CN109709233A - 一种检测血液、尿液中多种蘑菇毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测血液、尿液中多种蘑菇毒素的方法。该方法通过对实验条件的优化，首次建立了超高效液相色谱‑质谱/质谱法测定中毒患者血液和尿液中α‑鹅膏毒肽、β‑鹅膏毒肽、γ‑鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽含量的方法。为突发公共卫生事件的处置提供科学的检测方法。

Description

一种检测血液、尿液中多种蘑菇毒素的方法

技术领域

本发明涉及应急检测技术领域。更具体地，涉及一种检测血液、尿液中多种蘑菇毒素的方法。

背景技术

我国毒蘑菇约有500多种，其中约421种含毒素较少或经过处理之后可以食用，30余种含有可致死的强毒性，至少16种具有极毒性。一种毒蘑菇可能含有多种毒素，一种毒素可存在于多种毒蘑菇中。吉林省有着丰富的蘑菇资源，随着蘑菇资源的开发利用，误食毒蘑菇的事故也经常发生。这对人们的身体健康乃至生命都造成了很大威胁。2015年通过国家卫计委突发公共卫生事件管理信息系统收到的食物中毒类突发公共卫生事件(以下简称食物中毒事件)报告共169起，其中有毒动植物及毒蘑菇引起的食物中毒事件报告起数和死亡人数最多，分别占全年食物中毒事件总报告起数和总死亡人数的40.2％和73.6％，与2014年相比，分别增加了11.5％和15.6％，而毒蘑菇食物中毒事件占该类食物中毒事件报告起数的60.3％，严重地危害了人们的健康。毒蘑菇中毒病死率如此之高原因在于缺乏有效诊断手段指导救治。当前，对毒蘑菇中毒的诊断，主要依靠临床症状诊断和毒蘑菇形态鉴定。毒蘑菇中毒临床表现复杂，但初期均为消化道刺激症状，极易被误诊为急性肠胃炎、菌痢等消化系统疾病；对于形态鉴定，由于大多毒蘑菇与食用菌相似度很高，仅极少数该领域专家才能准确鉴定，从而造成即便能获取标本也难以准确诊断，而且常因毒蘑菇标本的缺失或烹饪形变致使形态鉴定困难。且中毒后不同毒素在机体内各脏器和血液、尿液中的含量是不同的，因此快速而有效地检测样品(中毒患者血液和尿液)中的毒素，对于食物中毒的毒源鉴定和中毒后的针对性治疗具有重要意义。食用毒蘑菇中毒的机理也非常复杂，目前引起中毒的毒蘑菇毒素主要有鹅膏毒肽类和鬼笔毒肽类，特别是鹅膏毒肽引起的中毒，死亡率高达90％。由于鹅膏毒肽类的毒性较大，特别是中毒症状在大量细胞被破坏后才出现，而此时大部分的毒素已进入靶器官，尿液和血液中浓度较低，常规的检测方法无法检出，从而耽误了最佳检测和治疗时期。因此为防治误食毒蘑菇中毒、确定中毒因子，为临床治疗提供科学的依据，建立快速、有效、准确地中毒患者血液、尿液中蘑菇毒素检测技术具有非常重要的意义。目前国内外对蘑菇毒素的检测技术主要有化学显色检测法、薄层层析法、放射免疫法、酶联免疫法、傅里叶变换红外光谱法、高效液相色谱法及液相色谱-质谱法等。每种检测技术都有其各自的优点和缺点。HPLC具有灵敏度高、快速、准确、重现性比较好等优点而被广泛地应用于蘑菇毒素的检测，但是由于样品所含化学成分复杂，HPLC难以同时使几种毒素得到较好地分离，且在相同的保留时间上，易出现假阳性结果，且分离时间长，需要液相色谱-质谱法进一步验证了所测结果的准确性。

针对以上问题，需要提供一种可快速、有效且准确的检测血液、尿液中多种蘑菇毒素的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服发生毒蘑菇中毒事件时，因患者尿液和血液中毒素浓度较低，常规的检测方法无法检出的问题，采用快速、简单、有效的前处理技术，提供了一种可快速、有效且准确的检测出血液或尿液中至少包括α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽等6种蘑菇毒素的可同时快速定性、精准定量的检测手段。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种检测血液、尿液中多种蘑菇毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)样品前处理

称取血液或尿液样品，并进行前处理，其中，前处理的方法包括：

将血液样品离心，提取血浆，按照1mL：1-3mL的比例加入含0.5-1％(V/V)乙酸的乙腈溶液，涡旋震荡、离心；取上清液用氮气吹干、定容，涡混震荡、过滤，得待测定的血液样品；

将尿液过滤后，得待测定的尿液样品；

2)测定

a制备标准使用液

将α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽标准品配制成标准使用液；

b绘制标准曲线

吸取上述标准使用液适量，用空白样品基质配成系列浓度的标准工作液，经UPLC-MS/MS分析，以定量离子峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线，得到标准工作曲线回归方程；

c色谱条件：

色谱柱为C18色谱柱，流动相为2mmol/L的乙酸铵水溶液A和2mmol/L的乙酸铵乙腈溶液B，流速为0.3mL/min，采用梯度洗脱方式，柱温40℃，其中，梯度洗脱的程序如下表1所示：

表1梯度洗脱程序

d质谱条件

离子源为电喷雾离子源，采用正离子模式，多离子反应监测，毛细管电压：2.9kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：800L/h；锥孔反吹气流量：150L/h；α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽定性、定量离子及碰撞能量见表2：

表2 6种蘑菇毒素主要质谱参数

e定量和/或定性测定。

进一步地，过滤时采用0.22μm的滤膜。

进一步地，步骤1)中，定容采用的溶液为：质量比为70-60:30-40的2mmol/L的乙酸铵水溶液和2mmol/L的乙酸铵乙腈溶液。可知，该定容的溶液为流动相溶液，加入流动相，可减少溶剂效应，提高方法的灵敏度。

进一步地，步骤2)b中，空白样品基质为不含有所测的蘑菇毒素的经上述步骤1)处理后所得的样品，其中，当待测样品为血液时，该空白样品基质为血浆，此时，还包括向血浆中加入含0.5-1％(V/V)乙酸的乙腈溶液的步骤。

进一步地，步骤2)a中，制备标准使用液的方法具体包括：

配制标准储备液：分别配制浓度为0.100mg/mL的α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽的标准储备溶液；

配制混合标准中间液：将上述α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽的标准储备溶液混合并定容，配制得到α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽浓度均为10μg/mL的混合液，即为混合标准中间溶液；

配制标准使用液：稀释上述配制得到的混合标准中间液，配制得到α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽浓度均为1μg/mL的混合液，即为标准使用液。

进一步地，步骤2)e中，所述定量测定具体包括：将步骤1)得到的待测定的样品注入UPLC-MS/MS进行测定，测得样液中目标化合物的色谱峰面积，根据标准工作曲线，计算样品溶液中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽的浓度，根据公式计算出样品中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽的含量。

进一步地，步骤2)e中，所述定性测定具体包括：

检测步骤1)得到的待测定的样品中的目标化合物，以保留时间和特征离子与定量离子所对应的色谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准工作溶液中目标化合物保留时间的相对偏差小于20％；样品特征离子的相对丰度与浓度相当混合标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过如下表3的规定，则可判断样品中存在相应的被测物。

表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差

通过对空白血液加标实验发现血液组织是结缔组织的一种，由血浆和血细胞组成。血浆的化学成分中，水分占90-92％，其他10％以溶质血浆蛋白为主，并含有电解质、营养素、酶类、激素类、胆固醇和其他重要组成部分，样品提取不好的话，会严重影响后续的检测，造成待测目标化合物检出限变高。本发明的检测方法中，首次提出对蘑菇中毒的生物样品(如人体血液)血浆进行提取，通过按1mL：1-3mL的比例加入含0.5-1％(V/V)乙酸的乙腈溶液不仅有效去除了基质干扰，而且目标化合物均有较高的回收率。对于尿液样品，为了尽量避免样品前处理造成待测目标化合物损失，同时考虑到尿液本身的成分，本方法采用直接过滤的进样的方式。

本发明的上述检测方法中，采用标准使用液绘制标准工作曲线。由于考虑到本方法为外标法和样品基质效应，所以采用对空白样品提取液添加不同浓度的目标化合物配置成混合标准工作液，克服一些样品的基质效应，提高定性、定量的准确性和可靠性。上述6种蘑菇毒素仅需9分钟就完成检测，为中毒患者赢得宝贵的抢救时间。

考察了不同流动相体系对目标化合物分离的影响，研究表明分别采用乙酸铵水溶液和甲醇做流动，以及乙酸铵水溶液和乙腈做流动相时，对6种蘑菇毒素的分离效果不好；此外，流动相的浓度也影响分离效果，浓度过高或过低均无法较好的分离出6种蘑菇毒素，仅采用2mmol/L乙酸铵水溶液和2mmol/L乙酸铵乙腈溶液作为流动相时，α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽能够很好的进行分离。根据α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽的理化性质，采用了正电离模式，多离子反应监测，确保快速定性，精准定量。

本发明的有益效果如下：

本发明通过对实验条件的优化，首次建立了超高效液相色谱-质谱/质谱法测定中毒患者血液和尿液中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽含量的方法。该方法避免了出现假阴、假阳性，有效地克服了基质干扰和减少了样品前处理所造成的损失，确保了定性、定量检测结果的准确性。血液样品中6种蘑菇毒素的检出限分别为α-鹅膏毒肽0.2μg/L、β-鹅膏毒肽0.2μg/L、γ-鹅膏毒肽0.2μg/L、二羟鬼笔毒肽0.1μg/L、羧基二羟基鬼笔毒肽0.2μg/L、羧基三羟基鬼笔毒肽0.2μg/L。尿液样品中6种蘑菇毒素的检出限分别为α-鹅膏毒肽0.5μg/L、β-鹅膏毒肽0.5μg/L、γ-鹅膏毒肽0.5μg/L、二羟鬼笔毒肽0.3μg/L、羧基二羟基鬼笔毒肽0.5μg/L、羧基三羟基鬼笔毒肽0.5μg/L，均可满足发生最小剂量蘑菇中毒时的检测要求。

血液和尿液方法平均回收率分别为91.8％-100.4％和92.5％-107.9％，RSD分别为2.2％-8.7％和2.6％-9.6％。

本发明的检测方法中，仅需9分钟以内就能完成对上述6种蘑菇毒素的检测，为中毒患者赢得宝贵的抢救时间。使得该技术方案非常适用于突发公共卫生事件的检测。

本发明样品前处理简单，提取效率比较高，分离效果好，重现性好，方法的灵敏度和检出限均能满足毒物残留分析的要求，且易于推广使用。为突发公共卫生事件应急检测提供了强有力的技术支持。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1中1-6分别示出了β-鹅膏毒肽(β-AMA)、α-鹅膏毒肽(α-AMA)、γ-鹅膏毒肽(γ-AMA)、羧基三羟基鬼笔毒肽(PSC)、羧基二羟基鬼笔毒肽(PCD)和二羟鬼笔毒肽POD)的标准溶液色谱图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本发明实施例中使用的仪器与试剂：

超高效液相色谱-串联质谱联用仪(UPLC-MS/MS)(Waters TQS，美国)、离心机(CF16RN,日立公司)、MS3型漩涡混合器(IKA,德国)、氮吹仪(OA.SYS，OA.JNC)；α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽标准品，均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度均≥90.0％；甲醇、乙腈、乙酸(色谱纯，美国Fisher公司)；乙酸铵(色谱纯，德国CNW公司)；有机滤膜，0.22μm、水系滤膜，0.22μm。

实施例1

检测血液、尿液中多种蘑菇毒素的方法，包括如下步骤：

1)样品前处理

1、血液样品：取5.00mL血液，以1500r/min离心5min，吸取上层血浆1.00mL于10mL离心管中，加入1mL含0.5％(V/V)乙酸的乙腈溶液，涡旋提取2min后，以5000r/min离心5min，取2.0mL上清液于10mL试管中，55℃水浴氮气吹干，加入250μL初始流动相(质量比为70-60:30-40的2mmol/L的乙酸铵水溶液和2mmol/L的乙酸铵乙腈溶液)定容，涡混震荡1min，经0.22μm滤膜过滤后，待测定。

2、尿液样品：取适量尿液经0.22μm滤膜过滤后供UPLC-MS/MS分析。

2)制备标准溶液

混合标准中间液：分别准确吸取上述6种标准储备液各1.0mL，用甲醇定容至10.0mL，制备成每毫升含6种蘑菇毒素各10.0μg的标准中间液，4℃冰箱中保存。

混合标准使用液：准确吸取混合标准中间液1.0mL，用水定容至10.0mL，制备成每毫升含6种蘑菇毒素各1.0μg的混合标准使用液，4℃冰箱中保存。

3)测定：

a标准工作曲线的绘制

血液样品标准工作曲线：在试管中分别按标准曲线的浓度加入10.0μL、40.0μL、60.0μL、80.0μL和100.0μL混合标准使用液，加入空白血浆至1.0mL，混匀后放置30min，加入1mL含0.5％(V/V)乙酸的乙腈溶液，与血样一起处理，混匀后过0.22μm滤膜，经UPLC-MS/MS分析，以定量离子峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线，得到标准工作曲线回归方程。

尿液样品标准工作曲线：在试管中分别按标准曲线的浓度加入10.0μL、40.0μL、60.0μL、80.0μL和100.0μL混合标准使用液，加入空白尿液至1.0mL，混匀后过0.22μm滤膜，经UPLC-MS/MS分析，以定量离子峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线，得到标准工作曲线回归方程。

b色谱条件

色谱柱为C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.8μm，美国Waters公司)；流动相为2mmol/L乙酸铵水溶液和2mmol/L乙酸铵乙腈溶液，流速为0.3mL/min，采用梯度洗脱方式：0min-3.5min,70％2mmol/L乙酸铵水溶液；3.5min-5.0min，70％-30％2mmol/L乙酸铵水溶液；5.0min-7.0min，30％-10％2mmol/L乙酸铵水溶液，7.0min-9.0min，10％-70％2mmol/L乙酸铵水溶液，总运行时间9.0min；柱温40℃，进样量10μL。图1中1-6分别示出了β-鹅膏毒肽(β-AMA)、α-鹅膏毒肽(α-AMA)、γ-鹅膏毒肽(γ-AMA)、羧基三羟基鬼笔毒肽(PSC)、羧基二羟基鬼笔毒肽(PCD)和二羟鬼笔毒肽POD)的标准溶液色谱图。

c质谱条件

离子源为电喷雾离子源，正离子模式，多离子反应监测，毛细管电压：2.9kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：800L/h；锥孔反吹气流量：150L/h。α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽的定性、定量离子及碰撞能量、锥孔电压见表4。

表4 6种蘑菇毒素主要质谱参数

4)计算

样品中6种蘑菇毒素含量按公式(1)计算。

式中：

ρ_i—试样中每种蘑菇毒素的含量，单位为微克每升(μg/L)；

A—从标准工作曲线上分别查得的试样中各蘑菇毒素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

V—所取血液、尿液的体积，单位为毫升(mL)；

V₁—待测溶液的定容体积，单位为毫升(mL)。

计算结果表示到三位有效数字。

根据标准工作曲线，计算样品溶液中6种蘑菇毒素的浓度，根据公式计算出样品中6种蘑菇毒素含量的含量。

5)结果(ug/L)

测试结果如下表5所示。

表5样品溶液中6种蘑菇毒素的浓度

实施例2

以空白基质溶液配制不同浓度的6种蘑菇毒素含量标准系列，采用UPLC-MS/MS进行分析，得出线性范围、回归方程和相关系数(r)及检出限。按本发明方法进行样品处理，在基质样品中添加不同含量的3个水平6种蘑菇毒素含量的混合标准溶液，每个添加浓度平行测定6次，测定精密度及准确度。

1)线性范围、回归方程、检出限

血液样品中6种蘑菇毒素含量的浓度在10μg/L-100μg/L范围内线性良好。6种蘑菇毒素的检出限分别为α-鹅膏毒肽0.2μg/L、β-鹅膏毒肽0.2μg/L、γ-鹅膏毒肽0.2μg/L、二羟鬼笔毒肽0.1μg/L、羧基二羟基鬼笔毒肽0.2μg/L、羧基三羟基鬼笔毒肽0.2μg/L。

尿液样品中6种蘑菇毒素含量的浓度在10μg/L-100μg/L范围内线性良好。6种蘑菇毒素的检出限分别为α-鹅膏毒肽0.5μg/L、β-鹅膏毒肽0.5μg/L、γ-鹅膏毒肽0.5μg/L、二羟鬼笔毒肽0.3μg/L、羧基二羟基鬼笔毒肽0.5μg/L、羧基三羟基鬼笔毒肽0.5μg/L。详见如下表6。

表6 6种蘑菇毒素线性范围及检出限

2)精密度和准确度试验

在基质样品中添加不同含量的3个水平6种蘑菇毒素的混合标准溶液，每个添加浓度平行测定6次，测定精密度及准确度，血液中6种蘑菇毒素加标回收率在91.8％-100.4％，所测定的相对标准偏差(RSD)为2.2％-8.7％；尿液中6种蘑菇毒素加标回收率在92.5％-107.9％，所测定的RSD为2.6％-9.6％。方法的准确度和精密度均能满足食物中毒物残留分析的要求(详见表7)。

表7 6种蘑菇毒素精密度和准确度试验结果(n＝6)

对比例1

重复实施例1，区别在于，将步骤3)b中的色谱条件改为“流动相为4mmol/L乙酸铵水溶液和4mmol/L乙酸铵乙腈溶液”，其余条件不变，结果表明，由于乙酸铵浓度的增加，导致6种蘑菇毒素质谱信号减弱，特别是羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽的响应值很低，无法检测到。

对比例2

重复实施例1，区别在于，将步骤3)b中的色谱条件改为“流动相为2mmol/L乙酸铵水溶液和2mmol/L甲醇溶液”，其余条件不变，5种蘑菇毒素在色谱图上相互重合，不能分离，同时基质干扰严重，羧基三羟基鬼笔毒肽的响应值很低，无法检测到。

对比例3

重复实施例1，区别在于，将步骤3)b中的色谱条件改为“流动相为2mmol/L乙酸铵水溶液和2mmol/L乙腈溶液”，其余条件不变，结果表明，由于α-鹅膏毒肽和β-鹅膏毒肽母离子、定性定量例子都非常接近，在上述色谱条件下，在色谱图上相互重合，不能分离。

对比例4

重复实施例1，区别在于，将步骤3)c中的质谱条件中，采用负离子模式，其余条件不变，结果表明6种蘑菇毒素响应值很低，灵敏度低，无法检测。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.一种检测血液、尿液中多种蘑菇毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)样品前处理

称取血液或尿液样品，并进行前处理，得待测定的样品，其中，前处理的方法包括：

将血液样品离心，提取血浆，按照1mL：1-3mL的比例加入含0.5-1％(V/V)乙酸的乙腈溶液，涡旋震荡、离心；取上清液用氮气吹干、定容，涡混震荡、过滤，得待测定的血液样品；

将尿液过滤后，得待测定的尿液样品；

2)测定

a制备标准使用液

将α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽标准品配制成标准使用液；

b绘制标准曲线

吸取上述标准使用液适量，用空白样品基质配成系列浓度的标准工作液，经UPLC-MS/MS分析，以定量离子峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线，得到标准工作曲线回归方程；

c色谱条件：

色谱柱为C18色谱柱，流动相为2mmol/L的乙酸铵水溶液A和2mmol/L的乙酸铵乙腈溶液B，流速为0.3mL/min，采用梯度洗脱方式，柱温40℃，其中，梯度洗脱的程序为：

d质谱条件

离子源为电喷雾离子源，采用正离子模式，多离子反应监测，毛细管电压：2.9kV；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：800L/h；锥孔反吹气流量：150L/h；

e定量和/或定性测定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，过滤时采用0.22μm的滤膜。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，定容采用的溶液为：质量比为70-60:30-40的2mmol/L的乙酸铵水溶液和2mmol/L的乙酸铵乙腈溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)b中，空白样品基质为不含有所测的蘑菇毒素的经上述步骤1)处理后所得的样品，其中，当待测样品为血液时，该空白样品基质为血浆，此时，还包括向血浆中加入含0.5-1％(V/V)乙酸的乙腈溶液的步骤。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)a中，制备标准使用液的方法具体包括：

配制标准储备液：分别配制浓度为0.100mg/mL的α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽的标准储备溶液；

配制混合标准中间液：将上述α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽的标准储备溶液混合并定容，配制得到α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽浓度均为10μg/mL的混合液，即为混合标准中间溶液；

配制标准使用液：稀释上述配制得到的混合标准中间液，配制得到α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽浓度均为1μg/mL的混合液，即为标准使用液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)e中，所述定量测定具体包括：将步骤1)得到的待测定的样品注入UPLC-MS/MS进行测定，测得样液中目标化合物的色谱峰面积，根据标准工作曲线，计算样品溶液中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽的浓度，根据公式计算出样品中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽的含量。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)e中，所述定性测定具体包括：

检测步骤1)得到的待测定的样品中的目标化合物，以保留时间和特征离子与定量离子所对应的色谱峰面积相对丰度进行定性。