CN112557568B - 一种雌二醇和雌酮的检测方法 - Google Patents

一种雌二醇和雌酮的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种雌二醇和雌酮的检测方法。本发明方法包括以下步骤：样本处理：取血清待测样品，加入内标D5‑雌二醇和13C3‑雌酮的乙腈水溶液，再加入萃取剂，离心，取上清液与碱水溶液混合，离心，取上清液浓缩、复溶，离心，取上清液进行液相色谱质谱法测定。本发明方法步骤简单操作方便，无需衍生化，取样量少，检测限低，样品前处理除杂效果佳，可满足临床各类人群的检测需求，特别是适用于极低浓度雌二醇和雌酮检测需求的人群。

Description

一种雌二醇和雌酮的检测方法
技术领域
本发明涉及分析领域，特别是涉及一种雌二醇和雌酮的检测方法。
背景技术
雌激素是一种具有广泛生物活性的类固醇激素，主要以17β-雌二醇(E2)、雌酮(E1)、雌三醇(E3)等形式存在，他们与雌激素受体(ERs)结合后可产生多种生理作用。E2是最具生物活性的雌激素，它是E1生物学效力的1.25-5倍，E3主要与妊娠相关，效力最弱。
雌激素在人体的生理作用主要有：辅助诊断青春期前的儿童和青少年卵巢功能缺陷，性腺发育不全，性腺功能减退症、性早熟和青春期前男子女性型乳房，也可用于鉴别诊断儿童中枢性性早熟；评估成年女性生殖功能，以辅助生殖；评估绝经期女性及老年男性因雌激素缺乏导致的骨折风险；以及用于雌激素或抗雌激素治疗药物的疗效监测等。
临床上雌二醇生理水平分布极宽，可以达到四个数量级，针对不同的人群，体内含量差异非常大，大部分人群的雌激素含量水平较低，特别是儿童、绝经期女性、男性、性发育延迟的青少年、服用芳香酶抑制剂治疗乳腺癌的女性等特殊人群，雌激素的水平更低，需要测量低至1pg/mL的浓度水平，而在进行体外受精计划的女性中，雌二醇的准确测量用于监测排卵诱导和卵巢过度刺激，则需要在大约3000pg/mL的水平上进行可靠的测量。
目前主要采用免疫法进行人体内雌激素(雌酮、雌二醇)的测定，受不同的内源性化合物的干扰(具有相似结构的雌激素异构体等)，免疫检测法无法区分且容易产生交叉反应，外源性雌激素(如共轭雌激素、营养补充剂等)也会干扰检测结果，导致结果的高估，同时，大多数直接免疫法只能检测低至30pg/mL的浓度水平，远远不能满足儿童、绝经期女性、男性、使用芳香酶抑制剂治疗的女性的测量需求，而间接免疫法虽然可检测更低浓度的雌二醇水平，但对于浓度＜5pg/mL的样本的检测也是存在困难。
串联质谱法在临床上的应用逐步被意识到，由于生物体内存在多种雌激素的结构类似物，为提高检测的特异性，多采用气相色谱质谱联用(GC-MS)分析法进行生物样品中的雌激素的检测，但气相色谱质谱联用分析法一般需要进行衍生化以降低沸点，促进气化，提高灵敏度，前处理复杂，分析时间长，不利于临床大样本的推广使用。液相色谱质谱联用法虽然能明显提高检测的通量，但由于目标物极性弱，不利于电离，实现低浓度测定也较困难，为了提升灵敏度采用衍生化法对雌二醇效果较差，可能导致与蛋白结合的雌激素水解，影响结果的准确性，且耗时较长，操作复杂。同时，背景干扰也是影响其检测限的一个重要因素。
因此本领域技术人员迫切需要解决的一个技术问题就是：如何提供一种前处理简单高效、耗时短、取样量少、试剂耗材成本低、易于规模化操作、灵敏度高(定量限低)、测量范围宽的检测方法，可满足不同人群的检测需求，特别是针对极低浓度水平的雌二醇的精准测量，可应用于临床的大样本人群推广。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种雌二醇和雌酮的检测方法，其前处理简单，定量限低，测量范围宽。
具体方案如下：
一种雌二醇和雌酮的检测方法，包括以下步骤：
样本处理：取血清待测样品，加入内标D5-雌二醇和13C3-雌酮的乙腈水溶液，再加入萃取剂，离心，取上清液与碱水溶液混合，离心，取上清液浓缩、复溶，离心，取上清液进行液相色谱质谱法测定。
在其中一些实施例中，所述碱水溶液为氨水溶液。
在其中一些实施例中，所述氨水溶液的体积浓度为0.1-0.3％。
在其中一些实施例中，所述氨水溶液与血清待测样品的体积比为(0.8～3):1，进一步优选为(0.8～1.5):1。
在其中一些实施例中，所述液相色谱质谱法的色谱柱柱温为50～70℃，优选为60±2℃。
在其中一些实施例中，所述液相色谱质谱法中液相色谱的流动相中的水相为0.08-0.3mmol/L氟化铵水溶液。
在其中一些实施例中，所述水相为0.08-0.15mmol/L氟化铵水溶液。
在其中一些实施例中，所述液相色谱质谱法中液相色谱的流动相中的有机相为体积比为(2-5):1的乙腈和甲醇混合溶液。
在其中一些实施例中，所述有机相为体积比为(3.5-4.5):1的乙腈和甲醇混合溶液。
在其中一些实施例中，所述液相色谱质谱法中质谱的分辨率为：一级质量分析器分辨率＝0.2或0.4，二级质量分析器的分辨率＝0.7或1.2；优选地，所述液相色谱质谱法中质谱的分辨率为：一级质量分析器分辨率＝0.4，二级质量分析器的分辨率＝1.2。
在其中一些实施例中，所述萃取剂为甲基叔丁基甲醚。
在其中一些实施例中，所述萃取剂与血清待测样品的体积比为(110～150):25，优选为(110～130):25。
在其中一些实施例中，所述复溶所用的复溶液为体积分数为8-30％的乙腈水溶液，进一步优选为体积分数为8-12％的乙腈水溶液。
在其中一些实施例中，所述内标D5-雌二醇和13C-雌酮的乙腈水溶液中，乙腈水溶液的体积分数为8-30％，进一步优选为8-12％。
在其中一些实施例中，所述复溶液与血清待测样品的体积比为(8-14)：25，进一步为(8-12)：25。
在其中一些实施例中，所述液相色谱条件还包括：色谱柱：Waters ACQUITY UPLCBEH C18；进样量为60-85μL，流速为0.2-0.5ml/min，所述血清待测样品的体积为220～270μL。
在其中一些实施例中，所述进样量为75-85μL，流速为0.2-0.4ml/min。
在其中一些实施例中，所述液相色谱的洗脱程序为：
0～0.5min，有机相5-20％，水相80-95％；
0.5～1min，有机相5-20％→30-40％，水相80-95％→60-70％；
1～6min，有机相30-40％→45-60％，水相60-70％→40-55％；
6～7.1min，有机相45-60％，水相40-55％；
7.1～7.11min，有机相45-60％→100％，水相40-55％→0％；
7.11～8min，有机相100％，水相0％；
8.0～9.0min，有机相100％→5-20％，水相0％→80-95％。
在其中一些实施例中，所述液相色谱的洗脱程序为：
0～0.5min，有机相5-15％，水相85-95％；
0.5～1min，有机相5-15％→30-40％，水相85-95％→60-70％；
1～6min，有机相30-40％→50-54.9％，水相60-70％→45.1-50％；
6～7.1min，有机相53-54.9％→55-60％，水相45.1-47％→40-45％；
7.1～7.11min，有机相55-60％→100％，水相40-45％→0％；
7.11～8min，有机相100％，水相0％；
8.0～9.0min，有机相100％→5-15％，水相0％→85-95％。
在其中一些实施例中，所述质谱检测的离子源为电喷雾离子源，在负离子模式下，采用多反应监测模式；其中，
雌二醇定性离子对的质荷比为：母离子271.2，子离子183.2；
雌二醇定量离子对的质荷比为：母离子271.2，子离子145.2；
内标D5-雌二醇离子对的质荷比为：母离子276.2，子离子147.0；
雌酮定性离子对的质荷比为：母离子269.2，子离子143.1；
雌酮定量离子对的质荷比为：母离子269.2，子离子145.1；
13C-雌酮内标离子对的质荷比为：母离子272.1，子离子148.1。
在其中一些实施例中，所述离心的转速为10000-13000rpm。
在其中一些实施例中，离心后于-20～-70℃冰冻30-60min再取上清液与碱水溶液混合，优选于-50～-70℃冰冻30-60min再取上清液与碱水溶液混合。
在其中一些实施例中，离心后于-20～-70℃冰冻30-60min再取上清液进行浓缩，优选于-50～-70℃冰冻30-60min再取上清液进行浓缩。
在其中一些实施例中，所述浓缩包括氮气吹干。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
针对现有检测方法受结构类似物和底物的干扰大，造成测定结果不准确，难以实现低至1pg/mL的低浓度测定，无法满足特殊人员的需求，并且前处理操作复杂，需衍生化等问题，本发明提供一种前处理简单，定量限低，测量范围宽的血清中雌二醇和雌酮的检测方法。
本发明方法通过在样品前处理过程中进行中加入乙腈进行蛋白沉淀，经萃取后加入碱性溶液净化即可，步骤简单操作方便，无需衍生化，加入碱性溶液净化可以有效除去未知杂质的干扰，提高定量准确性和稳定性，降低信噪比，从而可以检测更低浓度的样品，实现了更低的定量限(3.7pmol/L-3700pmol/L或1pg/mL-100pg/mL))，拓宽了可报告范围(3.7pmol/L-185000pmol/L或1pg/mL-50000pg/mL)，可满足临床各类人群的检测需求，特别是适用于极低浓度雌二醇和雌酮检测需求的人群。
血清样本中磷脂是引起基质效应的主要原因之一，当磷脂与目标化合物雌二醇、雌酮共流出的时候，会产生离子竞争，进而产生基质抑制效应。本发明的发明人在研究中进一步发现，选择柱温为非常规的50～70℃，可以明显降低血清中磷脂的基质效应，提升E1、E2离子化效率，提升检测通量。并且，当同时控制流动相的中的水相为0.08-0.3mmol/L氟化铵水溶液，有机相为体积比为(2-5):1(尤其是3.5-4.5:1)的乙腈和甲醇混合溶液时，一方面可以有效提高离子化效率，并缩短出峰时间，提高仪器检测通量；另一方面能有效降低磷脂在C18色谱柱中的潴留，从而降低其引起的基质效应。
此外，从质谱的扫描原理来说，分辨率越高，目标化合物扫描越精准，与杂质分离度越高，常规方法一般采用中等的分辨率，可兼顾灵敏度和准确度，本发明的发明人发现，通过优化质量分析器的分辨率，由常规的中等分辨率(0.7；1.2)优化为非常规的不同分辨率的组合(尤其是一级质量分析器分辨率＝0.4，二级质量分析器的分辨率＝1.2)，可以减低生物样品中复杂的基质以及结构类似物对目标化合物的干扰，使基线更低，同时保证具有良好的灵敏度、准确度和高的信噪比，有利于检测更低的目标物质浓度，拓宽检测方法线性范围。
附图说明
图1为雌酮(E1)线性回归曲线；
图2为雌二醇(E2)线性回归曲线；
图3为未经碱洗处理样品(A)的色谱图(干扰峰)；
图4为碱洗处理样品(A)的色谱图(无干扰峰)；
图5为未经碱洗处理样品(B)的色谱图(基线高)；
图6为碱洗处理样品(B)的色谱图(基线低)；
图7为柱温30℃的色谱图(磷脂干扰)；
图8为柱温60℃的色谱图(磷脂干扰)；
图9为不同一级质量分析器、二级质量分析器分辨率的色谱图中雌二醇的色谱峰(一级质量分析器FWHM＝0.2/0.4/0.7/1.2(从左至右)，二级质量分析器FWHM＝1.2)；
图10为不同一级质量分析器、二级质量分析器分辨率的色谱图中雌二醇的色谱峰(一级质量分析器FWHM＝0.4，二级质量分析器FWHM＝0.2/0.4/0.7/1.2时(从左至右))。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
1)试剂配置
储备液配制：用乙醇配制浓度为1mg/mL的雌酮、雌二醇储备液，以及浓度为1mg/mL的雌酮-2,3,4-13C3(13C3-E1)、17β-雌二醇-2,4,16,16,17-d5(d5-E2)的内标储备液；
曲线工作液配制：以10％(v/v)乙腈水溶液为空白基质使用容量瓶配制一系列标准工作曲线，曲线浓度范围为雌酮3.7-3700pmol/L，雌二醇为3.7-3700pmol/L。
内标工作液配制：用10％乙腈水稀释内标储备液，配制浓度为2400pmol/L的内标工作液。
2)液相条件
色谱柱采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(
Figure BDA0002849353620000071
1.7μm,2.1mm×100mm)；流动相A(水相)为0.1mM氟化铵水溶液，流动相B(有机相)为80％乙腈+20％甲醇混合溶液，柱温为60℃，进样量为80μL，流速和洗脱程序如表1所示。
表1液相条件
Figure BDA0002849353620000072
3)质谱条件
本方法使用美国Thermo TSQ Altis液相色谱质谱仪，采用电喷雾离子源(ESI)，在负离子模式下，多反应监测模式(MRM)，一级质量分析器FWHM＝0.4，二级质量分析器FWHM＝1.2。
表2质谱条件
Figure BDA0002849353620000081
表3源参数
Figure BDA0002849353620000082
4)样本处理
A.吸取250μL血清基质样品至2.0mL离心管中，加入25μL含内标的乙腈水溶液，加入1200μL萃取剂甲基叔丁基甲醚(MTBE)，漩涡剧烈震荡5min；
B.12000rpm、常温离心10min；
C.-50～-80℃冰冻30-60min，上层转至2.0mL离心管中，加入250μL 0.1-0.3％(v/v)氨水溶液漩涡剧烈震荡5min；
D.12000rpm、常温离心5min；
E.-70℃冰冻30-60min，上层转至1.5mL离心管中，氮气吹干；
F.加入80-120μL复溶液(体积分数为10％的乙腈水)，漩涡剧烈震荡3min后，12000rpm、常温离心5min，转移至1.5mL进样瓶中；
G.使用LC-MS/MS进行测定。
实施例2方法精密度(实施例1)
取250μL低、中、高三个浓度的雌激素质控品，浓度分别为：雌酮：36、300、2500pmol/L，雌二醇：36、330、3700pmol/L。批内精密度是每个样本重复测定20次。批间精密度每批测定2次，连续测定10天，共20次测量。
结果批内精密度(n＝20)：雌酮CV为1.8％-2.8％，雌二醇CV为2.4-5.3％，批间精密度(n＝20)：雌酮CV为2.0％-3.3％，雌二醇CV为4.4-7.9％，具有良好的精密度。
表4方法精密度
Figure BDA0002849353620000091
雌激素具有广泛的生物活性，低浓度水平的精准测定是限制其在临床推广使用的难点，随着浓度的降低，逐步接近方法的检测极限，数据的变异系数也随着变大，目前，在测定血清中雌激素水平的方法中，一般定量限只能做到10pg/mL(约37pmol/L)，检测精密度CV在10-20％之间。本发明在测定10pg/mL(约37pmol/L)的样本的时候，雌酮CV＜4％，雌二醇CV＜6％，表现出良好的重现性，证明本发明所提供的方法在检测雌激素低浓度水平样本时有优良的性能，可精准测量低水平的雌激素样本。
具体实施例3：方法准确度(实施例1)
回收率试验：取250μL高、中、低浓度的血清基质样本，检测血清基质样本浓度为：雌酮：4.37pmol/L、85.7pmol/L、456pmol/L，雌二醇：3.78pmol/L、185pmol/L、1234pmol/L，分别加入高、中、低浓度的标准溶液，检测血清基质样本和加标后的样本，每个样本平行做3次。
结果显示，血清基质中雌酮的加标回收率在89.2％～109.7％之间，雌二醇的加标回收率在86.5％～111.8％，具有良好的准确度。
具体实施例4：线性范围及稀释倍数(实施例1)
以10％乙腈水溶液为空白基质分别配制雌酮为3700pmol/L，雌二醇3700pmol/L的高浓度样本，逐一倍数稀释，得到不同曲线点其具体浓度；每个浓度的样本每天平行处理2个，测定3天，结果显示，雌酮、雌二酮在3.70-3700pmol/L之间线性良好，相关系数在0.99以上，回收率在90-110％之间，满足定量要求。(见表5及图1、2)，本发明线性范围还可根据临床应用的需求，进一步拓宽线性范围至50000pmol/L。
取1接近曲线高点浓度的血清样本，以10％乙腈水为基质，按照2、5、10、25、50倍进行稀释，稀释前(原样)与稀释后的血清样本分别平行处理5个，计算各稀释后浓度样本的回收率，结果显示，在50倍稀释倍数下回收率在85-115％之间，表明该方法可对线性高点附近的样本(接近3700pmol/L)进行最高50倍稀释，以此拓宽结果的检测范围，该发明所提供的方法可检测的样本浓度范围为3.7pmol/L-185000pmol/L，既可满足儿童、绝经期妇女、高龄男性及服用芳香酶抑制剂特殊人员的体内极低浓度的雌激素检测需求，也可满足使用辅助生殖技术的女性及怀孕后妇女体内较高的雌激素水平的检测需求，与现有的方法相比，线性范围更宽，临床应用范围更广。(见表6、7)
表5方法线性范围
Figure BDA0002849353620000111
表6雌酮稀释倍数验证
Figure BDA0002849353620000112
表7雌二醇稀释倍数验证
Figure BDA0002849353620000113
具体实施例5
随机挑选10例样本，每个样品平行取2次，其中一组按照本发明实施例1的前处理方法进行样品处理，另一组不进行本发明实施例1中前处理的碱洗步骤，其他与本发明实施例1前处理方法和其他条件一致；
将两组数据进行峰型比较，可发现，部分病人样品中由于基质较复杂。未经碱处理的方法，待测物出峰附近出现未知干扰峰，影响样品定量的准确性和稳定性，并且基线高，信噪比低(见图3，5)。在本发明方法通过对待测样品进行碱洗，其一除去了杂质干扰物，避免杂质对定量产生影响；其二，样本洁净程度提高，基线降低，信噪比增高，可检测更低浓度的样品(见图4，6)，其三对色谱柱和检测设备也可起保护作用。
具体实施例6
收集6个不同来源的病人样本，分别编号为A、B、C、D、E、F。
使用配制标准曲线的空白基质(10％乙腈水溶液)配制高、低两个不同浓度水平的标准溶液，分别编号为H、L。
将每个病人样本(A、B、C、D、E、F)分别与配制的高低浓度标准溶液(H、L)以1：1的比例进行稀释混合得混合样本。
将上述的高低浓度标准溶液、6个不同来源的病人样本和混匀后得到的12个样本，在同一批次内进行检测，每个样本平行处理3次；
比较混合样本的响应值(分析物峰面积/内标峰面积)与病人样本和标准溶液响应值的平均值的差异。要求差异小于20％，则说明无相对基质效应；
结果如表8所示，混合样本中雌二醇、雌酮的响应值与高低浓度样本和病人样本中雌二醇、雌酮响应值的均值差异均小于20％，说明无相对基质效应，可使用10％的乙腈水作为雌激素的替代基质使用。
表8雌酮和雌二醇相对基质效应
Figure BDA0002849353620000121
Figure BDA0002849353620000131
具体实施例7
本实施例与实施例1的区别在于，柱温为30℃。
结果如图7所示，当柱温为30℃时，E1、E2在7.96min、7.03min与磷脂(m/z184＞184通道)共洗脱。而当柱温由30℃升高至60℃的时候，磷脂、E1、E2的保留时间均有所提前，如图8所示，E1、E2在7.13min、6.44min与磷脂(m/z184＞184通道)共洗脱，磷脂的基质效应明显降低。
血清样本中磷脂是引起基质效应的主要原因之一，当磷脂与E1、E2目标化合物共流出的时候，会产生离子竞争，进而产生基质抑制效应，而E2离子化效率较差，因此难以实现低浓度测定。本发明方法通过控制柱温为60℃，改变磷脂和E2的洗脱时间，明显降低磷脂的基质效应，降低绝对基质效应，不仅可高离子化效率，还可缩短分析时间，提升检测通量(见表9)。
表9不同柱温下雌酮(E1)和雌二醇(E2)的响应和保留时间
Figure BDA0002849353620000141
具体实施例8
本实施例与实施例1的区别在于，一级质量分析器和二级质量分析器的分辨率不同。具体如以下八组所示：
(1)一级质量分析器FWHM＝0.2，二级质量分析器FWHM＝1.2。
(2)一级质量分析器FWHM＝0.4，二级质量分析器FWHM＝1.2(实施例1)。
(3)一级质量分析器FWHM＝0.7，二级质量分析器FWHM＝1.2。
(4)一级质量分析器FWHM＝1.2，二级质量分析器FWHM＝1.2。
(5)一级质量分析器FWHM＝0.4，二级质量分析器FWHM＝0.2。
(6)一级质量分析器FWHM＝0.4，二级质量分析器FWHM＝0.4。
(7)一级质量分析器FWHM＝0.4，二级质量分析器FWHM＝0.7。
(8)一级质量分析器FWHM＝0.4，二级质量分析器FWHM＝1.2(实施例1)。
如图9，一级质量分析器FWHM＝0.2、0.4、0.7或1.2，二级质量分析器FWHM＝1.2时，随着FWHM的增大，基线噪音明显增高，同时，雌二醇与未知干扰物的分离度逐步降低，当一级质量分析器FWHM＝0.7和1.2时，雌二醇与未知干扰物未能实现色谱分离，而一级质量分析器FWHM＝0.2，峰面积响应值为7151，低于实施例1(一级质量分析器FWHM＝0.4，二级质量分析器＝1.2)的峰面积响应值8448。
如图10，一级质量分析器FWHM＝0.4，二级质量分析器＝0.2、0.4、0.7或1.2，雌二醇分离度未见明显变化，响应逐级提升(峰面积分别为：1960→5788→7635)，都低于实施例1的峰面积响应值8448。
串联质谱法在进行目标化合物筛选的时候，一般在方法建立的时候均常规选择中等分辨率(FWHM＝0.7)，兼顾灵敏度和分辨率。但是，本发明实施例1选择一级质量分析器FWHM＝0.4，二级质量分析器FWHM＝1.2，既可减低生物样品里面复杂的基质及结构类似物对目标化合物的干扰，使基线更低，又能保证一定的灵敏度，响应更高，可检测更低的浓度。
具体实施例9
检测同一个样品，本实施例与实施例1的区别在于，水相不同。具体如(1)～(2)所示：
(1)水相为0.1mmol/L甲酸铵。
(2)水相为0.1mmol/L乙酸铵。
结果如表10所示，实施例1选择NH4F作为水相，与有机相配合，响应值大，有利于最大化地提高E1、E2的离子化效率，选择其他离子例如甲酸铵和乙酸铵的响应值低于实施例1。
表10不同水相(含0.1mmol/L铵盐)下E1、E2的响应
流动相-水相 E1 E2
(1)0.1mmol/L甲酸铵 54559 14567
(2)0.1mmol/L乙酸铵 28315 5673
实施例1(0.1mmol/L氟化铵) 102702 25927
具体实施例10
本实施例与实施例1的区别在于，有机相不同。具体如(1)～(5)所示：
(1)有机相为甲醇。
(2)有机相为乙腈。
(3)有机相为：乙腈:甲醇＝1:1。
(4)有机相为：乙腈:甲醇＝2:1。
(5)有机相为：乙腈:甲醇＝3:1。
表11不同有机相下E1、E2的响应、保留时间、系统压力
有机相 E1 RT-E1 E2 RT-E2 初始压力/Bar
(1)甲醇 35090 9.37 10805 9.31 332
(2)乙腈 32930 6.37 11909 5.69 304
(3)乙腈:甲醇＝1:1 41015 8.18 13417 7.61 317
(4)乙腈:甲醇＝2:1 42627 7.71 12814 7.07 310
(5)乙腈:甲醇＝3:1 44303 7.22 13218 6.54 305
实施例1(乙腈:甲醇＝4:1) 40848 7.11 12940 6.42 307
如表11，(1)和(2)单独使用甲醇、乙腈作为有机相，对于离子化效率影响不大，但样本出峰时间差异较大。实施例1选择80％乙腈+20％甲醇作为有机相，配合水相，既可有效地提高离子化效率，缩短出峰时间，提高仪器检测通量，同时，还能降低系统压力，进一步保护色谱柱。另一方面，本发明的发明人还发现，在进行高通量的项目时，磷脂容易在常规的C18柱潴留，基质效应越来越明显，在有机相中保留20％的甲醇溶剂，还可以减少磷脂带来的基质效应影响，发明人推测其可能原因是相比纯乙腈，磷脂在保留20％甲醇的体系中溶解度更高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种雌二醇和雌酮的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
样本处理：取血清待测样品，加入内标D5-雌二醇和13C3-雌酮的乙腈水溶液，再加入萃取剂，离心，取上清液与碱水溶液混合，离心，取上清液浓缩、复溶，离心，取上清液进行液相色谱质谱法测定；所述萃取剂为甲基叔丁基甲醚；
所述液相色谱质谱法的色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18；流动相中的水相为0.08-0.3mmol/L氟化铵水溶液，有机相为体积比为（2-5）:1的乙腈和甲醇混合溶液；
所述液相色谱的洗脱程序为：
0~0.5min，有机相5-20%，水相80-95%；
0.5~1min，有机相5-20%→30-40%，水相80-95%→60-70%；
1~6min，有机相30-40%→45-60%，水相60-70%→40-55%；
6~7.1min，有机相45-60%，水相40-55%；
7.1~7.11min，有机相45-60%→100%，水相40-55%→0%；
7.11~8min，有机相100%，水相0%；
8.0~9.0min，有机相100%→5-20%，水相0%→80-95%；
所述液相色谱质谱法中质谱的分辨率为：一级质量分析器的分辨率=0.2或0.4，二级质量分析器的分辨率=0.7或1.2。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述碱水溶液为氨水溶液；所述氨水溶液的体积浓度为0.1~0.3%。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱质谱法的色谱柱柱温为50~70℃。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱质谱法的色谱柱柱温为60±2℃。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述有机相为体积比为（3.5-4.5）:1的乙腈和甲醇混合溶液。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱质谱法中质谱的分辨率为：一级质量分析器分辨率=0.4，二级质量分析器的分辨率=1.2。
7.根据权利要求1~6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述萃取剂与血清待测样品取样量的体积比为（110~150）:25；和/或，所述复溶所用的复溶液为体积分数为8-30%的乙腈水溶液；和/或，所述内标D5-雌二醇和13C-雌酮的乙腈水溶液中，乙腈水溶液的体积分数为8-30%。
8.根据权利要求1~6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱条件还包括：
进样量为：60-85μL，流速为：0.2-0.5 ml/min；血清待测样品的体积为220~270μL。
9.根据权利要求1~6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述质谱检测的离子源为电喷雾离子源，在负离子模式下，采用多反应监测模式；
雌二醇定性离子对的质荷比为：母离子271.2，子离子183.2；
雌二醇定量离子对的质荷比为：母离子271.2，子离子145.2；
内标D5-雌二醇离子对的质荷比为：母离子276.2，子离子147.0；
雌酮定性离子对的质荷比为：母离子269.2，子离子143.1；
雌酮定量离子对的质荷比为：母离子269.2，子离子145.1；
13C-雌酮内标离子对的质荷比为：母离子272.1，子离子148.1。
10.根据权利要求1~6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述离心的转速为10000-13000 rpm；和/或，离心后于-20~-70 ℃冰冻30-60min再取上清液与碱水溶液混合；和/或，离心后于-20~-70 ℃冰冻30-60min再取上清液进行浓缩；和/或，所述浓缩包括氮气吹干。
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