CN115166095A - 一种蛋黄卵磷脂有关物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种蛋黄卵磷脂有关物质的检测方法，涉及药物分析技术领域。本发明采用高效液相色谱法进行检测，色谱条件为：亲水相互作用色谱柱，流动相A：乙酸铵水溶液‑乙腈（80：20，v/v，其中含有5mmol/L的乙酸铵），流动相B：乙腈，梯度洗脱，电喷雾检测器。本发明提供的方法能够实现待测组分之间的有效分离，准确度、重复性、精密度和耐用性均良好，为蛋黄卵磷脂产品的质量控制提供了新方法。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体而言，本发明涉及一种利用高效液相色谱法测定蛋黄卵磷脂中有关物质的方法。
背景技术
蛋黄卵磷脂是从鸡蛋中提取的两亲性物质，具有乳化性好、生物利用度高、致敏性低等优点，可作为药用辅料在脂质体、脂肪乳、聚合物胶束等剂型中使用，已有多种产品上市。
蛋黄卵磷脂是天然来源的物质，组成复杂，蛋黄卵磷脂的主要成分(式1-2)和有关物质(式3-6)的结构差异较小，现有的提取工艺难以除去蛋黄卵磷脂中的有关物质，主要有：磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、溶血磷脂酰胆碱，上述物质可能会导致红细胞溶解和炎症反应。
蛋黄卵磷脂的生产厂家众多，各厂家使用了不同的鸡蛋来源和提取手段导致了市面上该产品的差异性。目前的有关物质分析方法在分离效果、重复性、耐用性等方面存在不同的问题。
(1)分离问题：
磷脂为弱极性物质，常用正相色谱进行分离。由于蛋黄卵磷脂待测组分的结构相似、理化性质差异不大，难以通过常规的液相方法实现待测物质的完全分离。此外，蛋黄卵磷脂中还含有磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸等组分干扰待测物质的分析。《中国药典》法定方法采用硅胶柱分析蛋黄卵磷脂的有关物质，色谱图见图4。该方法无法实现PE与PI的基线分离，样品中的未知杂质与PI、LPE的分离不佳。
(2)检测问题：
由于磷脂的紫外吸收较弱，无法使用紫外检测器，现行方法中主要使用蒸发光散射检测器(ELSD)进行检测。由于蛋黄卵磷脂成分复杂、样品黏度较高，当测定较多样品时，雾化器和漂移管易被污染使基线噪音变大，导致灵敏度降低，需要经常对仪器进行维护。此外，使用ELSD定量时，需要对浓度和峰面积取对数后拟合标准曲线，用标准曲线法定量，实验操作较为繁琐；由于ELSD的状态较不稳定，长时间测定样品时，需要每天做随行标曲，影响实验效率。
上述问题主要与蛋黄卵磷脂样品的复杂性和蒸发光散射检测器的特性有关。首先，蛋黄卵磷脂样品中含有多种磷脂，部分种类的磷脂结构相似、极性差异小，难以分离。样品中还含有盐、脂肪酸等物质干扰待测组分的检测；由于鸡蛋来源和提纯工艺的不同，市面上不同企业生产的蛋黄卵磷脂产品差异较大。此外，ELSD的检测原理为：通过雾化器将色谱柱洗脱物雾化，雾化后的细小液滴进入高温漂移管后蒸发除去流动相，余下的不挥发性溶质颗粒在激光的照射下产生散射光，通过检测散射光的强度即获得被测组分的浓度信号。由于蛋黄卵磷脂的黏度大，待测样品的浓度较高，因此易导致雾化器和漂移管的污染。
因此，开发一种分离效果更好、耐用性佳的方法对有关物质分析方法，对提高用药安全和蛋黄卵磷脂的质量控制有重要意义。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种蛋黄卵磷脂的有关物质检测方法，所述有关物质包括磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、溶血磷脂酰胆碱。
本发明的第二目的在于提供一种蛋黄卵磷脂有关物质检测方法在蛋黄卵磷脂产品质量监控中的应用。
第一方面，本发明提供了一种蛋黄卵磷脂有关物质的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)配制溶液，分别配制空白溶液、对照品溶液和供试品溶液。
(2)测定方法：采用液相色谱法测定蛋黄卵磷脂有关物质的含量，待系统稳定后，分别进空白溶液、对照品溶液和供试品溶液，记录色谱图。
所述液相色谱检测的条件如下：
色谱柱：亲水相互作用色谱柱；
流动相A：乙酸铵水溶液-乙腈(80：20，v/v，其中含有5mmol/L的乙酸铵)；
流动相B：乙腈；
洗脱程序如下：0min：7％流动相A，93％流动相B，0-36min：流动相A逐渐升至21％，流动相B逐渐降至79％，36-37min：流动相A逐渐降至7％，流动相B逐渐升至93％，37-47min：7％流动相A，93％流动相B。
作为进一步技术方案，空白溶剂为二氯甲烷-甲醇(2:1，v/v)。
作为进一步技术方案，色谱柱为Waters Xbridge HILIC(4.6mm×250mm，5μm)。
作为进一步技术方案，所述流动相流速为1.0～1.2mL/min，优选为1.0mL/min。
作为进一步技术方案，所述色谱柱的柱温为35-40℃，优选为35℃。
作为进一步技术方案，所述检测器为电喷雾检测器或蒸发光散射检测器，优选为电喷雾检测器。
作为进一步技术方案，所述电喷雾检测器的雾化器温度为35-65℃，优选为50℃。
第二方面，本发明提供了一种蛋黄卵磷脂有关物质检测方法在蛋黄卵磷脂产品质量监控中的应用。
本发明关键点为色谱柱，洗脱程序和检测器的选择。
有益效果：
1、本发明提供的蛋黄卵磷脂有关物质检测方法，采用Waters Xbridge HILIC(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，以乙酸铵溶液和乙腈为流动相梯度洗脱，使用电喷雾检测器，能够准确实现蛋黄卵磷脂样品中有关物质的检测。与其他检测方法相比，本发明的分离效果好、灵敏度高、耐用性好，在系统适用性、重复性、专属性、准确度方面完全符合中国药典方法学验证的指导原则，可用于蛋黄卵磷脂的质量控制。
2、本发明经过大量实验，见优化过程和对比例，发现只有本发明所述的特定条件才能实现符合药典规定的检测结果，不同与本发明的实验条件难以符合要求。
本发明经过大量实验，考察了不同填料、不同规格的八种色谱柱，其中WatersXbridge HILIC(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱对待测组分的分离效果最好，其他种类的色谱柱均无法实现待测组分的完全分离。选定色谱柱后，本发明对多个实验参数进行了优化，通过评估待测组分的分离度、峰形、分析时间、检测灵敏度后，选择了最佳的洗脱程序、流动相组成、色谱柱温度和检测器温度，确定了蛋黄卵磷脂有关物质的分析方法，该方法对于待测组分的分离度良好、峰形优、灵敏度高、重复性好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1、为本发明空白溶液图谱；
图2、为本发明系统适用性溶液图谱；
图3、为本发明供试品溶液图谱；
图4、2020版《中国药典》方法蛋黄卵磷脂有关物质测定结果；A、蛋黄卵磷脂有关物质测定样品色谱图B、蛋黄卵磷脂样品有关物质与系统适用性图谱重叠色谱图；
图5、不同批次月旭Ultimate Diol柱-系统适用性溶液色谱图；
图6、不同批次Waters Xbridge HILIC柱-系统适用性溶液色谱图；
图7、使用不同改性剂时系统适用性溶液色谱图；
图8、优化前后蛋黄卵磷脂系统适用性溶液色谱图对比(上图：优化前，下图：优化后)；
图9、不同柱温下蛋黄卵磷脂系统适用性溶液HPLC色谱图；由上到下分别为40℃、35℃、30℃；
图10、方法1系统适用性溶液色谱图；
图11、方法2系统适用性溶液色谱图；
图12、方法3系统适用性溶液色谱图；
图13、方法4系统适用性溶液色谱图；
图14、方法5样品溶液色谱图；
图15、方法6样品溶液色谱图；
图16、方法7系统适用性溶液色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1蛋黄卵磷脂有关物质分析方法
(1)仪器：高效液相色谱仪，电喷雾检测器，电子天平。
(2)配制溶液
空白溶液：二氯甲烷-甲醇(2:1，v/v)。
供试品溶液：精密称取样品适量，用溶剂溶解成每1mL中含有蛋黄卵磷脂2.5mg的溶液，即为供试品溶液。
系统适用性溶液：精密称取蛋黄磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、蛋黄磷脂酰胆碱(PC)、鞘磷脂(SPM)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)对照品各5mg，分别置于10、5、10、5、5、5mL的容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，混匀。精密量取上述溶液各0.5、0.5、1、1、1、1mL于5ml容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，混匀，即为系统适用性溶液。
有关物质对照品储备液：分别精密称取PI、LPE、SPM、LPC对照品适量，用溶剂溶解成每1mL中含有1mg对照品的溶液，即为各有关物质对照品储备液。
混合对照品溶液：精密量取各有关物质对照品储备液适量，用溶剂稀释成每1mL含有PI、LPE、SPM和LPC分别为125、25、75和87.5μg的溶液，即为混合对照品溶液。各有关物质对照品浓度为限度浓度。
(3)色谱条件
色谱柱：Waters Xbridge HILIC(4.6mm×250mm，5μm)；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；流动相A：乙酸铵水溶液-乙腈(80:20，v/v，其中含有5mmol/L的乙酸铵)，流动相B：乙腈；按下列梯度进行洗脱：0min：7％流动相A，93％流动相B，0-36min：流动相A逐渐升至21％，流动相B逐渐降至79％，36-37min：流动相A逐渐降至7％，流动相B逐渐升至93％，37-47min：7％流动相A，93％流动相B；电喷雾检测器，雾化器温度：50℃，幂率：1.00，数据采集频率：10Hz，进样量10μL。
实施例2蛋黄卵磷脂有关物质分析方法学验证
对本发明制定的有关物质测定方法专属性、耐用性、检测限、定量限、线性、准确度、精密度、样品溶液稳定性进行验证，结果如下，证明本发明有关物质测定方法可行性良好。
(1)专属性试验
按实施例1有关物质方法配制空白溶剂、系统适用性溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪，色谱条件同实施例1，试验结果见图1-3。结果表明：系统适用性溶液与供试品溶液中各有关物质的分离度均大于1.5，且空白溶剂对样品检测无干扰。
(2)检测限和定量限
取实施例1项下PI、LPE、SPM和LPC对照品储备液，用溶剂逐级稀释，色谱条件同实施例1，以信噪比3：1为检测限，信噪比10：1为定量限，确定四种有关物质的LOD和LOQ，结果见表1。取各有关物质的定量限溶液连续6次注入液相色谱仪，记录保留时间和峰面积，计算RSD％，考察定量限的精密度，结果见表2。各有关物质定量限的保留时间RSD＜1％，峰面积RSD＜5％，保留时间和峰面积的精密度良好。
表1检测限和定量限
表2定量限的精密度测定结果
(3)线性
取实施例1项下PI、LPE、SPM和LPC对照品储备液，用溶剂稀释，在各有关物质的定量限水平～限度浓度的150％范围内配制标准曲线溶液。PI线性溶液的浓度分别为：1.2、2、10、50、100、200μg/mL，LPE线性溶液的浓度分别为：2.6、5.1、10.2、20.5、40.9、51.2μg/mL，SPM线性溶液的浓度分别为：3.7、10、20、40.1、80.1、120.2μg/mL，LPC线性溶液的浓度分别为：8.6、9.8、19.7、49.2、98.4、147.6μg/mL。色谱条件同实施例1，以浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标进行线性回归。线性结果如表3所示。各有关物质的线性关系良好。
表3线性试验结果
(3)重复性
由于样品中无PI和LPE，故向样品中加入一定量的PI和LPE对照品，使其成限度浓度，考察重复性。
精密称取蛋黄卵磷脂样品2.5mg于10mL容量瓶中，加入实施例1下的PI和LPE对照品溶液适量，用溶剂稀释至刻度，平行制备6份供试品溶液。取实施例1项下的混合对照品溶液。色谱条件同实施例1，用外标法计算样品中各有关物质的含量，计算RSD％，结果如表4所示，结果显示重复性较好。
表4重复性试验结果
(4)中间精密度
实验操作参照(3)重复性，在不同实验时间下、由不同分析人员、使用不同的仪器进行实验操作，每天测定2个样品，共测定6天。其余条件均相同，考察方法的中间精密度，结果见表5，各有关物质的精密度符合要求。
表5中间精密度试验结果
(5)准确度
用加样回收率实验来考察准确度。
精密称取已知各有关物质含量的样品2.5mg，共9份，置10mL容量瓶中，精密加入实施例1项下各对照品储备液，用溶剂稀释至刻度，使各有关物质浓度相当于LOQ水平、限度水平的100％和150％。各浓度水平平行操作3次，色谱条件同实施例1，用外标法计算回收率，结果见表6。该方法的准确度良好。
表6准确度试验结果
(6)稳定性
按实施例1项下配制供试品溶液，分别放置0、2、4、6、8、10、12小时后，色谱条件同实施例1，考察样品中各有关物质峰面积的变化，计算RSD％，结果见表7。该样品中无PI和LPE。样品中的有关物质在12小时内稳定性良好。
表7稳定性试验结果
(7)耐用性
取实施例1项下的蛋黄卵磷脂供试品溶液、系统适用性溶液作为分析对象，改变试验条件的参数，分别使用不同批次的色谱柱、改变流速、柱温，比较条件改变前后供试品溶液和系统适用性溶液中各组分之间的分离度，色谱条件同实施例1，结果见表8。不同条件下系统适用性溶液中的各组分分离度均大于1.5，该方法耐用性良好。
表8耐用性试验结果
实施例3检测市售16批蛋黄卵磷脂样品的有关物质含量
按实施例1配制供试品、混合对照品溶液，色谱条件同实施例1，记录色谱图，用外标法计算结果，结果见表9。结论：各有关物质含量均符合2020版《中国药典》要求。
表9蛋黄卵磷脂样品有关物质测定结果
注：-为未检出。
实施例4检测条件优化过程
1、色谱柱的选择
本发明考察了8种不同填料色谱柱对于蛋黄卵磷脂样品中有关物质的分离情况。色谱柱信息见表10。蛋黄卵磷脂的组成复杂，1～6号色谱柱均无法实现样品中有关物质的分离。7、8号色谱柱对于蛋黄卵磷脂中有关物质的分离效果较好。但7号柱的重现性较差，不同批次7号色谱柱对系统适用性溶液的分离色谱图见图5，由图可见，不同批次的该色谱柱对于待测组分的分离效果有较大差异，尤其是对于PE和PI组分的分离状况明显改变。而8号色谱柱不仅表现出对待测组分良好的分离能力，而且重现性较好，不同批次8号色谱柱对系统适用性溶液的分离色谱图见图6。因此选择8号柱作为蛋黄卵磷脂有关物质检测的色谱柱，进行后续方法优化。
表10有关物质测定用色谱柱列表
2、流动相的优化
本研究首先对流动相中的添加剂进行了选择，考察了5mM乙酸铵、5mM甲酸铵、0.1％甲酸对于分离效果和峰形的影响，系统适用性溶液的色谱图见图7，可以看出，当流动相中加入5mM乙酸铵时，PI的峰形最佳。由于乙酸铵浓度的升高会导致CAD检测器基线噪音的增大，本研究最终选用了5mM乙酸铵作为流动相添加剂。
筛选色谱柱时使用的流动相为A：5mM乙酸铵水，B：乙腈。由于A相为缓冲盐水相，B相为纯有机相，为了避免两相混合时缓冲盐与有机相无法充分混匀，影响流动相系统的稳定性，因此向A相中加入有机溶剂，增加A、B相之间的相溶能力。优化后的流动相为：A：乙酸铵水溶液-乙腈(80:20，v/v，其中含有5mmol/L的乙酸铵)，B：乙腈。
3、洗脱程序的优化
流动相的组成改变后，需要对梯度进行优化以实现原分离结果的重现。在此基础上，在保证各组分完全分离的前提下尽可能缩短分析时间。
原梯度：0min：94％B，40min：83％B，41min：94％B，51min：94％B。
优化后：0min：93％B，36min：79％B，37min：93％B，47min：93％B。
优化前后系统适用性溶液色谱图对比如图8所示，优化后仍可实现对六种待测组分的完全分离，且缩短了分析时间。
4、柱温的选择
该色谱柱的最高使用温度为50℃，为了提高色谱柱的耐用性，考察柱温为30、35、40℃时对各磷脂组分的分离情况，结果如图9所示。不同柱温下各组分的分离情况差异不大，柱温主要影响了PI的峰形，当柱温为30℃时，PI峰扁平。因此选择35℃作为柱温。
5、检测器参数的选择
雾化器温度是影响CAD响应的主要因素，我们考察了不同温度下系统适用性溶液中各组分的信噪比，结果如表11。由表可知，随着温度的升高,各组分的响应增加。但CAD温度为50℃和65℃时，响应差别不大。且部分型号的CAD最高可设置的温度为50℃，为了保证该方法的普适性，选择50℃作为CAD温度。
表11不同温度下系统适用性溶液中各组分的信噪比
最佳检测条件
综上所述，确定最终色谱条件为：色谱柱：Waters Xbridge Hilic(4.6mm×250mm，5μm)，流动相A：乙酸铵水溶液-乙腈(80:20，v/v，其中含有5mM的乙酸铵)，B：乙腈，流速：1.0ml/min，按下表进行梯度洗脱。柱温：35℃，检测器为电喷雾检测器，温度：55℃，幂率：1.00，数据采集频率：10Hz。梯度洗脱条件见表12。
表12蛋黄卵磷脂有关物质检测梯度洗脱条件
对比例不同洗脱条件的检测结果
注：方法1-4除了不同洗脱条件，其他同实施例1。
1、方法1
(1)实验条件：流动相A：35mM醋酸铵乙腈-水(95：5，v/v)，流动相B：乙腈；梯度洗脱：0min：97％B，0.5min：97％B，26min：75％B，26.5min：60％B，32.5min：60％B，34.5min：97％B，39.5min：97％B。
(2)色谱图：见图10
(3)结论：PE与PI分离不佳。
2、方法2
(1)实验条件：流动相A：5mM醋酸铵水，流动相B：乙腈；梯度洗脱：0min：97％B，0.5min：97％B，26min：75％B，26.5min：60％B，32.5min：60％B，34.5min：97％B，39.5min：97％B。
(2)色谱图：见图11
(3)结论：LPE与PC分离不佳。
3、方法3
(1)实验条件：流动相A：7mM醋酸铵水，流动相B：7mM醋酸铵乙腈-水(95：5，v/v)；梯度洗脱：0min：100％B，40min：90％B，40.5min：70％B，50min：70％B，50.5min：100％B，60min：100％B。
(2)色谱图：见图12
(3)结论：PI与PC分离不佳。
4、方法4
(1)色谱条件
色谱柱：Merck LiChrospher 100 Diol(4mm×125mm，5μm)；流动相A：三乙胺-冰醋酸-异丙醇-正己烷(0.08：1.5：17：81.42，v/v/v/v)，流动相B：三乙胺-冰醋酸-水-异丙醇(0.08：1.5：14：84.42，v/v/v/v)，溶剂：水-异丙醇-正己烷(8：46：46，v/v/v)；梯度洗脱：0min：5％B，2min：5％B，7min：20％B，10.5min：40％B，17min：100％B，19.5min：100％B，20.5min：5％B，27min：5％B。检测器：蒸发光散射检测器，漂移管温度：80℃，载气：空气，2.0L/min，进样量：20μL。
(2)配制溶液：同具体实施方式中溶液配制方法。
(3)色谱图，见图13
(4)结论：PI与LPE分离不佳。
5、方法5
(1)色谱条件
色谱柱：Alltima Silica(4.6×250mm，5μm)；流动相A：甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(85：15：0.45：0.05，v/v/v)，流动相B：正己烷-异丙醇-流动相A(20：48：32，v/v/v)，溶剂：三氯甲烷-水(2：1，v/v)；梯度洗脱：0min：90％B，20min：70％B，35min：5％B，36min：90％B，41min：90％B。检测器：蒸发光散射检测器，漂移管温度：72℃，，载气：空气，2.0L/min，进样量：20μL。
(2)配制溶液：同具体实施方式中溶液配制方法。
(3)色谱图，见图14
(4)结论：PE与PI分离不佳，一种未知杂质干扰PI与LPE的分离。
6、方法6
(1)色谱条件
色谱柱：月旭Ultimate Diol(4.6×250mm，5μm)；流动相A：甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(85：15：0.5：0.05，v/v/v)，流动相B：正己烷-异丙醇-流动相A(20：48：32，v/v/v)，溶剂：三氯甲烷-水(2：1，v/v)；梯度洗脱：0min：95％B，10min：78％B，22min：10％B，23min：95％B，27min：95％B。检测器：蒸发光散射检测器，漂移管温度：72℃，，载气：空气，2.0L/min，进样量：20μL。
(2)配制溶液：同具体实施方式中溶液配制方法。
(3)色谱图，见图15
(4)结论：PI与LPE分离不佳。
7、方法7
(1)色谱条件
色谱柱：Waters Acquity BEH Hilic(2.1×100mm，1.7μm)；流动相A：7mM乙酸铵水，流动相B：7mM乙酸铵乙腈-水(95：5，v/v)，溶剂：三氯甲烷-水(2：1，v/v)；梯度洗脱：0min：100％B，20min：84％B，30min：30％B，31min：100％B，36min：100％B。检测器：蒸发光散射检测器，漂移管温度：72℃，，载气：空气，2.0L/min，进样量：20μL。(2)配制溶液：同具体实施方式中溶液配制方法。
(3)色谱图，见图16；
(4)结论：六种组分仅有三个组分出峰。
ELSD通过雾化色谱柱流出物、高温除去流动相后再检测样品粒子，获得待测物质的信号，故高浓度、高粘度的蛋黄卵磷脂样品易污染ELSD，导致检测的灵敏度和重复性下降。此外，ELSD定量时，需要对浓度和峰面积取对数后拟合标准曲线，实验操作较繁琐。因此本发明中采用了电喷雾检测器(CAD)，CAD的灵敏度较高，检测时可降低样品浓度，从而降低样品对检测器的污染。CAD还可用外标法定量，简化了操作程序，实验效率更高。通过方法学验证结果表明，本发明建立HPLC-CAD方法具有分离效果好、灵敏度高、重复性好等优点，适合于蛋黄卵磷脂有关物质的检测。
Claims (8)
1.一种蛋黄卵磷脂有关物质的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱对样品进行检测，所述高效液相色谱的条件包括：色谱柱：亲水相互作用色谱柱；流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为乙酸铵水溶液-乙腈为80：20，v/v，其中含有5mmol/L的乙酸铵；流动相B为乙腈；洗脱方式为梯度洗脱，洗脱程序如下：0min：7%流动相A，93%流动相B；0-36min：流动相A逐渐升至21%，流动相B逐渐降至79%；36-37min：流动相A逐渐降至7%，流动相B逐渐升至93%；37-47min：7%流动相A，93%流动相B。
2.如权利要求1所述蛋黄卵磷脂中有关物质的检测方法，其特征在于，蛋黄卵磷脂的有关物质包括磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、溶血磷脂酰胆碱。
3.如权利要求1所述蛋黄卵磷脂中有关物质的检测方法，其特征在于，所述样品包括蛋黄卵磷脂和注射用蛋黄卵磷脂。
4.如权利要求1所述蛋黄卵磷脂中有关物质的检测方法，其特征在于，所述方法中供试品溶液、系统适用性溶液和对照品溶液均采用二氯甲烷-甲醇2:1,v/v配制。
5.如权利要求1所述蛋黄卵磷脂中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱规格包括Waters Xbridge HILIC，4.6mm×250mm，5μm。
6.如权利要求1所述蛋黄卵磷脂中有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相流速为1.0~1.2 mL/min。
7.如权利要求1所述蛋黄卵磷脂中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱温度为35-40℃。
8.如权利要求1所述蛋黄卵磷脂中有关物质的检测方法，其特征在于，所述方法的检测器为电喷雾检测器；所述电喷雾检测器的雾化器温度为35-65℃。
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| 李志琴: "梯度洗脱HPLC-ELSD法测定蛋黄卵磷脂有关物质", 《福建分析测试》, vol. 23, no. 5, 31 December 2014 (2014-12-31), pages 48 - 50 * |
| 李志琴: "梯度洗脱HPLC-ELSD法测定蛋黄卵磷脂有关物质", 《附件分析测试》, vol. 23, no. 5, 15 September 2014 (2014-09-15), pages 48 - 50 * |
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