CN110082440A - 超高效液相色谱串联质谱测定血浆分子靶向药浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超高效液相色谱串联质谱测定血浆分子靶向药浓度的方法，包括：分别采用乙腈溶解安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼配制标准曲线工作液，采用甲醇溶解地西泮配制成内标物工作液；将0‑5μL标准曲线工作液分别加入空白血浆补足至50μL，涡旋制成标准曲线血浆样品，加入内标物工作液，涡旋，离心，取上清液，进行UPLC‑MS/MS定量分析，绘制标准曲线；精密吸取50μL的待测血浆，样本前处理方法同上，按照当批次的标准曲线测定安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼浓度。本发明同时测定多种抗肿瘤分子靶向药物的血药浓度，灵敏度高、专属性强、快速、重现性好，适合用于临床高通量、同时检测和监测多种抗肿瘤分子靶向药物。

Description

超高效液相色谱串联质谱测定血浆分子靶向药浓度的方法

技术领域

本发明涉及检测药物浓度的方法。更具体地说，本发明涉及一种超高效液相色谱串联质谱测定血浆分子靶向药浓度的方法。

背景技术

安罗替尼(anlotinib)是中国原研创新药物之一，是一种新型小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，能有效抑制VEGFR、PDGFR、FGFR、c-Kit等激酶，具有抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤生长的双重功效，并于2018年5月获得国家药品监督管理局批准上市。色瑞替尼(Ceritinib)是一种新型的强效选择性小分子ATP竞争性ALK受体酪氨酸激酶抑制剂，于2014年4月被FDA批准用于治疗ALK阳性或克唑替尼耐药的非小细胞肺癌(NSCLC)，2015年美国国家综合癌症网络(NCCN)指南关于NSCLC的治疗策略中将色瑞替尼作为晚期NSCLC克唑替尼一线治疗进展后的治疗药物。依鲁替尼(Ibrutinib)是一种用于抑制布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)功能的靶向药物，能够与BTK活性中心的半胱氨酸残基共价结合，从而抑制B细胞的活动，对B细胞淋巴瘤疗效显著，尤其是对于难控制易复发的多种晚期淋巴瘤患者。

近年来，以酪氨酸激酶抑制剂(TKI)为代表的分子靶向药已经将肿瘤的治疗带领至新的靶向时代，从2001年FDA批准的首个TKI药物伊马替尼发展至今，基于不同作用机制、不同靶点的靶向药物层出不穷。随着临床分子靶向药物应用的逐渐深入，提高治疗疗效的同时也暴露出诸多劣势，其中由于特异位点突变、信号通路旁路激活以及转运体过表达引起的获得性耐药是临床应用中亟待解决的问题，而克服获得性耐药的一种有效方法是联合应用不同作用机制的TKI逆转外排转运体介导的耐药。已有学者正在开展不同TKI药物联合应用的临床研究。此外，分子靶向药物药代动力学特征个体间差异较大，这些差异进一步导致药物疗效及毒性不同。通过定期监测患者的血药浓度有助于预测疗效及可能的不良反应，显著提高患者的获益风险比、从而实现个体化精准用药。双原发或多原发癌是同一位患者同时发生两个或多个原发病灶，如肺癌伴发乳腺癌、肺癌伴发淋巴瘤等，其发病频率约为2-17％，显著危害人类的健康。安罗替尼和色瑞替尼均对肺癌具有显著的疗效，而依鲁替尼作为血液肿瘤的靶向药物，因此，建立一种准确、快速、高通量的方法用于同时测定两种或两种以上分子靶向药物是非常必要和需要的。

现有技术中用于测量生物基质中安罗替尼、色瑞替尼和依鲁替尼的方法大多检测的是上述单药，例如采用液液萃取法前处理大鼠血浆后采用LC-MS/MS测定安罗替尼药物浓度，分析时间长、线性范围窄、样本前处理不便利；采用蛋白沉淀-盐析辅助液液萃取法测定人血浆中色瑞替尼浓度，定量下限高，样本体积大；采用液液萃取法前处理大鼠血浆后利用LC-MS/MS法同时测定依鲁替尼及代谢物的浓度，提取回收率低且费时费力、分析时间长。目前，尚无同时测定上述三种靶向药物的方法。采用高效液相色谱串联质谱方法进行多种分子靶向药物的测定，并不是简单调试仪器参数就能实现，如何保证待测物之间不互相干扰是定量分析的难题，这也是为什么目前没有采用色谱串联质谱针对多种抗肿瘤分子靶向药物同时检测的技术公开的原因。为满足临床前和临床高通量检测的要求，本领域急需无特殊的设备要求、高通量、样品需求少、方便、快速、多功能的测定安罗替尼、色瑞替尼和依鲁替尼浓度的测定方法。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种超高效液相色谱串联质谱测定血浆分子靶向药浓度的方法，其能够同时测定安罗替尼、色瑞替尼和依鲁替尼血药浓度，将为后续临床常规治疗药物监测奠定技术基础。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种超高效液相色谱串联质谱测定血浆分子靶向药浓度的方法，包括：

分别采用乙腈溶解安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼配制多个浓度的标准曲线工作液，采用甲醇溶解地西泮内标物配制成内标物工作液；

将0-5μL安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼多个浓度的标准曲线工作液分别加入空白血浆补足至50μL，涡旋制成多个浓度的标准曲线血浆样品，加入800-1000μL内标物工作液，涡旋，0-4℃下离心，取上清液，进行UPLC-MS/MS定量分析，以血浆样品中安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼浓度为横坐标，以安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼峰面积与地西泮内标物峰面积的比值为纵坐标，绘制线性范围分别为0.1-20ng/mL、2-1000ng/mL、1-500ng/mL的标准曲线；

精密吸取50μL的待测血浆，加入绘制标准曲线时等量的内标物工作液，0-4℃下离心，取上清液，进行UPLC-MS/MS定量分析，在所述标准曲线上读取测得的安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼峰面积与内标物峰面积的比值对应的安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼浓度；

液相条件为：色谱柱为Waters XBrige C18，内径2.1mm、柱长50mm、粒径3.5mm，流速0.5mL/min，进样体积2μL，分析时间5min，柱温为10-30℃，洗针溶液为体积比为1:1:1:1的异丙醇、乙腈、甲醇和水的混合溶液，流动相的有机相为含有质量分数为0.2％的甲酸和5mM乙酸铵的甲醇，水相为含有质量分数为0.2％的甲酸和5mM乙酸铵的水，梯度洗脱设置为0-1.2min、1.2-3.2min、3.2-3.5min、3.5-5min有机相与水相的体积比分别为1:9、9:1、1:0、1:9；

质谱条件为：采用电喷雾离子源的多反应监测模式，正离子扫描模式，多反应监测模式，安罗替尼的母、子离子对的质荷比为m/z 408.2→339.2、色瑞替尼的母、子离子对的质荷比为m/z 558.2→433.2、依鲁替尼的母、子离子对的质荷比为m/z 441.0→138.0、内标的母、子离子对的质荷比为m/z 285.0→193.1，每个多反应监测模式通道的扫描时间为100ms，质谱的离子化温度为650℃、气帘气25psi、雾化气和辅助气均为55psi、离子化电压为5500V、入口电压为10eV、碰撞室出口电压为30eV。

优选的是，采用乙腈溶解安罗替尼配制成浓度为20ng/mL、40ng/mL、200ng/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL的标准曲线工作液，采用乙腈溶解色瑞替尼配制成浓度为400ng/mL、1μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、200μg/mL的标准曲线工作液，采用乙腈溶解依鲁替尼配制成浓度为200ng/mL、400ng/mL、1μg/mL、4μg/mL、20μg/mL、100μg/mL的标准曲线工作液，采用甲醇溶解地西泮内标物配制成浓度为1ng/mL的内标物工作液。

优选的是，精密吸取5μL标准曲线工作液，加入45μL空白血浆，加入900μL内标物工作液。

优选的是，涡旋震荡1min，4℃下13000rpm离心10min。

优选的是，分别采用乙腈溶解安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼配制多个浓度的质控工作液，采用甲醇溶解地西泮内标物配制成内标物工作液；

将0-5μL多个浓度的质控工作液分别加入空白血浆补足至50μL，涡旋制成多个浓度的质控血浆样品，加入800-1000μL内标物工作液，涡旋，0-4℃下离心，取上清液，进行UPLC-MS/MS定量分析，校正所述标准曲线，使至少2/3的质控样品的准确度在标示值的±15％内，且每一浓度水平至少50％样品应符合这一标准。

优选的是，采用乙腈溶解安罗替尼配制成浓度为40ng/mL、1μg/mL、3.2μg/mL的质控工作液，采用乙腈溶解色瑞替尼配制成浓度为1μg/mL、10μg/mL、160μg/mL的质控工作液，采用乙腈溶解依鲁替尼配制成浓度为400ng/mL、4μg/mL、80μg/mL的质控工作液。

优选的是，精密吸取5μL质控工作液，加入45μL空白血浆，加入900μL内标物工作液。

本发明至少包括以下有益效果：

第一、本发明同时测定多种抗肿瘤分子靶向药物(安罗替尼、色瑞替尼和依鲁替尼)的血药浓度，灵敏度高、专属性强、快速、重现性好，并且无需如激光二极管热解吸相关特殊仪器，因此适合用于临床高通量、同时检测和监测多种抗肿瘤分子靶向药物；

第二、在本发明的方法中，采用了比文献报道更少的血液样本体积，血浆样本体积为50μL，显著低于已发表文献的体积，定量分析的结果显示，实验中所用体积能满足定量检测的需要，基于此优势，本发明方法特别适合于晚期肿瘤患者身体状态较差时、临床采集血液样本体积较少时的定量测定，有利于临床治疗药物监测的应用；

第三、本发明首次建立的测定多种分子靶向药物浓度的方法在准确度、精密度、专属性、稳定性、提取回收率及基质效应等方面均达到2015年版《中国药典》四部9012《生物样品定量分析方法验证指导原则》对生物样品的分析要求，本发明方法成功应用于大鼠药动学研究；

第四、液相条件优选采用0.2％甲酸-5mM乙酸铵(水相)-0.2％甲酸-5mM乙酸铵甲醇(有机相)；加入甲酸能够促进被分析物离子化，提高检测的灵敏度；加入乙酸铵是利用了电解质效应，不仅增加了待测物的离子化效果而且有利于消除色谱峰的拖尾现象；此外，在本发明的方法中采用高效的Waters XBrige C18色谱柱(50mm×2.1mm I.D.，粒径为3.5μm)，提高了分离效率，实现了每个样品的分析时间仅为5min，显著增加了分析通量，提高了分析速度，有利于大批量临床前和临床样品的快速分析。本发明的方法采用高灵敏度、超快速扫描速度的QTRAP 5500质谱系统，安罗替尼、色瑞替尼和依鲁替尼的定量的检测限分别为0.1ng/mL、2ng/mL和1ng/mL。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为安罗替尼、色瑞替尼和依鲁替尼的质谱扫描图；

图2为标准曲线示意图；

图3为特异性考察结果典型色谱图；

图4为安罗替尼(6mg/kg)、色瑞替尼(25mg/kg)、依鲁替尼(10mg/kg)给药后大鼠药物浓度-时间曲线。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

<实例1>

1溶液配制

用于配制溶液的体积和重量可以成比例调整，除特殊声明外所有的溶液均保存于室温条件下。

1.1流动相溶液的配制

有机相(A)：含有质量分数为0.2％的甲酸和5mM乙酸铵的甲醇。

水相(B)：含有质量分数为0.2％的甲酸和5mM乙酸铵的水。

流动相选择：实验中为了满足低定量检测范围的要求，我们考察了多种常用流动相中的有机相(如甲醇、乙腈等)和水相，并尝试添加不同比例的溶液增强剂(如0.01％甲酸、0.05％甲酸、0.2％甲酸、0.01％乙酸、2mM甲酸铵、5mM甲酸铵、2mM乙酸铵等)。结果发现，当有机相和水相中分别加入甲酸后色谱峰型得以改善，综合流动相的组成、保留时间、色谱峰形、梯度时间等因素，最终确定最有流动相为含0.2％甲酸-5mM甲酸铵的甲醇-含0.2％甲酸-5mM甲酸铵水。

1.2工作液的配制

分别精密称取10.00mg以上的安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼、内标标准品地西泮于10mL烧杯中，加入少量乙腈溶解后转移至10mL量瓶中，定容得到浓度为1mg/mL的储备液。采用1:1乙腈水逐级稀释得到标准曲线的工作液：安罗替尼(20ng/mL、40ng/mL、200ng/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL)、色瑞替尼(400ng/mL、1μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、200μg/mL)、依鲁替尼(200ng/mL、400ng/mL、1μg/mL、4μg/mL、20μg/mL、100μg/mL)，储存于-80℃冰箱中备用。内标工作液采用甲醇稀释至浓度为1ng/mL。质控工作液分别为：安罗替尼(40ng/mL、1μg/mL、3.2μg/mL)、色瑞替尼(1μg/mL、10μg/mL、160μg/mL)、依鲁替尼(400ng/mL、4μg/mL、80μg/mL)。

1.3仪器及试剂

高效液相色谱仪LC-20ADXR串联QTRAP5500质谱检测器，日本岛津公司和AB SCIEX公司；MillQ-Direct 8超纯水系统，美国密理博公司；固定转角离心机，美国ThermoScientific公司。

安罗替尼(纯度>99％)、色瑞替尼(纯度>98％)、依鲁替尼(纯度>98％)及地西泮均从北京世康合成医药科技有限公司、中国药品生物制品检定所等权威机构合成购买；HPLC级甲醇、乙腈、异丙醇等均购于美国Fisher Scientific公司。其他常规试剂均可从日常商业渠道购买。

实验中发明人首先采用常规的UPLC-MS/MS系统进行初步考察定量分析的可行性，但是结果显示待测物的峰面积不能满足同时定量浓度的要求。因此，安罗替尼、色瑞替尼以及依鲁替尼作为新的靶向小分子化合物采用常规的LC-MS/MS系统分析时难度较大，为了保证实验顺利进行，发明人采用分辨力和检测能力更高的超高效液相色谱仪(LC-20ADXR)串联三重四级杆线性离子阱质谱仪(QTRAP 5500)作为最终检测用仪器。

1.4标准曲线和质控血浆样品的配制及前处理

分别吸取5μL系列浓度的标准曲线和质控工作液于Eppendorf管中，然后分别加入空白血浆50μL、内标工作液900μL，涡旋30s混匀，配制成浓度分别为安罗替尼(0.1、0.2、1、5、10、20ng/mL)、色瑞替尼(2、5、10、50、100、1000ng/mL)、依鲁替尼(1、2、5、20、100、500ng/mL)的系列标准血浆样品。按照上述相似的方法制备含血质控样本：安罗替尼(0.2、5、16ng/mL)、色瑞替尼(5、50、800ng/mL)、依鲁替尼(2、20、400ng/mL)。安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼分子离子质谱图如图1所示。

2液相色谱串联质谱方法条件

液相色谱条件：采用高效的Waters XBrige C18色谱柱(50mm×2.1mm I.D.，粒径为3.5μm)，柱温为室温。流动相为A相(甲醇，含有0.2％的甲酸和5mM乙酸铵)：B相(水，含有0.2％的甲酸和5mM乙酸铵)。流速为0.5mL/min，进样量为2μL。洗针液为含异丙醇、乙腈、甲醇和水的混合溶液(1:1:1:1，v/v/v/v)采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0-1.2min，90％B；1.2-3.2min，10％B；3.2-3.5min，0％B；3.5-5min，90％B。分析时间为5min，三者的保留时间分别为1.60min、1.91min、1.93min、1.88min。质谱条件：采用电喷雾离子源(Electrospray ionization,ESI)，在正离子电离模式下，选用多反应监测模式(multiplereaction monitoring,MRM)的质谱扫描方式进行测定，每个MRM通道的扫描时间为100ms，主要生成[M+H]⁺准分子离子峰。质谱仪的温度为650℃、气帘气25psi、喷雾气和辅助气均为55psi、离子化电压为5500V。安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼和内标地西泮的母、子离子对的质荷比分别为：m/z 408.2→339.2(安罗替尼)、m/z558.2→433.2(色瑞替尼)、m/z 441.0→138.0(依鲁替尼)、m/z 285.0→193.1(地西泮)。

洗脱方式：发明人也比较了等度洗脱和梯度洗脱，结果显示梯度洗脱时色谱峰形和响应均高于等度模式，因此最终设定在5min分析时间内设置梯度，起始梯度为95％的水相，从而保证在有机相比例最高时出色谱峰。另外，我们比较了不同的流速(0.4mL/min和0.5mL/min)、不同的柱温条件(室温、37℃、50℃)、不同的分析时间(4min和5min)、不同的进样体积(5μL、2μL和1μL)。经过多次摸索和优化，确证分析的最佳条件为流动相为甲醇(A)和水(B)(两者均含0.2％甲酸-5mM甲酸铵)，采用梯度洗脱的方式(0-1.2min,90％B；1.2-3.2min,10％B；3.2-3.5min,0％B；3.5-5min,90％B)，0.5mL/min流速，柱温为室温，分析时间为5min，进样体积为2μL，三者的保留时间分别为1.60min、1.91min、1.93min、1.88min。文献报道色瑞替尼可能存在残留效应，发明人采取了各种方法尽量消除残留效应，包括更换不同比例的洗针液(如异丙醇：水、甲醇：水、乙腈：水等)，并调节乙酸铵、添加低浓度的甲酸等，最终确定的洗针液为异丙醇：甲醇：乙腈：水＝1:1:1:1。另外，为了最大限度降低残留效应，当分析完高浓度样品后可进样纯有机溶剂，清洗分析系统。

质谱离子化方式：实验中发明人根据上述三种待测物和内标的化学结构和理化性质，分别考察了质谱的正离子和负离子电离模式，结果显示正离子模式下待测物和内标的响应较负离子模式改善，因此确定采用质谱的电喷雾模式(ESI)的正离子方式。选择分析的母、子离子对时，结合不同的电离能量和可能的生成的分子片段，采用[M+H]+模式分析，通过调整不同的质谱参数后确证最优参数。在ESI离子化方式下，上述三者主要生成

[M+H]+准分子离子峰。

多种抗肿瘤分子靶向药物在质谱仪中同时扫描，如何保证待测物之间不互相干扰是定量分析的关键。为此，实验中采用多离子检测模式(MRM)，通过观察安罗替尼、色瑞替尼和依鲁替尼的化学结构及可能的断裂位置确定了三者的分子离子对分别为：m/z 408.2→339.2(安罗替尼)、m/z 558.2→433.2(色瑞替尼)、m/z 441.0→138.0(依鲁替尼)，实验结果显示上述三者及内标不存在相互干扰，可准确定量分析。

3生物样本前处理

采用蛋白沉淀法对血浆样品进行预处理。取1.5mL离心管，加入45μL空白血浆，各加入5μL安罗替尼、色瑞替尼及依鲁替尼的工作液，涡旋30s，混合均匀。然后加入900μL含内标的沉淀剂(1ng/mL)，涡旋震荡约1min，于4℃13000rpm离心10min，吸取上清液样品瓶中，取上清液2μL进样进行UPLC-MS/MS分析，记录质量色谱图及化合物的峰面积，采用内标法计算三者的浓度。

经过文献检索和前期预实验摸索，实验中考察了常见的三种生物样本前处理方法：蛋白沉淀法、液液萃取法、固相萃取法。实验结果显示，采用含内标的甲醇溶液作为沉淀剂即可显著去除血浆中的蛋白质，且提取回收率和基质效应均符合检测方法指导原则的要求。因此，发明人选择了简单易行、效率较高、快速高通量、经济实用的蛋白沉淀法作为本实验的生物样本前处理方法。

4方法学验证

按照2015年版中国药典四部通则9012《生物样品定量分析方法验证指导原则》对检测方法进行全部验证，以确保检测的准确性、可重复性和稳定性。验证内容包括特异性、精密度和准确度、标准曲线、稳定性、基质效应、回收率等。

5大鼠的药代动力学

无特定病原体(SPF)级SD大鼠，雄性，体重180-220g，北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证：SCXK(京)2016-0006。

为了验证建立方法的通用性及可行性，发明人灌胃给药大鼠安罗替尼、色瑞替尼及依鲁替尼的混合药物后根据不同采血时间点，描述药物在体内的经时动力学曲线。

大鼠于给药前12h禁食不禁水，按照10μL/g灌胃给药。安罗替尼、色瑞替尼及依鲁替尼的给药剂量分别为6mg/kg、25mg/kg和10mg/kg。采血时间点为给药前、给药后5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h，共13个采血点，每管约0.2mL全血。全血样本置于肝素化的离心管中，于3500rpm离心10min，吸取上清血浆，于-80℃冰箱中保存备用。

实验结果显示，发明人所建立的UPLC-MS/MS方法能够准确定量大鼠灌胃给予三种抗肿瘤靶向药物后血浆中药物浓度。如图4所示，本发明方法的标准曲线范围完全覆盖动物的检测浓度范围。由于给药剂量不同，三者呈现的药时曲线趋势基本与给药剂量正相关。本发明方法能够测定给药后24h的安罗替尼血药浓度、给药后12h的依鲁替尼血药浓度及给药后72h的色瑞替尼血药浓度，方法得到成功的应用和推广。

6实验结果

6.1特异性

本实验考察了不同来源大鼠血浆，制备成特异性样品进行分析。配制双空白样品(不含分析物和内标的处理过基质样品)、空白样品(含内标的处理后基质样品)、定量下限样品。特异性考察结果如附图3。实验中LLOQ样品中安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼、地西泮的色谱峰信噪比分别为145、181、162、47，且不同离子扫描通道无相互干扰。

6.2精密度和准确度

平行配制6个血浆定量下限、低浓度、中浓度、高浓度质控样品的批内和批间的精密度和准确度的结果(表1)表明，该方法精密度和准确度结果均符合生物样本定量检测的要求。

表1方法的精密度和准确度

6.3基质效应和提取回收率

本实验考察了不同来源的大鼠空白血浆，制备低浓度、中浓度和高浓度样品，通过计算基质存在下的峰面积(B，由空白基质提取后加分析物测得)，与基质不存在(以水代替血浆)下的峰面积(C，分析物的纯溶液)比值，计算分析物和内标的基质因子。并通过分析物和内标的基质因子的比值，计算经内标归一化的基质因子，结果见表2。低、中、高浓度质控样品中分析物和内标的基质因子和经内标归一化的基质因子的CV均低于15％，表明血浆中三种待测物和内标化合物的测定不受生物基质的影响。分别考察了低、中、高3个浓度质控样品的提取回收率，每个浓度平行6个样品。另外考察了内标的提取回收率。结果如表2所示。

表2基质效应和提取回收率

6.4稳定性

本实验考察了三种化合物室温放置24h、制备后室温放置8h、反复冻融3次、-80℃长期保存33天，结果如表3所示，在常见的稳定性条件下安罗替尼、色瑞替尼及依鲁替尼均稳定。

表3稳定性

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。

Claims (7)

1.超高效液相色谱串联质谱测定血浆分子靶向药浓度的方法，其特征在于，包括：

分别采用乙腈溶解安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼配制多个浓度的标准曲线工作液，采用甲醇溶解地西泮内标物配制成内标物工作液；

将0-5μL安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼多个浓度的标准曲线工作液分别加入空白血浆补足至50μL，涡旋制成多个浓度的标准曲线血浆样品，加入800-1000μL内标物工作液，涡旋，0-4℃下离心，取上清液，进行UPLC-MS/MS定量分析，以血浆样品中安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼浓度为横坐标，以安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼峰面积与地西泮内标物峰面积的比值为纵坐标，绘制线性范围分别为0.1-20ng/mL、2-1000ng/mL、1-500ng/mL的标准曲线；

精密吸取50μL的待测血浆，加入绘制标准曲线时等量的内标物工作液，0-4℃下离心，取上清液，进行UPLC-MS/MS定量分析，在所述标准曲线上读取测得的安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼峰面积与内标物峰面积的比值对应的安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼浓度；

液相条件为：色谱柱为Waters XBrige C18，内径2.1mm、柱长50mm、粒径3.5mm，流速0.5mL/min，进样体积2μL，分析时间5min，柱温为10-30℃，洗针溶液为体积比为1:1:1:1的异丙醇、乙腈、甲醇和水的混合溶液，流动相的有机相为含有质量分数为0.2％的甲酸和5mM乙酸铵的甲醇，水相为含有质量分数为0.2％的甲酸和5mM乙酸铵的水，梯度洗脱设置为0-1.2min、1.2-3.2min、3.2-3.5min、3.5-5min有机相与水相的体积比分别为1:9、9:1、1:0、1:9；

质谱条件为：采用电喷雾离子源的多反应监测模式，正离子扫描模式，多反应监测模式，安罗替尼的母、子离子对的质荷比为m/z 408.2→339.2、色瑞替尼的母、子离子对的质荷比为m/z 558.2→433.2、依鲁替尼的母、子离子对的质荷比为m/z 441.0→138.0、内标的母、子离子对的质荷比为m/z 285.0→193.1，每个多反应监测模式通道的扫描时间为100ms，质谱的离子化温度为650℃、气帘气25psi、雾化气和辅助气均为55psi、离子化电压为5500V、入口电压为10eV、碰撞室出口电压为30eV。

2.如权利要求1所述的超高效液相色谱串联质谱测定血浆分子靶向药浓度的方法，其特征在于，采用乙腈溶解安罗替尼配制成浓度为20ng/mL、40ng/mL、200ng/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL的标准曲线工作液，采用乙腈溶解色瑞替尼配制成浓度为400ng/mL、1μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、200μg/mL的标准曲线工作液，采用乙腈溶解依鲁替尼配制成浓度为200ng/mL、400ng/mL、1μg/mL、4μg/mL、20μg/mL、100μg/mL的标准曲线工作液，采用甲醇溶解地西泮内标物配制成浓度为1ng/mL的内标物工作液。

3.如权利要求1所述的超高效液相色谱串联质谱测定血浆分子靶向药浓度的方法，其特征在于，精密吸取5μL标准曲线工作液，加入45μL空白血浆，加入900μL内标物工作液。

4.如权利要求1所述的超高效液相色谱串联质谱测定血浆分子靶向药浓度的方法，其特征在于，涡旋震荡1min，4℃下13000rpm离心10min。

5.如权利要求1-4任一项所述的超高效液相色谱串联质谱测定血浆分子靶向药浓度的方法，其特征在于，分别采用乙腈溶解安罗替尼、色瑞替尼、依鲁替尼配制多个浓度的质控工作液，采用甲醇溶解地西泮内标物配制成内标物工作液；

将0-5μL多个浓度的质控工作液分别加入空白血浆补足至50μL，涡旋制成多个浓度的质控血浆样品，加入800-1000μL内标物工作液，涡旋，0-4℃下离心，取上清液，进行UPLC-MS/MS定量分析，校正所述标准曲线，使至少2/3的质控样品的准确度在标示值的±15％内，且每一浓度水平至少50％样品应符合这一标准。

6.如权利要求5所述的超高效液相色谱串联质谱测定血浆分子靶向药浓度的方法，其特征在于，采用乙腈溶解安罗替尼配制成浓度为40ng/mL、1μg/mL、3.2μg/mL的质控工作液，采用乙腈溶解色瑞替尼配制成浓度为1μg/mL、10μg/mL、160μg/mL的质控工作液，采用乙腈溶解依鲁替尼配制成浓度为400ng/mL、4μg/mL、80μg/mL的质控工作液。

7.如权利要求6所述的超高效液相色谱串联质谱测定血浆分子靶向药浓度的方法，其特征在于，精密吸取5μL质控工作液，加入45μL空白血浆，加入900μL内标物工作液。