干燥气流量：3L/min；监测离子对及质谱参数见表2。
表2监测离子对及质谱参数
注：带*的为定量离子对
6)计算
样品中6中蘑菇毒素含量按公式(1)计算
式中：
ρ-试样中蘑菇毒素的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
A-从标准工作曲线上分别查得的试样中各蘑菇毒素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
V1-待测溶液的定容体积，单位为毫升(mL)；
V-所取蘑菇样品的质量，单位为克(g)。
实施例2
通过比较不同参数，优化样品前处理。得出前处理条件、液相条件的最佳参数。按本发明方法进行样品处理，在基质样品中添加3个浓度水平的7种蘑菇毒素混合标准溶液，每个添加浓度平行测定6次，测定精密度及准确度。
1)前处理条件优化
蘑菇毒素因结构差异具有不同的水溶性，且部分文献考察发现pH的差异对提取效果有影响，为此分别考察了水、甲醇、乙腈、30％甲醇、30％乙腈对毒素的提取效果及最佳提取溶剂在不同pH(pH＝2、4、7、10、12)下的提取效果。本申请用不同提取溶剂采取相同提取步骤，且置换成相同pH值的同种溶剂后再进样，从而抵消了溶剂效应进行比较。结果显示，每个毒素的最佳提取溶剂不同，甲醇的提取效果整体上是最佳的，故作为最佳提取溶剂，随着pH的上升，所有毒素的提取效果均有不同程度的下降，故最终选择pH＝2为最佳提取pH值。
取鹅膏毒素阳性蘑菇干粉(经检测含有α-AMA、β-AMA、γ-AMA、PCD、PHD)0.200g于15mL离心管中，分别添加100μL 1.00ug/ml脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺(相当于100ng)，分别放入30℃、40℃、50℃、60℃的水浴锅中充分提取30min，取提取液过滤后进行分析。结果发现，在30℃～60℃的温度梯度下，除脱磷裸盖菇素外的其余毒素的峰面积保持一致，没有显著性差异。脱磷裸盖菇素在40℃后峰面积呈显著性下降。因此将提取温度控制在40℃以下。取鹅膏阳性蘑菇干粉相同操作于30℃水浴中分别提取5min、10min、15min、20min、30min比较不同提取时间差异，结果得出大多数蘑菇毒素于15min达到平台期，故提取时间设定为15min。
用5mL最佳提取溶剂在最佳提取条件下分别提取3次，取提取液过滤后进行分析，结果分析得，随着提取次数增加，各毒素的峰面积下降幅度较大，所有毒素前2次提取的峰面积总和均能达到3次提取峰面积总和的95％以上。故提取次数设定为2次。
见图1，比较1mL0.3％甲酸+1mL0.1％甲酸作为淋洗液和1mL0.3％甲酸和1mL5％甲醇(含0.1％甲酸)做淋洗液的效果，可见两种方案的各毒素回收率无明显差异。排除掉脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的内标校正作用后，发现脱磷裸盖菇素的峰面积有明显差异，故以前一种方式为最佳淋洗条件。以5％氨水甲醇作为洗脱液优化洗脱体积，由图2可见在洗脱为2mL时综合回收率最佳，继而增加洗脱体积时，以外标法计算的鹅膏毒肽和鬼笔毒肽的回收率并未增加反而下降，认为是由于洗脱体积的增加导致基质中杂质被过多地从SPE上洗脱出来，导致基质抑制效应增加，回收率有所下降。
前期实验发现HLB小柱上样有流出脱磷裸盖菇素的现象，而WCX、MCX、SCX小柱均能较好保留目标化合物，考虑到各小柱子吸附剂差异，及脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺较易形成阳离子状态，故采用具有提供阳离子交换和反相保留双重作用的MCX、SCX、WCX小柱。在加标50μg/kg条件下，对MCX、SCX、WCX(均为60mg/3mL)进行比较，发现SCX柱的对各毒素的综合效果最佳，除了脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺有内标校正的作用差异较小外，其余毒素均可看出SCX(60mg/3mL)效果最佳，故选择该规格固相萃取小柱进行实验。
2)液相条件优化
7种蘑菇毒素分子中含有羟基、胺基等易于电离产生正离子的官能团，所有毒素在正离子模式下的响应均比负模式高。在乙腈-0.1％甲酸水溶液流动相体系下，7种毒素[M+H]+母离子的信号响应均高于[M+Na]+离子。比较了C18、T3、HILIC色谱柱，HILIC对各个毒素的分离较差，且峰形不理想。发现C18、T3的色谱分离效果比较理想，但是T3的对脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的保留效果比C18的效果好，所以最后采用T3色谱柱。在手动优化流动相的过程中，选用了0.1％甲酸水-甲醇、0.1％甲酸水-乙腈作比较，发现乙腈作为有机相时各毒素信号响应及峰形普遍比甲醇好。之后比较水-乙腈，0.1％甲酸水-乙腈，5mmoL乙酸铵(含0.1％甲酸)-乙腈,结果发现5mmoL乙酸铵(含0.1％甲酸)-乙腈作为流动相时所有毒素的信号综合强度最高，且峰形较好，故设为最终流动相体系。
3)方法验证
a.定性测定
按照上述条件处理的试液和相近浓度的基质标准溶液对比，如果色谱峰保留时间的相对偏差小于2.5％；定性离子对的相对丰度偏差不超过表3规定的范围，则可判断样品中存在相应的蘑菇毒素(详见表3)。
表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差
b.检出限和定量限
如表4所示，在香菇基质中，鹅膏毒肽、鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素、蟾蜍色胺的检出限(LOD，S/N＝3)分别为10.0、10.0、5.0、2.0μg/kg，定量限(LOQ，S/N＝10)分别为20.0、20.0、10.0和5.0μg/kg。
c.线性范围
以鹅膏毒肽和鬼笔毒肽的峰面积Y和浓度X(μg/kg)计算线性回归方程，以脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺与对应内标物峰面积的比值Y和浓度X(μg/kg)计算线性回归方程。在最佳条件下进行方法学指标验证，结果如表4所示，鹅膏毒肽、鬼笔毒肽(2.5-2500μg/kg)、脱磷裸盖菇素(0.5-300μg/kg)、蟾蜍色胺(0.5～200μg/kg)在线性范围内线性关系好，相关系数(r)均在0.995以上，满足要求(详见表4)。
表4 7种蘑菇毒素回归方程与检出限
d精密度与准确度
以不含目标毒素的香菇样品作为基质进行加标试验，加标浓度在5～100μg/kg之间，每个加标水平平行测定6次。回收率均值为71.8％～117％，相对标准偏差(RSD)为1.73％～9.92％。结果说明本方法的重现性和准确度均理想，满足实际样品的分析要求(详见表5)。
表5方法的加标回收率和精密度结果
※注：脱磷裸盖菇素：对应加标浓度为10、20、100μg/kg；蟾蜍色胺的加标浓度为5、10、50μg/kg。
e方法应用
在2021年由福建省各个设区市区疾控中心采集的59份野生蘑菇样品中，在1份绒毡鹅膏(Amanita vestita)中检出了较高含量的鹅膏肽类毒素(α-AMA、β-AMA，分别为607、377mg/kg)和鬼笔毒肽(PHD，69.0mg/kg)，在1份口蘑科蘑菇(Tricholomataceae sp)中检出较较低含量的脱磷裸盖菇素(12.6mg/kg)，均以干基计，未检出其他蘑菇毒素。同时采用市场监督管理总局的食品补充检验方法《蘑菇中α-鹅膏毒肽等6种蘑菇毒素的测定》对绒毡鹅膏进行检测对比，结果与本方法检测结果无统计学差异(显著性水平α＝0.05)，见图3。
之前的研究表明，鹅膏肽类毒素常采用反相色谱法进行保留，而神经精神型蘑菇毒素多采用亲水作用进行保留。但部分神经精神型毒素极性差异较大，具备在反相色谱上保留的能力。同时T3色谱柱比传统C18增加了极性基团修饰，显著增强对极性分子的反相保留能力，因此存在将鹅膏肽类和神经精神型毒素同时保留在反相色谱上的实验基础。在前处理部分，我们考虑了色胺类蘑菇毒素容易形成阳离子化合物而鹅膏肽类毒素易被反相保留，故主要选取具有阳离子交换和非极性双重性的固相萃取小柱作为净化材料。最终，我们建立了一种能同时检测5种鹅膏肽类(3种鹅膏毒肽和2种鬼笔毒肽)、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法。通过验证，该方法的精密度和准确度能够满足检测工作。同时将本方法与现有蘑菇毒素检测方法(BJS202008)相比，鹅膏毒肽和鬼笔毒肽的检测结果无显著差异，同时还能额外检测脱磷裸盖菇素与蟾蜍色胺。
研究过程中，我们发现多种蘑菇毒素检测方法的开发十分受限于市场上在售的毒菇毒素及其内标种类及未知毒素的研究进展。且由于毒素的种类多，性质差异大，难以只通过一种形式的作用力对所有毒素强吸附，而具备多种作用力的吸附材料开发种类有限且有可能吸附其他杂质造成干扰。因此，相比于样品前处理方法的开发，仪器条件的建立更容易实现多种毒素的检测，本方法的仪器条件实际上还可检测出毒蝇碱和裸盖菇素。在实际应用过程中，可以根据应急筛查和精准定量两种目的来灵活选择简单提取过滤后进样，还是充分提取净化后进样。在本方法应用过程还首次定量了绒毡鹅膏中鹅膏肽类的含量和种类。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应是本发明专利的保护范围。
Claims (6)
1.一种检测5种鹅膏肽类、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)标准溶液的配制
将α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺毒素标准品配制成标准使用液；将脱磷裸盖菇素-d10、蟾蜍色胺-d4配制成标准使用液；
(2)标准曲线的制作
吸取上述标准使用液，用空白样品基质配制成系列浓度的标准工作液，经UPLC-MS/MS分析，以5种鹅膏肽类毒素以定量离子峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线，脱磷裸盖菇素与蟾蜍色胺以定量离子峰面积与对应内标峰面积比值为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线；
(3)样品前处理
称取蘑菇干粉样品，进行前处理，得带测定的样品，其中，前处理的方法包括：
将蘑菇干粉用甲醇超声提取，旋蒸至干，复溶；用强阳离子交换固相萃取小柱净化后，氮气吹干、定容、涡旋混匀、离心取上清，得待测定的样品；
(4)测定
a、色谱条件：
T3反相色谱柱：HSS T3 1.8μm,2.1×100mm或等效柱；柱温：40℃；进样体积：10μL；流动相A：含0.1％甲酸的5mmoL乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；洗脱程序为：
b、质谱条件
离子源为电喷雾离子源，采用正离子模式，多离子反应监测，雾化气流量：3L/min；加热气流量：15L/min；接口温度：400℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；干燥气流量：3L/min；
c、定量/定性测定。
2.根据权利要求1所述的一种检测5种鹅膏肽类、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法，其特征在于：所述标准溶液的配制方法为：
配制标准储备液：分别配制浓度为100μg/mL的α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素的标准储备溶液和浓度为250μg/mL的蟾蜍色胺-d4的标准储备溶液；
配制标准中间液：利用所述标准储备溶液分别配制浓度为10.0μg/mL的α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素、蟾蜍色胺、脱磷裸盖菇素-d10和蟾蜍色胺-d4的标准中间溶液；
配制混合标准使用液：将上述α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺标准中间溶液混合并定容，所有毒素的浓度均为1μg/mL，即为混合毒素标准使用溶液；将上述配制得到的脱磷裸盖菇素-d10和蟾蜍色胺-d4的标准中间溶液混合并定容，所有内标的浓度均为1.00μg/mL，即为混合内标标准使用溶液。
3.根据权利要求1所述的一种5种鹅膏肽类、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的检测方法，其特征在于：标准曲线的制作过程中，空白样品基质为不含所测蘑菇毒素的食用菌样品经所述样品前处理步骤处理后所得的样品。
4.根据权利要求1所述的一种检测5种鹅膏肽类、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法，其特征在于：所述样品前处理过程中，采用强阳离子交换固相萃取小柱净化，定容用溶液为：0.05wt.％抗坏血酸水溶液。
5.根据权利要求1所述的一种检测5种鹅膏肽类、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法，其特征在于：在步骤4)c中，所述定量测定具体包括：将前处理得到的待测定的样品注入UPLC-MS/MS进行测定，测得样液中目标化合物的色谱峰面积，内标化合物的色谱峰面积，根据标准工作曲线，计算样品溶液中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的浓度，根据公式计算其含量。
6.根据权利要求1所述的一种检测5种鹅膏肽类、脱磷裸盖菇素和蟾蜍色胺的方法，其特征在于：在步骤4)c中，所述定性测定具体包括：前处理后得到的待测定样品中的目标化合物，以保留时间和特征离子与定量离子所对应的色谱峰面积相对丰度进行定性。
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