CN106908543A - 一种人血浆中吉非替尼含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人血浆中吉非替尼含量的检测方法,包括如下步骤:(1)标准工作溶液的配制;(2)样品处理;(3)标准曲线制作;(4)定量分析:取试验样品按照步骤(3)的方法处理,并按步骤(3)所得的标准曲线方程计算,得到待测样品中吉非替尼的浓度。本发明应用液质联用技术(HPLC‑MS/MS)测定人血浆中吉非替尼的浓度,准确定量人血浆中吉非替尼的浓度,通过色谱柱、溶解液、流动相、质谱条件等的合理选择,流速、洗脱方式、质谱条件等工艺条件的优化,排除基质效应的影响,使得整个定量检测方法切实可行,操作简便,重复性高,准确性好,可操作性强,可以直接运用于生物等效性中样品检测分析。
Description
技术领域
本发明属于生物分析领域,更具体地,涉及一种应用液质联用技术(HPLC-MS/MS)进行人血浆中吉非替尼含量的检测方法。
背景技术
吉非替尼,又名易瑞沙,是一种选择性表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂,该酶通常表达于上皮来源的实体瘤。对于EGFR酪氨酸激酶活性的抑制可妨碍肿瘤的生长,转移和血管生成,并增加肿瘤细胞的凋亡。在体内,吉非替尼广泛抑制异种移植于裸鼠的人肿瘤细胞衍生系的肿瘤生长,并提高化疗、放疗及激素治疗的抗肿瘤活性。在临床实验中已证实吉非替尼对局部晚期或转移性非小细胞肺癌具客观的抗肿瘤反应并可改善疾病相关的症状。药物代谢动力学特性静脉给药后,吉非替尼迅速廓清,分布广泛,平均清除半衰期为48小时。
吉非替尼作为一种用于治疗非小细胞肺癌的分子靶向药物,我国需求量较大。目前国内基本使用外资药企的产品,价格昂贵,为了提高我国人民用药的可及性,减轻癌症病人的经济负担,能用的起更便宜、质量比原研药相当的仿制药,亟需提供吉非替尼的一种新的检测方法,可以快速定量人口服用药后人体血浆的浓度。
发明内容
本发明针对上述现有技术中的不足,提供了一种人血浆中吉非替尼含量的检测方法,通过液液萃取的样品处理方式从人血浆中提取吉非替尼,将提取过的样品进行稀释,并进行液质联用分析。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
一种人血浆中吉非替尼含量的检测方法,包括如下步骤:
(1)标准工作溶液的配制:称取吉非替尼,加入甲醇,配制成浓度为2.00~3.00mg·mL-1的吉非替尼储备液,将所述吉非替尼储备液用体积比1:1的甲醇-水溶液稀释成梯度浓度为0.100~100μg·mL-1的吉非替尼工作溶液;按上述步骤重复一次,配置成梯度浓度为0.100~850μg·mL-1的吉非替尼平行工作溶液;称取盐酸吉非替尼-d3,加入甲醇,配制成浓度为0.450~0.550mg·mL-1的内标储备液,再用体积比1:1的甲醇-水溶液稀释成0.1~5.00μg·mL-1的内标工作溶液;所有储备液及工作溶液在0~10℃下保存,备用;
取空白人正常血浆,分别加入所述吉非替尼工作溶液,混匀,配置成相应梯度的校正标样,其梯度浓度范围为5.00~5000ng·mL-1;取空白人正常血浆,分别加入所述吉非替尼平行工作溶液,混匀,配置成相应梯度的质控样品,其梯度浓度范围为15.0~42500ng·mL-1;
(2)样品处理:取等体积的校正标样、质控样品、试验样品、空白人血浆和水,往校正标样、质控样品、试验样品中分别加入所述内标工作溶液,往空白人血浆和水中分别加入体积比1:1的甲醇-水溶液;向上述每个混合液中加入乙腈,混匀,离心,转移上清液,将各提取物保存;
(3)标准曲线制作:将步骤(2)得到校正标样、质控样品的提取物进行LC-MS/MS分析测定,以吉非替尼和内标吉非替尼-d3的色谱峰面积比为纵坐标,以人血浆中吉非替尼的浓度为横坐标制作标准曲线;
(4)定量分析:取试验样品按照步骤(3)的方法处理,并按步骤(3)所得的标准曲线方程计算,得到待测样品中吉非替尼的浓度。
优选地,步骤(3)中所述LC-MS/MS分析测定过程的工作条件为:
a.色谱条件:色谱柱为UItimateXB C18;流动相A:0.1%甲酸和10mM甲酸铵的水溶液;流动相B:0.1%甲酸的乙腈溶液;柱温箱温度:30℃;流速:1.20mL/min;色谱柱平衡状态时的柱压:17.5~18.5MPa;洗脱方式为梯度洗脱;
b.质谱条件:离子源为ESI源,采用正离子模式、多反应监测模式;电喷雾电压:5500V;涡旋离子喷雾温度:550℃;气帘气种类:30psi;碰撞池气体种类:中级;雾化气种类Gas1:50psi;辅助气Gas 2:60psi;数据收集时间:2.70min。
优选地,步骤(1)中所述吉非替尼储备液的浓度为2.50mg·mL-1,所述内标储备液的浓度为0.500mg·mL-1,所述吉非替尼工作溶液的梯度浓度分别为0.100、0.200、1.00、4.00、10.0、50.0、90.0、100μg·mL-1,所述吉非替尼平行工作溶液的浓度梯度为0.100、0.300、4.50、75.0、850μg·mL-1,所述内标工作溶液的浓度分别为5.00μg·mL-1、100ng·mL-1。
优选地,步骤(1)所述质控样品的梯度浓度分别为15.0、225、3750、42500ng·mL-1;所述质控样品于-60~-90℃储存;所述校正标样的梯度浓度分别为5.00、10.0、50.0、200、500、2500、4500、5000ng·mL-1;所述校正标样为新鲜配制。
优选地,步骤(2)所述离心的条件为在4℃、以1700×g的速度离心15min。
优选地,步骤(1)还往所述内标工作溶液中加入体积比为1:1的甲醇-水溶液进行稀释,配制得到准确度/稳定性评价溶液。
优选地,步骤(3)所述色谱条件还包括:进样体积2.00μL;自动进样器清洗溶液为甲醇;自动进样器洗针体积:400μL;压脚提升量:48mm;自动进样针清洗时浸泡时间1s;自动进样器清洗模式:进样前清洗和进样后清洗;自动进样器温度:4.0℃。
优选地,步骤(3)所述LC-MS/MS分析测定过程中吉非替尼的监测离子对为447.3/128.0,每次扫描一个离子对时所停留的时间150ms,去簇电压105V,碰撞能量41eV,质谱保留时间0.60~0.62min。
优选地,步骤(3)所述LC-MS/MS分析测定过程中内标吉非替尼-d3的监测离子对为450.1/128.0;每次扫描一个离子对时所停留的时间150ms,去簇电压92V,碰撞能量44.00eV,质谱保留时间0.60~0.62min。
与现有技术相比,本发明有益效果在于:(1)人血浆中吉非替尼定量检测的范围在5.00~5000ng/mL之间,精确检测范围在1000倍,同时进行了稀释可靠性研究,能够准确定量高于上线10倍的检测范围内;(2)优化了人血浆样品中基质效应的影响,通过简单的蛋白沉淀就可以完成样品分析流程,简化节约了处理过程,使实际操作过程周期短;(3)采用了吉非替尼-d3的同位素内标做为定量检测的标定物,与分析物内标的保留因子相似,排除了内标的干扰;(4)通过考察稳定性,基质效应,确保分析物溶液是可控的。本发明应用液质联用技术(HPLC-MS/MS)测定人血浆中吉非替尼的浓度,实现了一整套的检测分析的流程,准确定量人血浆中吉非替尼的浓度,通过色谱柱、溶解液、流动相、质谱条件等的合理选择,流速、洗脱方式、质谱条件等工艺条件的优化,使得整个定量检测方法切实可行,操作简便,仪器自动化程度高,重复性高,准确性好,可操作性强,可以直接运用于生物等效性中样品检测分析。
附图说明
图1为本发明人血浆中吉非替尼含量的检测方法的标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例中采用以下市售药品、实验耗材及仪器。
乙腈:色谱纯,Fisher Scientific。
甲醇:色谱纯,Fisher Scientific。
甲酸:色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司。
甲酸铵:色谱纯,Fisher Scientific。
超纯水:自制(纯水仪型号及厂家:Master-S15UV,上海和泰仪器有限公司)。
分析天平:BT125D十万分之一电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。
离心机:Sorvall Legend Micro 17R高速离心机,Thermo Scientific。
GL-20150MS离心机,BIORIDGE。
涡旋混合仪:MTV-100,杭州奥盛仪器有限公司。
超声波清洗器:KQ5200E,昆山市超声仪器有限公司。
移液器:0.5-10μL,2-20μL,20-200μL,100-1000μL,0.5-5mL,Eppendorf。
连续移液器:Multipipette Plus,Eppendorf。
移液站:Cybi-SELMA 96,德国耶拿分析仪器股份公司。
玻璃样品瓶及螺旋盖:3.0mL,5.0mL,7.0mL,10.0mL,20.0mL,南通叠泰实验仪器有限公司。
96孔深孔板:P-DW-20-C,2.00mL,GEB公司。
96孔深孔板密封垫:P-DW-20-C,2.00mL,GEB公司。
聚丙烯离心管:1.5mL,2.0mL,5.0mL,10.0mL,15.0mL,50.0mL,海门乐博科技有限公司。
聚丙烯冻存管:2.0mL,海克拉斯实验器材有限公司。
色谱柱:Ultimate XB C18,2.1×50.0mm,5.0μm,Welch。
高效液相色谱泵:LC-20AD XR,Shimadzu公司。
自动进样器:SIL-20AC XR,Shimadzu公司。
柱温箱:CTO-20AC,Shimadzu公司。
质谱仪:QTRAP 4500,AB Sciex公司。
注:实验耗材可根据实验使用情况和实验室库存情况进行适当调整。
本发明建立的人血浆中吉非替尼含量的检测方法,包括如下步骤:
(1)标准工作溶液的配制:称取吉非替尼,加入甲醇,配制成浓度为2.00~3.00mg·mL-1的吉非替尼储备液,将所述吉非替尼储备液用体积比1:1的甲醇-水溶液稀释成梯度浓度为0.100~100μg·mL-1的吉非替尼工作溶液;按上述步骤重复一次,配置成梯度浓度为0.100~850μg·mL-1的吉非替尼平行工作溶液;称取盐酸吉非替尼-d3,加入甲醇,配制成浓度为0.450~0.550mg·mL-1的内标储备液,再用体积比1:1的甲醇-水溶液稀释成0.1~5.00μg·mL-1的内标工作溶液;所有储备液及工作溶液在0~10℃下保存,备用;
取空白人正常血浆,分别加入所述吉非替尼工作溶液,混匀,配置成相应梯度的校正标样,其梯度浓度范围为5.00~5000ng·mL-1;取空白人正常血浆,分别加入所述吉非替尼平行工作溶液,混匀,配置成相应梯度的质控样品,其梯度浓度范围为15.0~42500ng·mL-1;
(2)样品处理:取等体积的校正标样、质控样品、试验样品、空白人血浆和水,往校正标样、质控样品、试验样品中分别加入所述内标工作溶液,往空白人血浆和水中分别加入体积比1:1的甲醇-水溶液;向上述每个混合液中加入乙腈,混匀,离心,转移上清液,将各提取物保存;
(3)标准曲线制作:将步骤(2)得到校正标样、质控样品的提取物进行LC-MS/MS分析测定,以吉非替尼和内标吉非替尼-d3的色谱峰面积比为纵坐标,以人血浆中吉非替尼的浓度为横坐标制作标准曲线;
(4)定量分析:取试验样品按照步骤(3)的方法处理,并按步骤(3)所得的标准曲线方程计算,得到待测样品中吉非替尼的浓度。
以下以具体实施条件为例对本发明方法进行进一步说明。
实施例1实验溶液和工作溶液的配制
流动相A(含0.1%甲酸与10mM甲酸铵的水溶液)[记作MPA]:在装有1000mL超纯水的玻璃瓶中加入1.00mL甲酸与约631mg甲酸铵,振荡混匀。储存条件:室温。有效期:2周。
流动相B(含0.1%甲酸的乙腈溶液)[记作MPB]:在装有1000mL乙腈的玻璃瓶中加入1.00mL甲酸,振荡混匀。储存条件:室温。有效期:2周。
甲醇:水(50:50,v:v)[记作R01]:在一个玻璃瓶中加入500mL甲醇和500mL水,振荡混匀。储存条件:室温。有效期:1个月。
注:溶液的配制体积可根据所用组成试剂或溶液体积按比例调整。
吉非替尼的储备液通过两次独立称量,分别配制获得。所有配制的储备液都应保存在0~10℃冰箱中。有效期设定为一年,但在一年内可以评价其稳定性,以测定的实际稳定性数据为准。配制校正标样和质控样品的工作溶液必须来自两次独立称量的储备液。
吉非替尼储备液[记作S01],2.50mg/mL。分别称取一定量的吉非替尼并放置于两个玻璃瓶中,记录重量,分别标记为S01-1、S01-2。根据吉非替尼的纯度、水分、是否成盐及其形式等信息来计算该分析物的真实重量,加入适量的甲醇,配得储备液的最终浓度为2.50mg/mL,涡旋混合。必要时可超声辅助化合物溶解。
内标储备液[记作I01],0.500mg/mL。称取一定量的盐酸吉非替尼-d3于玻璃瓶中,记录重量,标记为I01。根据盐酸吉非替尼-d3的纯度、水分、是否成盐及其形式计算该内标的真实重量。加入适量的甲醇,配得吉非替尼-d3储备液的最终浓度为0.500mg/mL,涡旋混合。必要时可超声辅助化合物溶解。
内标工作溶液(5.00μg/mL)[记作I02]。在玻璃瓶中加入4.95mL的R01,然后用移液器往瓶中加入50.0μL的吉非替尼-d3内标储备液I01,涡旋混合,制得I02。I02储存于0~10℃冰箱中,有效日期设定为两个月。
内标工作溶液(100ng/mL)[记作I03]。在玻璃瓶中加入49.0mL的R01,然后用移液器往瓶中加入1.00mL的吉非替尼-d3内标工作溶液I02,涡旋混合,制得I03。I03储存于0~10℃冰箱中,有效日期设定为两个月。
注:溶液的配制体积可以根据实际需要调整,但最终的目标浓度必须保持一致,并如实记录。
工作溶液的配制:在玻璃瓶或聚丙烯离心管中,加入如下表中所指定体积的R01,然后用移液器往每个小瓶中加入如下表中所指定体积的源溶液,涡旋混合。所有配制的工作溶液都保存在0~10℃的冰箱中。在获得工作溶液的长期储存稳定性数据前,其有效期设定为两个月。
注:S01-1为吉非替尼储备液,后续用于配制校正标样的储备液,S01-2为吉非替尼平行储备液,后续用于配制质控样品;C01-C13代表工作溶液。
校正标样的配制:在聚丙烯离心管中,用移液器加入适量的空白人正常血浆,如下表中所示,再加入相应的源溶液,涡旋混匀(大约30秒),配制成相应的校正标样。在方法验证的每个分析批中,校正标样都应当新鲜配制。
注:校正标样的配制体积可以根据实际需要调整,但最终的目标浓度必须保持一致,并如实记录。
质控样品的配制:在聚丙烯离心管中,用移液器加入适量的空白人血浆。然后,如下表中所示,再加入相应的源溶液,涡旋混匀(大约30秒),配制成相应的质控样品。为了便于以后使用及减少冻融次数,将质控样品分成若干等份。具体如下:转移适量体积(建议80.0μL)的质控样品至预先标记好的聚丙烯冻存管中,储存备用。储存配制的质控样品在-60~-90℃温度下的冰箱中。
注:质控样品的配制体积可以根据实际需要调整,但最终的目标浓度必须保持一致,并正确记录。
*QC-42500为稀释QC(DQC)样品,用于稀释可靠性评价。
准确度/稳定性评价溶液的配制:往玻璃瓶或聚丙烯离心管中加入如下表中指定体积的源溶液,然后加入适量的指定稀释溶液,配制出设定浓度的比较或稳定性评价溶液,涡旋混合。然后将该溶液储存在0~10℃冰箱中,有效期为1周。也可新鲜配制后立即进行分析测试。
注:溶液的配制体积可以根据实际需要调整,但最终的目标浓度必须保持一致,并如实记录。SC2溶液用于分析物平行配制的两份储备液的称量准确度比较,也可用于分析物储备液的稳定性评价。
实施例2
一种人血浆中吉非替尼含量的检测方法,包括如下步骤:
(1)标准工作溶液的配制:吉非替尼工作溶液的梯度浓度分别为0.100、0.200、1.00、4.00、10.0、50.0、90.0、100μg·mL-1,吉非替尼平行工作溶液的浓度梯度为0.100、0.300、4.50、75.0、850μg·mL-1;质控样品的梯度浓度分别为15.0、225、3750、42500ng·mL-1,校正标样的梯度浓度分别为5.00、10.0、50.0、200、500、2500、4500、5000ng·mL-1;
内标工作溶液有两种,浓度分别为5.00μg·mL-1、100ng·mL-1;准确度/稳定性评价溶液DIS、SC2为10.0ng·mL-1,SC1为5000ng·mL-1;
上述溶液的配制只要保证终浓度即可,其配制方法可基于实施例1中各溶液的制备方法,也可为其他方法。
(2)样品处理:将各样品从冰箱中取出,在室温融化,将每个小管中的样品分别涡旋混匀;采用移液器,往预先标记好的聚丙烯离心管或96孔板中分别加入25.0μL的校正标样、质控样品、试验样品、空白人血浆和水,往校正标样、质控样品、试验样品中分别加入25.0μL I03,往空白人血浆和水中分别加入25.0μL R01;
向上述每个混合液中加入400μL乙腈,涡旋混合5min,在4℃离心机中以1700×g的速度离心15分钟,转移50.0μL上清液至装有950μL R01的96孔板中,涡旋混匀;在进样分析前,将样品处理后的所有提取物保存在自动进样器的温度下或0~10℃的冰箱中。
(3)标准曲线制作:将步骤(2)得到校正标样、质控样品的提取物进行以下LC-MS/MS分析测定,每个分析批制备一条由8个浓度水平校正标样组成的标准曲线,同时利用质控样品进行检测。
色谱条件:
色谱柱:Ultimate XB C18,2.1×50.0mm,5.0μm,Welch;
流动相A(MPA):含0.1%的甲酸与10mM甲酸铵的水溶液;
流动相B(MPB):含0.1%的甲酸的乙腈溶液;
流速:1.20mL/min;
进样体积:2.00μL;
色谱柱平衡状态时的大致柱压:18.0Mpa;
自动进样器清洗溶液:甲醇;
自动进样器洗针体积:400μL;
压脚提升量:48mm;
自动进样器进样针清洗时浸泡时间:1sec;
动进样器清洗模式:进样前及进样后;
自动进样器温度:4℃;
自动进样器清洗设置:先冲洗后泡洗;
自动进样器清洗时间:1sec;
柱温箱温度:30℃;
色谱梯度:
注:单个样品的进样分析周期(Cycle Time):大约2.6分钟(从一个样品开始进样时至下一个样品开始进样时的时间差)。
质谱条件:
离子源:ESI;
离子化模式:正离子模式;
检测模式:多反应监测;
电喷雾电压:5500V;
涡旋离子喷雾温度:550℃;
气帘气种类:30;
碰撞池气体种类:中级;
雾化气种类(Gas1):50psi;
辅助气种类(Gas 2):60psi;
数据收集时间:2.70min
*注:停留时间,此处指的是在监测离子对时,每次扫描一个离子对时所停留的时间。
按上述色谱和质谱条件对校正标样、质控样品进行检测,色谱图采集和色谱峰积分由软件Analyst 1.6.2(AB Sciex)进行处理,以吉非替尼和内标吉非替尼-d3的色谱峰面积比为纵坐标,以人血浆中吉非替尼的浓度为横坐标,用加权(W=1/x2)最小二乘法以血浆中吉非替尼的浓度(X)与峰面积比(Y)进行线性回归,所得的回归方程(Y=a+bX)即为标准曲线,具体为y=0.00952x+0.0182(r=0.9991),浓度单位ng/mL,结果表明,吉非替尼在5.00~5000ng/mL范围内线性良好制作标准曲线,如图1所示。
(4)定量分析:试验样品采用蛋白沉淀方法处理,涡旋离心后,将上清液稀释,然后按照步骤(3)中的条件进行LC-MS/MS液质联用分析;吉非替尼的抗凝剂为肝素钠K2EDTA,所用试验样品的体积为25.0μL。按步骤(3)所得的标准曲线方程计算,得到试验样品中吉非替尼的浓度。
实施例3
本实施例对实施例2中LC-MS/MS方法测定人血浆中吉非替尼浓度的准确度、精密度进行评价。取20.0μL上述QC-15、QC-225、QC-3750三个浓度的质控样品各一份,按上述方法操作,于1日内每个浓度3个样品重复测定3次,并分别在不同天连续测定3个分析批,计算精密度,结果如下表所示:
分析批 | 准确度(%) | 精密度(n=5)(%) |
QC-15 | 96.9 | 4.1 |
QC-225 | 104.5 | 4.3 |
QC-3750 | 101.8 | 3.9 |
本发明建立的人血浆样品中吉非替尼含量的LC-MS/MS检测方法,能够快递定量人口服用药后人体血浆的浓度。本发明建立的方法定量范围在5.00~5000ng/mL,精确检测范围在1000倍,同时进行了稀释可靠性研究,能够准确定量高于上限10倍的检测范围;优化了血液样品中基质效应的影响,实际操作周期短;并且,通过考察稳定性,基质效应,确保分析物溶液是可控的,实现了一整套的检测分析流程,可以直接运用于生物等效性中样品检测分析。
以上详细描述了本发明的实施,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种人血浆中吉非替尼含量的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)标准工作溶液的配制:称取吉非替尼,加入甲醇,配制成浓度为2.00~3.00 mg•mL-1的吉非替尼储备液,将所述吉非替尼储备液用体积比1:1的甲醇-水溶液稀释成梯度浓度为0.100~100 μg•mL-1的吉非替尼工作溶液;按上述步骤重复一次,配置成梯度浓度为0.100~850 μg•mL-1的吉非替尼平行工作溶液;称取盐酸吉非替尼-d3,加入甲醇,配制成浓度为0.450~0.550mg•mL-1的内标储备液,再用体积比1:1的甲醇-水溶液稀释成0.1~5.00 μg•mL-1的内标工作溶液;所有储备液及工作溶液在0~10℃下保存,备用;
取空白人正常血浆,分别加入所述吉非替尼工作溶液,混匀,配置成相应梯度的校正标样,其梯度浓度范围为5.00~5000 ng•mL-1;取空白人正常血浆,分别加入所述吉非替尼平行工作溶液,混匀,配置成相应梯度的质控样品,其梯度浓度范围为15.0~42500 ng•mL-1;
(2)样品处理:取等体积的校正标样、质控样品、试验样品、空白人血浆和水,往校正标样、质控样品、试验样品中分别加入所述内标工作溶液,往空白人血浆和水中分别加入体积比1:1的甲醇-水溶液;向上述每个混合液中加入乙腈,混匀,离心,转移上清液,将各提取物保存;
(3)标准曲线制作:将步骤(2)得到校正标样、质控样品的提取物进行LC-MS/MS分析测定,以吉非替尼和内标吉非替尼-d3的色谱峰面积比为纵坐标,以人血浆中吉非替尼的浓度为横坐标制作标准曲线;
(4)定量分析:取试验样品按照步骤(3)的方法处理,并按步骤(3)所得的标准曲线方程计算,得到待测样品中吉非替尼的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种人血浆中吉非替尼含量的检测方法,其特征在于,步骤(3)中所述LC-MS/MS分析测定过程的工作条件为:
a.色谱条件:色谱柱为UItimateXB C18;流动相A:0.1%甲酸和10mM甲酸铵的水溶液;流动相B:0.1%甲酸的乙腈溶液;柱温箱温度:30℃;流速:1.20 mL/min;色谱柱平衡状态时的柱压:17.5~18.5 MPa;洗脱方式为梯度洗脱;
b.质谱条件:离子源为ESI源,采用正离子模式、多反应监测模式;电喷雾电压:5500V;涡旋离子喷雾温度:550℃;气帘气种类:30 psi;碰撞池气体种类:中级;雾化气种类Gas1:50 psi;辅助气Gas 2:60 psi;数据收集时间:2.70 min。
3.根据权利要求1所述的一种人血浆中吉非替尼含量的检测方法,其特征在于:步骤(1)中所述吉非替尼储备液的浓度为2.50 mg•mL-1,所述内标储备液的浓度为0.500 mg•mL-1,所述吉非替尼工作溶液的梯度浓度分别为0.100、0.200、1.00、4.00、10.0、50.0、90.0、100 μg•mL-1,所述吉非替尼平行工作溶液的浓度梯度为0.100、0.300、4.50、75.0、850 μg•mL-1,所述内标工作溶液的浓度分别为5.00 μg•mL-1 、100 ng•mL-1。
4.根据权利要求1所述的一种人血浆中吉非替尼含量的检测方法,其特征在于,步骤(1)所述质控样品的梯度浓度分别为15.0、225、3750、42500 ng•mL-1;所述质控样品于-60~-90 ℃储存;所述校正标样的梯度浓度分别为5.00、10.0、50.0、200、500、2500、4500、5000ng•mL-1;所述校正标样为新鲜配制。
5.根据权利要求1所述的一种人血浆中吉非替尼含量的检测方法,其特征在于,步骤(2)所述离心的条件为在4℃、以1700×g的速度离心15min。
6.根据权利要求1所述的一种人血浆中吉非替尼含量的检测方法,其特征在于,步骤(1)还往所述内标工作溶液中加入体积比为1:1的甲醇-水溶液进行稀释,配制得到准确度/稳定性评价溶液。
7.根据权利要求2所述的一种人血浆中吉非替尼含量的检测方法,其特征在于,步骤(3)所述色谱条件还包括:进样体积2.00μL;自动进样器清洗溶液为甲醇;自动进样器洗针体积:400 μL;压脚提升量:48 mm;自动进样针清洗时浸泡时间1 s;自动进样器清洗模式:进样前清洗和进样后清洗;自动进样器温度:4.0℃。
8.根据权利要求2所述的一种人血浆中吉非替尼含量的检测方法,其特征在于,步骤(3)所述LC-MS/MS分析测定过程中吉非替尼的监测离子对为447.3/128.0,每次扫描一个离子对时所停留的时间150 ms,去簇电压105 V,碰撞能量41 eV,质谱保留时间0.60~0.62min。
9.根据权利要求2所述的一种人血浆中吉非替尼含量的检测方法,其特征在于,步骤(3)所述LC-MS/MS分析测定过程中内标吉非替尼-d3的监测离子对为450.1/128.0;每次扫描一个离子对时所停留的时间150 ms,去簇电压92 V,碰撞能量44.00 eV,质谱保留时间0.60~0.62 min。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111999399A (zh) * | 2020-07-15 | 2020-11-27 | 中国医学科学院北京协和医院 | 利用液相色谱-串联质谱联用技术定量分析伏罗尼布及其代谢产物x297的方法 |
CN115236222A (zh) * | 2022-06-29 | 2022-10-25 | 上海市食品药品检验研究院 | 一种化妆品中人表皮生长因子的检测方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130143247A1 (en) * | 2010-08-18 | 2013-06-06 | Technion Research And Development Foundation Ltd. | Volatile organic compounds for detecting cell dysplasia and genetic alterations associated with lung cancer |
JP2016102673A (ja) * | 2014-11-27 | 2016-06-02 | 国立大学法人秋田大学 | 複数種類の抗がん剤の血中濃度の連続測定方法 |
CN106198778A (zh) * | 2016-06-24 | 2016-12-07 | 南京优科制药有限公司 | 一种同时测定吉非替尼及其有关物质的方法 |
-
2017
- 2017-03-17 CN CN201710159633.0A patent/CN106908543A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130143247A1 (en) * | 2010-08-18 | 2013-06-06 | Technion Research And Development Foundation Ltd. | Volatile organic compounds for detecting cell dysplasia and genetic alterations associated with lung cancer |
JP2016102673A (ja) * | 2014-11-27 | 2016-06-02 | 国立大学法人秋田大学 | 複数種類の抗がん剤の血中濃度の連続測定方法 |
CN106198778A (zh) * | 2016-06-24 | 2016-12-07 | 南京优科制药有限公司 | 一种同时测定吉非替尼及其有关物质的方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
NAN ZHENG ET AL: "Simultaneous determination of gefitinib and its major metabolites in mouse plasma by HPLC–MS/MS and its application to a pharmacokinetics study", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B》 * |
李翔 等: "HPLC法测定人血浆中吉非替尼的浓度", 《中国药物应用与监测》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111999399A (zh) * | 2020-07-15 | 2020-11-27 | 中国医学科学院北京协和医院 | 利用液相色谱-串联质谱联用技术定量分析伏罗尼布及其代谢产物x297的方法 |
CN115236222A (zh) * | 2022-06-29 | 2022-10-25 | 上海市食品药品检验研究院 | 一种化妆品中人表皮生长因子的检测方法 |
CN115236222B (zh) * | 2022-06-29 | 2023-12-22 | 上海市食品药品检验研究院 | 一种化妆品中人表皮生长因子的检测方法 |
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