CN114839284A - 非疾病诊断目的的鹅膏毒肽检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测技术领域,具体涉及一种非疾病诊断目的的鹅膏毒肽检测方法。所述检测方法包括对待测样品中的鹅膏毒肽进行检测的操作,所述待测样品由待检样本经蛋白降解处理后制得。该检测方法所使用的待测样品由待检样本经蛋白降解处理后制得,其中通过蛋白降解处理,能够降解蛋白结合态鹅膏毒肽中的蛋白,从而释放出更多的游离态鹅膏毒肽。因此,本发明所使用的待检样品中含有的游离态鹅膏毒肽,由原有游离态鹅膏毒肽以及蛋白结合态鹅膏毒肽释放出的游离态鹅膏毒肽组成,也即,本发明的检测方法能够同时检测待检样本中含有的游离态和蛋白结合态的鹅膏毒肽,这能够显著延长鹅膏毒肽的检测窗口期,有效提升鹅膏毒肽的检出率。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域,具体涉及一种非诊断目的的鹅膏毒肽检测方法。
背景技术
蘑菇中毒是引起食物中毒死亡的主要原因之一,也是影响公众健康的突出公共卫生问题之一。蘑菇中毒死亡事件调查数据显示,蘑菇中毒致死的主要原因是毒蘑菇中含有鹅膏毒肽,《中国含鹅膏毒肽蘑菇中毒临床诊断治疗专家共识》(2020年)中指出,90%的蘑菇中毒死亡事件是由蘑菇中含有的鹅膏毒肽引起中毒者急性肝衰竭所致。在已知的鹅膏毒肽中,α-鹅膏毒肽的毒性最强,也是最具有代表性的鹅膏毒肽类毒素。因此,对α-鹅膏毒肽的毒性和化学特性进行研究,对于蘑菇鹅膏毒肽中毒临床问题的解决有重要价值。
《中国含鹅膏毒肽蘑菇中毒临床诊断治疗专家共识》(2020年)中指出,中毒者生物样本(包括血液、尿液和胃液等)中检出鹅膏毒肽毒素,是蘑菇鹅膏毒肽中毒的重要诊断依据。《中国含鹅膏毒肽蘑菇中毒临床诊断治疗专家共识》(2020年)中进一步提示:液相色谱串联质谱法(LC-MS)是常用的鹅膏毒肽检测方法,其中,血液、尿液的检测时间窗口分别为进食毒蘑菇后的48h以内和96h以内。
然而,蘑菇鹅膏毒肽中毒的中毒病程可分四个阶段:进食毒蘑菇后有12h的潜伏期,潜伏期结束后患者出现以呕吐和腹泻为特征的首发症状;随后,患者可能进入没有任何症状的假愈期;2天后,患者症状加重,进入医院治疗;之后,患者出现以肝损坏为主的全身症状,进入暴发性肝衰竭期,进入此阶段的严重者可在3-7天死亡,患者病死率高达30-60%。
也就是说,进食毒蘑菇后,中毒者入院治疗的时间大多在食入毒蘑菇48h后,此时患者血、尿中游离的鹅膏毒肽很可能已经排出体外,导致患者血、尿等生物样品中的鹅膏毒肽因含量低于检测限(LOD,0.5-1μg/L)而无法被检出。因此,现有鹅膏毒肽检测方法的检测窗口期较短,鹅膏毒肽检出率较低,无法准确检测患者生物样品中的鹅膏毒肽。
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题在于克服现有鹅膏毒肽检测方法中存在的鹅膏毒肽检测窗口期较短、检出率较低的缺陷,从而提供一种非疾病诊断目的的鹅膏毒肽检测方法。
发明人研究发现,现有鹅膏毒肽检测方法对鹅膏毒肽检测窗口期较短、检出率较低的原因在于,现有鹅膏毒肽检测方法仅能针对待测样品中的游离态鹅膏毒肽进行检测,无法针对结合态鹅膏毒肽,而现有的待测样品制备过程仅能分离到生物样品中的游离态鹅膏毒肽,并没有考虑到生物样品中可能存在的其他形态鹅膏毒肽,例如与蛋白结合后的蛋白结合态鹅膏毒肽。
为此,本发明提供一种非疾病诊断目的的鹅膏毒肽检测方法,所述检测方法包括对待测样品中的鹅膏毒肽进行检测的操作,其中,所述待测样品由待检样本经蛋白降解处理后制得。
其中,对待测样品中的鹅膏毒肽进行检测的方法例如可以是放射免疫法、酶联免疫法、薄层色谱法、高效液相色谱法或者LC-MS等常用检测方法。
可选地,所述蛋白降解处理包括蛋白酶水解处理。
可选地,所述待测样品的制备方法包括:
取待检样本,与蛋白酶或蛋白酶溶液混合,水解,固相萃取,取洗脱液;
其中,所述待检样本与蛋白酶或蛋白酶溶液的混合操作使得蛋白酶的终浓度为0.03wt%~0.28wt%。蛋白酶可以溶解在磷酸缓冲溶液或生理盐水中。
可选地,所述水解的条件包括:水解温度为4~60℃,水解时间为0.5~24h;
可选的,水解时间为2~12h。
可选地,所述固相萃取使用的淋洗溶剂为体积百分浓度1~20%的甲醇水溶液,使用的洗脱溶剂为甲醇;
可选的,所述淋洗溶剂的使用量为水解产物上样量的2~20体积倍,所述洗脱溶剂的使用量为水解产物上样量的2~20体积倍。
可选地,所述待检样本包括血浆、尿液、胃液、胃肠道内容物匀浆上清液、粪便匀浆上清液及生物组织匀浆上清液中的至少一种;所述生物组织匀浆上清液包括肝脏匀浆上清液和/或肾脏匀浆上清液。
所述蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、非限制性水解蛋白酶、限制性水解蛋白酶、内肽酶、外肽酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、天门冬蛋白酶氨酸酶、真菌蛋白酶、细菌蛋白酶、植物蛋白酶、动物蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、羧肽酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶中的任一种。
可选地,采用UPLC-MS/MS法对待测样品中的鹅膏毒肽进行检测。
可选地,所述待测样品的制备方法还包括:
取所述洗脱液,除去溶剂,加入复溶溶剂,复溶后离心,取上清液,其中,所述复溶溶剂为体积百分浓度为5~20%的甲醇水溶液;可选的,复溶过程中还可以加入内标溶液,所述内标溶液为0.5~2μg/mL的微囊藻毒素(或其他结构类似物)甲醇溶液。
可选地,所述UPLC-MS/MS法的色谱条件包括:
柱温为30~50℃,流速为0.3mL/min,进样量为5~10μL;以0.2mM乙酸铵-0.1%甲酸水溶液为流动相A、乙腈为流动相B进行梯度洗脱,梯度洗脱程序包括:0~1.5min,流动相中乙腈的体积百分比为20%;1.5~3min,流动相中乙腈的体积百分比为20%→30%;3~4min,流动相中乙腈的体积百分比为30%→70%;4~4.1min,流动相中乙腈的体积百分比为70%→20%;4.1~5.5min,流动相中乙腈的体积百分比为20%。
可选的,所述UPLC-MS/MS法所用色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(100mm*2.1mm,1.8μm)或其他具有同等分离效果的色谱柱。
所述UPLC-MS/MS法的质谱条件包括:
离子源:电喷雾电离源,正离子模式,多反应监测;毛细管电压:3.5kV;离子源温度:150℃;去溶剂化温度:350℃;去溶剂气流速:850L/h;锥孔气流速:50L/h。
可选地,所述鹅膏毒肽包括:α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、ε-鹅膏毒肽、鹅膏酸(amanin)、鹅膏蕈(amanullin)和鹅膏酰胺(amaninamide)中的至少一种。
鹅膏毒肽的化学结构式如下:
其中,不同鹅膏毒肽对应的取代基如下表所示:
本发明技术方案,具有如下优点:
(1)本发明提供的鹅膏毒肽检测方法,所使用的待测样品由待检样本经蛋白降解处理后制得,其中通过蛋白降解处理,能够降解蛋白结合态鹅膏毒肽中的蛋白,从而释放出更多的游离态鹅膏毒肽,因此,本发明所使用的待检样品中含有的游离态鹅膏毒肽,由原有游离态鹅膏毒肽以及蛋白结合态鹅膏毒肽释放出的游离态鹅膏毒肽组成,也即,本发明的检测方法能够同时检测待检样本中含有的游离态和蛋白结合态的鹅膏毒肽,这能够显著延长鹅膏毒肽的检测窗口期,有效提升鹅膏毒肽的检出率;
(2)本发明提供的鹅膏毒肽检测方法,通过利用蛋白酶对待检样本中与鹅膏毒肽结合的蛋白进行水解,并对水解条件进行优化,能够有效释放出待检样本中与蛋白结合的鹅膏毒肽,该方法能够在中毒2d或2d后,尤其是中毒后第4d~10d,仍高水平检出待检样本中含有的鹅膏毒肽,因此该方法能够有效延长鹅膏毒肽的检测窗口期(最长可延长至14d),提升鹅膏毒肽检出率,同时通过一系列条件优化,确保了鹅膏毒肽定性、定量检测结果的准确性;
(3)本发明提供的鹅膏毒肽检测方法,待测样品的制备过程简单,方法的灵敏度和检出限均满足毒素残留分析要求,且易于推广使用,为临床中蘑菇鹅膏毒肽中毒的诊断提供强有力的技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1和对比例1的检测结果示意图;
图2是本发明实验例3的蛋白酶水解时间优化检测结果示意图;
图3是本发明实验例3的蛋白酶使用浓度优化检测结果示意图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明,并不局限于所述最佳实施方式,不对本发明的内容和保护范围构成限制,任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品,均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明实施例中使用的仪器和试剂:
Waters Xevo TQ-S Micro超高效液相色谱/三重四级杆质谱仪(美国沃特斯有限公司);E3116R型台式高速冷冻离心机(广东安胜仪器有限公司);十万分之一天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司);VORTEX-5型涡旋混合器(其林贝尔仪器制造有限公司);Milli-Q型超纯水机(美国Millipore公司);恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司);真空离心浓缩仪(德国CHRIST公司);色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(100mm*2.1mm,1.8μm);HLB固相萃取柱(美国沃特斯有限公司);α-鹅膏毒肽购自美国MCE公司,纯度≥90.0%;微囊藻毒素(百灵威);甲醇、乙腈、甲酸(质谱级,美国Fisher公司);乙酸铵(色谱纯,美国Fisher公司);胰蛋白酶固体(SIGMA);磷酸缓冲溶液(Solarbio)。
本发明实施例中α-鹅膏毒肽染毒小鼠的血浆样品由如下方法制备:
对ICR雄性小鼠腹腔注射染毒剂量为0.33mg/kg或0.66mg/kg的α-鹅膏毒肽毒素(溶解在无菌生理盐水中),在小鼠染毒后0.5h-14d之间的不同时间点处死小鼠,采集全血后,离心收集上层血浆(模拟中毒患者的血浆样本),待测。
实施例1
染毒小鼠血浆中含蛋白结合态α-鹅膏毒肽的检测方法,包括如下操作:
(1)待测样品制备
取染毒小鼠血浆样本(待检样本)200μl于1.5ml离心管中,加入1wt%的胰蛋白酶溶液20μl(胰蛋白酶固体溶解于磷酸缓冲溶液中制得),使得胰蛋白酶的终浓度为0.11wt%,涡旋混匀,于37℃下水浴水解8h。取固相萃取柱HLB,利用1mL甲醇、1mL水依次活化,静置平衡,取水解后的血浆样本(体积为220μl)上样,随后采用1ml体积百分浓度为5%甲醇水溶液淋洗,淋洗结束后利用2mL甲醇分步洗脱,收集洗脱液并真空离心旋蒸至干。蒸干溶剂后,加入10μL内标溶液(浓度为1μg/mL的微囊藻毒素溶液,溶解于甲醇)和90μL体积百分浓度为10%的甲醇水溶液复溶,涡旋混匀,12000rpm离心10min,取上清液,即得待测样品。
(2)标准溶液制备
标准储备液:取α-鹅膏毒肽的固体标准品500μg,精密称定,加入超纯水0.5mL,配制成浓度为1mg/mL的标准储备液,-20℃冰箱中保存。
标准中间液:精密量取标准储备液0.1mL,加水定容至10.0mL,制备成10μg/mL的标准中间溶液,4℃冰箱中保存。
标准使用液:取不同体积的标准中间溶液,用超纯水稀释,分别配制浓度为20μg/L、40μg/L、80μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L的系列标准使用液,现用现配。
(3)UPLC-MS/MS法检测
a、色谱条件:色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(100mm*2.1mm,1.8μm);0.2mM乙酸铵-0.1%甲酸水溶液为流动相A,乙腈为流动相B;柱温40℃,流速0.3mL/min,进样量10μL;采用梯度洗脱方式,梯度洗脱程序如下表1所示:
表1梯度洗脱程序表
b、质谱条件:离子源为电喷雾电离源,正离子模式,多反应监测(MRM);毛细管电压为3.5kV;离子源温度为150℃;去溶剂化温度为350℃;去溶剂气流速为850L/h;锥孔气流速为50L/h;质谱参数如表2所示:
表2质谱参数
c、标准工作曲线的绘制
血清样品标准工作曲线:取950μL空白小鼠血清于试管中,分别加入配置好的系列标准使用液50μL,配制成系列质量浓度的血清标准工作溶液(浓度分别为1μg/L、2μg/L、4μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L)。混匀后取200μL,按照操作(1)中待测样品制备方法进行同步处理,然后进行UPLC-MS/MS检测,以定量离子峰面积为纵坐标,血清标准工作溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线,得到标准工作曲线回归方程。
血清标准工作溶液中α-鹅膏毒肽含量的浓度在1μg/L-20μg/L范围内线性良好。根据信噪比,小鼠血清中含蛋白结合态α-鹅膏毒肽在内的α-鹅膏毒肽检出限为0.3μg/L(信噪比=3),定量限为1μg/L(信噪比=10)。本实施例中得到的标准工作曲线回归方程为如表3所示:
表3α-鹅膏毒肽线性范围、回归方程及定量限
(4)检测结果
按照上述方法对染毒小鼠血浆中的α-鹅膏毒肽含量进行检测,α-鹅膏毒肽的染毒剂量为0.33mg/kg,检测时间点为染毒后的第1-12d,每个时间点平行检测3个样本,以健康小鼠的血浆作为对照,检测结果如图1B和表4所示(LOD=0.3μg/L):
表4小鼠染毒0.33mg/kg的α-鹅膏毒肽后第1-12d的检测结果
由图1B和表4可以看出,本发明的检测方法可在小鼠染毒后2d的部分血浆样品中检出α-鹅膏毒肽;在小鼠染毒后第1-12d的血浆样品中,对α-鹅膏毒肽的检出率为53.33%(16/30);在小鼠染毒后第4-10d的血浆样品中,对α-鹅膏毒肽的检出率为83.33%;最长检测窗口期可延长至小鼠染毒后第14天。
对比例1
按照实施例1的方法染检测染毒小鼠血浆中的α-鹅膏毒肽,不同之处在于:本对比例中制备待测样品时不加入胰蛋白酶进行水解,具体的,本对比例中待测样品制备方法为:
取固相萃取柱HLB,利用1mL甲醇、1mL水依次活化,静置平衡,取染毒小鼠血浆样本(待检样本)220μl上样,随后采用1ml体积百分浓度为5%甲醇水溶液淋洗,淋洗结束后利用2mL甲醇分步洗脱,收集洗脱液并真空离心旋蒸至干。蒸干溶剂后,加入10μL内标溶液(浓度为1μg/mL的微囊藻毒素溶液,溶解于甲醇)和90μL体积百分浓度为10%的甲醇水溶液复溶,涡旋混匀,12000rpm离心10min,取上清液,即得待测样品。
本对比例的检测结果如图1A和表5所示(LOD=0.3μg/L):
表5小鼠染毒0.33mg/kg的α-鹅膏毒肽后第1-12d的检测结果
由图1A和表5可以看出,不加蛋白酶对血浆样品进行水解的情况下,小鼠染毒α-鹅膏毒肽24h后,血浆中α-鹅膏毒肽的检出率即为0%。
因此,相较于现有方法,本发明的方法对α-鹅膏毒肽的检出率可提高53.33~83.33%,检测窗口期可以延长到染毒后2-14d,最高的血浆浓度出现在小鼠染毒后6-7d。若本方法应用到临床中,可以使得中毒患者尽快确诊,争取宝贵的治疗时间。
实验例1
本实验例用于验证蛋白酶水解对样品中游离态α-鹅膏毒肽检测的影响:
取α-鹅膏毒肽加入小鼠空白血浆中配制成含10μg/Lα-鹅膏毒肽的加标血浆(样品),然后取200μl该加标血浆,加入20μl浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液,混匀后,于37℃下水浴水解0-12h。取不同水解时间点的血浆样品,按照实施例1操作(1)中的固相萃取法制备待测样品,并按照实施例1中操作(3)的UPLC-MS/MS方法进行检测,每个水解时间点平行检测两份样品,检测结果如表6所示。由表6可以看出,血浆中加入蛋白酶并水解12h以内,蛋白酶的加入以及水解时间对血浆中游离态α-鹅膏毒肽含量的检测结果几乎没有影响。
表6蛋白酶水解对样品中游离态α-鹅膏毒肽检测的影响
实验例2
本实验例用于验证血浆样品中存在蛋白结合态α-鹅膏毒肽:
分别以0.33mg/kg和0.66mg/kg的染毒剂量对ICR雄性小鼠腹腔注射α-鹅膏毒肽毒素进行染毒,并于染毒后0.5h-14d以内的不同时间点采集小鼠血浆,分别利用实施例1(蛋白酶水解)和对比例1(未水解)的方法检测每个时间点采集的小鼠血浆中的α-鹅膏毒肽含量,统计检出率,结果如表7所示(LOD=0.3μg/L)。
表7不同检测方法对相同染毒小鼠血浆中α-鹅膏毒肽的检测结果
由表7可以看出,小鼠染毒α-鹅膏毒肽2d后,利用对比例1(未水解)的方法进行检测时,小鼠血清中均无法检出α-鹅膏毒肽(检测结果<LOD),而利用实施例1(蛋白酶水解)的方法进行检测时,大部分小鼠血清都能检出一定量的α-鹅膏毒肽,检出率为83.33%,检出范围为1~5μg/L。因此,通过两种方法对比,一方面可以确认血浆样品中存在蛋白结合态α-鹅膏毒肽,另一方面可以确认蛋白酶水解可以释放血浆中与蛋白质结合的α-鹅膏毒肽,从而提高α-鹅膏毒肽检出率和检出水平。
实验例3
本实验例用于验证蛋白酶水解时间和使用浓度对检测结果的影响:
(1)用于蛋白酶水解条件优化的样本的选择:由实验例2检测结果可知,α-鹅膏毒肽染毒剂量为0.33mg/kg或0.66mg/kg时,染毒后7d左右小鼠血浆中的α-鹅膏毒肽检测浓度达到峰值。因此,本实验例选用以0.33mg/kg的染毒剂量染毒6d-7d的小鼠血浆作为蛋白酶水解条件优化的样本。
(2)用于蛋白酶水解条件优化的样本的制备:大量收集以0.33mg/kg的染毒剂量染毒6d(20只)和7d(20只)的小鼠血浆,作为蛋白酶水解条件优化的小鼠待测血浆样品。
(3)蛋白酶水解时间优化:取小鼠待测血浆样品0.2ml,加入0.25%的胰蛋白酶溶液20μl,涡旋混匀,于37℃下水浴水解0~12h。分别于不同水解时间点取水解产物,按照实施例1操作(1)中的固相萃取法制备待测样品,并按照实施例1操作(3)中的UPLC-MS/MS法检测各待测样品中的α-鹅膏毒肽含量,染毒后7d(20只)的小鼠血浆重复水解试验两次,每个水解时间点平行检测两份样品,检测结果如表8-10和图2A-C所示(LOD=0.3μg/L)。
表8染毒6d时不同水解时间点小鼠血浆中α-鹅膏毒肽检测结果
表9染毒7d时不同水解时间点小鼠血浆中α-鹅膏毒肽检测结果(第1次)
表10染毒7d时不同水解时间点小鼠血浆中α-鹅膏毒肽检测结果(第2次)
由表8至表10可知,水解时间为2-12h以内,染毒6d和7d的小鼠血浆内均能检出α-鹅膏毒肽,且当水解时间为8h,检出水平最高。
(4)蛋白酶使用浓度优化:选用以0.33mg/kg的染毒剂量染毒6d的小鼠血浆为样品,取小鼠血浆样品0.2ml,加入0.25wt%~2.5wt%的胰蛋白酶溶液20μl,涡旋混匀,于37℃下水浴水解8h。分别取不同胰蛋白酶浓度下的水解产物,按照实施例1操作(1)中的固相萃取法制备待测样品,并按照实施例1操作(3)中的UPLC-MS/MS法检测各待测样品中的α-鹅膏毒肽含量,每个胰蛋白酶浓度平行检测两份样品,检测结果如表11和图3所示。
表11染毒6d时不同胰蛋白酶浓度下小鼠血浆中α-鹅膏毒肽检测结果
由表11可知,蛋白酶溶液使用量为20μl的情况下,胰蛋白酶溶液浓度为0.25wt%~2.5wt%(即样品中蛋白酶终浓度为0.03wt%~0.28wt%)时,染毒6d的小鼠血浆内均能检出α-鹅膏毒肽,且当胰蛋白酶溶液浓度为1%(样品中蛋白酶终浓度为0.11wt%)时,检出水平最高。
实验例4
本实验例用于验证本发明鹅膏毒肽检测方法的准确度和精密度(n=6):
分别取α-鹅膏毒肽加入小鼠空白血浆中配制成含1μg/L(LOQ浓度)、2μg/L(低浓度)、10μg/L(中浓度)和18μg/L(高浓度)的α-鹅膏毒肽的加标血浆。每种浓度水平的加标血浆各取200μl,按照实施例1操作(1)的方法制备待测样品,并按照实施例1操作(3)的UPLC-MS/MS法检测各待测样品中的α-鹅膏毒肽含量,每种浓度水平的加标血浆制作3批,每批平行制备6份待测样品,检测结果如表12所示。
表12准确度和精密度验证结果
由表12可以看出,本发明鹅膏毒肽检测方法在LOQ、低、中、高浓度水平下的批内加标回收率为85.6%-107.4%,批内相对标准偏差(RSD)为3.6%-8.1%;同时测定3批,批间加标回收率为84.2%-104.6%,批间相对标准偏差(RSD)为3.0%-6.6%。可见,本发明鹅膏毒肽检测方法的准确度和精密度均能满足中国药典生物样品定量分析方法验证指导原则的要求。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种非疾病诊断目的的鹅膏毒肽检测方法,其特征在于,所述检测方法包括对待测样品中的鹅膏毒肽进行检测的操作,其中,所述待测样品由待检样本经蛋白降解处理后制得。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述蛋白降解处理包括蛋白酶水解处理。
3.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,所述待测样品的制备方法包括:
取待检样本,与蛋白酶或蛋白酶溶液混合,水解,固相萃取,取洗脱液;
其中,所述待检样本与蛋白酶或蛋白酶溶液的混合操作使得蛋白酶的终浓度为0.03wt%~0.28wt%。
4.根据权利要求3所述的检测方法,其特征在于,所述水解的条件包括:水解温度为4~60℃,水解时间为0.5~24h;
可选的,水解时间为2~12h。
5.根据权利要求3所述的检测方法,其特征在于,所述固相萃取使用的淋洗溶剂为体积百分浓度1~20%的甲醇水溶液,使用的洗脱溶剂为甲醇;
可选的,所述淋洗溶剂的使用量为水解产物上样量的2~20体积倍,所述洗脱溶剂的使用量为水解产物上样量的2~20体积倍。
6.根据权利要求2~5中任一项所述的检测方法,其特征在于,所述待检样本包括血浆、尿液、胃液、胃肠道内容物匀浆上清液、粪便匀浆上清液及生物组织匀浆上清液中的至少一种;所述生物组织匀浆上清液包括肝脏匀浆上清液和/或肾脏匀浆上清液;
所述蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、非限制性水解蛋白酶、限制性水解蛋白酶、内肽酶、外肽酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、天门冬蛋白酶氨酸酶、真菌蛋白酶、细菌蛋白酶、植物蛋白酶、动物蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、羧肽酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶中的任一种。
7.根据权利要求3~5任一项所述的检测方法,其特征在于,采用UPLC-MS/MS法对待测样品中的鹅膏毒肽进行检测。
8.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,所述待测样品的制备方法还包括:
取所述洗脱液,除去溶剂,加入复溶溶剂,复溶后离心,取上清液,其中,所述复溶溶剂为体积百分浓度为5~20%的甲醇水溶液。
9.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,所述UPLC-MS/MS法的色谱条件包括:
柱温为30~50℃,流速为0.3mL/min,进样量为5~10μL;以0.2mM乙酸铵-0.1%甲酸水溶液为流动相A、乙腈为流动相B进行梯度洗脱,梯度洗脱程序包括:0~1.5min,流动相中乙腈的体积百分比为20%;1.5~3min,流动相中乙腈的体积百分比为20%→30%;3~4min,流动相中乙腈的体积百分比为30%→70%;4~4.1min,流动相中乙腈的体积百分比为70%→20%;4.1~5.5min,流动相中乙腈的体积百分比为20%;
所述UPLC-MS/MS法的质谱条件包括:
离子源:电喷雾电离源,正离子模式,多反应监测;毛细管电压:3.5kV;离子源温度:150℃;去溶剂化温度:350℃;去溶剂气流速:850L/h;锥孔气流速:50L/h。
10.根据权利要求1~9任一项所述的检测方法,其特征在于,所述鹅膏毒肽包括:α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、ε-鹅膏毒肽、鹅膏酸(amanin)、鹅膏蕈(amanullin)和鹅膏酰胺(amaninamide)中的至少一种。
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