BR122013005232A2 - Peptídeo; ácido nucleico ou vetor de expressão; célula hospedeira; método in vitro para produzir linfócitos t citotóxicos ativados; tais linfócitos; e usos - Google Patents

Abstract

peptideo; acido nucleico ou vetor de expressao; celula hospedeira; metodo in vitro para produ- zir linfocitos t citotoxicos ativados; tais linfocitos; e usos a presente invencéo refere-se a peptideos imunoterapicos e seu uso em imunoterapia, em particular na imunoterapia do cancer. mais particularmente ainda refere-se ela a um peptideo compreendendo a sequéncia seq id no.8 (spqyswringipqqht) que induz células t de reacéo cruzada com o dito peptideo, tal peptideo ou variante tendo um comprimento total de entre 16 e 100 aminoécidos. divulgam-se aqui epitopos peptidicos de céluia t auxiliar associados a tumor, isoladamente ou em combinagéo com outros peptideos associados a tumores, que servem como ingredientes farmacéuticos ativos em composicoes de vacinas estimuiadoras das respostas imunes antitumor. em particular, a composicéo dos peptideos da presente invencao pode ser usada em composicoes de vacina para extrair respostas antitumorais imunes contra céncer colorretal.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PEPTÍDEO;

ÁCIDO NUCLEICO OU VETOR DE EXPRESSÃO; CÉLULA HOSPEDEIRA; MÉTODO IN VITRO PARA PRODUZIR LINFÓCITOS T CITOTÓXICOS ATIVADOS; TAIS LINFÓCITOS; E USOS”.

Dividido do PI0814140-1 depositado em 25/07/2008.

Relatório Descritivo

A presente refere-se a peptídeos imunoterápicos e a seu uso em imunoterapia, em particular na imunoterapia do câncer. A presente invenção divulga epítopos peptídicos de célula T auxiliar associados a tumor, isoladamente ou em combinação com outros peptídeos associados a tumores, que servem como ingredientes farmacêuticos ativos em composições de vacinas estimuladoras das respostas imunes antitumor. Em particular, a composição dos peptídeos da presente invenção pode ser usada em composições de vacina para extrair respostas antitumorais imunes contra câncer colorretal.

Para os fins da presente invenção, todas as referências aqui citadas passam a fazer parte integral deste documento por referência. Antecedentes da Invenção

Carcinoma colorretal

De acordo com a Sociedade Americana de Câncer, câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais comum nos EUA, afligindo mais de 175.000 novos pacientes cada ano. Nos EUA, Japão, França, Alemanha, Itália, Espanha e Reino Unido, ele afeta mais de 480.000 pacientes. É uma das causas mais comuns de mortalidade de câncer em países desenvolvidos.

A pesquisa sugere que o princípio do câncer colorretal é o resultado de interações entre fatores herdados e ambientais. Na maioria dos casos, pólipos adenomatosos pareçam ser precursores de tumores colorretal; contudo, a transição pode demorar muitos anos. O fator primário de risco para câncer colorretal é a idade, com 90% de casos diagnosticados sobre a idade de 50 anos. Outros fatores de risco para câncer colorretal de acordo com a Sociedade Americana de Câncer incluem consumo de álcool, uma dieta alta em gordura e/ou de carne vermelha e uma ingestão insuficiente de

2/93 frutas e verduras. A incidência continua a aumentar, especialmente em áreas tal como no Japão, onde a adoção de dietas ocidentalizadas com gordura em excesso, ingestão de carne e uma diminuição na ingestão de fibra podem ser a causa. No entanto, índices de incidência não aumentam tão rápido como previamente que pode ser devido ao aumento de proteções e remoções de pólipo, prevenindo assim uma progressão de pólipos ao câncer.

Como na maioria dos tumores sólidos, o tratamento de primeira linha é a cirurgia, no entanto, seus benefícios permanecem reservados a pacientes do estágio inietal, mas uma proporção significativa de pacientes é diagnosticada em estágios avançados da doença. Para regimes avançados de quimioterapia de câncer colorretal, regimes baseados em fluorouracila são um padrão de tratamento. A maioria destes regimes são os chamados protocolos FOLFOX (5-FU infusional/leucovorina mais oxaliplatina) e FOLFIRI (irinotecan, leucovorina, bolus e 5 FU de infusão contínua) .

A introdução de citotóxicos de terceira-geração tal como irinotecan e oxaliplatina levantou a esperança de melhorar significativamente a eficácia, mas o prognóstico é ainda relativamente pobre, e o índice de sobrevivência geralmente permanece em aproximadamente 20 meses em doença metastática e, como um resultado, as expectativas não satisfeitas nesta doença permanecem elevadas.

Recentemente uma nova geração de fármacos, agentes de alvo molecular, tal como Avastin (Bevacizumab) e Erbitux (Cetuximab), tornaramse disponíveis e aproximadamente 40 compostos estão em etapa avançada de desenvolvimento clínico para diferentes estágios de câncer colorretal. As combinações de vários destes compostos aumentam o número de opções potenciais de tratamento a serem esperados para o futuro. A maioria vasta de substâncias está na fase 2, com EGFR endereçado por estes compostos mais frequentemente do que por qualquer outro fármaco em desenvolvimento para câncer colorretal, que é devido ao fato de que em ~80% dos pacientes com câncer colorretal, a expressão de EGFR é super-regulada.

Testes clínicos com pacientes na etapa II combinando quimioterapia com os anticorpos monoclonais recentemente aprovados (mAbs) (ce

3/93 tuximab + irinotecan ou FOLFOX4; bevacizumab como um agente único ou junto com FOLFOX4) são conduzidos atualmente. Três a quatro anos de observação são esperados para resultados estatisticamente significativos destes testes.

Os anticorpos monoclonais (mAbs) atualmente usados em oncologia em geral tem uma chance excelente de não interferir na imunoterapia ativa. De fato, há evidências pré-clínicas que sugerem que o esgotamento de VEGF (por bevacizumab) contribui positivamente para ativação de células T mediada por DC.

Atualmente, há aproximadamente 16 ensaios testando a segurança e o potencial de novos aprimoramentos imunoterápicos para o tratamento de CRC.

Aprimoramentos imunoterápicos para o tratamento

A estimulação da resposta imune depende da presença de antígenos que sejam reconhecidos como estranhos pelo sistema imune do hospedeiro. A descoberta da existência de antígenos associados a tumor gerou a possibilidade de usar um sistema imune do anfitrião para intervir no crescimento do tumor. Vários mecanismos de aproveitamento das armas humorais e celulares do sistema imunológico estão sendo explorados atualmente na imunoterapia do câncer.

Alguns elementos específicos da resposta imune celular são capazes de reconhecer e destruir células tumorais. O isolamento de células T citotóxicas (CTL) a partir de populações celulares que se infiltram no tumor ou, a partir do sangue periférico, sugere que essas células desempenham um papel importante nas defesas imunes naturais contra o câncer (Cheever et al.., Annals N.Y. Acad. Sei. 1993 690:101-112; Zeh HJ, Perry-Lalley D, Dudley ME, Rosenberg SA, Yang JC; J Immunol. 1999, 162(2):989-94; CTLs de alta avidez para dois autoantígenos demonstraram uma eficácia antitumoral superior in vitro e in vivo.). As células T CD8 positivas (TCD8+) em particular, aquelas que reconhecem as moléculas de classe I dos peptídeos do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC), formados normalmente por 8 a 10 resíduos derivados de proteínas ou produtos ribosomais com de

4/93 feito (DRIPs) (Schubert U, Antón LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, Bennink JR.; Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes; Nature 2000; 404(6779):770-774) localizados nos citosois desempenham um papel importante nessa resposta. As moléculas MHC dos humanos também são designadas como antígenos leucocitários humanos (HLA).

Há duas classes de moléculas MHC: Moléculas MHC da classe I que podem ser encontradas na maioria das células contendo um núcleo que apresenta peptídeos que resultam da divagem proteolítica de proteínas endógenas, DRIPs e peptídeos maiores. Moléculas MHC da classe II podem ser encontradas predominantemente em células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs) e peptídeos presentes provenientes de proteínas exógenas que são ocupadas por APCs durante o curso de endocitose, e transformadas posteriormente. Os complexos de peptídeo e molécula MHC de classe I são reconhecidos por linfócitos T citotóxicos CD8 positivos suportando o TCR apropriado, complexos de peptídeo e molécula MHC de classe II que são reconhecidos por células T auxiliares CD4 positivas suportando o TCR apropriado.

As células T auxiliares CD4 positivas fazem um papel importante em orquestrar as funções de respostas antitumor de célula T e, para esta razão, a identificação de epítopos de célula T CD4 positivas derivados de antígenos associados a tumor (TAA) pode ser de grande importância para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos para desencadear respostas imunes antitumorais (Kobayashi.H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta, e E. Celis. Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoembryonic antigen. Clin. Câncer Res. 2002, 8:3219-3225., Gnjatic, S.,

D. Atanackovic, E. Jãger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, e L.J. Old. Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses against NY-ESO-1 in câncer patients: Correlation with antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2003, 100 (15): 8862-7) células T CD4+ podem levar a níveis localmente aumentados de

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IFNy (Qin Z, Schwartzkopff J, Pradera F, Kammertoens T, Seliger B, Pircher H, Blankenstein T; A criticai requirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumor rejection by CD8+ T cells; J Câncer Res; 2003, 63(14): 4095-4100).

Foi mostrado em modelos animais mamíferos, por exemplo, em camundongos, que mesmo na ausência de células de linfócitos T citotóxico (CTL) efetoras (isto é, linfócitos T de CD8 positivo), células T de CD4 positivo são suficientes para impedir a manifestação de tumores via inibição de angiogênese por secreção de interferon-gama (IFNy) (Qin, Z. e T. Blankenstein. CD4+ T-cell-mediated tumour rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 2000, 12:677-686). Adicionalmente, foi mostrado que células T CD4-positivas reconhecidas de peptídeos de antígenos associados a tumor apresentados por moléculas HLA de classe II podem agir contra progressão de tumor via indução de respostas de um anticorpo (Ab). (Kennedy, R.C., M.H. Shearer, A.M. Watts, e R.K. Bright. CD4+ T lymphocytes play a criticai role in antibody production and tumour immunity against simian virus 40 large tumour antigen. Câncer Res. 2003, 63:10401045). Ao contrário dos peptídeos associados a tumores que se ligam a moléculas HLA da classe I, somente um pequeno número de ligantes de classe II TAA foram descritos até agora (www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de).

Considerando que a expressão constitutiva das moléculas HLA classe II normalmente se limita a células do sistema imunológico (Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-Soria, e W. Reith. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 1996, 14: 301-331), não se considerava possível isolar peptídeos da classe II diretamente a partir de tumores primários. No entanto, os inventores recentemente foram bem sucedidos em identificar um número de epítopos MHC de classe II diretamente de tumores (EP 1642905, EP 1760088; Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Muller M, Krãmer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K,

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Stevanovic S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Câncer Res. 2006; 12:4163-4170).

Na ausência de inflamação, a expressão de moléculas MHC de clase II se restringe principalmente a células do sistema imunológico, em especial às células profissionais apresentadoras de antígenos (APC), como por exemplo, os monócitos, células derivadas de monócitos, macrófagos e células dendríticas. Em pacientes de tumor, células do tumor inesperadamente expressaram moléculas MHC da classe II (Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Muller M, Krãmer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanovic S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Câncer Res. 2006; 12:4163-4170)

Para que um peptídeo dispare (provoque) uma resposta imunológica celular, é preciso que ele se ligue a uma molécula MHC. Esse processo depende dos alelos da molécula MHC e dos polimorfismos específicos da sequência de aminoácidos do peptídeo. Os peptídeos que se ligam às MHC da classe I normalmente têm um comprimento de 8-10 resíduos aminoácidos e contêm dois resíduos conservados (âncoras) em sua sequência que interagem com a correspondente fenda de ligação da molécula MHC. Desta forma, cada alelo MHC tem um motivo compulsório que determina quais os peptídeos podem ligar especificamente ao encaixe compulsório (Rammensee HG, Bachmann J, Stevanovic S. MHC ligands and peptide motifs, Landes Bioscience, E.U.A., 1997).

Na reação imune dependente MHC da classe I, os peptídeos não apenas têm que poder ligar a uma certa classe de moléculas MHC da classe I expressas por células de tumor, mas sim eles também têm que ser reconhecidos por células T suportando receptores específicos de célula T (TCR).

Os antígenos que são reconhecidos pelos linfócitos T específicos do tumor, ou seja, os seus epítopos, podem ser moléculas derivadas de todas as classes de proteínas, tais como enzimas, receptores, fatores de

7/93 transcrição, etc. Além do mais, antígenos associados a tumor, por exemplo, também podem estar presentes em células de tumor, por exemplo como produtos provenientes de uma mutação de genes Outra classe importante de antígenos associados a tumor são antígenos específicos de tecidos, tal como antígenos CT (câncer-testículo) que são expressos em tipos diferentes de tumores e em tecido saudável do testículo.

Vários antígenos associados a tumor foram identificados. Além disso, muito esforço de pesquisa foi investido para identificar antígenos associados a tumor adicionais. Alguns grupos de antígenos associados a tumor, também referidos na arte como antígenos específicos de tumor, são específicos de tecido. Os exemplos incluem tirosinase para melanoma, mas não são limitados a elas, PSA e PSMA para câncer de próstata e cruzamentos cromossómicos (translocações) tal como bcr/abl em linfoma. No entanto, muitos antígenos associados a tumor identificados por ocorrer em múltiplos tipos de tumor, e alguns genes, tais como os de proteínas oncogênicas e/ou aqueles supressores de tumor (genes supressores de tumor são, por exemplo, revisados para câncer renal em Linehan WM, Walther MM, Zbar B. The genetic basis of câncer of the kidney. J Urol. 2003 Dec; 170 (6Pt1):2163-72) que realmente causa o evento de transformação, ocorrente em quase todos tipos de tumor. Por exemplo, proteínas celulares normais que controlam o crescimento e diferenciação de célula, tal como p53 (que é um exemplo de um gene de supressor de tumor), c-met, myc, pRB, VHL, e HER-2/neu, podem acumular mutações resultando em sobre-regulação de expressão destes produto, tornando-os oncogênicos (McCartey et al.. Câncer Research, 1998, 15:58 2601-5; Disis et al.. Ciba Achou. Symp. 1994 187:198-211). Essas proteínas mutantes também podem ser um alvo de uma resposta imune específica do tumor em diversos tipos de câncer.

Imunoterapia em pacientes cancerígenos tem a meta de ativar especificamente células do sistema imune, especialmente as chamadas células T citotóxicas (CTL, também conhecidas como células assassinas, também conhecidas como células T de CD8 positivo) contra células de tumor, mas não contra o tecido saudável. As células de tumor diferem de célu

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Ias saudáveis pela expressão de proteínas associadas a tumor. As moléculas de HLA na superfície de célula apresentam o conteúdo celular ao exterior, capacitando assim uma célula T citotóxica a diferenciar entre uma célula saudável e uma de tumor. Isto é obtido quebrando-se todas as proteínas dentro da célula em peptídeos curtos, que então são anexados a moléculas HLA e apresentadas na superfície de célula (Rammensee, HG, Falk, K, and Rotzschke, O; Peptides naturally presented by MHC class I molecules, Annu. Rev. Immunol., 1993, 11, 213-244). Os peptídeos que são apresentados em células de tumor, mas não em células saudáveis do corpo ou pelo menos em uma extensão muito menor, são chamados de peptídeos associados a tumor (TUMAPs).

Para que as proteínas sejam reconhecidas pelos linfócitos T citotóxicos como antígenos específicos ou associados do tumor e, para que elas sejam usadas num tratamento, elas precisam atender a certos pré-requisitos. O antígeno deve ser expresso principalmente por células tumorais e não por tecidos saudáveis normais ou preferivelmente em quantidades pequenas deles. Além disso, é desejável que o respectivo antígeno esteja presente não só num tipo específico de tumor, mas também que esteja presente em altas concentrações (por exemplo, número de cópias do respectivo peptídeo por célula). Antígenos específicos ou associados de tumor frequentemente são derivados de proteínas diretamente envolvidas em transformação de uma célula normal em uma célula de tumor, devido a uma função, por exemplo, em controle de ciclo de célula ou apoptose. Adicionalmente, alvos a jusante das proteínas também diretamente causativos para uma transformação também podem ser super-regulados e assim indiretamente associados a tumor. Tais antígenos indiretamente associados a tumor também podem ser alvos de uma tentativa de vacinação. É essencial em ambos os casos, a presença de epítopos na sequência de aminoácidos do antígeno, uma vez que esse peptídeo (peptídeo imunogênico), derivado de um antígeno associado a tumor, deve induzir uma resposta da célula T in vitro ou in vivo.

Basicamente, qualquer peptídeo capaz de ligar uma molécula MHC pode funcionar como um epítopo de célula T. Um pré-requisito para a

9/93 indução de uma resposta de célula T in vitro ou in vivo é a presença de uma célula T com um TCR correspondente e a ausência de tolerância para este epítopo particular. As células T auxiliares desempenham um importante papel na coordenação da função efetora das células T citotóxicas na imunidade antitumoral. Os epítopos das células T auxiliares que provocam uma resposta das células T auxiliares do tipo TH1 apoiam as funções efetoras das células T assassinas CD8 positivas, que incluem funções citotóxicas dirigidas contra as células tumorais que apresentam complexos peptídeo/MHC associados ao tumor nas superfícies celulares. Desta forma, os epítopos peptídicos de célula T auxiliar associados a tumores, isoladamente ou em combinação com outros peptídeos associados a tumores, podem servir como ingredientes farmacêuticos ativos em composições de vacinas estimuladoras das respostas imunes antitumorais.

Já que ambos os tipos de respostas, CD8 e CD4 dependente, contribuem conjuntamente e sinergicamente para o efeito antitumor, a identificação e a caracterização de antígenos associados a tumores reconhecidos por qualquer CD8 + CTLs (molécula MHC da classe I) ou por CTLs de CD4 positivo (molécula MHC da classe II) é importante no desenvolvimento de vacinas tumorais. É, portanto, um objetivo da invenção presente fornecer composições de peptídeos que contêm peptídeos de ligação a complexos MHC de qualquer classe.

Primeiros testes clínicos usando peptídeos associados a tumor começaram nos meados dos anos 1990 por Boon e colegas principalmente para o melanoma de indicação. Respostas clínicas nos melhores testes variaram de 10% a 30%. Efeitos colaterais severos ou autoimunidade severa não foram obtidos em qualquer teste clínico usando-se vacina monoterápica baseada em peptídeo. Formas leves de vitiligo têm sido relatadas em alguns pacientes que tinham sido tratados com peptídeos associados a melanoma.

No entanto, a preparação de um tipo de CTL é normalmente insuficiente eliminar todas células de tumor. Os tumores são muito mutagênicos e assim capazes de responder rapidamente a ataques de CTL mudando seu padrão de proteína para fugir do reconhecimento por CTLs. Para contra

10/93 atacar os mecanismos de evasão de tumor, uma variedade de peptídeos específicos é usada para vacinação. Desta maneira, um ataque simultâneo amplo pode ser montado contra o tumor por vários clones de CTL simultaneamente. Isto pode diminuir as chances do tumor em fugir de uma resposta imune. Esta hipótese recentemente foi confirmada num estudo clínico tratando pacientes de melanoma em estágio avançado. Com só poucas exceções, pacientes que tiveram ao menos três respostas distintas de células T, mostraram respostas clínicas objetivas ou doença estável (Banchereau, J, Palucka, AK, Dhodapkar, M, Burkeholder, S, Taquet, N, Rolland, A, Taquet, S, Coquery, S, Wittkowski, KM, Bhardwaj, N, Pineiro, L, Steinman, R, and Fay, J; Immune and clinicai responses in patients with metastatic melanoma to CD34(+) progenitor-derived dendritic cell vaccine, Câncer Res., 2001, 61, 6451-6458) assim como sobrevivência aumentada (comunicação pessoal com J. Banchereau), enquanto a maioria vasta dos pacientes com menos de três respostas de células T foram diagnosticada com doença progressiva.

Um estudo dos candidatos mostrou um efeito semelhante quando pacientes sofrendo de carcinoma célula de renal foram tratados com uma vacina composta de 13 peptídeos diferentes (H. Singh-Jasuja, S. Walter, T. Weinschenk, A. Mayer, P. Y. Dietrich, M. Staehler, A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Rammensee, J. Frisch; Correlation of T-cell response, clinicai activity and regulatory T-cell leveis in renal cell carcinoma patients treated with IMA901, a novel multi-peptide vaccine; ASCO Meeting 2007 Pôster # 3017; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open labei study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based câncer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Pôster# 3017).

A tarefa mais importante no desenvolvimento de uma vacina de tumor é, portanto, não apenas a identificação e caracterização de novos antígenos associados a tumor e epítopos imunogênicos T auxiliares derivados dele, mas também a combinação de epítopos diferentes para aumentar a probabilidade de uma resposta a mais de um epítopo para cada paciente. É, portanto um objetivo da presente invenção fornecer combinações de se

11/93 quências de aminoácido de tais peptídeos que têm a capacidade de se ligar a uma molécula do complexo de histocompatibilidade humana (MHC) principal da classe I (HLA da classe I) ou II (HLA da classe II). Fora isso, também é um objeto da invenção presente, fornecer uma vacina eficaz anticâncer que é baseada numa combinação dos peptídeos.

Na presente invenção, os inventores isolaram e caracterizaram peptídeos ligando a moléculas HLA classe I ou II diretamente de tumores em mamíferos, isto é, carcinomas colorretais.

A presente invenção fornece peptídeos que se originam de antígenos associados com tumorigênese, e têm a capacidade de ligar suficientemente a moléculas MHC (HLA) classe II para desencadear uma resposta imune de leucócitos humanos, especialmente linfócitos, especialmente linfócitos T, especialmente linfócitos de T CD4 positivos, especialmente linfócitos de T CD positivos mediando respostas imunes tipo T_Hi.

A presente invenção também fornece peptídeos que se originam de antígenos associados com tumorigênese, e têm a capacidade de ligar suficientemente a moléculas MHC (HLA) classe I para desencadear uma resposta imune de leucócitos humanos, especialmente linfócitos, especialmente linfócitos T, especialmente linfócitos T citotóxicos de CD8 positivos, bem como combinações dos dois que são particularmente úteis para a vacinação de pacientes que sofrem de câncer.

De acordo com a invenção presente, o objeto é resolvido fornecendo uma composição farmacêutica constituindo ao menos dois peptídeos contendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo composto pela SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 7, e/ou contendo uma sequência de aminoácido variante que é no mínimo 80% homóloga à SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 7, e/ou um polinucleotídeo contendo um ácido nucleico codificando SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 7 ou sequência de aminoácido variante, e um transportador farmaceuticamente aceitável. Composições farmacêuticas da presente invenção também podem incluir pelo menos um peptídeo adicional contendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ ID NO: 8 a SEQ ID NO: 15, ou conter uma sequência de aminoáci

12/93 do variante que é pelo menos 80 % idêntica a SEQ ID NO: 8 a SEQ ID NO: 15, ou polinucleotídeo contendo um ácido nucleico codificando SEQ ID NO: 8 a SEQ ID NO: 15 ou a sequência de aminoácido variante. Os peptídeos podem ter um comprimento total entre 8 e 100 aminoácidos, de preferência entre 8 e 30 aminoácidos e de preferência ainda maior entre 8 e 16 aminoácidos. Os peptídeos também podem conter ligações não-peptídicas.

Como descrito nisto embaixo, todos os peptídeos que formam a base da presente invenção foram identificados como apresentado pelas células MHC de classe l ou II. Assim, todos estes peptídeos particulares assim como outros peptídeos contendo a sequência (isto é, peptídeos derivados) extraem uma resposta específica de célula T, embora a extensão em que tal resposta será induzida talvez varie para cada peptídeo individual e para cada paciente individual. As diferenças, por exemplo, podiam ser causadas devido a mutações nos peptídeos. A pessoa de habilidade na arte presente está bem consciente dos métodos que podem ser aplicados para determinar a extensão a que uma resposta é induzida por um peptídeo individual, em particular com referência aos exemplos nisto e na respectiva literatura.

Preferivelmente as variantes da invenção induzirão células T que reagindo em cruz com o respectivo peptídeo da invenção.

A porcentagem de homologia entre a sequência de aminoácido de um peptídeo ou uma sequência de ácido nucleico codificando o peptídeo e uma variante pode ser calculado usando-se algoritmos bem conhecidos na técnica. Na invenção presente, o termo homólogo refere-se ao grau de identidade entre sequências de duas sequências de aminoácidos, isto é, sequências de peptídeo ou de polipeptídeo. A homologia acima mencionada é determinada comparando-se duas sequências alinhadas sob condições ideais sobre as sequências serem comparadas. As sequências de aminoácido ou sequências de ácido nucleico a serem comparadas podem ter uma adição ou supressão (por exemplo, lacuna e similares) no alinhamento ideal das duas sequências. Essa homologia de sequência pode ser calculada através da criação de alinhamento, utilizando, por exemplo, o algoritmo ClustalW (Nucleic Acid Res., 22(22): 4673 4680 (1994). Software para análise de

13/93 sequências disponíveis comumente, mais especificamente, Vector NTI, GENETYX ou ferramentas de análise fornecidas por bancos de dados públicos, como os encontrados em, por exemplo, http://restools.sdsc.edu/biotools/biotools16.html também podem ser usados.

Transportadores farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos e são geralmente líquidos, nos quais um agente ativo terapêutico é formulado. O transportador geralmente não fornece qualquer atividade farmacológica à formulação, embora possa fornecer estabilidade química e/ou de biológica, características de liberação e similares. Formulações exemplares podem ser achadas, por exemplo, em Alfonso R. Gennaro. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000 e inclui, salmouras, água, água amortizada, 0,3% glicina, ácido hialurônico, dextrose e similares, mas não está limitada a estes. Recentemente, foi descoberto que certas emulsões de gordura, que estiveram em uso durante muitos anos para nutrição intravenosa de pacientes humanos, também podem agir como um veículo para peptídeos. Dois exemplos de tais emulsões são as emulsões de gordura disponíveis comercialmente conhecidas como Intralipid e Lipofundin. Intralipid é uma marca registrada de Kabi Pharmacia, Suécia, para uma emulsão de gordura para nutrição intravenosa, descrita na U.S. Pat. N² 3,169,094. Lipofundin é uma marca registrada de B. Braun Melsungen, Alemanha. Ambos contêm óleo de grão de soja como gordura (100 ou 200 g em 1.000 ml de água destilada: 10% ou 20%, respectivamente). Os fosfolipídeos de gema são usados como emulsionantes em Intralipid (12 g/l de água destilada) e lecitina de gema em Lipofundin (12 g/l de água destilada). Isotonicidade resulta da adição de glicerol (25 g/l) em Intralipid e Lipofundin.

Os peptídeos originam se de antígenos associados a tumor, especialmente antígenos associados a tumor com funções em, por exemplo, proteólise, angiogênese, crescimento de célula, regulamento de ciclo de célula, divisão de célula, regulamento de transcrição, regulamento de tradução, invasão de tecido, etc. A tabela 1 fornece os peptídeos e a função da proteína, da qual os peptídeos são derivados.

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Tabela 1_: Peptídeos da presente invenção e função da proteína pai φ T5

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Cromossomo 20 leitura aberta emoldurada 42

C20orf42 é uma proteína de adesão focal envolvida na anexação da actina de citoesqueleto à membrana plasmática e nos processos celulares mediados por integrina. Deficiência de C20orf42 como resultado de mutações com perda de função causam a síndrome de Kindler, uma genodermatose autossômica recessiva caracterizada por bolhas na pele, atrofia progressiva da pele, fotossensibilidade e, ocasionalmente, carcinogênese (Herz, C, Aumailley, M, Schulte, C, Schlotzer-Schrehardt, U, BrucknerTuderman, L, and Has, C; Kindlin-1 is a phosphoprotein involved in regulation of polarity, proliferation, and motility of epidermal keratinocytes, J Biol Chem., 2006, 281, 36082-36090). Recentemente, um grave envolvimento do trato gastrintestinal, com colite hemorrágica tem sido relatado em um paciente com uma mutação de perda de função. (Sadler, E, Klausegger, A, Muss, W, Deinsberger, U, Pohla-Gubo, G, Laimer, M, Lanschuetzer, C, Bauer, JW, and Hintner, H; Novel KIND1 gene mutation in Kindler syndrome with severe gastrointestinal tract involvement, Arch. Dermatol., 2006, 142, 1619-1624).

No contexto de câncer, C20orf42 foi descrito dentro de estudos investigando expressão de gene em cenários relevantes o câncer. Foi descoberto que ele está superexpresso em 70% de carcinomas de cólon e 60% de carcinomas de pulmão testados (n = 10). Expressão normal de tecido por Northern Blot foi restringida a tecidos neuromusculares (Weinstein, EJ, Bourner, M, Head, R, Zakeri, H, Bauer, C, and Mazzarella, R; URP1: a member of a novel family of PH and FERM domain-containing membraneassociated proteins is significantly over-expressed in lung and colon carcinomas, Biochim. Biophys. Acta, 2003, 1637, 207-216). Além do mais, C20orf42 foi identificado como um gene envolvido em migração de célula mediada por TGF-β e invasão de tumor (Kloeker, S, Major, MB, Calderwood, DA, Ginsberg, MH, Jones, DA, and Beckerle, MC; The Kindler syndrome protein is regulated by transforming growth factor-beta and involved in integrinmediated adhesion, J. Biol. Chem., 2004, 279, 6824-6833).

Homólogo de oxidase NADPH-1 (NOX1)

NOX1 é uma enzima responsável de fator de crescimento que

16/93 catalisa a formação das espécies reativas de superóxido de oxigênio (O₂.) e peróxido de hidrogênio (H2O2). Sua expressão foi originalmente identificada no cólon, próstata, útero, e proliferava en células de músculo lisas vasculares (Suh, Y. A. et al.. Cell transformation by the superoxide-generating oxidase Mox1. Nature 1999, 401, 79-82). Sua expressão é ligada a um número de respostas biológicas inclusive proliferação celular, angiogênese, e ativação de vias de sinalização celular (Harper, R. W., Xu, C., Soucek, K., Setiadi, H. e Eiserich, J. Ρ. A reappraisal of the genomic organization of human Nox1 and its splice variants. Arch. Biochem. Biophys. 2005, 435, 323-330).

NOX1 altamente é expresso no cólon, mas sua função em fisiologia colônica ou patológica ainda é pobremente entendida. Em tecidos normais, a expressão NOX1 era baixa no ileo, intermediária no cólon direito, e alta no cólon esquerdo. Não havia nenhuma diferença estatística em expressão NOX1 entre amostras derivadas de adenomas, adenocarcinomas de cólon bem diferenciadas ou pobremente diferenciadas. NOX1 foi altamente expresso em células epiteliais de cólon, dentro das criptas e na superfície luminal. Em conclusão, NOX1 é uma enzima que é constitutivamente expressa em epitélio de cólon e diretamente não é associada com tumorigênese (Szanto, I. et al.. Expression of NOX1, a superoxide-generating NADPH oxidase, in colon câncer and inflammatory bowel disease. J Pathol. 2005, 207, 164-176).

Imuno-histoquímica mostrou que Nox1 foi constitutivamente expressa na superfície de células mucosas. Adenomas e adenocarcinomas bem diferenciadas super-regularam a expressão de NOX1. O fator nuclear (NF)-capaB foi predominantemente ativado em adenoma e células de adenocarcinoma expressando NOX1 abundante, sugerindo que NOX1 pode estimular caminhos antiapoptóticos dependentes de NF-kappaB em tumores de cólon (Fukuyama, M. et al.. Overexpression of a novel superoxideproducing enzyme, NADPH oxidase 1, in adenoma and well differentiated adenocarcinoma of the human colon. Câncer Lett. 2005, 221, 97-104).

Sinalização de Wnt3a/beta-Catenin tem sido descrito para induzir a expressão de NOX1 (Petropoulos, H. & Skerjanc, I. S. Beta-catenin is

17/93 essential and sufficient for skeletal myogenesis in P19 cells. J Biol Chem. 2002, 277, 15393-15399).

Recentemente, espécies reativas de oxigênio foram sugeridas a induzir apoptoses endoteliais que subsequentemente induzem a expressão de várias moléculas de adesão para células de tumor. Isto indica que pode ser viável atacar a produção de ROS para prevenir contra a recorrência de tumor em locais distantes (Ten, KM, van der Wal, JB, Sluiter, W, Hofland, LJ, Jeekel, J, Sonneveld, P, and van Eijck, CH; The role of superoxide ânions in the development of dístant tumour recurrence, 2006, Br.J Câncer, ).

Ornitina descarboxilase 1 (QDC1)

ODC1 é a enzima de índice limitante do caminho biossíntese de poliaminas, que catalisa a ornitina à putrescina. O nível de atividade para a enzima varia em resposta aos estímulos que promovem o crescimento e exibem um alto índice de renovação em comparação a outras proteínas mamíferas.

O metabolismo de poliaminas é um componente integral do mecanismo de carcinogênese em tecidos epiteliais. Aumentos em ODC1 são frequentemente associados com iniciação de crescimento normal de célula e com crescimento sustentável de célula neoplásica. Os inibidores de ODC1 suprimem a formação de tumor em modelos experimentais de bexiga, peito, cólon e carcinogênese de pele. A superexpressão de atividade ODC1 é uma característica bem reconhecida de muitos cânceres e ODC1 foi considerada como um protooncogeno (Auvinen, M., Paasinen, A., Andersson, L. C. e Holtta, E. Ornithine decarboxylase activity is criticai for cell transformation. Nature 1992, 360, 355-358).

Mutações germinais em gene de polipose adenomatosa de coli (APC) são uma das mais claramente definidas predisposições herdadas para o câncer de cólon. As mutações APC causam um aumento substancial em níveis livres de β-catenina, que se move para o núcleo, onde ela forma um complexo com membros do fator de melhoria linfóide (LEF)/família de fatores específicos de sequência de transcrição de célula T (Tcf). O oncogene c-myc é um dos genes alvo Tcf, He, T. C. et al.. A identificação de c-MYC

18/93 como um alvo do caminho de APC (Science 281, 1509-1512 (1998). RNA de c-Myc e proteína são superexpressas tanto estágios iniciais como estágios avançados de gênese tumoral colorretal). ODC é um gene de alvo de c-Myc.

A perda de função de APC causa uma super-regulação de ODC1 (Gerner, EW and Meyskens, FL, Jr., Polyamines and câncer: old molecules, new understanding, Nat. Rev. Câncer, 2004, 4, 781-792) e superexpressão frequentemente foram observadas em carcinoma colorretal (Hu, H. Y. et al.. O gene de ornitina descarboxilase é superexpresso em carcinoma colorretal, World J. Gastroenteroí. 2005, 11, 2244-2248; Kitahara, O. et al.. As alterações da expressão de gene durante carcinogênese colorretal revelaram por micromatrix de cDNA depois de microdissecção de laser-captura de tecidos de tumor e epitélio normal; Câncer Res. 2001, 61, 3544-3549; Nemoto, T., Kubota, S., Ishida, H., Murata, N. e Hashimoto, D. Ornithine decarboxylase, mitogen-activated protein kinase and matrix metalloproteinase2 expressions in human colon tumors. World J. Gastroenteroí. 2005, 11, 3065-3069).

ODC1 tem propriedades pró-angiogênica agindo como um supressor de endostatina (Nemoto, T., Hori, H., Yoshimoto, M., Seyama, Y. & Kubota, S. Overexpression of ornithine decarboxylase enhances endothelial proliferation by suppressing endostatin expression. Blood 2002, 99, 14781481).

Infecção da linha celular CRC HT-29 com um antissenso de codificação adenovírus RNA para ODC1 e descarboxilase S-adenosilmetionina (outra enzima importante da via de biossíntese de poliaminas) leva a uma sub-regulação de CCND1 e parada do ciclo celular. Além disso, a translocação nuclear da beta-catenina também foi inibida. (Gong, L, Jiang, C, Zhang, B, Hu, H, Wang, W, and Liu, X; Adenovirus-mediated Expression of Both Antisense Ornithine Decarboxylase and S-adenosylmethionine Decarboxylase Induces G(1) Arrest in HT-29 Cells, J Biochem. Mol. Biol, 2006, 39, 730-736). O adenovirus também induziu regressão de tumor em tumores estabelecidos em camundongos nus. (Zhang, B, Liu, XX, Zhang, Y, Jiang, CY, Hu, HY, Gong, L, Liu, M, and Teng, QS; Polyamine depletion by ODC-AdoMetDC

19/93 antisense adenovirus impairs human colorectal câncer growth and invasion in vitro and in vivo, 2006, J Gene Med, 8, 980-989).

Um inibidor específico e irreversível de ODC1 é 2-difluorometilornitina (DMFO, Eflornithine (Sanofi-Aventis)). Ele é vendido para o tratamento de doenças de sono (causadas por tripanosomas) e é o ingrediente ativo do creme de remoção de cabelo Vaniqa.

Com respeito a câncer, DMFO foi largamente usado em modelos pré-clínicos e mostraram efeitos anti-tumor promissores diminuindo os níveis de poliamina (Gerner, EW and Meyskens, FL, Jr.; Polyamines and câncer: old molecules, new understanding, Nat. Rev. Câncer, 2004, 4, 781-792). Testes clínicos foram executados para vários cânceres e alguns estão atualmente a ser estudados para CRC. No entanto, estes estudos são principalmente combinação de aprimoramentos executados em cenários preventivos com pacientes especialmente suscetível a CRC (pólipos adenomatosos). O peptídeo imunogênicos ODC ODC 001 foi identificado previamente (M. Diehl, Tese de PhD, Universidade de Tubingen, 1998)

Antíqeno Nuclear de Célula Proliferante (PCNA)

PCNA é achado no núcleo e é um cofactor de polimerase de DNA delta. A proteína codificada age como um homotrímero e ajuda a aumentar a processabilidade de síntese de fio principal durante a replicação de DNA. Portanto, é expressa em todas as células que proliferam, especialmente células de tumor, e é usada como um marcador para detectar proliferação.

índices de proliferação em mucosa normal neoplásica e adjacente, conforme definido pela análise imuno-histoquímica PCNA, é conhecido há muito tempo como preditores independentes de recorrência e sobrevivência baixa em pacientes com câncer colorretal (al-Sheneber, IF, Shibata, HR, Sampalis, J, and Jothy, S; Prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen expression in colorectal câncer, Câncer, 1993, 71, 19541959; Mayer, A, Takimoto, M, Fritz, E, Schellander, G, Kofler, K, and Ludwig, H; The prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen, epidermal growth factor receptor, and mdr gene expression in colorectal câncer, Câncer, 1993, 71, 2454-2460; Nakamura, T, Tabuchi, Y, Nakae, S, Ohno, M, and

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Saitoh, Y; Serum carcinoembryonic antigen leveis and proliferating cell nuclear antigen labeling index for patients with colorectal carcinoma. Correlation with tumor progression and survival, Câncer, 1996, 77, 1741-1746) Topoisomerase de DNA II (TOP2)

TOP2A e TOP2B codificam isoformas de uma topoisomerase de DNA, uma enzima que controla e altera os estados topológicos de DNA durante a transcrição. Esta enzima nuclear é envolvida em processos tal como a condensação de cromossomo, separação de cromátides, e o alívio de tensão torsional que ocorre durarrte a transcrição de DNA e na replicação. Ela catalisa a quebra e a reunião transitória de dois fios de DNA dúplex, que permite que os fios atravessem-se, alterando assim a topologia de DNA. O dois isoformas desta enzima existem como produtos prováveis de um evento de duplicação de gene. O gene codificando a forma alfa está localizado junto ao cromossomo 17 e o gene beta junto ao cromossomo 3.

TOP2A é o alvo para vários agentes anticâncer e uma variedade de mutações neste gene foi associada com o desenvolvimento de resistência de fármaco.

O gene TOP2A é localizado junto ao oncogene HER-2, o oncogene mais frequentemente amplificado em câncer de mama, na localização de cromossomo 17q12-q21 e é amplificado ou deletado, com frequência igual, em quase 90% de tumores de mama HER-2 primários amplificados (Jarvinen, TA e Liu, ET; Topoisomerase II alpha gene (TOP2A) amplification and deletion in cancer-more common than anticipated, Cytopathology, 14, 309-313). Além do mais, amplificações TOP2A foram relatadas para outros cânceres. Testes experimentais recentes, bem como inúmeros grandes estudos, multicêntricos sugerem que a amplificação (e / ou deleção) do TOP2A pode contribuir para a sensibilidade ou resistência a fármacos citotóxicas comumente utilizadas, isto é, inibidores da topoisomerase II (antraciclinas etc. Kellner, U, Sehested, M, Jensen, PB, Gieseler, F, and Rudolph, P; Culprit and victim - DNA topoisomerase II, Lancet Oncol., 2002, 3, 235-243), dependendo do defeito genético específico no local TOP2A (Jarvinen, TA and Liu, ET; Simultaneous amplification of HER-2 (ERBB2) and topoisomer

21/93 ase llalpha (TOP2A) genes-molecular basis for combination chemotherapy in câncer, Curr.Cancer Drug Targets., 2006, 6, 579-602).

Sem TOP2A, replicação de DNA e divisão de célula são impossíveis. Portanto, ele tornou-se o alvo principal de muitos regimes de terapia antitumorais, mesmo sabendo que o mecanismo exato de matança de célula permanece esquivo (Kellner, U, Sehested, M, Jensen, PB, Gieseler, F, e Rudolph, P; Culprit and victim -DNA topoisomerase II, Lancet Oncol., 2002, 3, 235-243). O êxito desta tentativa é limitado pelo desenvolvimento de resistência espontânea, e dano induzido por droga de DNA pode aumentar a malignidade.

TOP2B, a segunda proteína fonte potencial para TOP-001, não esteve no foco de pesquisa sobre o câncer tanto porque é localizado numa região cromossômica (3p24) que não é conhecida para amplificação frequente em tumores. No entanto, TOP2B é semelhante em estrutura primária a TOP2A e tem propriedades catalíticas quase idênticas (Leontiou, C, Lightowlers, R, Lakey, JH, and Austin, CA; Kinetic analysis of human topoisomerase llalpha and beta DNA binding by surface plasmon resonance, FEBS Lett., 2003, 554, 206-210). Em outro estudo também foi mostrado que ambos isoformes podem substituir um ao outro (Sakaguchi, A and Kikuchi, A; Functional compatibility between isoform alpha and beta of type II DNA topoisomerase, J Cell Sei., 2004, 117, 1047-1054).

Na invenção presente, os inventores fornecem evidência conclusiva que peptídeos associados a tumor suficientemente ligam às moléculas HLA da classe I capazes de eliciar respostas imunes mediados por citotóxicos T linfócitos CD8 positivos humanos, demonstrando também que os peptídeos são adequados para o desencadeamento de respostas do sistema imunológico humano contra peptídeos selecionados do peptidome das células tumorais.

Semelhantemente, foi descoberto que peptídeos associados a tumor suficientemente ligando a moléculas HLA da classe II, especialmente aqueles alelos HLA da classe de II geneticamente codificados por HLA DR loci do genoma humano, podem extrair respostas imunes mediadas por célu

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Ias T humanas CD4 positivas. AS células T CD4 positivas foram isoladas de sangue periférico humano, demonstrando que os peptídeos alegados são convenientes para desencadear respostas de células T do sistema imune humano contra peptídeos selecionados do peptidome de célula de tumor. Como exemplificado abaixo com um peptídeo TGFBI-004, este peptídeo ligando HLA-DR e associado a tumor puderam ser reconhecidos por células T CD4 positivas.

Como peptídeos podem ser sintetizados quimicamente e podem ser usados como ingredientes farmacêuticos ativos de preparações farmacêuticas, os peptídeos fornecidos pela invenção presente podem ser usados para imunoterapia, preferencialmente imunoterapia de câncer.

Em outro aspecto, a composição farmacêutica compreende adicionalmente pelo menos um peptídeo adicional contendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ ID NO 8 a SEQ ID NO 15, ou contendo uma sequência de aminoácidos variante que é pelo menos 80% homóloga à SEQ ID NO 8 a SEQ ID NO 15, ou um polinucleotídeo contendo um ácido nucleico codificando SEQ ID NO 8 a SEQ ID NO 15 ou a sequência de aminoácido variante. Os peptídeos de SEQ ID NO 8 a SEQ ID NO 13 e 15 são peptídeos imunogênicos previamente identificados e se ligam a moléculas MHC de classe I e MHC de classe II (ver a tabela 2).

Foi descoberto que estes peptídeos desencadearam respostas de células T in vivo em pacientes sofrendo de carcinoma de células renais (RCC) (H. Singh-Jasuja, S. Walter, T. Weinschenk, A. Mayer, P. Y. Dietrich, M. Staehler, A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Rammensee, J. Frisch; Correlation of T-cell response, clinicai activity and regulatory T-cell leveis in renal cell carcinoma patients treated with IMA901, a novel multi-peptide vaccine; ASCO Meeting 2007 Pôster # 3017; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open labei study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based câncervaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Pôster# 3017). Já que as proteínas de origem não são apenas superexpressas em RCC, mas também em CRC e outros tipos de cânceres, estes peptídeos também

23/93 são úteis em vacinas para o tratamento de outros tipos de tumor, em vacinas de antiCRC particulares.

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Molécula de adesão de célula carcinoembriônica relacionada a antíqeno 5

O antígeno carcinoembriônico (CEA = CEACAM5) é uma proteína de membrana de 180 kDa altamente glicosilada composta de três unidades de C2 como Ig repetitivas flanqueadas por uma região de Ig como V e uma região C-terminal, que inclui a região de ligação glicofosfatidilinositol (Hegde, P, Qi, R, Gaspard, R, Abernathy, K, Dharap, S, Earle-Hughes, J, Gay, C, Nwokekeh, NU, Chen, T, Saeed, Al, Sharov, V, Lee, NH, Yeatman, TJ, and Quackenbush, J; Identification of tumour markers in models of human coloreçtal câncer using a 19,200-element complementary DNA microarray, Câncer Res„ 2001, 61, 7792-7797).

Como um antígeno oncofetal, CEA é expresso durante desenvolvimento fetal, mas também, em níveis baixos, no epitélio gastrointestinal de adultos. No entanto, CEA é superexpresso numa alta porcentagem de tumores humanos, inclusive 90% de câncer gastrointestinal, colorretal e pancreático, 70% das células de câncer de célula de pulmão não-pequena e 50% dos cânceres de mama (Thompson, JA, Grunert, F, e Zimmermann, W; Carcinoembryonic antigen gene family: molecular biology and clinicai perspectives, J Clin Lab Anal., 5, 344-366 2005). Devido à sua alta expressão pelas células tumorais e sua secreção para o soro, a CEA tem sido amplamente utilizada como marcador tumoral (Sikorska, H, Shuster, J, and Gold, P; Clinicai applications of carcinoembryonic antigen, Câncer Detect.Prev., 12, 321-355 1988) e é o marcador padrão de soro para o monitoramento câncer colorretal (Locker, GY, Hamilton, S, Harris, J, Jessup, JM, Kemeny, N, Macdonald, JS, Somerfield, MR, Hayes, DF, e Bast, RC, Jr.; ASCO 2006 update of recommendations for the use of tumour markers in gastrointestinal câncer, J Clin Oncol, 24, 5313-5327, 2006).

Apesar da superexpressão de CEA em células de tumor, pacientes cancerígenos normalmente não mostram uma resposta imune contra este antígeno (Orefice, S, Fossati, G, Pietrojusti, E, e Bonfanti, G; Delayed cutaneous hypersensitivity reaction to carcinoembryonic antigen in câncer patients, Tumouri, 1982, 68, 473-475,). O sistema imune geralmente tornase tolerante a CEA, porque ele normalmente é expresso em níveis baixos no

26/93 corpo. No entanto, numa série de estudos clínicos de vacina, a imunogenicidade de CEA foi demonstrada (Sarobe, P, Huarte, E, Lasarte, JJ, e BorrasCuesta, F; Carcinoembryonic antigen as a target to induce anti-tumour immune responses, Curr. Câncer Drug Targets., 2004, 4, 443-454), especialmente em carcinoma colorretal (CRC) (Mosolits, S, Ullenhag, G, e Mellstedt, H; Therapeutic vaccination in patients with gastrointestinal malignancies. Uma revisão de resultados imunológicos e clínicos, Ann.Oncol., 2005, 16, 847-862), e CEA é o antígeno associado a tumor (TAA) com o maior número de plataformas de vacina testadas neste tipo de tumor (von Mehren, M; Colorectal câncer vaccines: what we know and what we don't yet know, Semin. Oncol., 2005, 32, 76-84).

Vários epítopos de célula T citotóxicos e auxiliares têm sido descritos para o CEA (Crosti, M, Longhi, R, Consogno, G, Melloni, G, Zannini, P, e Protti, MP; Identification of novel subdominant epitopes on the carcinoembryonic antigen recognized by CD4+ T-cells of lung câncer patients, J Immunol., 2006, 176, 5093-5099; Novellino, L, Castelli, C, e Parmiani, G; A listing of human tumour antigens recognized by T-cells: March 2004 update, Câncer Immunol.lmmunother., 2004, 54, 187-207; Ruiz, M, Kobayashi, H, Lasarte, JJ, Prieto, J, Borras-Cuesta, F, Celis, E, e Sarobe, P; Identification and characterization of a T-helper peptide from carcinoembryonic antigen, Clin Câncer Res., 2004, 10, 2860-2867), permitindo uma variedade de ensaios de vacinação baseados em peptideos no CRC (Babatz, J, Rollig, C, Lobel, B, Folprecht, G, Haack, M, Gunther, H, Kohne, CH, Ehninger, G, Schmitz, M, e Bornhauser, M; Induction of cellular immune responses against carcinoembryonic antigen in patients with metastatic tumours after vaccination with altered peptide ligand-loaded dendritic celis, Câncer Immunol. Immunother., 2006, 55, 268-276; Fong, L, Hou, Y, Rivas, A, Benike, C, Yuen, A, Fisher, GA, Davis, MM, e Engleman, EG; Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic celis for tumour immunotherapy, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A, 2001, 98, 8809-8814; Liu, KJ, Wang, CC, Chen, LT, Cheng, AL, Lin, DT, Wu, YC, Yu, WL, Hung, YM, Yang, HY, Juang, SH, e Whang-Peng, J; Generation of carcinoembryonic antigen (CEA)-specific T-cell responses in

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HLA-A*0201 and HLA-A*2402 late-stage colorectal câncer patients after vaccination with dendritic cells loaded with CEA peptides, Clin Câncer Res., 2004, 10, 2645-2651; Matsuda, K, Tsunoda, T, Tanaka, H, Umano, Y, Tanimura, H, Nukaya, I, Takesako, K, e Yamaue, H; Enhancement of cytotoxic

T-lymphocyte responses in patients with gastrointestinal malignancies following vaccination with CEA peptide-pulsed dendritic cells, Câncer Immunol. Immunother., 2004, 53, 609-616; Ueda, Y, Itoh, T, Nukaya, I, Kawashima, I, Okugawa, K, Yano, Y, Yamamoto, Y, Naitoh, K, Shimizu, K, Imura, K, Fuji, N, Fujiwara, H, Ochiai, T, Itoi, H, Sonoyama, T, Hagiwara, A, Takesako, K, e Yamagishi, H; Dendritic cell-based immunotherapy of câncer with carcinoembryonic antigen-derived, HI_A-A24-restricted CTL epitope: Clinicai outcomes of 18 patients with metastatic gastrointestinal or lung adenocarcinomas, Int. J Oncol., 2004, 24, 909-917; Weihrauch, MR, Ansen, S, Jurkiewicz, E, Geisen, C, Xia, Z, Anderson, KS, Gracien, E, Schmidt, M, Wittig, B, Diehl, V, Wolf, J, Bohlen, H, e Nadler, LM; Phase l/ll combined chemoimmunotherapy with carcinoembryonic antigen-derived HLA-A2restricted CAP-1 peptide and irinotecan, 5-fluorouracil, and leucovorin in patients with primary metastatic colorectal câncer, Clin Câncer Res., 2005, 11, 5993-6001). Estes e outros testes clínicos demonstraram até agora a segurança de vacinações CEA e evidência para a indução de resposta imune contra este antígeno (von Mehren, M; Colorectal câncer vaccines: what we know and what we don't yet know, Semin.Oncol., 2005, 32, 76-84).

Um variante de CEA-006 foi publicado previamente (Ruiz, M, Kobayashi, H, Lasarte, JJ, Prieto, J, Borras-Cuesta, F, Celis, E, and Sarobe, P; Identification and characterization of a T-helper peptide from carcinoembryonic antigen, Clin Câncer Res., 2004, 10, 2860-2867). CEA-005 é um mutante com um único câmbio de aminoácidos e foi relatado em superar a tolerância imune central (Zaremba, S, Barzaga, E, Zhu, M, Soares, N, Tsang, KY, and Schlom, J; Identification of an enhancer agonist cytotoxic T lymphocyte peptide from human carcinoembryonic antigen, Câncer Res., 1997, 57, 4570-4577).

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Fator de transformação de crescimento, beta induzido (TGFBI)

TGFBI foi primeiro identificado como um gene TGF beta induzido numa linha humana de célula de adenocarcinoma de pulmão. Ele codifica para uma proteína de matriz extracelular secretada, e acredita-se que ele age sobre anexo de célula e composição de matriz extracelular.

Foi descoberto que TGFBI se encontra entre genes mais significativamente elevados em cânceres colorretais e também é expresso em altos níveis em adenomas. Resultados PCR quantitativos demonstraram forte elevação em células epiteliaís tumoraís não purificadas e purificadas. Consequentemente, em experimentos de hibridação in situ revelaram que TGFBI é expresso em muitos tipos de célula, em compartimento estromal e epitelial (Buckhaults, P, Rago, C, St, CB, Romans, KE, Saha, S, Zhang, L, Vogelstein, B, e Kinzler, KW; Secreted and cell surface genes expressed in benign and malignant colorectal tumours, Câncer Res., 2001, 61, 6996-7001).

Em uma meta-análise de estudos investigando expressão de gene em carcinoma colorretal, TGFBI foi identificado como um de nove genes descritos como repetidamente (4 estudos para TGFBI) super-regulados (Shih, W, Chetty, R, e Tsao, MS; Expression profiling by microarrays in colorectal câncer, Oncol.Rep., 2005, 13, 517-524).

Em tecidos pancreáticos humanos, houve um aumento de 32,4 vezes em níveis TGFBI de mRNA em cânceres de pâncreas, em comparação aos tecidos normais do controle. Em análise de hibridação in situ revelou que mRNA de TGFBI foi expresso principalmente nas células de câncer dentro da massa pancreática de tumor (Schneider, D, Kleeff, J, Berberat, PO, Zhu, Z, Korc, M, Friess, H, e Buchler, MW; Induction and expression of betaig-h3 in pancreatic câncer cells, Biochim. Biophys. Acta, 2002, 1588, 1-6).

TGFBI foi identificado como um gene promovendo angiogênese num modelo in vitro. Adicionalmente, expressão de TGFBI drasticamente melhorada foi detectada em vários tumores. Oligonucleotídeos antisense para TGFBI bloqueou tanto a expressão do gene e como a formação de tubos endoteliais in vitro, sugerindo que TGFBI pode desempenhar um papel crítico em interações na matriz de célula endotelial (Aitkenhead, M, Wang,

29/93

SJ, Nakatsu, MN, Mestas, J, Heard, C, e Hughes, CC; Identification of endothelial cell genes expressed in an in vitro model of angiogenesis: induction of ESM-1, (beta)ig-h3, and NrCAM, Microvasc. Res., 2002, 63, 159-171). Mucina-1 (MUC1)

Mucinas são glicoproteínas epiteliais de alto peso molecular com teor elevado de oligossacarideos-glicosídicos O agrupadas e ligadas a peptídeos tandem repetitivos ricos em treonina, serina e prolina. Há duas classes de mucinas estruturalmente e funcionalmente distintas: as mucinas de transmembrana, à qual MUC1 pertence, e mucinas secretadas que formam gel. Mucinas de câncer do cólon têm diferenças em estruturas de carboidratos, que são investigadas como marcadores de diagnóstico e prognóstico, e também são alvos para vacinas contra o câncer.

O domínio extracelular da proteína MUC1 é constituído por repetições altamente conservadas de 20 aminoácidos, o número real varia entre 25 e 100, dependendo do alelo. Cada repetição em tandem contém cinco locais de glicosilação potencial, e entre os dupletos de treoninas e serinas há uma região imunodominantes contendo epítopos reconhecidos por vários antianticorpos MUC1 (Taylor-Papadimitriou, J, Burchell, J, Miles, DW, e Dalziel, M; MUC1 and câncer, Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1455, 301-313).

Comparado à maioria dos outros epitélios, a MUC1 do cólon é mais fortemente glicosilada mascarando assim as proteínas MUC1 de imuno-histoquímica por anticorpos MUC1 específicos. Em adenocarcinomas colorretais, MUC1 é menos glicosilada, permitindo a imunodetecção. A MUC1 aberrantemente glicosilada confere novas propriedades de ligação e pode, simultaneamente, mediar e ligar moléculas em bloco de adesão com alguma especificidade molecular, desempenhando um papel duplo na disseminação metastática de células tumorais (McDermott, KM, Crocker, PR, Harris, A, Burdick, MD, Hinoda, Y, Hayashi, T, Imai, K, e Hollingsworth, MA; Overexpression of MUC1 reconfigures the binding properties of tumor cells, int. J Câncer, 2001, 94, 783-791).

MUC1 como detectado imunologicamente é aumentado em expressão em cânceres de cólon, que corresponde a um prognóstico pior (B

30/93 yrd, JC e Bresalier, RS; Mucins and mucin binding proteins in colorectal câncer, Câncer Metastasis Rev., 2004, 23, 77-99), indicando que regulação alta de MUC1 pode estar envolvida na progressão do CRC. Cânceres de cólon com metástase expressam MUC1 mais fortemente do que esses sem metástase (Nakamori, S, Ota, DM, Cleary, KR, Shiviani, K, e Irimura, T; MUC1 mucin expression as a marker of progression and metastasis of human colorectal carcinoma, Gastroenterology, 1994, 106, 353-361), e MUC1 manchado foi positivo em todos os cânceres colorretais com envolvimento hepático em um estudo (Matsuda, K, Masaki, T, Watanabe, T, Kitayama, J, Nagawa, H, Muto, T, and Ajioka, Y; Clinicai significance of MUC1 and MUC2 mucin and p53 protein expression in colorectal carcinoma, Jpn. J Clin Oncol., 2000, 30, 8994). Um estudo recente realizado em 462 pacientes com câncer colorretal descobriu que expressão MUC1 é um marcador de prognóstico independente de prognóstico reduzido (Duncan, TJ, Watson, NF, Al-Attar, AH, Scholefield, JH, and Durrant, LG; The role of MUC1 and MUC3 in the biology and prognosis of colorectal câncer, World J Surg. Oncol, 2007, 5, 31).

Há um significado fisiopatológico de anticorpos circulantes antiMUC1 no CRC: os anticorpos anti-MUC1 foram detectados em 5 de 31 (16,1%) sujeitos saudáveis e em 27 de 56 (48.2%) pacientes com câncer colorretal (Nakamura, H, Hinoda, Y, Nakagawa, N, Makiguchi, Y, Itoh, F, Endo, T, and Imai, K; Detection of circulating anti-MUC1 mucin core protein antibodies in patients with colorectal câncer, J Gastroenterol., 1998, 33, 354361).

Além do seu papel como um alvo de anticorpos, MUC1 é também um alvo bem estabelecido para as células T citotóxicas. Vários relatos demonstraram que MHC citotóxica de célula T irrestrita de tumores do mieloma múltiplo de mama, ovário e pâncreas, e podem reconhecer epítopos da proteína do núcleo MUC1 localizado na repetição em tandem (Apostolopoulos, V and McKenzie, IF; Cellular mucins: targets for immunotherapy, Crit Rev. Immunol., 1994, 14, 293-309; Finn, OJ, Jerome, KR, Henderson, RA, Pecher, G, Domenech, N, Magarian-Blander, J, and Barratt-Boyes, SM; MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and câncer vaccines, Immu

31/93 nol. Rev., 1995, 145, 61-89; Barnd, DL, Lan, MS, Metzgar, RS, and Finn, OJ; Specific, major histocompatibility complex-unrestricted recognition of tumorassociated mucins by human cytotoxic T cells, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A, 1989, 86, 7159-7163; Takahashi, T, Makiguchi, Y, Hinoda, Y, Kakiuchi, H, Nakagawa, N, Imai, K, and Yachi, A; Expression of MUC1 on myeloma cells and induetion of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient, J. Immunol., 1994, 153, 2102-2109; Noto, H, Takahashi, T, Makiguchi, Y, Hayashi, T, Hinoda, Y, and Imai, K; Cytotoxic T lymphocytes derived from bone marrow morronuclear ceife of multiple myeloma patients recognize an underglycosylated form of MUC1 mucin, Int. Immunol., 1997, 9, 791-798). No entanto, epítopos HLA-A*02 de células T restritas derivados da proteína MUC1 também foram identificados (Apostolopoulos, V, Karanikas, V, Haurum, JS, and McKenzie, IF; Induetion of HLA-A2-restricted CTLs to the mucin 1 human breast câncer antigen, J Immunol., 1997, 159, 5211-5218; Brossart, P, Heinrich, KS, Stuhler, G, Behnke, L, Reichardt, VL, Stevanovic, S, Muhm, A, Rammensee, HG, Kanz, L, and Brugger, W, Identification of HLA-A2-restricted T-cell epitopes derived from the MUC1 tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies, Blood, 1999, 93, 4309-4317). Um desses peptídeos é MUC-001. Ele é derivado da região de repetição do tandem da proteína MUC1. Indução de respostas T citotóxicas dos linfócitos in vivo após a vacinação com as células dendríticas do peptídeo pulsado em pacientes com câncer de mama avançado ou câncer de ovário com estes peptídeos MUC1 tem sido bem-sucedida (Brossart, P, Wirths, S, Stuhler, G, Reichardt, VL, Kanz, L, and Brugger, W; Induetion of cytotoxic T-lymphocyte responses in vivo after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells, Blood, 2000, 96, 3102-3108; Wierecky, J, Mueller, M, and Brossart, P; Dendritic cell-based câncer immunotherapy targeting MUC-1, Câncer Immunol. Immunother., 2005 abr. 28: 288-94). Além do mais, tais vacinações induziram respostas clínicas em pacientes com carcinoma de célula renais de com êxito (Wierecky, J, Muller, MR, Wirths, S, Halder-Oehler, E, Dorfel, D, Schmidt, SM, Hantschel, M, Brugger, W, Schroder, S, Horger, MS, Kanz, L, and Brossart, P; Immunologic and clinicai responses after vaccinations with peptide

32/93 pulsed dendritic cells in metastatic renal câncer patients, Câncer Res., 2006, 66, 5910-5918).

Super-regulação de MUC1 imunorreativa em câncer colorretal não é baseada principalmente na superexpressão do mRNA, mas sim causado pela diminuição da sua glicosilação que desmascara epítopos para o reconhecimento de anticorpos, especialmente na região da repetição em tandem de MUC1. Esta desglicosilação fornece ao mesmo tempo uma oportunidade para a geração de epítopos de célula T por processamento alterado de antígeno em células de tumor, que é prevenida em células normais por glicosilação. Este mecanismo pode explicar as características chamativas de MUC-001 como um epítopo de célula T associado a tumor apesar da ausência de forte superexpressão de mRNA. Algumas evidências de que as mudanças de glicosilação realmente podem afetar o processamento do antígeno vêm de uma observação recente, que a glicosilação alterada de MUC1 em câncer colorretal pode ser realmente detectada por células apresentadoras de antígenos através de um receptor que reconhece especificamente glicoformes tumorais (Saeland, E, van Vliet, SJ, Backstrom, M, van, dB, V, Geijtenbeek, TB, Meijer, GA, and van, KY; 2006, The C-type lectin MGL expressed by dendritic cells detects glycan changes on MUC1 in colon carcinoma, Câncer Immunol.lmmunother., 2007, 56(8): 1225-36). Uma absorção e tratamento específico de glicoformes tumorais por células apresentadoras de antígeno também pode explicar o fato de que células T específicas MUC001 têm sido observadas naturalmente (sem vacinação) em pacientes com câncer mamário (Rentzsch, C, Kayser, S, Stumm, S, Watermann, I, Walter, S, Stevanovic, S, Wallwiener, D, and Guckel, B; Evaluation of pre-existent immunity in patients with primary breast câncer: molecular and cellular assays to quantify antigen-specific T lymphocytes in peripheral blood mononuclear cells, Clin Câncer Res., 2003, 9, 4376-4386) e câncer colorretal (Dittmann, J, Keller-Matschke, K, Weinschenk, T, Kratt, T, Heck, T, Becker, HD, Stevanovic, S, Rammensee, HG, and Gouttefangeas, C; CD8+ T-cell response against MUC1-derived peptides in gastrointestinal câncer survivors, Câncer Immunol. Immunother., 2005, 54, 750-758). Nestes pacientes, ne33/93 nhum efeito autoimunes foi relatado. Isto demonstra o papel natural de MUC001 como um peptídeo associado a tumor induzindo células T específicas e sugere que a administração de MUC-001 pode ser considerada segura embora nenhuma superexpressão possa ser detectada para o antígeno MUC1 no nível de mRNA.

Proto-oncogene Met (receptor do fator de crescimento hepatócito) (c-Met)

O produto de proteína MET proto-oncogene é o receptor do fator de crescimento hepatócito. Ele contém um domínio de quinase de tirosina que ativa caminhos de sinalização envolvidos na proliferação, motilidade, adesão e invasão de célula (Trusolino, L and Comoglio, PM; Scatter-factor and semaphorin receptors: cell signalling for invasive growth, Nat. Rev. Câncer, 2002, 2, 289-300).

Os estudos em vários tipos de tumor demonstraram vários mecanismos para ativação de c-MET, inclusive laço de autocrina HGF/c-MET, ativando mutações de ponto, proteína de fusão de TPR-MET, e um fracasso na tentativa de rachar c-MET em correntes α e β (Di Renzo, MF, Olivero, M, Martone, T, Maffe, A, Maggiora, P, Stefani, AD, Valente, G, Giordano, S, Cortesina, G, and Comoglio, PM; Somatic mutations of the MET oncogene are selected during metastatic spread of human HNSC carcinomas, Oncogene, 2000, 19, 1547-1555; Ebert, M, Yokoyama, M, Friess, H, Buchler, MW, and Korc, M; Coexpression of the c-met proto-oncogene and hepatocyte growth factor in human pancreatic câncer, Câncer Res., 1994, 54, 57755778; Mondino, A, Giordano, S, and Comoglio, PM; Defective posttranslational processing activates the tyrosine kinase encoded by the MET protooncogene (hepatocyte growth factor receptor), Mol. Cell Biol., 1991, 11, 6084-6092; Olivero, M, Valente, G, Bardelli, A, Longati, P, Ferrero, N, Cracco, C, Terrone, C, Rocca-Rossetti, S, Comoglio, PM, and Di Renzo, MF; Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family, Int. J Câncer, 1999, 82, 640-643; Park, M, Dean, M, Cooper, CS, Schmidt, M, O'Brien, SJ, Blair, DG, and Vande Woude, GF; Mechanism of met oncogene activation, Cell, 1986, 45, 895-904; Park, WS, Dong, SM, Kim, SY, Na, EY, Shin, MS, Pi, JH, Kim, BJ, Bae, JH, Hong, YK,

34/93

Lee, KS, Lee, SH, Yoo, NJ, Jang, JJ, Pack, S, Zhuang, Z, Schmidt, L, Zbar, B, and Lee, JY; 1999, Somatic mutations in the kinase domain of the Met/hepatocyte growth factor receptor gene in childhood hepatocellular carcinomas, Câncer Res., 59, 307-310; Rahimi, N, Tremblay, E, McAdam, L, Park, M, Schwall, R, and Elliott, B; 1996, Identification of a hepatocyte growth factor autocrine loop in a murine mammary carcinoma, Cell Growth Differ., 7, 263-270;Schmidt, L, Duh, FM, Chen, F, Kishida, T, Glenn, G, Choyke, P, Scherer, SW, Zhuang, Z, Lubensky, I, Dean, M, Allikmets, R, Chidambaram, A, Befgerheim, UR, Feltís, JT, Casadevall, C, Zamarron, A, Bernues, M, Richard, S, Lips, CJ, Walther, MM, Tsui, LC, Geil, L, Orcutt, ML, Stackhouse, T, Lipan, J, Slife, L, Brauch, H, Decker, J, Niehans, G, Hughson, MD, Moch, H, Storkel, S, Lerman, Ml, Linehan, WM, and Zbar, B; 1997, Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas, Nat.Genet., 16, 68-73; Schmidt, L, Junker, K, Weirich, G, Glenn, G, Choyke, P, Lubensky, I, Zhuang, Z, Jeffers, M, Vande, WG, Neumann, H, Walther, M, Linehan, WM, and Zbar, B; 1998, Two North American families with hereditary papillary renal carcinoma and identical novel mutations in the MET proto-oncogene, Câncer Res., 58, 1719-1722). Mecanicamente, superexpressão c-Met coopera com mutação Ki-ras oncogênica para aumentar tumorigenicidade de células de câncer de cólon in vivo (Long, IS, Han, K, Li, M, Shirasawa, S, Sasazuki, T, Johnston, M, and Tsao, MS; Met receptor overexpression and oncogenic Ki-ras mutation cooperate to enhance tumorigenicity of colon câncer cells in vivo, Mol.Câncer Res., 2003, 1, 393-401).

Curiosamente, há algumas evidências para interações da sinalização MET com o caminho Wnt/beta-catenina frequentemente superregulado no câncer do cólon. MET pode ser ativado pela prostaglandina E2 (PGE2) e c-Met ativado por PGE2 associados com β-catenina e aumenta a sua fosforilação da tirosina induzindo invasividade de células de câncer de cólon (Pai, R, Nakamura, T, Moon, WS, and Tarnawski, AS; Prostaglandins promote colon câncer cell invasion; signaling by cross-talk between two distinct growth factor receptors, FASEB J, 2003, 17, 1640-1647). Recentemen

35/93 te, ativação mútua de MET e beta-catenina foi descrita, resultando num laço positivo de reação entre estes dois jogadores chaves em tumorigênese colorretal (Rasola, A, Fassetta, M, De, BF, DAIessandro, L, Gramaglia, D, Di Renzo, MF, and Comoglio, PM; A positive feedback loop between hepatocyte growth factor receptor and beta-catenin sustains colorectal câncer cell invasive growth, Oncogene, 2007, 26, 1078-1087).

O nível de expressão de mRNA de c-Met em tumores primários de CRC (n = 36) é um marcador previsível importante para invasão de estágio inicial e doença de metástase regional, correlacionando assim diretamente com o estágio de câncer de cólon (Takeuchi, H, Bilchik, A, Saha, S, Turner, R, Wiese, D, Tanaka, M, Kuo, C, Wang, HJ, and Hoon, DS; c-MET expression levei in primary colon câncer: a predictor of tumor invasion and lymph node metastases, Clin Câncer Res., 2003, 9, 1480-1488). Outra análise de expressão de c-Met de 130 amostras de CRC mostrou superexpressão (T/N> 2,0) de c-Met em 69% CRC primário e níveis de c-Met significativamente mais altos em CRC com invasão de vaso sanguíneo (P = 0,04), e em estágio avançado (P = 0,04) apoiando o papel do c-Met para a progressão humana de CRC e metástase (Zeng, Z, Weiser, MR, DAIessio, M, Grace, A, Shia, J, and Paty, PB; Immunoblot analysis of c-Met expression in human colorectal câncer: overexpression is associated with advanced stage câncer, Clin Exp. Metastasis, 2004, 21, 409-417). Em outro estudo 69% e 48% de 60 adenocarcinomas de cólon mostraram uma elevação maior do que 2 e uma elevação maior que de 10 vezes em mRNA de c-MET, respectivamente, comparados com mucosa normal adjacente (Kammula, US, Kuntz, EJ, Francone, TD, Zeng, Z, Shia, J, Landmann, RG, Paty, PB, and Weiser, MR; Molecular co-expression of the c-Met oncogene and hepatocyte growth factor in primary colon câncer predicts tumor stage and clinicai outcome, Câncer Lett., 2007, 248, 219-228). Assim, sinalização de c-Met aumentado é uma ocorrência comum em CRC em estágios primários, mas com expressão ainda maior ocorrendo em doença avançada e metastática.

Ciclina D1 (CCND1)

CCND1 pertence à família de ciclina altamente conservada, cu

36/93 jos membros são caracterizados por uma periodicidade dramática em abundância de proteína por todo o ciclo de célula. Ciclinas funcionam como reguladores de quinases CDK. Ciclinas diferentes apresentam expressão e padrões distintos de degradação, que contribuem para a coordenação temporal de cada evento mitótico. Esta ciclina forma um complexo com e funções como uma subunidade reguladora de CDK4 ou CDK6, cujas atividades são exigidas para transição G1/S de ciclo de célula. Mutações, amplificação e superexpressão deste gene, que altera a progressão de ciclo de célula, são observadas frequentemente numa variedade de tumores e pode contribuir para a tumorigênese (Fu, M, Wang, C, LI, Z, Sakamaki, T, and Pestell, RG; Minireview: Cyclin D1: normal and abnormal functions, Endocrinology, 2004, 145, 5439-5447).

Um polimorfismo comum de nucleotídeo A/G único (A870G) resulta em duas distintas isoformas de mRNA a e b. A isoforma b alternadamente emendada codifica uma proteína truncada, que tem sido associada a uma maior incidência de aparecimento do tumor, incluindo câncer de pulmão, câncer de cólon e outros tipos de câncer (Fu, M, Wang C, LI, Z, Sakamaki, T, e Pestell, RG; Minireview: Cyclin D1: normal and abnormal functions, Endocrinology, 2004, 145, 5439-5447).

Para o câncer colorretal, superexpressão de CCND1 no mRNA e níveis de proteína foram frequentemente descritos (Sutter, T, Doi, S, Carnevale, KA, Arber, N, and Weinstein, IB; Expression of cyclins D1 and E in human colon adenocarcinomas, J Med, 1997, 28, 285-309; Mermelshtein, A, Gerson, A, Walfisch, S, Delgado, B, Shechter-Maor, G, Delgado, J, Fich, A, and Gheber, L; Expression of D-type cyclins in colon câncer and in cell lines from colon carcinomas, Br. J Câncer, 2005, 93, 338-345; Balcerczak, E, Pasz-Walczak, G, Kumor, P, Panczyk, M, Kordek, R, Wierzbicki, R, and Mirowski, M; Cyclin D1 protein and CCND1 gene expression in colorectal câncer, Eur. J Surg.Oncol., 2005, 31, 721-726; Bondi, J, Husdal, A, Bukholm, G, Nesland, JM, Bakka, A, and Bukholm, IR; Expression and gene amplification of primary (A, B1, D1, D3, e E) and secondary (C e H) cyclins in colon adenocarcinomas and correlation with patient outcome, J Clin Pathol., 2005, 58,

37/93

509-514; Perez, R, Wu, N, Klipfel, AA, and Beart, RW, Jr.; A better cell cycle target for gene therapy of colorectal câncer: cyclin G, J Gastrointest. Surg., 2003, 7, 884-889; Wong, NA, Morris, RG, McCondochie, A, Bader, S, Jodrell, Dl, and Harrison, DJ; Cyclin D1 overexpression in colorectal carcinoma in vivo is dependent on beta-catenin protein dysregulation, but not k-ras mutation, J Pathol., 2002, 197, 128-135; McKay, JA, Douglas, JJ, Ross, VG, Curran, S, Murray, Gl, Cassidy, J, and McLeod, HL; Cyclin D1 protein expression and gene polymorphism in colorectal câncer. Aberdeen Colorectal Initiative, Int.J Câncer, 2000, 88, 77-81; Bartkova, J, Lukas, J, Strauss, M, and Bartek, J; The PRAD-1/cyclin D1 oncogene product accumulates aberrantly in a subset of colorectal carcinomas, Int. J Câncer, 1994, 58, 568-573).

Isto pode ser explicado pelo fato bem-estabelecido que CCND1 é um gene de alvo do caminho β-Catenina-TCF/LEF que é frequentemente super-regulado em carcinoma colorretal (Shtutman, M, Zhurinsky, J, Simcha, I, Albanese, C, DAmico, M, Pestell, R, and Ben-Ze'ev, A; The cyclin D1 gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A, 1999, 96, 5522-5527; Tetsu, O and McCormick, F; Beta-catenin regulates expression of cyclin D1 in colon carcinoma cells, Nature, 1999, 398, 422426).

Expressão melhorada CCND1 foi ligada a níveis mais altos de tumor, metástase, e sobrevivência diminuída (Balcerczak, E, Pasz-Walczak, G, Kumor, P, Panczyk, M, Kordek, R, Wierzbicki, R, and Mirowski, M; Cyclin D1 protein and CCND1 gene expression in colorectal câncer, Eur. J Surg. Oncol., 2005, 31, 721-726; Bahnassy, AA, Zekri, AR, El-Houssini, S, ElShehaby, AM, Mahmoud, MR, Abdallah, S, and El-Serafi, M; Cyclin A and cyclin D1 as significant prognostic markers in colorectal câncer patients, BMC. Gastroenterol., 2004, 4, 22; McKay, JA, Douglas, JJ, Ross, VG, Curran, S, Murray, Gl, Cassidy, J, and McLeod, HL; Cyclin D1 protein expression and gene polymorphism in colorectal câncer. Aberdeen Colorectal Initiative, Int. J Câncer, 2000, 88, 77-81; Maeda, K, Chung, Y, Kang, S, Ogawa, M, Onoda, N, Nishiguchi, Y, Ikehara, T, Nakata, B, Okuno, M, and Sowa, M; Cyclin D1 overexpression and prognosis in colorectal adenocarcinoma, On

38/93 cology, 1998, 55, 145-151).

Metallopeptidase de matriz 7 (matrilisina, uterina) (MMP7)

As metalopeptidases de matriz (MMPs) são uma grande família de proteinases zincos-dependentes, estrutural mente relacionadas tipicamente descritas como capazes de degradar componentes da matriz extracelular. MMPs individuais foram identificados em apresentar expressão aumentada em tumores e a maioria dos tumores demonstra uma atividade MMP aprimorada (Curran, S and Murray, Gl; 1999, Matrix metalloproteinases in tumour invasion and metastasis, J Pathol., 189, 300-308; Curran, S and Murray, Gl; 2000, Matrix metalloproteinases: molecular aspects of their roles in tumour invasion and metastasis, Eur.J Câncer, 36, 1621-1630).

Membrana basal e matriz extracelular representam duas barreiras físicas à invasão maligna, e sua degradação por MMPs desempenha um papel importante na progressão do tumor e na disseminação metastática (Johnsen, M, Lund, LR, Romer, J, Almholt, K, and Dano, K; 1998, Câncer invasion and tissue remodeling: common themes in proteolytic matrix degradation, Curr.Opin.Cell Biol., 10, 667-671; Nelson, AR, Fingleton, B, Rothenberg, ML, and Matrisian, LM; 2000, Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinicai implications, J Clin Oncol., 18, 1135-1149; Wang, FQ, So, J, Reierstad, S, and Fishman, DA; 2005, Matrilysin (MMP-7) promotes invasion of ovarian câncer celis by activation of progelatinase, Int.J Câncer, 114, 1931). Além desta função, MMPs são discutidas por seu envolvimento no desenvolvimento e progressão tumoral, incluindo papéis em apoptose, proliferação celular e diferenciação celular. Estas funções estão ligadas à proteólise mediada por MMP de proteínas não-matriz e ações distintas da sua atividade enzimática (Egeblad, M and Werb, Z; 2002, New functions for the matrix metalloproteinases in câncer progression, Nat.Rev.Cancer, 2, 161-174; Leeman, MF, Curran, S, and Murray, Gl; 2003, New insights into the roles of matrix metalloproteinases in colorectal câncer development and progression, J.Pathol., 201, 528-534).

Estudos recentes mostraram que vários metaloproteinases de matriz, especialmente matrilisina (MMP7), interage com os caminhos especí

39/93 ficos moleculares genéticos e sinalizadores envolvidos no desenvolvimento de câncer colorretal. Em particular, matrilisina é ativada numa primeira etapa de tumorigênese colorretal pelo caminho sinalizando beta-catenina (Brabletz, T, Jung, A, Dag, S, Hlubek, F, and Kirchner, T; 1999, beta-catenin regulates the expression of the matrix metalloproteinase-7 in human colorretal câncer, Am.J Pathol., 155, 1033-1038; Leeman, MF, Curran, S, and Murray, GI; 2003, New insights into the roles of matrix metalloproteinases in colorectal câncer development and progression, J.Pathol., 201,528-534; Zucker, S and Vacirca, J; 2004, Role of matrix metalloproteinases (MMPs) in colorectal câncer, Câncer Metastasis Rev., 23, 101-117).

MMP7 foi superexpresso tanto em tumores colorretais benignos como em malignos (Ishikawa, T, Ichikawa, Y, Mitsuhashi, M, Momiyama, N, Chishima, T, Tanaka, K, Yamaoka, H, Miyazakic, K, Nagashima, Y, Akitaya, T, and Shimada, H; 1996, Matrilysin is associated with progression of colorectal tumor, Câncer Lett., 107, 5-10; McDonnell, S, Navre, M, Coffey, RJ, Jr., and Matrisian, LM; 1991, Expression and localization of the matrix metalloproteinase pump-1 (MMP-7) in human gastric and colon carcinomas, Mol.Carcinog., 4, 527-533; Miyazaki, K, Hattori, Y, Umenishi, F, Yasumitsu, H, and Umeda, M; 1990, Purification and characterization of extracellular matrix-degrading metalloproteinase, matrin (pump-1), secreted from human rectal carcinoma cell line, Câncer Res., 50, 7758-7764; Nagashima, Y, Hasegawa, S, Koshikawa, N, Taki, A, Ichikawa, Y, Kitamura, H, Misugi, K, Kihira, Y, Matuo, Y, Yasumitsu, H, and Miyazaki, K; 1997, Expression of matrilysin in vascular endothelial cells adjacent to matrilysin-producing tumors, Int.J Câncer, 72, 441-445; Newell, KJ, Witty, JP, Rodgers, WH, and Matrisian, LM; 1994, Expression and localization of matrix-degrading metalloproteinases during colorectal tumorigenesis, Mol.Carcinog., 10, 199-206; Yoshimoto, M, Itoh, F, Yamamoto, H, Hinoda, Y, Imai, K, and Yachi, A; 1993, Expression of MMP-7(PUMP-1) mRNA in human colorectal cancers, Int.J Câncer, 54, 614618). MMP7 é apenas um de vários MMPs que realmente é secretado por células de tumor (Overall, CM and Kleifeld, O; 2006, Tumour microenvironment - opinion: validating matrix metalloproteinases as drug targets and anti

40/93 targets for câncer therapy, Nat.Rev.Câncer, 6, 227-239). Além disso, os níveis de expressão do mRNA de MMP7 correlacionam com o estágio da progressão de CRC (Ishikawa, T, Ichikawa, Y, Mitsuhashi, M, Momiyama, N, Chishima, T, Tanaka, K, Yamaoka, H, Miyazakic, K, Nagashima, Y, Akitaya, T, and Shimada, H; 1996, Matrilysin is associated with progression of colorectal tumor, Câncer Lett., 107, 5-10; Mori, M, Barnard, GF, Mimori, K, Ueo, H, Akiyoshi, T, and Sugimachi, K; 1995, Overexpression of matrix metalloproteinase-7 mRNA in human colon carcinomas, Câncer, 75, 1516-1519). Em metástases CRC, MMP7 também desempenha um papel crítico (Adachi, Y, Yamamoto, H, Itoh, F, Hinoda, Y, Okada, Y, and Imai, K; 1999, Contribution of matrilysin (MMP-7) to the metastatic pathway of human colorectal cancers, Gut, 45, 252-258; Mori, M, Barnard, GF, Mimori, K, Ueo, H, Akiyoshi, T, and Sugimachi, K; 1995, Overexpression of matrix metalloproteinase-7 mRNA in human colon carcinomas, Câncer, 75, 1516-1519).

Os níveis elevados MMP7 estão associados a um prognóstico pobre em pacientes com câncer colorretal avançado (Maurel, J, Nadai, C, Garcia-Albeniz, X, Gallego, R, Carcereny, E, Almendro, V, Marmol, M, Gallardo, E, Maria, AJ, Longaron, R, Martinez-Fernandez, A, Molina, R, Castells, A, and Gascon, P; 2007, Serum matrix metalloproteinase 7 leveis identifies poor prognosis advanced colorectal câncer patients, Int.J Câncer, Published Online: 8 May 2007) e superexpressão em pacientes CRC, novamente associados com sobrevivência diminuída, tem sido sugerido para promover fugas da vigilância imunológica, aderindo-se Fas em células tumorais (Wang, WS, Chen, PM, Wang, HS, Liang, WY, and Su, Y; 2006, Matrix metalloproteinase-7 increases resistance to Fas-mediated apoptosis and is a poor prognostic factor of patients with colorectal carcinoma, Carcinogenesis, 27, 1113-1120).

As proteínas podem ser o alvo de uma resposta imune específica do tumor em diversos tipos de câncer.

O peptídeo HBV-001 antígeno do núcleo do vírus da hepatite B não é derivado de um antígeno associado a um tumor endógeno humano, mas é derivado do antígeno do núcleo do vírus da hepatite B. Em primeiro

41/93 lugar, ele permite comparações quantitativas da magnitude das respostas de células T induzidas por TUMAPs e, portanto, permite-nos tirar conclusões importantes sobre a capacidade de obter respostas antitumorais. Segundamente, ele age como um importante controle positivo no caso de ausência de respostas das células T no paciente. E em terceiro lugar, ele também permite tirar conclusões sobre o estado da imunocompetência do paciente.

A infecção com o vírus da hepatite B (VHB) é uma das principais causas das doenças hepáticas, atingindo cerca de 350 milhões de pessoas ao redor do mundo (Rehermann, B and Nãscímbeni, M; Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection, Nat.Rev.lmmunol., 2005, 5, 215-229). Devido à facilidade da transmissão horizontal e vertical e o potencial da doença se tornar crônica, que pode levar à cirrose hepática e ao carcinoma hepatocelular, o VHB representa um grande impacto no sistema público de saúde de inúmeros países. O genoma do VHB (Previsani, N and Lavanchy, D; 2002, Hepatitis B, (Epidemic and Pandemic Alert and Response, World Health Organization, Geneva, 2002)) é formado de DNA circular parcialmente de fita dupla. Nos vírions de VHB, ele é conjugado com a proteína essencial do capsídeo HBc e outras proteínas para formar o nucleocapsídeo, que é cercado por um envelope externo contendo lipídios e a família HBs de proteínas de superfície (também chamada de proteína do envelope). A notação dos determinantes antigênicos associados com HBc e HBs é HBcAg e HBsAg, respectivamente. Esses antígenos são associados a respostas sorológicas, ou seja, de anticorpos encontrados no sangue do paciente e estão entre os sistemas antígeno-anticorpo mais úteis para o diagnóstico de infecção com VHB. O HBc irá representar um novo antígeno estranho, para todos aqueles que não tenham um histórico de infecção com VHB. Como os peptídeos imunogênicos para esse antígeno são bem conhecidos (Bertoletti, A, Chisari, FV, Penna, A, Guilhot, S, Galati, L, Missale, G, Fowler, P, Schlicht, HJ, Vitiello, A, Chesnut, RC, and .; 1993, Definition of a minimal optimal cytotoxic T-cell epitope within the hepatitis B virus nucleocapsid protein, J.Virol., 67, 2376-2380;Livingston, BD, Crimi, C, Grey, H, Ishioka, G, Chisari, FV, Fikes, J, Grey, H, Chesnut, RW, and Sette, A; 1997, The hepatitis B vi

42/93 rus-specific CTL responses induced in humans by lipopeptide vaccination are comparable to those elicited by acute viral infection, J.Immunol., 159, 13831392), selecionou-se um peptídeo de 10 aminoácidos do HBcAg como antígeno de controle positivo dentro do IMA. A indução de Células T citotóxicas específicos do peptídeo HBc será então utilizada como marcador da imunocompetência e vacinação bem-sucedida.

A composição farmacêutica, além do mais, pode conter peptídeos adicionais e/ou excipientes para ser mais eficaz, como será explicado mais adiante.

Com uma sequência variante de aminoácidos da sequência de aminoácido específica, os inventores querem dizer que as cadeias laterais, por exemplo, um ou dois dos resíduos aminoácidos são alterados (por exemplo, substituindo-os com a cadeia lateral de outro resíduo aminoácido que ocorre naturalmente ou por uma cadeia de algum outro lado), de tal modo que o peptídeo ainda seja capaz de ligar a uma molécula HLA sensivelmente da mesma forma que um peptídeo constituído da sequência de aminoácido específico. Por exemplo, um peptídeo pode ser modificado, de modo que ao menos mantenha, se não melhora, a capacidade de interagir e de ligar a uma molécula MHC conveniente, tal como HLA-A ou -DR, e para que pelo menos mantenha, se não melhore, a capacidade de gerar CTL ativado, que possa reconhecer e matar as células que expressem um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos, tal como aquela definida nos aspectos da invenção. Como pacote derivado do banco de dados, certas posições de HLA-A peptídeos ligantes são tipicamente resíduos de âncora, formando uma sequência núcleo apropriada para o motivo do sulco de ligação HLA.

Os resíduos de aminoácido que não são substancialmente essenciais para interações com o receptor de células T podem ser modificados por substituição com outro aminoácido cuja integração substancialmente não afete a reatividade de célula T e não elimina ligação ao MHC relevante. Assim, aparte da condição dada, o peptídeo da invenção pode ser qualquer peptídeo (sendo que aqui os inventores incluem oligopeptídeo ou polipeptí

43/93 deo) que inclui as sequências de aminoácido ou uma porção ou variante disso como dado.

Além do mais é conhecido para peptídeos MHC de classe II apresentados, que estes peptídeos são compostos de uma sequência de centro tendo um motivo de aminoácido de HLA específico, e opcionalmente extensões terminais N e/ou C que não interferem na função da sequência de centro (isto é, são considerados como irrelevantes para a interação do peptídeo e da célula T). As extensões do terminal N e/ou C podem conter, por exemplo, de 1 a 10 aminoácidos de comprimento, respectivamente. Estes peptídeos podem ser usados diretamente para carregar moléculas MHC da classe II ou a sequência pode ser clonada nos vetores de acordo com a descrição contida abaixo. Como estes peptídeos formam o produto final do processamento de peptídeos maiores dentro da célula, peptídeos mais longos também podem ser usados. Os peptídeos da invenção podem ser de qualquer tamanho, mas tipicamente podem ser menores do que 100.000 em peso molecular, preferivelmente menores do que 50.000, mais preferivelmente menores do que 10.000 e tipicamente aproximadamente 5.000. Em termos de número de resíduos aminoácidos, os peptídeos da invenção podem ter menos que 1000 resíduos, preferivelmente menos que 500 resíduos, mais preferivelmente menos que 100 resíduos. Assim, a presente invenção também fornece composições de peptídeos e variantes, em que o dito peptídeo ou variante tem um comprimento total entre 8 e 100, de preferência entre 8 e 30, e mais preferido entre 8 e 16, ou seja, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14, 15 ou 16 aminoácidos.

Correspondentemente, variantes que induzem células T que cruzam com um peptídeo da invenção são frequentemente variantes de longo comprimento.

Se um peptídeo é mais longo do que ao redor de 12 resíduos de aminoácido, ele é usado para diretamente ligar a uma molécula MHC de classe II, sendo que é preferido que os resíduos que ladeiam a região de ligação de HLA de centro são uns que substancialmente não afetam a capacidade do peptídeo ligar especificamente ao sulco comprometedor das mo44/93 léculas MHC de classe II ou apresentar o peptídeo ao CTL. No entanto, como já indicado acima, será apreciado que peptídeos maiores podem ser usados, especialmente quando codificados por um polinucleotídeo, desde que estes peptídeos maiores possam ser fragmentados por células convenientes que apresentam antígenos.

É também possível, que epítopos MHC da classe I, embora normalmente entre 8-10 aminoácidos de comprimento, sejam gerados por processamento peptídico de peptídeos mais longos ou proteínas que incluem o epítopo real. Semelhante a epítopos MHC de classe II, é preferido que os resíduos que ladeiam a região de ligação não afetem substancialmente a capacidade do peptídeo de se ligar especificamente ao sulco de ligação da molécula MHC de classe I ou apresentar o peptídeo ao CTL nem mascarar os locais para divagem proteolítica necessária para expor o epítopo atual o durante processamento.

Assim, a presente invenção também fornece peptídeos e variantes de epítopos MHC de classe I com um comprimento entre 8 e 100, de preferência entre 8 e 30, e mais preferencialmente entre 8 e 16, ou seja, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15 ou 16 aminoácidos.

Naturalmente, os peptídeos ou variantes de acordo com a presente invenção têm a capacidade de se ligar a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade humana (MHC) classe I ou II. A ligação de um peptídeo ou uma variante a um complexo de MHC pode ser testada por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles descritos abaixo nos exemplos da invenção presente ou aqueles descritos na literatura para diferentes alelos MHC de classe II (e.g. Vogt AB, Kropshofer H, Kalbacher H, Kalbus M, Rammensee HG, Coligan JE, Martin R; Ligand motifs of HLADRB5*0101 and DRB1*1501 molecules delineated from self-peptides; J Immunol. 1994; 153(4): 1665-1673; Malcherek G, Gnau V, Stevanovic S, Rammensee HG, Jung G, Melms A; Analysis of allele-specific contact sites of natural HLA-DR17 ligands; J Immunol. 1994; 153(3):1141-1149; Manici S, Sturniolo T, Imro MA, Hammer J, Sinigaglia F, Noppen C, Spagnoli G, Mazzi B, Bellone M, Dellabona P, Protti MP; Melanoma cells present a MAGE-3

45/93 epitope to CD4(+) cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DR11; J Exp Med. 1999; 189(5): 871-876; Hammer J, Gallazzi F, Bono E, Karr RW, Guenot J, Valsasnini P, Nagy ZA, Sinigaglia F; Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules: correlation with rheumatoid arthritis association; J Exp Med. 1995 181(5):1847-1855; Tompkins SM, Via PA, Moore JC, Jensen PE; A europium fluoroimmunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins; J Immunol Methods. 1993; 163(2): 209-216; Boyton RJ, Lohmann T, Londei M, Kalbacher H, HalderT, Frater AJ, Douek DC, Leslie DG, Flavell RA, Altmann DM; Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes: analysis in disease discordant human twins, non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice; Int Immunol. 1998 (12):1765-1776).

Extensões N e/ou C terminalmente adicionais localizados de aminoácidos que necessariamente não formam a parte do peptídeo que funciona como um epítopo para moléculas MHC, mas podem, no entanto, ser importantes para fornecer uma introdução eficiente do peptídeo nas células de acordo com a invenção presente. Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo da invenção presente é uma proteína de fusão que inclui, por exemplo, o N-terminal de 80 aminoácidos da cadeia invariável HLA-DR associada a antígeno (p33, no seguinte li) como derivado do NCBI, GenBank, número acessão X00497 (Strubin, M., Mach, B. and Long, E.O. The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrana polarity EMBO J. 3 (4), 869-872 (1984)).

Preferidas são composições farmacêuticas, onde os peptídeos têm um comprimento total entre 8 e 100 aminoácidos, de preferência entre 8 e 30 aminoácidos e de preferência ainda maior entre 8 e 16 aminoácidos.

Além do mais o peptídeo ou variante pode ser modificado mais adiante para melhorar a estabilidade e/ou ligar a moléculas de MHC para extrair uma resposta imune mais forte. Os métodos para tal otimização de uma sequência peptídica bem são conhecidos na arte e incluem, por exem

46/93 pio, a introdução de ligações peptídicas inversas ou ligações não peptídicas.

Assim, de acordo com outro aspecto a invenção fornece uma composição farmacêutica, em que pelo menos um peptídeo ou variante inclui ligações não-peptídicas.

Em resíduos inversos de aminoácido de ligação peptídica não são unidos por peptídeo (-CO-NH-) conexões, mas a ligação peptídica é invertida. Tais peptídeos miméticos retroinversos podem ser criados usandose métodos conhecidos na técnica, por exemplo, tal como esses descritos em Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, incorporado nisto por referência. Este aprimoramento envolve a criação de pseudopeptídeos contendo alterações envolvendo a vértebra, e não a orientação de correntes laterais. Meziere et al.. (1997) mostra que para respostas de MHC e de célula T auxiliares, estes pseudopeptídeos são úteis. Os peptídeos retroinversos, contendo ligações NH-CO ao invés de ligações peptídicas CO-NH, são muito mais resistentes a proteólise.

Uma ligação não peptídica é, por exemplo, -CH₂-NH, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH-, -COCH₂-, -CH(OH)CH₂-, e -CH₂SO-, Patente dos Estados Unidos 4,897,445 fornece um método para a síntese sólida de fase de ligação não peptídica (-CH2-NH) em correntes de polipeptídeo que envolvem polipeptídeos sintetizadas por procedimentos padronizados e a ligação não peptídica sintetizada por reagir com um amino aldeído e um aminoácido na presença de NaCNBH₃.

Os peptídeos constituindo as sequências da invenção descritas acima podem ser sintetizados com grupos químicos adicionais presentes em seus terminais aminados e/ou carboxílicos, para melhorar, por exemplo, a estabilidade, biodisponibilidade e/ou afinidade dos peptídeos. Por exemplo, grupos hidrofóbicos tal como carbobenzoxila, dansil, ou os grupos de tbutiloxicarbonila podem ser adicionados aos términos aminados dos peptídeos. Da mesma maneira, um grupo de acetila ou um grupo de 9 fluorenilmetóxi-carbonila pode ser colocado nos términos aminados dos peptídeos. Adicionalmente, o grupo hidrofóbico, t-butiloxicarbonila ou grupo aminado pode, por exemplo, ser adicionado aos términos aminados dos peptídeos.

47/93

Além disso, todos os peptídeos da invenção podem ser sintetizados de tal modo que sua configuração estérica seja alterada. Por exemplo, o D-isômero de um ou mais dos resíduos aminoácidos do peptídeo pode ser usado, ao invés do L-isômero normal. Mais ainda, ao menos um dos resíduos de aminoácido dos peptídeos da invenção pode ser substituído por um dos resíduos aminoácidos conhecidos que ocorrem não naturalmente. As alterações tal como estas podem servir para aumentar a estabilidade, biodisponibilidade e/ou de ação de ligação dos peptídeos da invenção.

Semelhantemente, um peptídeo ou variante da invenção pode ser modificado quimicamente reagindo com aminoácidos específicos antes ou depois da síntese do peptídeo. Os exemplos para tais modificações são bem conhecidos na técnica e são resumidos, por exemplo, em R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005, que é incorporado nisto por referência. Modificação química de aminoácidos inclui, mas não é limitado a, modificação por acilação, amidinação, piridoxilação de lisina, alquilação redutiva, trinitrobenzilação de grupos aminados com ácido de sulfônico 2, 4, 6-trinitrobenzeno (TNBS), modificação de amido dos grupos de carboxila e modificação de sulfidrilo por oxidação performica ácida de cisteína, a ácido de cisteico, formação de derivados mercuriais, formação de bissulfeto misturado com outros compostos de tiol, reação com maleimida, carboximetilação com ácido de iodoacetico ou iodoacetamida e carbamoilação com cianeto em pH alcalino, embora sem limitação a isso. Nesta consideração, a pessoa habilidosa é referida ao Capítulo 15 dos Protocolos Atuais em Ciência de Proteína, Eds. Coligan et al.. (John Wiley & Filhos NY 19952000) para metodologia mais extensa relativa à modificação química das proteínas.

Em resumo, a modificação dos resíduos de arginil em proteínas frequentemente é baseada na reação de compostos de dicarbonila vicinais tal como fenilglioxal, butanodiona 2,3 e ciclo-hexanodionas 1,2 para formar um adulto. Outro exemplo é a reação de metilglioxal com resíduos de arginina. Cisteína pode ser modificada sem modificação concomitante de outros locais nucleofílicos tal como histidina e lisina. Como um resultado, um gran

48/93 de número de reagentes está disponível para a modificação de cisteína. Os sites de companhias tal como Pierce Chemical, Sigma-Aldrich e outras fornecem informações em reagentes específicos.

Redução seletiva de ligações de dissulfeto em proteínas é também comum. As ligações de dissulfeto podem ser formadas e podem ser oxidadas durante o tratamento térmico de biofármacos.

O reagente K de Woodward pode ser usado para modificar resíduos ácidos glutâmicos específicos. N-(3-(dimetilamino)propil)-N’ -etilcarbodiimido pode ser usado para formar ligações cruzadas intra-moleculares entre um resíduo de lisina e um resíduo ácido glutâmico.

O dietilpirocarbonato, por exemplo, é um reagente para a modificação de resíduos de histidil em proteínas. Histidina também pode ser modificada para usar 4-hidróxi-2-nonenal.

A reação de resíduos de lisina e outros grupos α-aminados i, por exemplo, útil na ligação de peptideos a superfícies ou na ligação cruzada de proteínas/peptídeos. A lisina é o local de anexo de póli(etileno) glicol e o local importante de modificação na glicação de proteínas.

Os resíduos de metionina em proteínas podem ser modificados com, por exemplo, iodoacetamida, bromoetilamina, e cloramina T.

Tetranitrometano e N-acetilimidazol podem ser usados para a modificação de resíduos de tirosil. Ligação em cruz através da formação de ditirosina pode ser realizada com peróxido de hidrogênio / íons de cobre.

Estudos recentes na modificação de triptofano usaram N-bromossuccinimida, 2-hidroxi-5-nitrobenzil ou brometo de 3-bromo-3-metil-2-(2nitrophenilmercapto)-3H-indolo (BPNS-escatol).

Modificação bem-sucedida de proteínas terapêuticas e peptídeos com PEG frequentemente é associada com uma extensão de meiovida circulatória, enquanto que uma ligação cruzada de proteínas com glutaraldeído, diacrilato de polietilenoglicol e formaldeído é usada para a preparação de hidrogéis. Modificação química de alérgenos para imunoterapia frequentemente é realizada por carbamilação com cianeto de potássio.

Geralmente, peptideos e variantes (ao menos esses a conter

49/93 conexões peptídicas entre resíduos de aminoácido) podem ser sintetizados, p. ex. usando-se o modo Fmoc-poliamido de síntese de fase sólida peptídica como divulgado por Lu et al.. (1981) J. Org. Chem. 46, 3433 e referências lá contidas.

A purificação pode ser efetuada por qualquer um, ou uma combinação de técnicas tal como a recristalização, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de íon-intercâmbio, cromatografia de interação de hidrofóbico e (normalmente) cromatografia líquida de alto desempenho na fase reversa usando-se, por exemplo, separação de declive de acetonitrila/água.

A análise de peptídeos pode ser executada usando-se cromatografia de fina de camada, eletroforese, em tubo particular eletroforese capilar, extração de fase sólida (CSPE), cromatografia líquida de alto desempenho na fase reversa, análise de aminoácido depois da hidrólise ácida e por bombardeio rápido de átomos (FAB) análise espectrométrica de massa, assim como MALDI e ESI-Q-TOF análise espectrométrica de massa.

Mais um aspecto da invenção fornece um ácido nucleico (por exemplo, um polinucleotídeo) codificando um peptídeo ou variante da invenção. O polinucleotídeo pode ser, por exemplo, DNA, cDNA, PNA, CNA e RNA, tanto de fita única como de fita dupla, ou formas nativas ou estabilizadas de polinucleotídeo, tal como, por exemplo, polinucleotídeos com uma espinha de fosforotioato, ou combinações destes e pode ou não conter íntrons, contanto que ele se codifique para o peptídeo. Naturalmente, que só os peptídeos contendo resíduos de aminoácido que ocorrem naturalmente são unidos por ligações peptídicas que surgiram naturalmente, que podem ser codificados por um polinucleotídeo. Um ainda mais aspecto da invenção fornece um vetor de expressão capaz de expressar um polinucleotídeo de acordo com a invenção. Vetores de expressão para diferentes tipos de células são bem conhecidos na arte e podem ser selecionados sem a necessidade de experimentação exagerada.

Geralmente, o DNA é inserido num vetor de expressão, tal como um plasmida, em orientação adequada e corrigida lendo-se a armação para

50/93 expressão. Se for necessário, o DNA pode ser ligado às sequências reguladoras de nucleotídeo de controle transcricional e translacional apropriados reconhecidos pelo anfitrião desejado, embora tais controles sejam geralmente disponíveis no vetor de expressão. O vetor então é introduzido no anfitrião através de técnicas normais.

A orientação pode ser achada, por exemplo, em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

Numa personificação particularmente preferida da invenção, no entanto, a composição farmacêutica compreende pelo menos dois peptídeos constituídos por sequências de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 15.

A quantidade ideal de cada peptídeo ser incluído na vacina e o regime de dosagem ideal podem ser determinados por um profissional habilidoso na técnica sem a necessidade de experimentação exagerada. Por exemplo, o peptídeo ou seu variante podem ser preparados para injeção intravenosa (i.v.), injeção subcutânea (s.c.), injeção intradermal (i.d.), injeção intraperitoneal (i.p.), injeção intramuscular (i.m.). Vias preferidas de injeção peptídica são s.c., i.d., i.p., i.m., e i.v. Vias preferidas de injeção de DNA incluem i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. As doses, por exemplo, entre 1 e 500 mg, 50 pg e 1,5 mg, preferivelmente 125 pg a 500 pg, de peptídeo ou DNA podem ser dadas e dependerão do respectivo peptídeo ou DNA. As doses deste alcance foram usadas com êxito em estudos prévios (Brunsvig PF, Aamdal S, Gjertsen MK, Kvalheim G, Markowski-Grimsrud CJ, Sve I, Dyrhaug M, Trachsel S, Moller M, Eriksen JA, Gaudernack G; Telomerase vacinação peptídica: a phase l/ll study in patients with non-small cell lung câncer; Câncer Immunol Immunother. 2006; 55(12): 1553-1564; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open labei study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based câncer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Abstract No 3017)

A composição farmacêutica inventiva pode ser elaborada de tal

51/93 forma, que a seleção, número e/ou a quantidade de peptídeos presentes na composição é / são específicas do tecido, do câncer e/ou do paciente. Por exemplo, a seleção exata de peptídeos pode ser guiada por padrões de expressão das proteínas pai num tecido dado para evitar efeitos colaterais. A seleção pode ser dependente do tipo de câncer específico do qual o paciente a ser tratado sofre no momento, assim como o estado da doença, regimes anteriores de tratamento, o estado imune do paciente, e naturalmente o haplotipo HLA do paciente. Além do mais, a vacina de acordo com a invenção pode conter componentes individualizados, de acordo com necessidades particulares pessoais do paciente. Os exemplos são diferentes quantidades de peptídeos de acordo com a expressão do TAAs relacionado no paciente particular, efeitos colaterais indesejáveis devido a alergias pessoais ou outros tratamentos, e ajustes para tratamentos secundários seguindo um primeiro turno ou esquema de tratamento.

Para composição ser usada como uma vacina para CRC, por exemplo, peptídeos cujas proteínas pai são expressas em altas quantidades em tecidos normais serão evitadas ou estarão presentes em quantidades baixas na composição da invenção. Por outro lado, se é conhecido que o tumor de um paciente expressa altas quantidades de uma certa proteína, a respectiva composição farmacêutica para tratamento deste câncer pode estar presente em altas quantidades e/ou em mais do que um peptídeo específico para esta proteína ou caminho particular desta proteína podem ser incluídos.

A pessoa de habilidade profissional poderá selecionar combinações preferidas de peptídeos imunogênicos por meio de testes, por exemplo, a geração de células T in vitro, bem como a sua eficiência e presença global, a proliferação, a afinidade e a expansão de determinadas células T de certos peptídeos e a funcionalidade das células T, por exemplo, analisando a produção de IFN-γ (ver exemplos abaixo). Normalmente, os peptídeos mais eficientes são então combinados como uma vacina para propósitos como o descrito acima.

Uma vacina conveniente preferivelmente conterá entre 1 e 20

52/93 peptídeos, mais preferivelmente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 peptídeos diferentes, mais preferivelmente 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, ou 14 peptídeos diferentes, ainda mais preferencialmente 14 peptídeos diferentes. O comprimento do peptídeo para uso em uma vacina contra o câncer pode ser qualquer peptídeo adequado. Em particular, pode ser adequado um peptídeo de 9-meros ou de 7-meros ou 8-meros ou 10-meros ou 11-meros ou um peptídeo de 12-meros, 13-meros, 14-meros ou 15meros. Peptídeos mais longos também podem ser adequados, porém, peptídeos de 9-meros ou 10-meros como descrito nas tabelas anexas 1 e 2, são os preferidos para peptídeos MHC da classe I, enquanto 12-meroes a 15meros são preferidos para peptídeos MHC da classe II.

O(s) peptídeo(s) constitui(constituem) uma vacina contra tumor ou câncer. Ela pode ser administrada diretamente ao paciente, no órgão afetado ou sistematicamente, ou aplicada ex vivo a células derivadas do paciente ou de uma linha de célula humana que subsequentemente foram administradas ao paciente, ou usadas in vitro para selecionar uma subpopulação de células imunes derivadas do paciente, que são então readministradas ao paciente.

Os peptídeos podem ser substancialmente puros, ou combinados com um adjuvante imunoestimulante (veja abaixo), ou usados em combinação com citoquinas imunoestimulantes, ou ser administrados com um sistema de administração adequado, por exemplo, lipossomas. O peptídeo também pode ser conjugado com um veículo apropriado, como o hemocianina do molusco fechadura (KLH) ou manana (ver WO 95/18145 e Longenecker et al.. (1993) Ann. NY Acad. Sei. 690,276-291). O peptídeo também pode ser marcado, ou ser uma proteína de fusão ou uma molécula híbrida. Espera-se que os peptídeos cujas sequências são dadas na presente invenção estimulem as CTL CD4 ou CD8. No entanto, a estimulação é mais eficiente quando houver ajuda por parte das células T positivas para a CD oposta. Assim, para epítopos MHC da Classe II que estimulam CTL CD4, o parceiro de fusão ou secções de uma molécula híbrida adequada proporciona epítopos que estimulam as células T CD8 positivas. Por outro lado, para epítopos

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MHC da Classe I que estimulam CTL CD8, o parceiro de fusão ou secções de uma molécula híbrida adequada proporciona epítopos que estimulam as células T CD4 positivas. Os epítopos que estimulam as CD4 e CD8 são bem conhecidos no estado da técnica, e incluem aqueles identificados na presente invenção.

Para se obter uma resposta imune, geralmente é necessário incluir excipientes que tornam a composição mais imunogênica. Assim, em uma modalidade preferida da invenção, a composição farmacêutica ainda pode incluir pelo menos um adjuvante adequado.

Adjuvantes são substâncias que não reforçam ou potencializam especificamente a resposta imune (por exemplo, respostas imunes mediadas por CTLs e células T auxiliares (T_H)) para um antígeno, e terão, portanto, de ser considerados úteis para o medicamento da presente invenção. Adjuvantes adequados incluem, mas não estão limitados a, 1018 ISS, sais de alumínio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870, 893, CpG7909, cyaa, dSlim, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, Lipovac, MF59, monofosforilo lipídio A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-CE, ONTAK, PepTel® vector system, micropartículas PLG, resiquimodo, SRL172, virossomos e outros vírus como partículas, YF 17D, armadilha VEGF, R848, beta-glucanas, Pam3Cys, stimulon QS21 Áquila (Aquila Biotech, Worcester, MA, E.U.A.), que é derivado de saponina, extratos de micobactérias e mímicas de parede de célula bacteriana sintética assim como outros adjuvantes proprietários, tal como o Ribi's Detox. Quil ou Superfos. Adjuvantes, tais como Freund's ou GM-CSF são preferidos. Vários adjuvantes imunológicos (por exemplo, MF59) específicos para células dendríticas e suas preparações foram descritos anteriormente (Dupuis M, Murphy TJ, Higgins D, Ugozzoli M, van Nest G, Ott G, McDonald DM; Dendritic cells internalize vaccine adjuvant after intramuscular injection; Cell Immunol. 1998; 186(1): 18-27; Allison AC; The mode of action of immunological adjuvants; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11). Também é possível utilizar citoquinas. Várias citocinas foram diretamente suspeitas em influenciar a migração den

54/93 drítica para os tecidos linfóides (por exemplo, TNF-U), acelerando assim a maturação de células dendríticas em células eficientes que contêm antígeno para linfócitos T (por exemplo, a GM-CSF, IL-1 e IL -4) (U.S. Pat. No. 5,849,589, especificamente incorporadas aqui por referência na sua totalidade), e atuando como imunoadjuvantes (por exemplo, IL-12) (Gabrilovich Dl, Cunningham HT, Carbone DP; IL-12 and mutant P53 peptide-pulsed dendritic cells for the specific immunotherapy of câncer; J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418).

Oligonucleótidos imunoestimulatórios CpG também foram relatados para melhorar os efeitos de adjuvantes na elaboração de uma vacina. Sem ser vinculada por teoria, CpG oligonucleótidos atuam através da ativação do sistema imunitário do inata (não-adaptativo), através de receptores do tipo Toll (TLR), principalmente TLR9. Ativação TLR9 de CpG disparado aumenta as respostas humorais e celulares específicas do antígeno para uma ampla variedade de antígenos, incluindo antígenos de peptídeo ou proteína, vírus vivos ou mortos, vacinas de células dendríticas, vacinas celulares autólogas e polissacarídeos conjugados em ambas as vacinas, profiláticas e terapêuticas. Mais importante é o fato que ela reforça a maturação e diferenciação de células dendríticas, resultando em uma maior ativação de células T_Hi e em uma forte geração de linfócitos T citotóxicos (CTL), mesmo na ausência da ajuda de células T CD4. O viés de TH1 induzida por estimulação de TLR9 é mantida mesmo na presença de adjuvantes de vacina, tais como alumínio ou adjuvante incompleto de Freund (IFA) que, normalmente, promove um viés de TH2. Oligonucleótidos CpG mostram uma atividade ainda maior de adjuvante quando formulado ou coadministrado com outros adjuvantes ou em formulações como as micropartículas, nanopartículas, emulsões lipídicas ou formulações similares, que são especialmente necessárias para induzir uma resposta forte quando o antígeno é relativamente fraco. Eles também aceleram a resposta imune e permitem as doses de antígeno a serem reduzidas por aproximadamente duas ordens de magnitude, com respostas comparáveis de anticorpo para a vacina de dose integral sem CpG em algumas experiências (Arthur M. Krieg, Therapeutic potential of Toll

55/93 like receptor 9 activation, Nature Reviews, Drug Discovery, 2006, 5, 471484). U. S. Pat. No. 6,406,705 B1 descreve o uso combinado de CpG oligonucleotídeos, adjuvantes de ácido não nucleico e um antígeno para induzir uma resposta imune específica do antígeno. Uma CpG TLR9 antagonista disponível no comércio é a dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) por Mologen (Berlim, ALEMANHA), que é um componente preferido da composição farmacêutica da presente invenção. Outras moléculas que se ligam a TLR, como a TLR 7, TLR 8 e / ou TLR 9 que se ligam ao RNA também podem ser utilizadas.

Outros exemplos de adjuvantes úteis incluem, mas não estão limitados a CpGs quimicamente modificados (por exemplo, CpR, Idera), Poly(l:C) (p. ex. polyl:C12U) Poly(l:C), DNA ou RNA não-CpG bacteriano, bem como pequenas moléculas e anticorpos imunoativos tais como imidazoquinolinas, ciclofosfamida, sunitiniba, bevacizumab, celebrex, NCX-4016, o sildenafil, tadalafil, vardenafil, sorafenib, XL-999, CP-547632, pazopanib, ZD2171, AZD2171, ipilimumab, tremelimumab e SC58175, que podem agir terapeuticamente e/ou como um adjuvante. As quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção podem ser facilmente determinadas pelo artesão qualificado sem experimentação.

Adjuvantes preferidos são dSLIM, BCG, QK432, imiquimod, PeviTer e Juvlmmune.

Em uma variante preferida, a composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é selecionado dentre o grupo de fatores estimulantes de colônias, tais como o fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF, sargramostim).

Em uma variante preferida, a composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é imiquimod.

A composição é usada para administração parenteral, como por exemplo, por via subcutânea, intradérmica ou intramuscular ou para administração oral. Para isso, os peptídeos e outras moléculas opcionais são dissolvidos ou suspensos em veículo em forma farmacêutica aceitável, de preferência em forma aquosa. Além disso, a composição pode conter excipientes,

56/93 tais como tampões, agentes de ligação, agentes desintegrantes, diluentes, flavorizantes, lubrificantes, etc.. Os peptídeos também podem ser administrados juntamente com substâncias imunoestimulantes tais como as citoquinas. Uma relação completa de excipientes utilizáveis nessa composição pode ser obtida, por exemplo, de A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^a ed., 2000, da American Pharmaceutical Association e da imprensa farmacêutica. A composição pode ser usada para a prevenção, profilaxia e/ou terapia de doenças adenomatosas ou cancerígenas, de preferência o CRC.

Células T citotóxicas (CTLs) reconhecem um antígeno na forma de um limite peptídico a uma molécula MHC antes do próprio antígeno estranho intacto. A molécula MHC em si, está localizada na superfície celular de uma célula apresentando antígeno. Assim, uma ativação de CTLs é só possível se um complexo trimérico de antígeno peptídico, molécula MHC e APC estiver presente. Correspondentemente, ela pode aumentar a resposta imunológica se não apenas o peptídeo for usado para a ativação de CTLs mas, se adicionalmente, APCs forem adicionadas com a respectiva molécula MHC.

Portanto, em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção contém adicionalmente pelo menos uma célula apresentadora de antígeno.

A célula apresentadora de antígeno (ou célula estimulador) normalmente tem uma molécula MHC de classe I ou II em sua superfície e em uma encarnação é bastante incapaz de se carregar com a molécula MHC de classe I ou II com o antígeno selecionado. Como descrito mais detalhadamente abaixo, a molécula MHC de classe I ou II pode ser facilmente carregada com o antígeno selecionado in vitro.

Preferivelmente, a célula mamífera carece ou tem um nível reduzido da função do transportador peptídico TAP, ou esta função foi enfraquecida. Células convenientes que carecem de transportador peptídico TAP incluem T2, RMA-S e células de drosofila. TAP é o Transportador Associado com Processamento de antígeno.

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O peptídeo humano carregando linha de célula T2 deficiente está disponível na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EUA sob o Catalogue No CRL 1992; a linha de células de drosofila Schneider está disponível no ATCC sob o Catálogo No CRL 19863; a linhagem de células RMA-S está descrita em Karre e Ljunggren (1985) J. Exp. Med. 162, 1745. Estas linhas de células podem ser usadas como APCs, e devido à falta da TAP, quase todos os peptídeos apresentados por MHC da classe I serão os peptídeos sob escrutínio externo usados para carregar as moléculas MHC de classe I vazias destas linhas celulares, logo, todos os efeitos serão claramente atribuídos aos peptídeos utilizados.

Preferivelmente, as células apresentadoras de antígenos são células dendríticas. Convenientemente, as células dendríticas são células dendríticas autólogas que são pulsadas com um peptídeo antigênico. O peptídeo antigênico pode ser qualquer peptídeo antigênico conveniente, que possa gerar uma resposta apropriada de célula T. A terapia de célula T usando células autólogas dendríticas pulsadas com peptídeos de um antígeno associado a tumor foi divulgado em Murphy et al.. (1996) The Prostate 29, 371-380 e Tjua et al. (1997) The Prostate 32, 272-278.

Assim, numa personificação preferida da invenção presente, a composição farmacêutica contendo ao menos uma célula apresentadora de antígeno é pulsada ou é carregada com o peptídeo, por exemplo, através do método do exemplo 4.

Como uma alternativa, a célula apresentadora de antígeno constitui um construto de expressão codificando o peptídeo. O polinucleotídeo pode ser qualquer polinucleotídeo conveniente e é preferido que ele seja capaz de transduzir a célula dendritica resultando assim na apresentação de um peptídeo e iniciação de imunidade.

Convenientemente, um ácido nucleico da invenção pode ser constituído em um polinucleotídeo viral ou em um vírus. Por exemplo, as células dendríticas transduzidas por adenovírus foram comprovadas em induzir uma imunidade antitumoral específica de antígeno em relação à MUC1

58/93 (veja Gongo et al.. (1997) Gene Ther. 4, 1023-1028). Semelhantemente, sistemas baseados em adenovirus também podem ser usados (veja, por exemplo, Wan et al. (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363); sistemas retrovirais podem ser usados (Specht et al. (1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221 e Szabolcs et al. (1997), transferência de sangue mediada por partículas a células dendriticas também podem ser usadas (Tuting et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707); e RNA também pode ser usado (Ashley et al. (1997) J. Exp. Med. 186, 1177 1182).

Geralmente, uma composição farmacêutica da invenção contendo (um) ácido(s) nucleico(s) da invenção pode ser administrada numa maneira semelhante daquelas contendo peptídeo(s) da invenção, por exemplo, intravenosamente, intra-arterialmente, intraperitonealmente, intramuscularmente, intradermicamente, intra-tumoralmente, por via oral, via dérmica, via nasal, via bucal, via retal, via vaginal, por inalação ou por administração tópica.

Devido a mecanismos de evasão, um tumor frequentemente desenvolve resistência à droga com a qual ele é tratado. A resistência de fármaco pode ocorrer durante o tratamento e se manifesta em metástases e tumores recorrentes. Para evitar resistência de tal fármaco, um tumor geralmente é tratado por uma combinação de fármacos e metástases, e tumores recorrentes após um período de tempo livre de doença muitas vezes exigem uma combinação diferente. Portanto, num aspecto da invenção a composição farmacêutica é administrada junto com um segundo agente anticâncer. O segundo agente pode ser administrado antes, depois ou simultaneamente com a composição farmacêutica da invenção. Uma administração simultânea pode, por exemplo, ser realizada misturando-se a composição farmacêutica da invenção com o segundo agente anticâncer, se propriedades químicas são compatíveis. Outra maneira de uma administração simultânea é a administração da composição e do agente anticâncer no mesmo dia, independentemente da via de administração de tal modo que a composição farmacêutica da invenção pode ser, por exemplo, injetada, enquanto o segundo agente anticâncer é, por exemplo, dado oralmente. A composição

59/93 farmacêutica e o segundo agente anticâncer também podem ser administrados dentro do mesmo curso de tratamento, mas em dias diferentes e/ou dentro de cursos separados de tratamento.

Outro aspecto da invenção presente fornece um método para tratar ou prevenir que um câncer em um paciente, no qual ao paciente é dada uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das composições farmacêuticas da invenção.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz será uma quantidade suficiente para induzir uma resposta imune, em particular uma ativação de uma subpopulação de CTLs. Uma pessoa habilidosa na técnica facilmente pode determinar se uma quantidade é eficaz usando métodos imunológicos normais, tal como esses fornecidos nos exemplos das especificações presentes. Outra maneira de controlar o efeito de uma certa quantidade da composição farmacêutica é observar o crescimento do tumor tratado e/ou sua recorrência.

Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, a composição farmacêutica é usada como uma vacina anticâncer.

A composição contendo peptídeos ou ácidos nucleico que codificam peptídeo também pode constituir uma vacina contra tumor ou câncer. Ela pode ser administrada diretamente ao paciente, no órgão afetado ou sistematicamente, ou aplicada ex vivo a células derivadas do paciente ou de uma linha de célula humana que subsequentemente foram administradas ao paciente, ou usadas in vitro para selecionar uma subpopulação de células imunes derivadas do paciente, que são então readministradas ao paciente.

A composição da invenção pode ser usada em um método de tratamento ou como uma vacina para câncer. O câncer pode ser da cavidade oral e faringe, câncer do aparelho digestivo, câncer de cólon, reto e ânus, câncer do trato respiratório, câncer de mama, câncer do colo do útero, vagina e vulva, câncer de corpo do útero e ovário, câncer do trato genital masculino, o cancro do aparelho urinário, o câncer de ossos e tecidos moles, e sarcoma de Kaposi, melanoma da pele, melanoma ocular, e não o câncer melanoma ocular, o câncer de cérebro e sistema nervoso central, o câncer

60/93 de tireóide e outras glândulas endócrinas, linfoma de Hodgkin, Linfoma nãoHodgkin, mieloma e, de preferência câncer renal, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer gástrico, câncer de cérebro, GIST ou glioblastoma.

Na modalidade mais preferida do método de tratamento ou vacina de acordo com a invenção, a vacina é uma vacina contra tumores múltiplos peptídeos para o tratamento do carcinoma colorretal. Preferivelmente, a vacina constitui um jogo de peptídeos associados a tumor selecionados da SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 15 que foram identificados e estão localizados em células primárias de câncer colorretal. Esse conjunto inclui peptídeos HLA da classe I e classe II. O conjunto de peptídeos também pode conter pelo menos um peptídeo, tal como o antígeno do núcleo HBV, usado como um peptídeo de controle positivo e, atuando como marcador imunológico, para testar a eficiência da administração intradérmica. Em uma modalidade especial, a vacina é composta de 14 peptídeos individuais (de acordo com a SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 15), entre cerca de 1500 pg para cerca de 75 mg, de preferência entre cerca de 1000 pg para cerca de 750 pg e mais preferivelmente entre cerca de 500 pg para cerca de 600 pg, e ainda mais preferivelmente acima de cerca de 578 de cada peptídeo, que pode ser purificado por HPLC e cromatografia de troca iônica e aparecer como um pó branco a branco desbotado. O liofilizado é preferencialmente dissolvido em bicarbonato de sódio, e é utilizado para a injeção intradérmica de 30 minutos após a reconstituição em temperatura ambiente. De acordo com a presente invenção, as quantidades de peptídeos preferenciais podem variar entre cerca de 0,1 e 100 mg, de preferência entre cerca de 0,1 a 1 mg, e mais preferivelmente entre cerca de 300 pg a 800 pg por 500 pl de solução. O termo cerca terá de significar +/- 10 por cento do valor referido, exceto onde mencionado de forma diferente. O profissional habilitado saberá ajustar a quantidade efetiva de peptídeo a ser usada com base em diversos fatores tais como, por exemplo, a situação imunológica do paciente individual e/ou a quantidade de TUMAP presente em um tipo de câncer em particular. Os peptídeos da invenção presente também poderão ser fornecidos em outras

61/93 formas convenientes (soluções estéreis, etc.) ao invés de um liofilizado.

A preparação farmacêutica da invenção presente constitui peptídeos, e/ou ácido(s) nucleico(s) de acordo com a invenção, e é administrada a um paciente que sofre de uma doença cancerosa ou adenomatosa, que é associada com o respectivo peptideo ou antígeno. Por isso, uma resposta de célula T imunológica pode ser desencadeada.

Preferida é uma composição farmacêutica de acordo com a invenção, onde a quantidade de (em particular) de peptídeo(s) associado(s) a tumor, de ácido(s) nucleico(s) de acordo com a invenção ou vetor(es) de expressão de acordo com a invenção como presentes na composição é / são específica(s) de tecidos, câncer e /ou do paciente.

Em outra personificação da invenção a vacina é uma vacina de ácido nucleico. Sabe-se que a inoculação com uma vacina de ácido nucléico, como uma vacina de DNA, que codifica um polipeptídeo leva a uma resposta de célula T. Ela pode ser administrada diretamente ao paciente, no órgão afetado ou sistematicamente, ou aplicada ex vivo a células derivadas do paciente ou de uma linha de célula humana que subsequentemente foram administradas ao paciente, ou usadas in vitro para selecionar uma subpopulação de células imunes derivadas do paciente, que são então readministradas ao paciente. Se o ácido nucléico é administrado a células in vitro, pode ser útil para as células se elas forem transfectadas de forma a coexpressar citocinas imuno-estimulantes, como interleucina-2 e GM-CSF. O(s) ácido(s) nucleico(s) pode(m) ser substancialmente puros, ou combinados com um adjuvante imunoestimulante, ou usados em combinação com citoquinas imunoestimulantes, ou ser administrados com um sistema de administração adequado, por exemplo, lipossomas. A vacina de ácido nucleico também pode ser administrada com um adjuvante tal como aqueles descritos para as vacinas peptídicas acima. É preferido que a vacina de ácido nucleico seja administrada sem adjuvante.

O polinucleotídeo pode ser substancialmente puro, ou estar contido num vetor conveniente ou sistema de entrega. Vetores convenientes e sistemas de entrega incluem o viral, tal como sistemas baseados em adeno

62/93 vírus, vírus de vaccínia, retrovírus, vírus de herpes, vírus associado a adenos ou híbridos contendo elementos de mais de um vírus. Sistemas nãovirais de entrega incluem lipídios catiônicos e polímeros catiônicos e são bem conhecidos na técnica de entrega de DNA. Entrega física, tal como via um gene-arma, também pode ser usada. O peptídeo ou peptídeo codificado pelo ácido nucleico também pode ser uma proteína de fusão, por exemplo, com um epítopo de toxóide tetânico que estimule células T CD4 positivas.

Convenientemente, qualquer ácido nucleico administrado ao paciente é estéril e livre de pirógenos. DNA nu pode ser dado intramuscularmente ou intradermicamente ou subcutaneamente. Convenientemente, a vacina de ácido nucleico pode constituir qualquer meio adequado de entrega de ácido nucleico. O ácido nucléico, de preferência DNA, também pode ser entregue em um lipossoma ou como parte de um sistema de entrega de vector viral. É preferível que a vacina de ácidos nucléicos, como a vacina de DNA, seja administrada no músculo, enquanto que vacinas peptídicas sejam preferivelmente administradas s.c. ou i.d.. Também é preferível que a vacina seja administrada na pele.

Acredita-se que a absorção do ácido nucleico e a expressão do polipeptídeo codificado por células apresentadoras de antígenos profissionais, tais como células dendríticas possa ser o mecanismo do condicionamento da resposta imune, no entanto, as células dendríticas não podem ser transfectadas, mas ainda são importantes, pois podem pegar o peptídeo expresso a partir de células transfectadas no tecido (preparação-cruzada, por exemplo, Thomas AM, Santarsiero LM, Lutz ER, Armstrong TD, Chen YC, Huang LQ, Laheru DA, Goggins M, Hruban RH, Jaffee EM. Respostas de célula T CD8(+) específicas de mesotelina fornecem evidência da preparação-cruzada in vivo por células que apresentadoras de antígeno em pacientes vacinados com câncer pancreático. J Exp Med. 2004 Aug 2;200(3):297306).

A terapia de imunização de mediada por polinucleotídeo de câncer é descrita em Conry et al. (1996) Seminários em Oncologia 23, 135-147;

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Condon et al. (1996) Nature Medicine 2, 1122-1127; Gongo et al. (1997) Nature Medicine 3, 558-561; Zhai et al. (1996) J. Immunol. 156, 700-710; Graham et al. (1996) Int J. Câncer 65, 664-670; e Burchell et al. (1996) 309-313 Em: Breast Câncer, Advances in biology and therapeutics, Calvo et al. (eds), John Libbey Eurotext, todos são incorporados aqui por referência em suas respectivas totalidades.

Também pode ser útil direcionar a vacina a populações específicas de célula, por exemplo, células apresentadoras de antígenos, tanto no local da injeção, no uso de vetores direcionados, em sistemas de distribuição, ou na purificação seletiva da população como uma célula do paciente e administração ex vivo do peptídeo ou ácidos nucléicos (por exemplo, as células dendríticas podem ser classificadas conforme o descrito em Scand) Zhou et al. (1995) Blood 86, 3295-3301; Roth et al. (1996) Scand. J. Immunology 43, 646-651). Por exemplo, vetores direcionados podem incluir um promotor específico de tecido ou tumor que direciona a expressão do antígeno para um local adequado.

Finalmente, a vacina de acordo com a invenção pode ser dependente do tipo de câncer específico do qual o paciente a ser tratado sofre no momento, assim como o estado da doença, regimes anteriores de tratamento, o estado imune do paciente, e naturalmente o haplotipo HLA do paciente. Além do mais, a vacina de acordo com a invenção pode conter componentes individualizados, de acordo com necessidades particulares pessoais do paciente. Os exemplos são diferentes quantidades de peptídeos de acordo com a expressão do TAAs relacionado no paciente particular, efeitos colaterais indesejáveis devido a alergias pessoais ou outros tratamentos, e ajustes para tratamentos secundários seguindo um primeiro turno ou esquema de tratamento.

Além de ser útil para tratar o câncer, os peptídeos da invenção presente são também úteis como diagnósticos. Já que os peptídeos foram gerados de glioblastoma e, já que foi determinado que estes peptídeos não estão presentes em tecidos normais, estes peptídeos podem ser usados para diagnosticar a presença de um câncer.

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A presença de peptídeos da invenção presente em biópsias de tecido pode auxiliar um patologista em diagnóstico de câncer. Detecção de certos peptídeos da invenção por meio de anticorpos, espectrometria de massa ou outros métodos sabidos na arte podem contar ao patologista que o tecido é maligno ou inflamado ou geralmente doente. A presença de grupos de peptídeos da presente invenção pode capacitar classificação ou subclassificação de tecidos doentes.

A detecção de peptídeos da presente invenção em espécime doente de tecido pode capacitar a decisão sobre o benefício de terapias envolvendo o sistema imune, especialmente se linfócitos T são conhecidos ou esperados em ser envolvido no mecanismo de ação. Perda de expressão de MHC é um mecanismo bem descrito, no qual células malignas ou infectadas escapam imunomonitorização. Assim, presença de peptídeos da presente invenção mostra que este mecanismo não é explorado pelas células analisadas.

Os peptídeos da presente invenção podem ser usados para analisar respostas de linfócito contra esses peptídeos da presente invenção, tal como respostas de célula T ou respostas de anticorpo contra os peptídeos da presente invenção ou os peptídeos da presente invenção complexados para moléculas de MHC. Estas respostas de linfócito podem ser usadas como marcadores de prognóstico para decisão em outros passos de terapia. Estas respostas também podem ser usadas como marcadores de substituto em tentativas de imunoterapia tentando induzir respostas por meios diferentes, por exemplo, vacinação de proteína, ácidos nucléicos, materiais autólogos, transferência adotiva de linfócitos. Em cenários de terapia de gene, respostas de linfócito contra os peptídeos da presente invenção podem ser consideradas na avaliação de efeitos colaterais. Monitoração de respostas de linfócito também talvez seja uma ferramenta valiosa para exames complementares de terapias de transplante, por exemplo, para a detecção de transplante contra anfitrião e anfitrião contra doenças de transplante.

Os peptídeos da presente invenção podem ser usados para gerar e desenvolver anticorpos específicos contra complexos de MHC/peptí65/93 deos. Estes podem ser usados para terapia, atacando toxinas ou substâncias radioativas no tecido doente. Outro uso destes anticorpos pode estar atacando radionuclídeos no tecido doente para propósitos de imagens tal como PET. Este uso pode ajudar a detectar metástases pequenas ou determinar o tamanho e localização precisa de tecidos doentes. Além do mais, os peptídeos podem ser usados para verificar-se um diagnóstico de patologista sobre um câncer, com base numa amostra de biópsias.

Em outro aspecto do mesmo, a presente invenção se refere a um kit composto (a) um recipiente contendo uma composição farmacêutica, de acordo com a descrição acima, em solução ou em forma liofilizada (b) opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluente ou uma solução para a reconstituição para tal formulação liofilizada, e (c ) opcionalmente, as instruções para (i) o uso da solução, ou (ii) reconstituição e/ou uso da formulação liofilizada citada. O kit pode ainda incluir um ou mais tampões (iii), um diluente (iv), um filtro (v), uma agulha (vi), ou uma seringa (v). O recipiente deve ser de preferência uma garrafa, um frasco, uma seringa ou um tubo de ensaio, e ele pode ser um recipiente multiuso. A composição farmacêutica é, de preferência, liofilizada.

Kits da presente invenção contêm, de preferência, uma formulação liofilizada da presente invenção em um recipiente adequado assim como as instruções para a sua reconstituição e/ou utilização. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos (por exemplo, frascos de câmara dupla), seringas (por exemplo, seringas de câmara dupla) e tubos de ensaio. O recipiente pode ser formado a partir de uma variedade de materiais como vidro ou plástico. Preferencialmente, o kit e / ou o recipiente contêm instruções sobre o recipiente ou similares que indicam as direções para a reconstituição e/ou utilização. Por exemplo, o rótulo poderá indicar que a formulação liofilizada deverá ser reconstituída a concentrações de peptídeos, tal como descrito acima. O rótulo ainda pode indicar que a formulação é destinada ou apropriada para administração subcutânea.

O recipiente que detém a formulação pode ser um frasco multiuso, que permite a repetição de administrações (por exemplo, 2-6 administra

66/93 ções), da formulação reconstituída. O kit ainda pode incluir um segundo recipiente, contendo um diluente adequado (por exemplo, solução de bicarbonato de sódio).

Após a mistura do diluente e da formulação liofilizada, a concentração no final de peptídeo na formulação reconstituída é, de preferência, pelo menos, 0,15 mg/mL/peptídeo (= 75pg) e preferencialmente não superior a 3 mg/mL/peptídeo (= 1.500pg). O kit ainda pode incluir outros materiais, conforme desejado a partir de uma perspectiva comercial ou do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e suplementos de embalagem com instruções de utilização.

Kits da presente invenção podem ter um único recipiente que contém a formulação das composições farmacêuticas, segundo a presente invenção, com ou sem outros componentes (por exemplo, outros compostos ou composições farmacêuticas desses outros compostos), ou podem ter recipientes distintos para cada componente.

Preferencialmente, kits da invenção incluem uma formulação da invenção embalada para uso em combinação com a coadministração de um segundo composto (como adjuvantes (por exemplo, GM-CSF), um agente quimioterápico, um produto natural, um hormônio ou antagonista, um agente ou inibidor de antiangiogênese, um agente indutor de apoptose ou um quelante) ou uma composição farmacêutica dos mesmos. Os componentes do kit pode ser pré-complexado ou cada componente pode ser depositado separadamente em recipientes distintos antes da administração a um paciente. Os componentes do kit podem ser fornecidos em uma ou mais soluções líquidas, de preferência, uma solução aquosa, ainda mais preferencialmente, uma solução aquosa estéril. Os componentes do kit também podem ser fornecidos como sólidos, que podem ser convertidos em líquidos através da adição de solventes adequados, que devem ser fornecidos preferencialmente em um recipiente distinto.

O recipiente de um kit terapêutico pode ser um frasco, tubo de ensaio, container, garrafa, seringa, ou quaisquer outros meios de armazenamento de sólidos ou líquidos. Normalmente, quando há mais de um com

67/93 ponente, o kit deverá conter um segundo frasco ou outro recipiente, que permita separar a dosagem. O kit também pode conter um outro recipiente para um líquido farmaceuticamente aceitável. De preferência, o kit terapêutico deverá conter um aparelho (por exemplo, uma ou mais agulhas, seringas, conta-gotas, pipetas, etc), que permita a administração correta dos agentes da invenção que são componentes do presente kit.

A formulação farmacêutica da presente invenção é uma que seja adequada para a administração dos peptídeos por qualquer via aceitável, tal como a oral (entérica), nasal, oftálmica, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa ou transdérmica. De preferência a administração deve ser subcutânea e, ainda mais preferencialmente, intradérmica, que pode ser efetuada por bomba de infusão.

Deve ser entendido que as características da invenção como divulgadas e descritas aqui podem ser usadas não apenas na respectiva combinação como indicado, mas também em uma maneira singular sem partir do alcance pretendido da invenção presente. Para os fins da presente invenção, todas as referências aqui citadas passam a fazer parte integral deste documento por referência.

A invenção será agora descrita em mais detalhes por referência às seguintes figuras, a listagem de sequências, e os exemplos. Os seguintes exemplos são fornecidos apenas para propósitos ilustrativos e não têm a intenção de limitar a invenção.

Descrição curta das figuras

Figura 1: Análise de tetramer de proliferação de acionamento microsférico de tetramer ODC-001 e linfócitos CD8 + específicos de NOX001 do sangue periférico. PBMCs enriquecidos com 1 x 10⁶ CD8+ por poço de doador HD100 saudável de HI_A-A*0201+ foi estimulado semanalmente com microsferes unidas a anti-CD28 mais antígeno de alta densidade A*0201/ODC-001 (painel superior) ou anti-CD28 mais antígeno de alta densidade A*0201/NOX-001 (painel inferior). Depois de três estímulos in vitro, todas células foram manchadas com anticorpo CD8 FITC mais tetrâmeros A*0201/NOX-001 PE e A*0201/ODC-001 APC. As células são fechadas na

68/93 população de linfócito ou linfócitos CD8+ (painel direito) e números representam porcentagem de tetramer+ dentro de linfócitos CD8+.

Figura 2: Imunogenicidade in vitro de TGFBI-004, como detectada por IFNy ELISPOT depois de cinco ciclos de estimulação. As células foram preparadas e reestimuladas repetidamente com TGFBI-004 e, então, incubadas com TGFBI-004 (poços 1, 2, 3 e 4) e peptídeo irrelevante (Neg. controle), respectivamente. A análise segundo IFNy ELISPOT foi executada num Leitor ELISPOT (CTL, Cleveland, EUA). PHA-lonomicina serviu como controle positivo. Os números indicam a contagem de manchas positivas.

Figura 3: Imunogenicidade in vitro de TGFBI-004, como detectada por ICS depois de cinco ciclos de estimulação. As células foram preparadas com autólogos DCs carregados com TGFBI-004 e reestimuladas repetidamente com PBMCs autólogo mais TGFBI-004. Para a leitura, as células foram incubadas com TGFBI-004 relevante (poços 1, 2, 3 e 4) e irrelevante (Neg. controle), respectivamente. Adicionalmente ao IFNy a manchar, células também foram manchadas com CD4-FITC e anticorpos CD8-PerCP. A análise foi executada num citómetro de quatro cores FACSCalibur (BD Biosciences, Alemanha).

Figura 4: Análise de ELISPOT da produção de IFNy por linhas de células T em cima reestimulação in vitro com o peptídeo NOX-001. A. Uma linha de células T 7+ do doador HBC-154 (classificado CD8 + NOX-001 tetrâmero+); B. Uma linha de células T 7+ do doador HBC-154 (classificado CD8 + NOX-001 tetrâmero). Tipo CD8+ NOX-001 tetrâmero+ (A.) e CD8+ NOX-001 tetrâmero- (B.) células foram analisadas por IFNy ELISPOT depois de reestimulação com peptídeo irrelevante (MLA-001) (poços superiores) e relevante (NOX-001) (poços inferiores) (10 pg/ml). Os números indicam a contagem de manchas positivas.

Figura 5: Frequências de células T CD8+ específicas de CEA004 em 4 doadores saudáveis HLA-A2, após estimulação in vitro com CEA004 como determinado por análise citométrica de fluxo.

Figura 6: A afinidade de peptídeos HLA da classe I da invenção à molécula MHC codificada pelo alelo HLA-A*0201.

69/93

Exemplos

1. Síntese e estrutura

Os peptídeos foram sintetizados por síntese de fase sólida padrão e bem-estabelecida usando química de Fmoc. Depois de purificação por preparativos HPLC, procedimento de íon-intercâmbio foi executado para incorporar íons psicológicos contrários compatíveis (acetato ou cloreto). Finalmente, sólidos brancos a brancos desbotados foram obtidos depois de liofilização. Todos TUMAPs são administrados como sais de acetato exceto IMA-CCN-001 que é fornecido como sal de cloreto por razões técnicas du10 rante o procedimento industrial.

Importantemente, identidade e pureza dos peptídeos podem ser determinadas facilmente e com alta exatidão usando espectrometria de massa, análise de aminoácido e HPLC analítico. De acordo com resultados analíticos, todos os peptídeos usados para vacina IMA910 mostram a estru15 tura correta com purezas > 95%.

70/93

Tabela: Características físico-químicas de peptídeos em IMA910

71/93

Distribuição granulométrica e medição em forma de partículas das partículas obtidas após a reconstituição foram realizadas capturando-se imagens diretas de cada partícula individual no intervalo de 0,25 a 100 pm seguidos por análise de imagem Como um resultado, a maioria (> 95%) das partículas foram encontradas no alcance de 0,25 a 2.7 pm. Até agora, nenhumas diferenças importantes em tamanho e distribuição puderam ser observadas dentro de 1, 2 ou 3 horas depois da reconstituição.

2. Componentes da composição farmacêutica exemplar IMA910

IMA910 é composto de um coquetel de peptídeos associados a tumor sintéticos (TUMAPs) dos quais a maioria foi identificado em células primárias de câncer colorretal. O TUMAPs inclui 10 peptídeos de ligação HLA de classe I com a capacidade de ativar células T citotóxicas (células T CD8+) e 3 peptídeos de ligação HLA de classe II com a capacidade de ativar células auxiliares T (células T CD4+). Células T auxiliares desempenham um papel crucial na assistência da função das células T citotóxicas, liberando citocinas que aumentam a função de eliminação de células T CD8+ e também podem atuar diretamente contra as células tumorais (Knutson, KL and Disis, ML; Augmenting T helper cell immunity in câncer, Curr.Drug Targets.lmmune.Endocr.Metabol.Disord., 2005, 5, 365-371). Adicionalmente a esses 13 TUMAPs, IMA910 contém um peptídeo viral de controle.

As amostras de tecidos malignos e normais cirurgicamente retiradas de pacientes de CRC e do sangue de doadores saudáveis foram analisadas num aprimoramento progressivo:

a primeira análise de larga escala de genoma de expressão de mRNA por micromatrix foi usada para identificar genes superexpressos no tecido maligno comparado com um alcance de órgãos e tecidos normais.

Num segundo passo, ligandos HLA do material maligno foram identificados por espectrometria de massa.

Ligandos HLA subsequentemente identificados foram comparados com dados de expressão de gene. Peptídeos codificados por genes seletivamente expressos ou de superexpressos como detectados no passo 1 foram considerados candidatos TUMAPs convenientes para uma vacina de

72/93 multipeptídeo.

Uma procura de literatura foi executada identificar evidência adicional apoiando a relevância dos peptídeos identificados como TUMAPs.

Finalmente, células T CD8+ periféricas de indivíduos saudáveis foram testadas em reatividade contra os ligandos HLA associados a tumor usando-se vários imunoensaios (em ensaios de células T in vitro).

73/93

Tabela 3: Composição TUMAP IMA910.

ó [2 o c

Φ ω σ

(0 ο σ Cü çn φ ο iCO c

								ra
		E						o
		φ						Ό
		ada		φ				>
			CO s				φ 3
		3		CO				o
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		φ		Φ				O
		1		E				o.
		Φ						Φ
		Q.						o
		3 <0		3				3
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	Φ		υ				(0
o		c		φ				ra
		Φ		σ				υ
o i«J CO		E φ +*		ο <ra CO			o	CO ra E		φ CO o
CO		c		φ			ira	CO		o
Φ		Φ		3			CO	φ
ιΟ. X Φ k. Φ Q.		Ia, frequ		ra d □í o			ra > c o ra	o O CE O	CO Φ k-	o de apc	ica
2		3		E			CO	E	o	ira	c
<0 O		cél		φ o			φ 3 ra	φ o	E 3	o Ξ	φ 31 O
Ό		φ		3				3		C
ra N Έ υ 2		σ o o '5 φ	LΦ υ c «ra υ φ a	stabeleci			otilidade	stabeleci	erada err	o forte, ii	, pro-anç
ra o		3	φ			E	φ	cs	ira CO	o m
2 c φ		O c Φ E	CO o o. +5	o o o Q.			ação,	o o o Q.	o ira o ra	CO φ BQ. X	o ra i
E φ LΔ		_ra 3 σ>	CO O ♦*	Φ D <			£ o	A de	<õ o o	Φ L. Φ Q.	w c ra fc.
O		φ	3	<				<		3
CL		tu	E	H			0.	1-	α	CO	1-
					ra
				ra	T5
u					CO
Φ				3	c
Λ ra ra L-				le cél	o õ ra						Φ CO
3 Φ				o t(Q	φ k_ ra		+» 0)			T I	_ra X
				CO	υ	<	E			0.	o
O CM O	42			ade:	c o ’ϊΖ	UI o	φ c φ			Q < Z	•Ώ ra υ
E	ra			φ		IO	S)			xidase de 1	CO
o <0 <0 o E o	u ra u. 3 u O E	iclina D1		lolécula d	E φ o _c 'ü k. s	antígeno	rotoonco	lucina 1		rnitina de
υ	φ	o		2	υ	ra	CL	2		O	O
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		o		o			o	o		o	o
O O		o		o			O 1	O 1 O		o l	o 1
i		z		<			h		X	υ
CM		o		LU			LU	o		o	Q
O		υ		υ			s	2		z	o

74/93

Tabela 3: -continuação75/93

3. Apresentação de epítopos contidos nas amostras de tumor em IMA910 Preparação

Espécimes de tecido cirurgicamente retirados foram fornecidos pela Universitãtsklinik fur Allgemeine, Viszeral- und Transplantationschirurgie, Tubingen, depois do consentimento expresso por escrito ter sido obtido de cada paciente.

Isolamento de peptídeos HLA em amostras de tecido

Bacias de peptídeos HLA provenientes de amostras de tecidos congelados por choque foram obtidos por precipitação imune a partir de tecidos sólidos de acordo com um protocolo ligeiramente modificados (Falk,K., Rotzschke.O., Stevanovic.S., Jung,G. & Rammensee.H.G. Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules. Nature 1991, 351, 290-296; Seeger,F.H. et al.. O motivo peptídico HLAA*6601: predição por estrutura de bolso e verificação por análise peptídica. Immunogenetics 1999, 49, 571-576) usando o anticorpo HI_A-A*02 específico BB7.2 ou o anticorpo específico HI_A-A, -B, -C W6/32, sefarose ativada por CNBr, tratamento ácido, e ultrafiltração.

Detecção de TUMAPs por espectrometria de massa ESI de cromatografia líquida (ESI-LCMS)

Epítopos contidos em IMA910 foram sistematicamente procurados por amostras de tumores colorretais através de espectrometria de massa. As bacias peptídicas de HLA obtidas foram separadas de acordo com sua hidrofobicidade por cromatografia de fase revertida (CapLC, Waters) e os peptídeos a serem diluídos foram analisados num tempo de aceleração híbrida quádrupla ortogonal de espectrômetro de massa de voo tandem (Q-TOF Ultima, Waters) equipados com uma fonte de ESI. Bacias peptídicas foram carregadas sobre uma pré-coluna C18 para concentração e dessalinização. Depois de carregar, a pré-coluna foi colocada em linha para separação por uma coluna de microtubo capilar de sílica fundida (75 pm i.d. x 250 mm) empacotada com 5 pm de material C18 de fase revertida (Dionex). Solvente A era 4 mM de acetato/água de amônio. Solvente B era 2 mM de acetato de amônio em 80% de acetonitrila/água. Ambos solventes foram ajustados a um pH 3.0 com ácido

76/93 fórmico. Um binário gradiente de 15% a 60% B dentro de 90 minutos foi executado, aplicando um índice de fluxo de 5 μΙ/min reduzido a aproximadamente 200 nl/min por um sistema fendido. Um tubo capilar revestido de vidro dourado (PicoTip, New Objective) foi usado para introdução na fonte de micro-ESI. O tempo de integração para o analisador TOF era de 1.9 s com um atraso interscan de 0,1 s. Para detecção de peptídeos definidos, foi executado um rastreamento de alta sensibilidade neste tipo de experimentos ESI-LCMS com base nos pesos moleculares conhecidos e tempos de retenção dos peptídeos no sistema cromatográfico. Portanto, uma lista incluída contendo os valores m/z dos peptídeos previamente identificados (carregadas singularmente e/ou duplamente) foi solicitada para a seleção precursora. Subsequentemente a sequência foi revelada por deterioração induzida por colisão (ClD) na espectrometria de massa (ESI-LCMS/MS). A sequência TUMAP em questão foi assegurada por comparação do padrão de fragmentação TUMAP natural gerado com o padrão de fragmentação de um peptídeo de referência sequência idêntica sintética. A avaliação do rendimento de purificação peptídica de HLA e a reprodutibilidade do sistema analítico, inclusive estabilidade de tempo de retenção foram executadas usando-se a intensidade e o tempo de retenção de um peptídeo HLA-A*02 endógeno abundante (YLLPAIVHI de DDX5) como padrão interno. Portanto, o critério de inclusão de amostra de CRC para detecção de TUMAP previamente identificado nestes experimentos foi posto sob uma intensidade mínima de 650 contagens por escaneamento do sinal normal interno duplamente carregado (YLLPAIVHI) no experimento de LCMS/MS para assegurar um isolamento bem-sucedido de peptídeo HLA e um desempenho correto do sistema analítico.

A tabela 3 expõe os resultados de uma análise de amostras de câncer de cólon e de reto em diferentes estágios assim como metástases originadas de qualquer parte primária do tumor. Todos os TUMAPs HLAA*02 foram achados na maioria de amostras. Frequências de redetecção de TUMAPs HLA-DR são geralmente mais baixas. Isto pode ser esperado, porque para peptídeos HLA de classe II, vários variações de comprimento para cada sequência de núcleo podem existir.

77/93

Tabela 3: Redetecção de TUMAPS em amostras de CRC

TGFBI -004

1

05

ώ

03 c:

03 cz

I ! 03 c

n.a.

n.a.

1

Classe II

MMP -001

1

(D C

1

ro c

n.a.

cu c:

-----------------------------------------------1 I n.a.

+

n.a.

1--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- : n.a.

n.a.

1

rométrica de massa

CEA- 006

1

n.a.

ώ c

n.a.

n.a.

n.a.

n.a.

n.a.

n.a.

1

CEA- 004

|ΘΛΕΙΛ oeu

MUC- 001

ΙΘΛΒΙΛ OEU

espect

CCN- 001

|ΘΛΕΙΛ OEU

n análise

ODC- 001

n.a.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Φ 1 o D

PCN- 001

n.a.

+

+

1

+

+

+

+

+

1

+

+

detecta

NOX- 001

n.a.

+

+

1

+

+

+

+

+

+

i

1

ou não

TOP- 001

n.a.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

1

ectado (+)

TGFBI- 001

n.a.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

P re-det

C20- 001

n.a.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

< 2 Z) 1-

Classe

MET- 001

n.a.

1

1

+

1

1

t

+

1

1

1

+

Estágio do tu- mor

>

>

>

Localização do tumor

cólon

cólon

cólon

cólon

cólon

cólon

cólon

cólon

cólon

cólon

cólon

cólon

Massa de tumor (9)

c··

O

10,8

CM

CO

3,4

3,4

5,3

oo

CO

2,7

5,0

Amostra de CRC

CCA062

CCA740

CCA165

CCA712

CCA707

CCA718

I CCA739

CCA166

CCA734

CCA719

CCA725

Γ CCA164

O Z

04

co

LíO

CO

00

cn

O

04

78/93

Tabela 3: -conitinuação-

Λ ω

Classe II

CEA- MMP TGFBI 006 -001 -004

1 +

1

< 1

+ 1

+ +

I i Cü c ώ c ώ c

+ 1

+ 1

+ 1 1

--------------------------------------------------------------------------1-------------------------------------------------------------------------1------------------------------------------------------------------------------------33% ; 42% ! 33%

rométrica de ma:

CEA- 004

|ΘΛΒΙΛ oeu

1

MUC- 001

ΙΘΛΒΙΛ oeu

1

o Φ Q. (Λ Φ

CCN- 001

ΙΘΛΒΙΛ OBU

1

n análise

ODC- 001

n.a.

n.a.

ro c:

+

+

+

n.a.

n.a.

+

100%

φ 1 o TJ

PCN- 001

n.a.

n.a.

n.a.

+

+

+

n.a.

n.a.

l

80%

detecta

NOX- 001

n.a.

n.a.

n.a.

+

+

1

n.a.

n.a.

1

67%

ou não

TOP- 001

(ü c

n.a.

n.a.

+

+

+

n.a.

n.a.

1

b* CO

o Ό cc +·

TGFBI -001

n.a.

n.a.

n.a.

+

+

+

n.a.

n.a.

+

100%

3 re-dete<

C20- 001

n.a.

n.a.

, n.a. i_____________________________________________________________________________________1

+

+

+

i ! i n.a.

n.a.

+

100%

< S D 1-

Classe

MET- 001

n.a.

n.a.

n.a.

1

+

1

n.a.

n.a.

+

33%

Estágio do tumor

>

σ-

C^·

>

>

>

Localização do tumor

cólon

cólon

cólon

metástase de cólon

reto

1 reto

reto

reto

metástase de reto

ie amostras analisadas

Massa de tumor (g)

5,2

CO

O

3,2

3,6

3,6

4,6

CO θ'

4,8

Amostra de CRC

CCA167

CCA056

CCA305

CCA708

CCA160

CCA754

o r~- < O O

CCA171

CCA724

E φ o Ό CO

O z

CO

20

CD

00

O>

V“ CXI

Dete<

n.a. não analisado

79/93

4. Imunoqenicidade in vitro de peptídeos IMA910 MHC de classe I apresentados

Para obter informações sobre a imunogenicidade de peptídeos incluídos lem MA910, realizamos investigações com uma plataforma de estimulação in vitro bem estabelecida já descrita por (Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; 2003, Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J.lmmunol., 171, 4974-4978). Desta forma, nós poderiamos mostrar dados de imunogenicidade positiva para 10/10 peptídeos HI_A-A*0201 restritos testados contidos em IMA910, demonstrando que estes peptídeos são epítopos de célula T contra os quais a células T precursoras CD8+ existem nos seres humanos. O único outro peptídeo HLA de classe I contido em IMA910 (MUC-001) não pôde ser testado com este método, devido ao relativo baixo nível de afinidade A*0201 deste TUMAP.

Uma evidência recente desafia severamente a utilidade de CEA005 para uma vacina de câncer. Em um estudo abrangente recente (lero, M, Squarcina, P, Romero, P, Guillaume, P, Scarselli, E, Cerino, R, Carrabba, M, Toutirais, O, Parmiani, G, Rivoltini, L; LowTCR avidity and lack of tumor cell recognition in CD8(+) T cells primed with the CEA-analogue CAP1-6D peptide, Câncer Immunol Immunother. 2007 Dec; 56(12): 1979-91) os autores pela primeira vez sistematicamente caracterizaram funções efetoras de células T preparadas por CEA-005 contra a sequência CEA-004 nativa. Para um grande número de amostras de sangue de pacientes de CRC e doadores saudáveis foi observado que a preparação de célula T com CEA-005 reproduzivelmente promoveu a geração de células T de baixa afinidade com falta de capacidade de reconhecer células expressoras de CEA de carcinoma colorretal apresentando a sequência nativa. Tal reconhecimento-cruzado de baixa afinidade não-efetiva de sequências nativas pode ser um problema geral em protocolos de vacinação com peptídeos ligantes alterados, como corroborados recentemente por resultados semelhantes relatados para outro peptídeo CEA e seus agonistas alterados (Alves, PM, Viatte, S, Fagerberg,

80/93

T, Michielin, Ο, Bricard, G, Bouzourene, H, Vuilleumier, H, Kruger, T, Givel, JC, Levy, F, Speiser, DE, Cerottini, JC, Romero, P; Immunogenicity of the carcinoembryonic antigen derived peptide 694 in HLA-A2 healthy donors and colorectal carcinoma patients, Câncer Immunol. Immunother., 2007, 56, 1795-1805). Além do mais, tais resultados também foram relatados para uma sequência nativa do Melan-A/MART-1 bem estabelecida de antígeno de melanoma e seu agonista (D. Speiser, comunicação pessoal).

Ao todo, apesar da imunogenicidade geralmente reforçada de peptídeos agonistas alterados, evidências recentes sugerem que peptídeos nativos podem ser os candidatos a vacina mais atraentes devido ao reconhecimento-cruzado ineficiente da sequência nativa por células T estimuladas com agonistas alterados. Isto sugere que CEA-004 (CAP1) deve ser preferido em comparação com seus agonistas descritos em WO9919478A1, como CEA-005 (CAP1-6D) ou CAP1-6D,7I.

Aliás, dados suficientes demonstram imunogenicidade in vivo considerável da própria sequência nativa CEA-004. Em vários estudos foram observadas respostas de célula T induzidas espontaneamente contra este peptídeo entre pacientes com câncer mas não em doadores saudáveis (Nagorsen, D, Keilholz, U, Rivoltini, L, Schmittel, A, Letsch, A, Asemissen, AM, Berger, G, Buhr, HJ, Thiel, E, Scheibenbogen, C; Natural T-cell response against MHC class I epitopes of epithelial cell adhesion molecule, her-2/neu, and carcinoembryonic antigen in patients with colorectal câncer, Câncer Res. 2000, 60, 4850-4854; Weihrauch, MR, Ansen, S, Jurkiewicz, E, Geisen, C, Xia, Z, Anderson, KS, Gracien, E, Schmidt, M, Wittig, B, Diehl, V, Wolf, J, Bohlen, H, Nadler, LM; Phase l/ll combined chemoimmunotherapy with carcinoembryonic antigen-derived HLA-A2-restricted CAP-1 peptide and irinotecan, 5-fluorouracil, and leucovorin in patients with primary metastatic colorectal câncer, Clin Câncer Res. 2005, 11, 5993-6001; Babatz, J, Rollig, C, Lobel, B, Folprecht, G, Haack, M, Gunther, H, Kohne, CH, Ehninger, G, Schmitz, M, Bornhauser, M; Induetion of cellular immune responses against carcinoembryonic antigen in patients with metastatic tumors after vaccination with altered peptide ligand-loaded dendritic cells, Câncer Immunol. Immuno

81/93 ther. 2006, 55, 268-276). Além disso, as abordagens de vacinação em pacientes CRC usando-se CEA-004 ou proteína CEA demonstraram estimulação eficaz de respostas de célula T contra CEA-004 (Tsang, KY, Zaremba, S, Nieroda, CA, Zhu, MZ, Hamilton, JM, Schlom, J; Generation of human cytotoxic T cells specific for human carcinoembryonic antigen epitopes from patients immunized with recombinant vaccinia-CEA vaccine, J Natl. Câncer Inst. 1995, 87, 982-990; Morse, MA, Deng, Y, Coleman, D, Hull, S, Kitrell-Fisher, E, Nair, S, Schlom, J, Ryback, ME, Lyerly, HK; A Phase I study of active immunotherapy with carcinoembryonic antigen peptide (CAP-l)-pulsed, autologous human cultured dendritic cells in patients with metastatic malignancies expressing carcinoembryonic antigen, Clin Câncer Res. 1999, 5, 1331-1338; Zhu, MZ, Marshall, J, Cole, D, Schlom, J, Tsang, KY; Specific cytolytic T-cell responses to human CEA from patients immunized with recombinant avipoxCEA vaccine, Clin Câncer Res. 2000, 6, 24-33; Weihrauch, MR, Ansen, S, Jurkiewicz, E, Geisen, C, Xia, Z, Anderson, KS, Gracien, E, Schmidt, M, Wittig, B, Diehl, V, Wolf, J, Bohlen, H, Nadler, LM; Phase l/ll combined chemoimmunotherapy with carcinoembryonic antigen-derived HLA-A2restricted CAP-1 peptide and irinotecan, 5-fluorouracil, and leucovorin in patients with primary metastatic colorectal câncer, Clin Câncer Res. 2005, 11, 5993-6001).

Preparação in vitro de células T CD8+

Para poder executar estímulos in vitro por células artificiais apresentando antígeno (aAPC) carregadas com complexo peptídico MHC (pMHC) e anticorpo anti-CD28, em primeiro lugar isolaram-se PBMCs (células periféricas mononucleares de sangue) de camadas leuco-plaquetárias frescas HLA-A*02+ usando um agente normal para separação gradiente de densidade (PAA, Coibe, Alemanha). As camadas leuco-plaquetárias foram obtidas ou do Banco de Sangue de Tubingen ou do Katharinenhospital Stuttgart. PBMCs isolados foram incubados durante a noite em agente de célula T (TCM) para preparação em seres humanos in vitro formados por RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) suplementados com 10% de calor de soro humano AB inativado (PAA, Coibe, Alemanha), 100 U/ml de

82/93 penicilina / 100 pg/ml de estreptomicina (Cambrex, Verviers, Bélgica), 1 mM de piruvato de sódio (CC Pro, Neustadt, Alemanha) e 20 pg/ml de gentamicina (Cambrex,). Linfócitos CD8+ foram isolados usando o kit positivo de seleção CD8+ MACS (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. As células T CD8+ obtidas foram incubadas até o uso em TCM suplementados com 2.5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Alemanha) e 10 U/ml IL-2 (Chiron, Munique, Alemanha). A geração de contas revestidas com pMHC/anti-CD28, os estímulos de célula T e a revisão foram executadas como descrito anteriormente (Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 2003, 171, 4974-4978) com pequenas modificações. Em resumo, moléculas HLA-A*0201 recombinantes biotiniladas carecendo de domínio de transmembrana e biotiniladas nos términos de carboxi da corrente pesada, foram produzidas seguindo um método descrito por (Altman, JD, Moss, PA, Goulder, PJ, Barouch, DH, Heyzer-Williams, MG, Bell, Jl, McMichael, AJ, and Davis, MM; Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes, Science, 1996, 274, 94-96). O lgG2a anti-humano CD28 Ab 9.3 purificado coestimulatoriamente de rato foi(Jung, G, Ledbetter, JA, and Muller-Eberhard, HJ; Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates, Proc Natl Acad Sei USA, 1987, 84, 46114615) foi quimicamente biotinilado usando-se um Sulfo-Nhidroxissuccinimidobiotina como recomendado pelo fabricante (Perbio, Bonn, Alemanha). As contas usadas eram formadas por partículas de poliestireno revestidas com streptavidina com um tamanho de 5,60 pm (Bangs Laboratories, Illinois/EUA). A pMHC usada como controles positivos e negativos foram A*0201/MLA-001 (ELAGIGILTV peptídico de Melan-A/MART-1 modificado) e A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI de DDX5) ou A*0201/HBV-001 (FLPSDFFPSV), respectivamente.

800.000 contas / 200 pl foram revestidas em pratos de 96 poços ondulados na presença de 600 ng de biotina anti-CD28 mais 200 ng biotina

83/93 pMHC relevante (contas de alta densidade) ou 2 ng de MHC relevante mais 200 ng de MHC irrelevante (biblioteca de pMHC) (contas de baixa de densidade). Os estímulos foram iniciados em pratos de 96 poços ondulados por co-incubação de 1x10⁶ células T CD8+ com 2x10⁵ contas revestidas lavadas em 200 pl TCM suplementadas com 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) por 3-4 dias a 37° C. A metade do agente foi então trocada por TCM fresco suplementado com 80 U/ml IL-2 e a incubação foi continuada por 3-4 dias a 37° C. Este ciclo de estímulo foi executado para um total de três vezes. Finalmente, análises tetraméricas foram executadas com fluorescente de tetrâmeros MHC (produzidos como descrito por (Altman, JD, Moss, PA, Goulder, PJ, Barouch, DH, Heyzer-Williams, MG, Bell, Jl, McMichael, AJ, and Davis, MM; Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes, Science, 1996, 274, 94-96)) mais anticorpo-clone CD8-FITC clone SK1 (BD, Heidelberg, Alemanha) em um FACSCalibur de quatro cores(BD). Células específicas peptídicas foram calculadas como porcentagem de células T CD8+ totais. A avaliação de análise de tetramérica foi feita usando-se o software FCS Express (De Novo Software). Preparação in vitro de linfócitos CD8+ de tetrâmero+ específico foi detectada por cercamento apropriado e por comparação com estímulos negativos de controle. Imunogenicidade para um antígeno dado foi detectado se pelo menos um poço estimulado, avaliado in vitro proveniente de um doador saudável tenha sido encontrado contendo uma linha de célula T CD8+ após a estimulação in vitro (ou seja, este poço continha pelo menos 1% do tetrâmero+ específico entre células T CD8+ e a porcentagem de células tetrâmero+ específicas era pelo menos 10x maior do que a média dos estímulos de controle negativos).

Imunogenicidade in vitro para 10 peptídeos IMA910

Para 10/10 peptídeos HLA de classe I testados, a imunogenicidade in vitro pôde ser demonstrada pela geração de linhas de célula T específicas do peptídeo. Uma coloração representativa mostrou uma geração de linhas de células T específicas para NOX-001 e ODC-001 como mostrado na figura 1. Os resultados estão resumidos na tabela 4. O único outro peptídeo HLA de classe I contido em IMA910 (MUC-001) não pôde ser testado com

84/93 esse método, devido à afinidade relativamente baixa A*0201 deste TUMAP e, sendo assim, a realização de estimulação in vitro utilizando monômeros pMHC torna-se metodologicamente impossível.

Tabela 4: Imunogenicidade de 10 peptídeos HLA de classe I incluídos em 5 IMA910

Antígeno	Doadores positivos / doadores testados	Poços positivos / poços testados
IMA-HBV-001	7/16(44%)	10/107 (9% )
IMA-TGFBI-001	3/4 ( 75%)	4/22 ( 18%)
IMA-NOX-001	3/5 (60%)	9/60 (15%)
IMA-PCN-001	3/4 ( 75%)	4/42 ( 10%)
IMA-TOP-001	2/5 (40% )	7/72 (10%)
IMA-C20-001	1/5 (20% )	1/60 (2%)
IMA-ODC-001	1/5 (20%)	1/60 (2%)
IMA-HBV-001	2/5 (40% )	10/54 ( 19% )
IMA-CEA-004	4/4 (100%)	50/60 (83%)
IMA-CCN-001	5/5 (100% )	42/54 (78%)
IMA-MET-001	4/6 ( 67% )	30/72 (42% )

Resultados de experimentos de imunogenicidade in vitro conduzidos por immatics para 10 de 11 peptídeos HLA de classe I incluídos em IMA910 foram resumidos aqui. Resultados mostrados foram obtidos por estímulo de células CD8+ com contas de alta densidade. Como lotes de soro 10 humanos diferentes podem altamente afetar os resultados de imunogenicidade, só foram avaliados ensaios, nos quais lotes idênticos de soro foram usados juntos.

Células TIMA-CEA-004 preparadas in vitro

4/6 doadores eram avaliáveis. Em todos os quatro doadores, 15 mostrou-se com sucesso a indução da resposta das células T direcionadas a

CEA-004 sob estimulação in vitro com o CEA-004 (ver quadro e figura). Assim, o peptídeo CEA-004 provou ser um indutor potente de resposta das células T CD8+ humanas in vitro. Importantemente, CEA-004 era reproduzivelmente capaz de extrair frequências mais altas de respostas de célula T

85/93 específicas de CEA-004 em comparação com CEA-005 (83% de poços em comparação com 64% de poços, veja a Tabela 4). As frequências de células específicas CEA-004 dentro de poços positivos individuais também estavam mais altas depois que a preparação CEA-004 foi comparada com preparação CEA-005 (veja figura 5).

Resposta das células T CD8+ in vitro específicas do peptídeo proveniente de 4 doadores HLA-A*02 saudáveis determinada pela análise de citometria de fluxo

Células T CD8+ foram preparadas usando antígeno artificial apresentando células carregadas com CEA-004, CEA-005 ou peptídeo irrelevante (IMA-RSL-001), respectivamente. Depois de três ciclos de estimulação, a detecção de células peptídico-reativas foi executada por dupla coloração com CEA-004 mais CEA-005 tetrâmeros (tabela 5 A.) e com o CEA-004 mais o tetrâmero A*0201 irrelevante (tabela 5 B.). Os números indicados na tabela representam porcentagens de poços contendo ou CTLs CEA-004+ ou CEA-005+. O lote de soro humano usou para todos os experimentos era C02104-0167.

Tabela 5 A.

Estímulo antigênico	Poços com células CEA-004 + tetrâmero+
CEA-004	50/60 (83%)
CEA-005	19/72 (26%)

Tabela 5 B.

Estímulo antigênico	Poços com células CEA-004+ tetrâmeras+
CEA-004	50/60 (83%)
CEA-005	46/72 (64%)

Células T CD8+ foram isoladas dos PBMCs, preparadas in vitro usando células artificiais apresentadoras de antígeno carregadas com CEA004, RSL-001 ou peptídeo DDX5-001, respectivamente. Depois de três ciclos de estimulação, a detecção de células peptídico-reativas foi executada manchando-se com CEA-004 mais tetrâmeros peptídicos A*0201 irrelevantes. Os valores indicados acima representam as porcentagens de células CEA-004 específicas de cada poço estimulado. RSL-001 e estímulos DDX5

86/93

001 serviram como controles negativos. A figura 5 mostra as frequências de células T CD8+ específicas de CEA-004 em 4 doadores HLA-A2 saudáveis, após estimulação in vitro com CEA-004 como determinado por análise citométrica de fluxo. Os valores de limite para poços positivos são indicados para cada doador separadamente (—) e foram definidos como 10x maior do que a média dos estímulos de controle negativos e pelo menos 1%. Poços com valores de porcentagem acima do limite (> 1 %) foram considerados positivos e são representados pelos losangos cor-de-rosa, enquanto poços negativos são mostrados por losangos pretos.

5. Imunoqenicidade in vitro de peptídeos IMA910 MHC de classe II apresentados

As células T auxiliares desempenham um papel importante no apoio de CTLs para ativar e manter respostas imunes contra as células tumorais. Portanto, peptídeos MHC da classe II foram incluídos em IMA910. TGFBI-004, um dos três peptídeos da classe II contidos em IMA910, foi testado para seu potencial imunogênico in vitro e provou ser um indutor tanto de células T específicas CD4+ como de células T específicas CD8+. A geração de linfócitos T CD4+ e CD8+ funcionais foi demonstrada em experimentos utilizando estimulações realizadas em um sistema autólogo.

Princípio do teste

Preparação e expansão células humanas específicas CD4+ e CD8+ foram ensaiadas in vitro por preparação de PBMCs monócitoesgotadas com DCs autólogos e reestimulação com PBMCs autólogas. Resumidamente, para gerar células T CD4+ específicas de antígeno, PBMCs de monócitos esgotados provenientes de um doador saudável (genótipo HLA de classe I: A1/A25/B8/B18 e classe II:

DQB1*02/DQB1*06/DRB1*03/DRB1*15/DRB3/ DRB5) foram estimulados com o peptídeo-pulsante DCs autólogos e re-estimulados com PBMCs autólogos mais o peptídeo. Como um sistema de leitura para fora, a produção de IFNy após uma estimulação de curto prazo foi avaliada por ELISPOT e citometria de fluxo. Células T foram analisadas depois de oito estímulos por ELISPOT e coloração IFNy intracelular mais CD4-FITC e CD8-PerCP para

87/93 determinar a porcentagem de células produzindo IFNy em subpopulações de células T específicas. Nesta experiência, células estimuladas com peptídeo TGFBI-004 de diferentes poços foram juntadas, incubadas com peptídeo irrelevante para a leitura e executadas como controles negativos.

A geração de células de dendríticas (DCs)

DCs humanos foram obtidos de monócitos cultivados em meio DC formado por RPMI 1640-Glutamax/25mM Hepes (Invitrogen, Alemanha) suplementados com 10% de plasma autóloga //100 U/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina. Primeiramente, camada leuco-plaquetária e plasma foram obtidos por centrifugação do sangue de um doador saudável (Banco de Sangue Tubingen). PBMCs foram então isolados da camada leucoplaquetária por separação padrão gradiente de densidade (Meio de Separação Linfócito, PAA, Áustria) e ressuspensos em meio DC para determinar o número total de células. 100-120 milhões de PBMCs foram lavadas, ressuspensas em 15 ml de agente X-Vivo 20 (BioWhittaker, Bélgica) e transferidas para um frasco de cultura celular. Depois de 2 horas a 37° C, agentes contendo leucócitos periféricos de sangue (PBL) foram retirado, monócitos aderentes foram lavados duas vezes com 10 ml PBS e cultivados por 6 dias em 10 ml de agente DC com 100 ng/ml de GM-CSF e 30 ng/ml IL-4 (ImmunoTools, Alemanha) ou 20 ng/ml (R&D systems, Alemanha). Nos dias 3 e 5, 100 ng/ml GM-CSF e 30 ng/ml IL-4 (Immunotools) ou 20 ng / ml de IL-4 (R&D Systems, Alemanha) forsm adicionados. No dia 7, DCs imaturos foram ativados com 10 ng/ml de TNF-UM (R&D Systems, Alemanha) e 20 pg/ml pólo (IC) (Sigma Aldrich, Alemanha) ou 100 ng/ml LPS por 24 horas. PBMCs restante e PBLs obtidos foram distribuídos em alíquotas e congelados.

Preparação in vitro de células T específicas

Para gerar células T CD4+, 3 milhões de PBMCs/PBLs foram estimuladas com 2 χ 105 DCs autólogos. DCs foram colhidos no dia 8 (veja o capítulo 3.1, Geração de DCs). PBS com 5 mM EDTA foi usado com este propósito ganhar a maior quantidade de células possível (inclusive células aderentes). Depois que lavado com meio de DC, número de célula foi determinado. Para carregar com peptídeo, DCs foram resuspensos em 1 ml de

88/93 agente DC de e incubou com 25 pg/ml peptídeo por 2 horas a 37° C. Peptídeos usados para pulsar DCs eram TGFBI-004, Posmix (mistura de EBV e CMV peptídeos relacionados), Padre e CMV. PBMCs/PBLs autólogos foram descongelados, lavados com meio de DC (ao menos duas vezes) e banhados num prato de 24 poços a uma densidade de 3 milhões de células/ml em 1 ml. DCs carregados com peptídeo foram então adicionados (como 1 ml de suspensão contendo o peptídeo) aos PBMCs/PBLs do prato e incubado por 7 dias a 37° C. Depois da preparação, CTLs obtidos eram primeiramente reestimulados com PBMCs autólogos criopreservados e carregados com peptídeo que foram irradiados (30 Gy; Gammacell 1000 Elite, Nordion International, Canadá). 5 x 10⁵ CTLs e 2,5 x 10⁶ PBMCs foram adicionados por poço para este propósito.. Pulsação de PBMCs com peptídeo foi executada como acima mencionado (para DCs). No dia 1 depois da primeira reestimulação, IL-2 (R&D Systems, Alemanha) e IL-7 foram adicionados a uma concentração final de 2 ng/ml e 5 ng/ml, respectivamente. Depois disso, cada segundo dia e cada sétimo dia IL-2 e IL-7 foram adicionados aos agentes. A segunda reestimulação foi feita após 7 dias, mas esse peptídeo de tempo foi adicionado sozinho (sem PBMCs) às CTLs cultivadas. Reestimulações foram executadas num ciclo de 7 dias, com PBMCs carregados com peptídeo e com peptídeos sozinhos adicionados alternativamente. Análises foram executadas depois da oitava estimulação por IFNy intracelular colorada e IFNy ELISPOT.

Resultados

Foi possível preparar linhas de célula T CD4+ especificamente reagindo ao peptídeo de interesse (Figura 2 e Figura 3). As respostas de célula T puderam ser detectadas via ELISPOT em 2 de 4 linhas de célula T, ao passo que em 3 de 4 linhas de célula T específicas de TGFBI-004 IFNy produzindo células CD4+ e/ou CD8+ foram mostradas via ICS.

Assim, TGFBI-004 podia extrair respostas de célula T CD4+ e CD8+ num doador testado com o sistema experimental descrito acima. De acordo com este resultado promissor, é provável que este peptídeo seja imunogênico e tenha a capacidade de induzir respostas de célula T.

89/93

6. Validação funcional exemplificada por NQX-001 e TGFBI-001

Imunogenicidade de peptídeos incluídos na vacina IMA910 foi demonstrada in vitro, utilizando plataforma de validação TUMAP da Immatics. A indução de células T específicas é uma indicação para a capacidade de peptídeos em ativar o sistema imunológico com sucesso. Já que uma eficiente resposta imune antitumoral só é possível quando as células T ativadas são funcionais e de alta avidez, nos continuamos a investigar as TUMAPs para preparar linfócitos T de alta avidez, na sua capacidade de produzir IFNy ou de matar linhagens de células tumorais. Dois peptídeos, NOX001 e TGFBI-001, foram escolhidos para validação mais profunda devido a sua capacidade de induzir ala avidez CTLs in vitro. Nós pudemos provar que células T precursoras de alta avidez existem contra ambos peptídeos em seres humanos e que linhas de célula T CD8+ funcionais podiam ser geradas por NOX-001.

Princípio do teste

Para obter uma visão adicional sobre a imunogenicidade de peptídeos IMA910 e sobre as propriedades das células T específicas, dois peptídeos, NOX-001 e TGFBI-001, foram selecionados para avaliação mais aprofundada. As experiências representadas com este propósito foram conduzidas pela immatics (classificação de célula foi executada na Universidade de Tubingen, laboratório do Dr. Buhring).

Dependendo da sua capacidade de ser ativada por antígeno de alta ou baixa densidade, linhas de célula T podem ser divididas em alta ou baixa avidez. Como foi mostrado anteriormente (Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 2003, 171, 4974-4978), CTLs humanas de alta-avidez podem ser criadas com êxito usando-se menos peptídeo para ativação se comparado com células T CD8+ de baixa avidez. Também foi demonstrado que as células que expandiram desta maneira são mais eficientes em reconhecer tumor do que linhas de célula expressando antígeno, por meio disso constituindo uma possível fer90/93 ramenta importante no desenvolvimento de estratégias de terapia.

Para poder determinar a capacidade de peptídeos em gerar linhas CTL de alta-avidez, células CD8+ humanas isoladas foram preparadas e expandidas por estímulos repetidos in vitro com contas revestidas com anticorpo pMHC de baixa densidade (complexo peptídeo MHC) e anti-CD28 na presença de IL-12 e IL-2. Depois de três estímulos, uma fração in vitro de células T preparadas foram coloradas com tetrâmero pMHC e detectadas por análise citométrica. Células de tetrâmeros positivos provenientes de cada doador foram juntadas posteriormente de acordo com a especificidade de antígeno, coloradas com tetrâmero pMHC e anticorpo humano anti-CD8FITC e, finalmente, submetidas a uma classificação de FACS num FACSAria. Células classificadas forram cultivadas e expandidas na presença de células irradiadas alimentadoras, citocinas e mitógenos. Como uma leitura para a geração de células injetadas específicas antígeno e de alta avidez, coloração de tetrâmero pMHC foi executada. Para determinar sua funcionalidade, a produção de IFNy foi ensaiada por ELISPOT e a eliminação de linhas de célula de tumor foi examinada usando um ensaio de citotoxicidade baseado em colorir viva/morta depois de reestimulação das células com o peptídeo correspondente e linhas de célula de tumor.

A geração de linhas de célula T CD8+ específicas

Estimulações in vitro usando células artificiais apresentando antígeno (aAPC) carregadas com complexo de peptídeo-MHC (pMHC) e anticorpo anti-CD28 foram conduzidas como detalhado acima. A única diferença ao método descrito foi o fato que estimulações foram executadas com contas revestidas com 2 ng de (pMHC) MHC relevante mais 200 ng de (pMHC) MHC irrelevante livrário (contas de baixa densidade) em vez de 200 ng MHC relevante (contas de alta densidade). Assim, predominantemente células T de alta avidez foram geradas para validação mais profunda de peptídeos. Depois de três estimulações, uma fração de células T preparadas in vitro foram coloradas com tetrâmero pMHC e detectadas por análise citométrica. Imunogenicidade para um antígeno dado foi detectado se pelo menos um poço estimulado, avaliado in vitro proveniente de um doador saudável tenha

91/93 sido encontrado contendo uma linha de célula T CD8+ após a estimulação in vitro (ou seja, este poço continha pelo menos 1% do tetrâmero específico + entre células T CD8+ e a porcentagem de células tetrâmero+ específicas era pelo menos 10x maior do que a média dos estímulos de controle negativos). Células de tetrâmeros positivos provenientes de cada doador foram juntadas posteriormente de acordo com a especificidade de antígeno, coloradas com tetrâmero pMHC correspondente e clone SK1 anticorpo humano anti-CD8FITC e, finalmente, submetidas a uma classificação de FACS num FACSAria (BD Biosciences, Alemanha). Células classificadas foram cultivadas em meio de célula T (RPMI-Glutamax suplementado com soro humano inativado AB 10% de calor, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, 1 mM de sódio piruvato e 20 pg/ml de gentamicina) na presença de 5 x 105 células / ml PBMCs irradiadas frescas alogênicas, 5 x 104 células / ml de células LG2-EBV irradiadas, 150 U/ml IL-2 (Chiron, Munique, Alemanha) e 0,5 pg/ml PHA-L (Roche Diagnostics, Mannheim, Mannheim, Alemanha). A expansão destas células ocorreu em meio de célula T contendo 150 U/ml IL-2. Como uma leitura para a geração de células injetadas específicas antígeno e de alta avidez, coloração de tetrâmero pMHC foi executada, foi executada como descrito acima e analisada num FACSCalibur de quatro cores (BD Biosciences, Alemanha).

Testes de funcionalidade

Para determinar sua funcionalidade, produção de IFNy foi avaliada por ELISPOT (Conjunto IFNy da ELISPOT, BD, Alemanha) depois de reestimulação das células com o peptídeo correspondente. Além disso, a citotoxicidade mediada por células LTC específicas foi investigada através de eliminação de linhagens de células tumorais utilizando o kit de citotoxicidade VIVO/MORTO mediado por células (L7010, Invitrogen, Alemanha). Ambos os ensaios foram executados de acordo com instruções do fabricante, exceto o anotado contrariamente.

Resultados

Ambos os peptídeos, NOX-001 e TGFBI-001, foram imunogênicos in vitro como mostrado por preparação com sucesso com aAPCs de bai

92/93 xa densidade pMHC. Para NOX-001 assim como para TGFBI-001 linhas específicas de célula T puderam ser estabelecidas por FACS, demonstrando assim que alta-avidez de célula T CD8+ precursoras existem em doadores saudáveis.

Adicionalmente, para NOX-001, uma linha de célula T pôde ser estabelecida, que também provou ser funcional por ELISPOT desde que estava expressando especificamente IFNy depois de re-estimulação com este peptídeo (fig. 4).

7. A ligação de peptídeos restringidos a HLA de classe I da invenção a HLAA*0201

O objetivo desta análise era avaliar a afinidade da classe de peptídeos HLA de classe I à molécula MHC codificada pelo alelo HLAA*0201, pois isto é um parâmetro importante para o modo de ação de IMA910. As afinidades para HLA-A*0201 foi elevada para 9 de 10 peptídeos restringidos a HLA de classe I em IMA910, dissociações constantes (KD) permanecendo na faixa de 0.001 a 0.2 nM. Também o marcador viral peptídico IMA-HBV-001 mostrou ligação forte. A afinidade para IMA-MUC-001 era aproximadamente duas décadas mais fraca. Estes resultados confirmaram a afinidade comprometedora forte de 9 entre 10 peptídeos restringidos a HLA de classe I do candidato à vacina IMA910 para moléculas MHC.

Princípio do teste

Complexos HLA/peptídeo estáveis consistem em três moléculas: HLA de corrente pesada, beta-2 microglobulina (b2m) e o ligando peptídico. A atividade de moléculas de corrente pesada do recombinante desnaturado HLA-A*0201 sozinhos podem ser conservadas, fazendo delas os equivalentes funcionais das moléculas HLA-A*0201 vazias. Quando diluídas em tampões aquosos contendo b2m e um peptídeo apropriado, estas moléculas dobram rapidamente e eficientemente numa maneira inteiramente dependente de peptídio. A disponibilidade destas moléculas é usada num ensaio baseado em ELISA para medir a afinidade de interação entre peptídeo e molécula HLA da classe de I (Sylvester-Hvid et al.., 2002).

Moléculas purificadas HLA-A*0201 de recombinante foram incu93/93 badas juntos com doses b2m e graduadas do peptídeo de interesse. A quantidade de complexos HLA/peptídeo dobrados em de novo foi determinada por ELISA quantitativa. As constantes de dissociação (valores K_D) foram calculadas, usando-se uma curva padrão registrada de diluições de um com5 plexo HLA/peptídeo calibrante.

Resultados

Os resultados são mostrados na figura 6. Um valor Kd mais baixo reflete maior afinidade para HLA-A*0201. A maioria dos peptídeos IMA910 e o peptídeo de controle viral IMA-HBV-001 tinham afinidades simila10 res e fortes para HLA-A * 0201 dentro do intervalo de 0,001 (IMA-TGFBI001) a 0,2 nM (IMA-ODC-001). A afinidade de IMA-MUC-001 era aproximadamente duas a três décadas mais baixas em comparação com a maioria dos ligandos incluídos. No entanto, a vacinação com IMA-MUC-001 levou a respostas imunológicas em pacientes com carcinoma de células renais em 15 um primeiro ensaio clínico realizado por immatics, sendo assim, a menor afinidade de ligação do IMA-MUC-001 não dá motivo para preocupação.

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Peptídeo, caracterizado pelo fato de ser um peptídeo compreendendo a sequência SEQ ID No. 8 (SPQYSWRINGIPQQHT) que induz células T de reação cruzada com o dito peptídeo, sendo que o dito peptídeo ou variante tem um comprimento total de entre 16 e 100 aminoácidos.
2. 2. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o dito peptídio ou variante ter um comprimento total de entre 16 e 30 aminoácidos.
3. 3. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ter a capacidade de se ligar a uma molécula do complexo de histocompatibilidade humano (MHC) principal classe-ll.
4. 4. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de consistir de uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID No. 8.
5. 5. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   5, caracterizado pelo fato de incluir ligações não-peptídicas.
6. 6. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   5, caracterizado pelo fato de ser parte de uma proteína de fusão, compreendendo aminoácidos N-terminais da cadeia invariante (li) associada a antígeno HLA-DR.
7. 7. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de codificar para um peptídeo como definido em uma das reivindicações 1 a 6.
8. 8. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ser DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA ou suas combinações, ou um vetor de expressão, sendo que o dito vetor está operavelmente ligado ao dito ácido nucleico.
9. 9. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compreender um ácido nucleico ou um vetor de expressão como definido na reivindicação 7 ou 8, célula essa que é uma célula que apresenta antígeno, em particular uma célula dendrítica ou célula que apresenta antígeno em que a dita célula não é uma célula-tronco embriônica humana.
10. 10. Método in vitro para produzir linfócitos T citotóxicos (CTL) a2/2 tivados, método esse caracterizado pelo fato de compreender colocar-se CTL em contato in vitro com moléculas MHC humanas classe I ou II carregadas com antígeno, expressas sobre a superfície de uma célula adequada que apresenta antígeno, por um período de tempo suficiente para ativar os ditos CTL em uma maneira específica de antígeno, sendo que o dito antígeno é um peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
11. 11. Linfócitos T citotóxicos (CTL) ativados, produzidos pelo método definido na reivindicação 12, caracterizados pelo fato de reconhecerem seletivamente uma célula que expressa aberrantemente um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
12. 12. Uso de um peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, de um ácido nucleico ou de um vetor de expressão como definido na reivindicação 7 ou 8, de uma célula como definida na reivindicação 10, ou de um linfócito T citotóxico ativado como definido na reivindicação 11, caracterizado pelo fato de ser como um medicamento para o tratamento de câncer.
13. 13. Uso de um peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, de um ácido nucleico ou de um vetor de expressão como definido na reivindicação 7 ou 8, de uma célula como definida na reivindicação 10, ou de um linfócito T citotóxico ativado como definido na reivindicação 11, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento utilizável para o tratamento de câncer.
14. 14. Uso de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de o dito câncer ser um câncer de glioblastoma, um câncer coloretal, um câncer pancreático, um câncer pulmonar, um câncer renal ou um câncer gástrico.
15. 15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de o dito medicamento ser uma vacina.