CN105572264B - Uplc-ms/ms法测定人血浆中他菲替尼和活性代谢产物scr868的浓度 - Google Patents
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Abstract
本文涉及UPLC‑MS/MS法测定人血浆中他菲替尼和活性代谢产物SCR868的浓度。本文提供通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC‑MS/MS)测定人血浆中他菲替尼和活性代谢产物SCR868的浓度的方法,其中所述方法采用含甲酸的甲酸铵水‑乙腈作为流动相进行。本发明的方法的特异性好、灵敏度高,他菲替尼和SCR868在血浆0.2~50ng/mL范围内线性关系良好,已经成功应用于临床药代动力学样本的检测。
Description
技术领域
本发明涉及检测人血浆中药物的浓度的方法。具体而言,本发明涉及通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人血浆中他菲替尼和活性代谢产物SCR868的浓度的方法。
背景技术
引言
酪氨酸激酶受体(TKRs)在肿瘤的发生、发展和转移中起着重要的作用,这使其成为肿瘤治疗的关键靶点[1]。随着第一个表皮生长因子受体抑制剂——易瑞沙在EGFR突变的非小细胞肺癌患者的治疗中取得了令人瞩目的成绩[2],几年来涌现了更多的酪氨酸受体抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitors,TKIs)。然而越来越多的TKIs药物仍然不能从根本性改善目前肿瘤的生存期和死亡率,以及TKIs耐药的问题,因此临床需要更多药物来改变这一现状[3]。
他菲替尼(tafetinib)是一个新型、口服TKI类药物,其化学结构在舒尼替尼的构效的基础上添加了不饱和六元环以增加药物的脂溶性。经临床前实验发现他菲替尼对于Kit、VEGR、PDGFR、RET、FLT等多个靶点具有较好的抑制作用,并且与同等剂量的舒尼替尼的毒性相当[4]-[5]。良好的耐受性和抗肿瘤活性使他菲替尼成为一个有前景的抗肿瘤新药,现已获得了临床试验批准,在实体瘤患者进行I期临床试验。
检测血液或其他生物样本中的药物浓度是药动学、药效学研究和临床治疗的基础。用于检测血浆药物浓度的方法应当具备高灵敏度、能够快速获得结果和能够使用少量样品进行。然而,由于血液中存在包括磷脂、蛋白等多种组份,检测易受基质效应等各种因素的影响。如何最大可能减少基质效应,尽可能获得血液中药物的准确浓度,是本领域必须进行深入研究的课题。
HPLC法是目前检测血药浓度常用的方法,应用范围广泛。但是,由于使用色谱柱进行分离耗费时间较长、灵敏度较低,并不适用于高通量的生物样品分析。
超高效液相色谱质谱联用(Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC-MS/MS)法提高了分析通量,节省了样品和溶剂分析时间。然而,UPLC-MS/MS对流动相,色谱柱,样品前处理,质谱接口,数据采集系统都提出了特别的要求。尽管对转换方法进行了一些研究,传统的高效液相色谱HPLC的条件不能直接应用于UPLC-MS/MS,需要对包括样品前处理、内标、流动相、色谱柱选择、质谱条件设置等各项条件进行大量试验,才能实现UPLC-MS/MS快速检测分析。例如,周新等人的研究(HPLC与UPLC色谱条件转换方法研究,分析试验室,第27卷第4期,2008年4月)表明直接将HPLC条件应用于UPLC,不能达到对待测物质分离分析的目的;而且质谱检测与色谱检测不同,对于流动相组成、流速等多种方面需要额外的注意,因此对实验条件包括例如流动相选择等进行具体深入研究才能获得分离状况良好的UPLC-MS/MS方法。
目前尚未见有用于测定人血浆中他菲替尼和活性代谢产物SCR868的浓度的方法的报道。已经报道的检测狗血浆中他菲替尼和SCR868的血药浓度的方法采用液液萃取且灵敏度较低,不适用于临床药代动力学研究的大批量的样本检测。
本领域急需能够用于检测人血浆中他菲替尼和SCR868的浓度的快速、灵敏的方法。
发明内容
发明人已经建立了快速、灵敏的超高效液相色谱串联质谱(ultra highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)技术检测人血浆中他菲替尼和活性代谢产物SCR868(N-去乙基他菲替尼)的浓度。本发明的方法具有的优点包括例如样本处理简单、快捷、灵敏度高等。
在一些实施方案中,本发明提供通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人血浆中他菲替尼和活性代谢产物SCR868的浓度的方法,其中所述方法采用含甲酸的甲酸铵水-乙腈作为流动相进行。发明人已经发现尽管使用甲醇作为流动相可获得更好的响应,但是基线噪音也相应增高,而且目标化合物的信号较高,存在较为严重的残留。而采用含甲酸的甲酸铵水-乙腈作为流动相进行分析时,洗脱能够快速、充分分离待测物质,获得良好的峰形。
在一些实施方案中,本发明的方法采用的含甲酸的甲酸铵水-乙腈流动相的体积比选自以下范围:含甲酸的甲酸铵水:乙腈(80/20,v/v)-含甲酸的甲酸铵水:乙腈(20/80,v/v),含甲酸的甲酸铵水:乙腈(70/30,v/v)-含甲酸的甲酸铵水:乙腈(30/70,v/v),含甲酸的甲酸铵水:乙腈(60/40,v/v)-含甲酸的甲酸铵水:乙腈(40/60,v/v)。在一些实施方案中,本发明的方法采用含甲酸的甲酸铵水:乙腈(55/45,v/v)作为流动相进行。
在一些实施方案中,本发明的方法中采用的流动相为0.1%甲酸10mM甲酸铵水-乙腈。在一些实施方案中,所述流动相采用上述体积比进行。在一些实施方案中,本发明的方法中采用流动相0.1%甲酸10mM甲酸铵水-乙腈(55/45,v/v)进行。为了改善色谱分离选择性,可以考虑调节流动相的极性,向流动相中加入改性剂等。已经观察到采用所述流动相进行洗脱能够充分分离待测物质,获得良好的峰形和较快的分析时间。
在一些实施方案中,本发明的方法采用ZORBAX SB-C18column(3.5μm,150mm×2.1mm)作为分析柱进行。在色谱法中,色谱柱的选择十分重要,对色谱柱的要求是柱效高、选择性好,分析速度快等。在本发明中,发明人发现ZORBAX SB-C18column(3.5μm,150mm×2.1mm)能够实现他菲替尼和活性代谢产物SCR868良好分离和峰型,而其它色谱柱如Acquity UPLC BEH C18(50mm×2.1mm,1.7μm)对于目标化合物的保留较差,而且峰形的对称性欠佳。还发现色谱柱Acquity BEH Shield RP 18(100mm×2.1mm,1.7μm)在等度洗脱时仍难以获得对称的峰形,使用梯度洗脱,峰形可以得到改善,但是洗脱时间较长,而且存在较为严重的拖尾。因此,已经观察到采用ZORBAX SB-C18column(3.5μm,150mm×2.1mm)作为分析柱能够充分分离待测物质,获得良好的峰形和较快的分析时间。
在一些实施方案中,本发明的方法可以采用盐酸哌唑嗪为内标进行。在采用内标法时,内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去,和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征;在色谱分析条件下,内标物必须能与样品中各组分充分分离。在一些实施方案中,发明人已经显示盐酸哌唑嗪能够提供线性关系良好、精密度、基质效应、提取回收率以及稳定性符合要求的检测方法。
在一些实施方案中,本发明的方法采用蛋白沉淀法进行前处理。发明人已经发现通过液液萃取进行样品前处理时,操作繁琐耗时,提取回收率低,并且检测的灵敏度也较低,不能满足临床药代动力学中大样本检测人血浆中他菲替尼和活性代谢产物SCR868的浓度的要求。本发明的研究结果显示在本发明的条件下能够采用蛋白沉淀法进行样本前处理,并且获得令人惊讶的高回收率,从而可以避免繁琐耗时的液液萃取过程。在本发明中,可以通过例如甲醇或乙腈进行蛋白沉淀处理。优选地,在本发明的条件下可以采用乙腈进行蛋白沉淀。已经发现最初血浆样品用甲醇蛋白沉淀后,并进一步用甲醇稀释后直接进样,标准曲线最高点后的空白样品残留峰面积较高,且色谱峰存在拖尾。在一些实施方案中,本发明的方法能够获得提高的回收率。在一些实施方案中,本发明的方法获得高达80%以上的回收率。在一些实施方案中,本发明的方法获得高达85%以上的回收率。在一些实施方案中,本发明的方法获得高达90%以上的回收率。在一些实施方案中,本发明的方法获得高达95%以上的回收率。在一些实施方案中,本发明能够得令人吃惊的高达99%的提取回收率。在一些实施方案中,本发明的方法获得的提取率能够高达99%,并且能够获得高的灵敏度和避免基质效应。在一些实施方案中,待测人血浆样品通过蛋白沉淀法前处理后,通过纯化水进行稀释。在一些实施方案中,待测人血浆样品通过蛋白沉淀法如乙腈蛋白沉淀法前处理后,通过纯化水进行稀释至接近流动相流动相比例的溶剂比例。在一些实施方案中,通过纯化水进行稀释至选自下述的溶剂比例:水:乙腈(80/20,v/v)-水:乙腈(20/80,v/v),水:乙腈(60/40,v/v)-水:乙腈(40/60,v/v),优选水:乙腈(55/45,v/v)。发明人发现蛋白沉淀后加入纯化水进行稀释,优选接近流动相比例的溶剂比例,可以获得更好的峰形,并减小残留,尤其能够获得提高的灵敏度。在一些实施方案中,本发明的方法检测血浆中的他菲替尼和SCR868的灵敏度为大于0.1ng/mL。在一些实施方案中,本发明的方法检测血浆中的他菲替尼和SCR868的灵敏度为0.2ng/mL。
在一些实施方案中,本发明的方法具有降低的基质效应。在一些实施方案中,本发明的方法的基质效应在95-110%之间。
在一些实施方案中,本发明的方法具有提高的灵敏度。在一些实施方案中,本发明的方法中他菲替尼和SCR868在血浆0.2~50ng/mL范围内线性关系良好。
在一些实施方案中,本发明的方法中所述流动相采用0.1-0.8ml/min的流速进行,优选采用0.2-0.50ml/min的流速进行。
在一些实施方案中,本发明的方法可以采用梯度洗脱或等度洗脱进行。在一些实施方案中,本发明的方法通过等度洗脱进行。
在一些实施方案中,血浆样品前处理采用乙腈蛋白沉淀,经纯化水进一步稀释后用Agilent ZORBAX SB-C18column(3.5μm,150mm×2.1mm)色谱柱,45%乙腈和55%10mM甲酸铵0.1%甲酸水进行分离。
本发明的方法的特异性、基质效应、提取回收率以及稳定性均进行了验证,所述方法已经成功应用于临床药代动力学样本的检测。
附图说明
图1:他菲替尼(左),M1(中)和内标(哌唑嗪)二级质谱图。
图2:3个目标化合物的空白血浆、含内标空白血浆和低定量下限的特征性色谱图。
图3:他菲替尼标准曲线。
图4:M1标准曲线。
图5:10mg剂量组他菲替尼和M1药时曲线图。
具体实施方式
1、为了支持其临床药代动力学研究,发明人建立了快捷、灵敏的高效液相色谱质谱联用(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法检测人血浆中他菲替尼和主要活性代谢产物SCR868(N-去乙基他菲替尼)的血药浓度。血浆样品前处理采用400ul乙腈蛋白沉淀,经纯化水进一步稀释后用Agilent ZORBAXSB-C18column(3.5μm,150mm×2.1mm)色谱柱,45%乙腈和55%10mM甲酸铵0.1%甲酸水,0.25ml/min等度洗脱进行分离,内标选用盐酸哌唑嗪,质谱条件为电喷雾电离(ESI),阳离子多反应监测模式(MRM),监测离子对为:他菲替尼m/z 425.2>309.1,SCR868m/z 397>309.1,内标384>247。
2、材料与方法
2.1、试剂与药品
苹果酸他菲替尼和主要代谢产物M1(N-去乙基他菲替尼)标准品均由南京优科生物技术有限公司提供,内标盐酸哌唑嗪购自中国食品药品检定研究院。高效液相色谱纯级甲醇和乙腈购自Fisher公司,高效液相色谱纯级甲酸和甲酸铵购自Sigma公司,实验用水为MilliQ Direct 8所制超纯水。
2.2、实验仪器和分析条件
液相色谱仪为Waters公司的超高效液相色谱,色谱柱为安捷伦ZORBAX SB-C18column(3.5μm,150mm×2.1mm),液相条件为:流动相:0.1%甲酸10mM甲酸铵水-乙腈(55/45,v/v);流速:0.25mL/min;进样量:2μl;柱温:40℃;进样器内温度:4℃。
质谱条件:用AB公司QTRAP 5500三重四级杆质谱进行分析检测。电喷雾电离(ESI),正离子模式,多反应监测模式(MRM),喷雾电压为4000V,离子源温度为:500℃,气帘气:30psi.,雾化气:35psi,辅助雾化气:40psi,他菲替尼、SCR868和内标检测离子对分别为:m/z 425.2>309.1,DP、EP、CXP和CE分别为70V、5V、10V、40V,m/z 397>309.1m/z,DP、EP、CXP和CE分别为150V、6V、14V、30V;384>247,DP、EP、CXP和CE分别为100V、6V、12V、47V(二级质谱图见图1)。
2.3、储备液和工作液配制
精密称取适量他菲替尼、SCR868和内标标准品,用甲醇配制成1mg/ml的储备液。内标工作液用50%甲醇水稀释,浓度为80ng/ml的内标工作液。他菲替尼和SCR868储备液等比例混合后,进一步用甲醇稀释,配制成两个化合物浓度为500、200、100、50、20、10、5、2ng/ml的标准曲线工作液,以及400、40、4ng/ml质控工作液。储备液置于4℃保存,工作液置于-20℃保存。
2.4、血浆样品配制
在1.5ml EP管中加入5μl甲醇和50μl内标工作液后加入45μl血浆样品,再加入400μl乙腈,涡旋混匀30s,12000rpm离心10min,取80μl上清于新的EP管内,加入60μl纯水稀释,涡旋10s,12000rpm离心5min,取2μl进样检测。
2.5、方法学验证
参照2015年《中国药典》中的《生物样品定量分析方法验证指导原则》,对检测方法进行验证,验证内容包括特异性、精密度、灵敏度、标准曲线、提取回收率、基质效应、稳定性。
2.5.1、特异性
分别取6个个体空白血浆45μl,加入55μl甲醇,随后按“2.4、血浆样品处理”项下操作,进样检测获得空白血浆图谱(图2)。
分别取6个个体空白血浆45μl,按照按“2.4、血浆样品处理”项下操作,进样检测获得仅加内标的空白血浆图谱(图2)。
分别取6个个体空白血浆45μl,加入5μl 2ng/ml的标准曲线工作液,再加入50μl内标工作液,随后按照按“2.4、血浆样品处理”项下操作,进样检测获得低定量下限的图谱(图2)。
2.5.2、精密度和准确度
45μl空白血浆加入5μl相应浓度的工作液配制成0.2、0.4、4、40ng/ml的血浆样品各6份,作为精密度和准确度样品,随后按照“2.4、血浆样品处理”项下处理。不同天测定3批样品,计算他菲替尼/SCR868峰面积和内标峰面积的比值,代入当天的标准曲线求得实测浓度,计算批内和批间精密度和准确度。精密度和准确度分别用RSD%和RE%表示,其绝对值小于15%为合格,低定量下限小于20%为合格。结果见表1。
表1他菲替尼和M1批内、批间精密度与准确度。
2.5.3、标准曲线
45μl空白血浆加入5μl相应浓度的标准曲线工作液,配制成相当于血浆中他菲替尼和M1浓度分别为50、20、10、5、2、1、0.5、0.2ng/mL的模拟血浆样品,随后按“2.4血浆样品的处理”项下操作,进样检测。验证三批,以他菲替尼/M1浓度与内标浓度比值(X)为横坐标,他菲替尼/M1与内标物的峰面积比值f为纵坐标,用加权(W=1/X2)最小二乘法进行回归运算,求得的直线回归方程即为标准曲线。他菲替尼标准曲线见图3,M1标准曲线见图4。
2.5.4、提取回收率和基质效应
对照组(SET1)样品的制备:于1.5ml离心管中加入45μl纯水,再加入他菲替尼和M1浓度分别为4ng/mL,40ng/mL,400ng/mL的质控混合工作液5μl,以及内标溶液50μl,精密加入400μl乙腈,涡旋混匀,于12000rpm离心10min,吸取50μl上清液加入到进样瓶中,取2μl进行LC-MS/MS分析。每浓度制备3份样品,记录色谱图,记录他菲替尼峰面积(A),计算其平均值As,M1峰面积(B),计算其平均值Bs,记录各组内标峰面积(C),求其平均值(Cs)。
对照组(SET2)样品的制备:1.5ml的Ep管中精密加入45μl 6个不同个体空白血浆,加入400μl乙腈,涡旋振荡10s,于12000rpm离心10min,取全部上清于新的Ep管中,再加入5μl浓度为4ng/mL,40ng/mL,400ng/mL的他菲替尼和M1质控混合工作液,再精密加入内标溶液50μl,涡旋混匀后,吸取50μl上清液加入到进样瓶中,取2μl进行LC-MS/MS分析。记录色谱图,记录各浓度他菲替尼的峰面积Am,求其平均值Am′,M1的峰面积Bm,平均值Bm′;记录所有浓度中的内标峰面积Cm,求其平均值Cm′。
实验组(SET3)样品的制备:按“血浆样品标准曲线”测定方法配制成血浆他菲替尼和M1浓度分别为4ng/mL,40ng/mL,400ng/mL的低、中、高三种不同浓度的血浆样本各6份,按“2.4血浆样品的处理”项下操作,进行UPLC-MS/MS分析,记录色谱图。记录各浓度样品的他菲替尼的峰面积Ai,M1的峰面积Bi,记录所有内标峰面积Ci,分别将Ai、Bi、Ci和As、Bs和Cs代入下式即可求得他菲替尼、代谢物M1和内标哌唑嗪的绝对提取回收率(AR%):
他菲替尼:AR%=Ai/As×100%;
M1:AR%=Bi/Bs×100%;
内标:AR%=Ci/Cs×100%;
将Ai、Bi、Ci和Am′、Bm′、Cm′代入下式即可求得他菲替尼、代谢物M1和内标哌唑嗪的相对提取回收率(RR%):
他菲替尼:RR%=Ai/Am′×100%;
M1:RR%=Bi/Bm′×100%;
内标:RR%=Ci/Cm′×100%;
将Am、Bm、Cm和As、Bs、Cs代入下式即可求得他菲替尼、代谢物M1和内标哌唑嗪的基质因子(MF%):
他菲替尼:MF%=Am/As×100%;
M1:MF%=Bm/Bs×100%;
内标:MF%=Cm/Cs×100%;
待测物他菲替尼和M1的基质因子与内标的基质因子之比为内标归一化基质因子(MF’%),6个个体内标归一化基质因子CV应小于15%。
结果见表2。
表2他菲替尼、M1和内标基质效应和提取回收率。
2.5.5、稳定性考察
稳定性考察包括:血浆样品-80℃冻存29天,-80℃和室温反复冻融3次、处理后样品进样器放置24h,储备液75天稳定性。配制低、中、高浓度质控样品各5个,置于相应环境条件后,处理后进样检测,以新鲜配制的标准曲线和质控样品进行定量,计算测得浓度与理论值的偏差。结果见表3。
表3他菲替尼和M1稳定性(平均值±SD)
3、药代动力学检测
入组经治疗失败或者缺乏有效治疗方法的晚期实体瘤患者,于试验前一日晚8点禁食,自由饮水。试验当日早8:30-9:00空腹口服苹果酸他菲替尼,观察14天,如未出现DLT,则序贯进入多次给药的耐受性和药代动力学试验,连续服药28天。于单次给药前0h,给药后1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h(d2)、36h、48h(d3)、d5、d8、d11、d14。多剂给药第1天给药前,d2、d5、d8、d11、d15、d22、d28天给药前,第28天末次给药后1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h(d2)、36h、48h(d3)、d5、d8、d11、d14采集静脉血,3500rpm离心10min,血浆样品分装后冻存于-80℃,等待进行药代动力学检测。10mg剂量组药时曲线见图5。
4、讨论
在色谱柱选择方面,最初尝试使用Waters的Acquity UPLC BEH C18(50mm×2.1mm,1.7μm)但是柱子对于目标化合物的保留较差,而且峰形的对称性欠佳。后又尝试Acquity BEH Shield RP 18(100mm×2.1mm,1.7μm),但是在等度洗脱时仍难以获得对称的峰形,使用梯度洗脱,峰形可以得到改善,但是洗脱时间较长,而且存在较为严重的拖尾。经过多次探索,最终选用安捷伦ZORBAX SB-C18column(3.5μm,150mm×2.1mm),0.1%甲酸10mM甲酸铵水-乙腈(55/45,v/v)等度洗脱,0.25ml/min的流速可以较好的将目标化合物进行分离,并获得良好的峰形和合理的分析时间。
尽管使用甲醇作为流动相可获得更好的响应,但是基线噪音也相应增高,而且目标化合物的信号较高,存在较为严重的残留。为了结果残留问题,发明人将洗脱液的量加到最大,并在弱洗脱液内添加0.1%甲酸,以减小进样针的残留。最初血浆样品用400μl甲醇蛋白沉淀后,并进一步用甲醇稀释后直接进样,标准曲线最高点后的空白样品残留峰面积高达LLOQ的1/3,且色谱峰存在拖尾,即使换为乙腈蛋白沉淀也不能改善残留问题。最终使用乙腈蛋白沉淀后加入纯化水进行稀释,处理后样品的溶剂组成可以影响目标化合物的峰形和残留情况。接近流动相比例的溶剂比例,可以获得更好的峰形,并减小残留。
目前并未有关于人血浆中他菲替尼和SCR868血药浓度检测的方法报道,已有的检测狗血浆中他菲替尼和SCR868浓度的方法并不适用于临床药代动力学研究的大批量的样本检测[6]。发明人开发的UPLC-MS/MS方法测定人血浆中他菲替尼和SCR868的浓度,样本处理简单、快捷,适合大通量的临床样品检测。该方法已成功应用于他菲替尼10mg剂量组实体瘤受试者单、多次给药的的血药浓度检测。
参考文献
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Claims (12)
1.通过超高效液相色谱串联质谱法UPLC-MS/MS测定人血浆中他菲替尼和活性代谢产物SCR868的浓度的方法,其中所述方法采用含甲酸的甲酸铵水-乙腈作为流动相进行,其中待测人血浆样品通过乙腈蛋白沉淀法进行前处理后,通过纯化水进行稀释至流动相比例的溶剂比例。
2.权利要求1所述的方法,其中所述方法采用的含甲酸的甲酸铵水-乙腈流动相的体积比选自以下范围:含甲酸的甲酸铵水:乙腈80/20,v/v-含甲酸的甲酸铵水:乙腈20/80,v/v。
3.权利要求1所述的方法,其中所述方法采用的含甲酸的甲酸铵水-乙腈流动相的体积比选自以下范围:含甲酸的甲酸铵水:乙腈60/40,v/v-含甲酸的甲酸铵水:乙腈40/60,v/v。
4.权利要求1所述的方法,其中所述方法采用的含甲酸的甲酸铵水-乙腈流动相的体积比为含甲酸的甲酸铵水:乙腈55/45,v/v。
5.权利要求1-4任一项所述的方法,其中所述方法采用ZORBAX SB-C18column 3.5μm,150mm×2.1mm作为分析柱进行。
6.权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述方法采用盐酸哌唑嗪为内标进行。
7.权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述方法采用0.1-0.8ml/min的流速进行。
8.权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述方法采用0.2ml/min的流速进行。
9.权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述方法通过等度洗脱进行。
10.权利要求1所述的方法,其中稀释至选自下述的溶剂比例:水:乙腈80/20,v/v-水:乙腈20/80,v/v。
11.权利要求1所述的方法,其中稀释至选自下述的溶剂比例:水:乙腈60/40,v/v-水:乙腈40/60,v/v。
12.权利要求1所述的方法,其中稀释至选自下述的溶剂比例:水:乙腈55/45,v/v。
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