CN112834678A - 一种检测血清中11种抗肿瘤药物浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测血清中11种抗肿瘤药物浓度的方法，属于血液检测技术领域。该方法采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的11种抗肿瘤药物浓度，先利用超高效液相色谱将待测物与血清基质分离，再利用质谱内标定量法，计算11种抗肿瘤药物的含量。本发明的方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，6.5分钟之内即可完成血清中11种抗肿瘤药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上血清中11种抗肿瘤药物的定量分析，为临床上11种抗肿瘤药物浓度监测提供简单快速的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于血液检测技术领域，具体涉及一种检测血清中11种抗肿瘤药物浓度的方法。
背景技术
目前，恶性肿瘤是威胁人类生命健康的重大疾病之一，该疾病具有高发病率、高致死率等特点。上个世纪70年代我国癌症发病率、死亡率较高的是胃癌、食管癌、肝癌、宫颈癌、肺癌，90年代肝癌和肺癌上升到前几位。近年来，根据对华北、东北、华东、华中、华南、西南、西北7个大区的统计，我国肿瘤发病率前10名是男性的肺、胃、肝脏、食管癌等，女性的乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胃癌等。而且随着人口的老龄化，我国癌症发病率逐渐增高，癌症是我国居民目前第一死因，不仅对健康构成重大威胁，还对经济社会发展造成严重负担。由于癌症的高发病率，导致药物的联合使用也越来越多，因此，癌症药物的血药浓度监测意义重大。
卡培他滨适用于晚期原发性或转移性乳腺癌，口服后经肠黏膜迅速吸收，然后在肝脏被羧基酯酶转化为无活性的中间体5'-脱氧-5'氟胞苷，以后经肝脏和肿瘤组织的胞苷脱氨酶的作用转化为5'-脱氧-5'氟尿苷，最后在肿瘤组织内经胸苷磷酸化酶催化为氟尿嘧啶(5-FU)而起作用。阿法替尼是新一代口服小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，是首个不可逆ErbB家族阻滞剂，可作用于包括EGFR在内的整个ErbB家族，与第一代可逆的EGFR TKI不同的是，阿法替尼会不可逆地与EGFR结合，从而达到关闭癌细胞信号通路、抑制肿瘤生长的目的。他莫昔芬为合成的抗雌激素药物。结构类似雌激素，能与雌二醇竞争雌激素受体，与雌激素受体形成稳定的复合物，并转运入核内，阻止染色体基因开放，从而使癌细胞的生长和发育受到抑制。吉非替尼是一种口服表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFR-TK)抑制剂(属小分子化合物)，对EGFR-TK的抑制可阻碍肿瘤的生长、转移和血管生成，并增加肿瘤细胞的凋亡。伊马替尼，酪氨酸激酶抑制剂，是一种小分子蛋白激酶抑制剂，它具有阻断一种或多种蛋白激酶的作用，临床用于治疗慢性髓性白血病和恶性胃肠道间质肿瘤。舒尼替尼是一种新型多靶向性的治疗肿瘤的口服药物，用于治疗对标准疗法没有响应或不能耐受之胃肠道基质肿瘤和转移性肾细胞癌。厄洛替尼是一种靶向治疗药物，可特异性地针对肿瘤细胞作用，抑制肿瘤的形成和生长，通过抑制酪氨酸激酶的活性的方式来抑制肿瘤生长，酪氨酸激酶是EGFR细胞内的重要组成部分之一，试用于两个或两个以上化疗方案失败的局部晚期或转移的非小细胞肺癌的三线治疗。盐酸埃克替尼是我国首个小分子靶向抗癌药，是一种高效特异性的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，适用于晚期非小细胞肺癌二线治疗。阿帕替尼适用于晚期胃腺癌或胃-食管结合部腺癌患者三线及三线以上治疗。克唑替尼是一种酪氨酸激酶受体抑制剂，包括ALK、肝细胞生长因子受体(HGFR，c-Met)、ROS1(c-cos)和RON，易位可促使ALK基因引起致癌融合蛋白的表达，ALK融合蛋白形成可引起基因表达和信号的激活和失调，进而促使表达这些蛋白的肿瘤细胞增殖和存活。
目前针对抗肿瘤药物浓度检测的方法主要为高效液色谱-串联质谱法，如专利CN108828077A公开了一种同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒及其检测方法与应用，该方法有一定的缺陷：首先，只检测了一种药物与其代谢产物，由于病人大多数都会与其他药物联合用药，其临床意义有限；其次，该方法中卡培他滨的定量下线高，对用药指导有一定的局限性。再比如一篇名为“An LC-MS/MS method for rapid and sensitivehigh-throughput simultaneous determination of various protein kinaseinhibitors in human plasma”的文章，该文章基于LC-MS/MS检测了人血浆种5种蛋白激酶抑制剂药物，该方法的样本用量为300μL，且前处理采用较为复杂的液液萃取法，即便如此，阿法替尼的定量下限是5ng/mL，而临床上阿法替尼给药后的谷浓度低于5ng/mL，因此在临床上应用非常有限。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种简单、高效且可靠的血清中11种抗肿瘤药物浓度的检测方法，相比已有的检测方法，更能满足临床应用的需求。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测血清中11种抗肿瘤药物浓度的方法，将待测血清样本进行预处理后，先利用超高效液相色谱将待测物与血清基质分离，再利用质谱内标定量法，根据已经建立的校准曲线，计算得到11种抗肿瘤药物的含量；
所述预处理是向待测血清样本中加入含内标的蛋白沉淀剂，经振荡、离心后取上清，所述蛋白沉淀剂为甲醇与乙腈的混合溶液，甲醇与乙腈体积比为1:1～3；
所述校准曲线是以标准品与内标物的浓度比为X轴、标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立；
所述11种抗肿瘤药物为：卡培他滨(CPT)、阿法替尼(AFT)、他莫昔芬(TMX)、吉非替尼(GFT)、伊马替尼(IMT)、舒尼替尼(SNT)、厄洛替尼(ELT)、N-去乙基舒尼替尼(NSNT)、盐酸埃克替尼(ICT)、阿帕替尼(APT)和克唑替尼(CZP)；
所采用的色谱条件如下：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A为0.01％～0.2％甲酸和1mM～3mM乙酸铵水溶液的混合溶液，流动相B为乙腈；
色谱柱为Phenomenex Kinetex XB-C18，型号为3.0×50mm,2.6μm；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，流动相A和流动相B的初始比例为85～100:25～0，梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85～100:25～0匀速渐变至70:30，在1.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98，在3.0-4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持为2:98，在4.0-6.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98变至初始比例，每个样品采集时间为6.5分钟；
流速为0.2～0.4mL/min，柱温为40～50℃，进样体积为0.2～2μL；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为3.0kV(ESI+)；干燥气温度为300℃；雾化气压力为45psi，鞘气温度350℃，鞘气流速11L/min。
进一步地，所述11种抗肿瘤药物对应的内标物为：卡培他滨-d11(CPT-d11)、阿法替尼-d6(AFT-d6)、他莫昔芬-d5(TMX-d5)、吉非替尼-d3(GFT-d3)、伊马替尼-d8(IMT-d8)、舒尼替尼-d4(SNT-d4)、N-去乙基舒尼替尼-d5(NSNT-d5)、阿帕替尼-d8(APT-d8)和克唑替尼-d5(CZP-d5)。
进一步地，所述流动相A为0.1％甲酸和2mM乙酸铵水溶液的混合溶液，流动相B为乙腈，流动相A和流动相B的初始比例为99:1。
进一步地，所述流速为0.3mL/min，柱温为45℃，进样体积为1μL。
进一步地，所述蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为1:2。
进一步地，所述预处理的具体过程是：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂，振荡3～10min，在12000～15000r/min，4～20℃离心4～10min后，取上清。
进一步地，所述含内标的蛋白沉淀剂是将20μL内标溶液加入至19.98mL蛋白沉淀剂中后得到，所述内标溶液中内标物的浓度为：卡培他滨-d11 1000ng/mL、阿法替尼-d65000ng/mL、他莫昔芬-d5 500ng/mL、吉非替尼-d3 2000ng/mL、伊马替尼-d8 5000ng/mL、舒尼替尼-d4 400ng/mL、N-去乙基舒尼替尼-d5 400ng/mL、阿帕替尼-d8 2000ng/mL和克唑替尼-d5 2000ng/mL。
采用本发明的技术方案，优势如下：
本发明提供一种检测血清中11种抗肿瘤药物浓度的方法，灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，6.5分钟之内完成血清中11种抗肿瘤药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上血清中11种抗肿瘤药物的定量分析，为临床上11种抗肿瘤药物浓度监测提供简单快速的检测方法。
附图说明
图1为11种抗肿瘤药物标准品的提取离子流谱图。
图2为血清中11种抗肿瘤药物的提取离子流谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测检测血清中11种抗肿瘤药物浓度的方法，血清样本通过预处理后，振荡、离心后取上清进样，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的11种抗肿瘤药物浓度，先利用超高效液相色谱将待测物与血清基质分离，再利用质谱内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算11种抗肿瘤药物的含量。
所述11种抗肿瘤药物为：卡培他滨(CPT)、阿法替尼(AFT)、他莫昔芬(TMX)、吉非替尼(GFT)、伊马替尼(IMT)、舒尼替尼(SNT)、厄洛替尼(ELT)、N-去乙基舒尼替尼(NSNT)、盐酸埃克替尼(ICT)、阿帕替尼(APT)和克唑替尼(CZP)；
所述11种抗肿瘤药物对应的内标物为：卡培他滨-d11(CPT-d11)、阿法替尼-d6(AFT-d6)、他莫昔芬-d5(TMX-d5)、吉非替尼-d3(GFT-d3)、伊马替尼-d8(IMT-d8)、舒尼替尼-d4(SNT-d4)、N-去乙基舒尼替尼-d5(NSNT-d5)、阿帕替尼-d8(APT-d8)和克唑替尼-d5(CZP-d5)。
具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.01％～0.2％甲酸，1mM～3mM乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Phenomenex Kinetex XB-C18(3.0×50mm,2.6μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，所述流动相A和流动相B的初始比例为85～100:25～0；所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85～100:25～0匀速渐变至70:30；在1.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98；在3.0-4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持为2:98，在4.0-6.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98变至初始比例，每个样品采集时间为6.5分钟；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为3.0kV(ESI+)；干燥气温度为300℃；雾化气压力为45psi，鞘气温度350℃，鞘气流速11L/min；同时监测了各目标物及其对应内标。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸和乙酸铵，可有效提高目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血清中11种抗肿瘤药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，6.5分钟之内完成11种抗肿瘤药物的分离和检测。在一种优选方案中，流动相A为0.01％～0.2％甲酸，1mM～3mM乙酸铵水溶液，在不影响本发明效果的情况下，优选地，流动相A为0.1％甲酸，2mM乙酸铵水溶液。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用乙腈和0.01％～0.2％甲酸，1mM～3mM乙酸铵水溶液作为流动相，色谱柱型号为Phenomenex Kinetex XB-C18(3.0×50mm,2.6μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强，准确度和精密度基本满足要求。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明采用同位素内标，内标和待测物具有相同化学性质和基质效应，测定血清中的11种抗肿瘤药物浓度时的重现性、准确度均较好。
在一种优选方案中，流动相A和流动相B的初始比例为85～100:25～0。进一步优选地，流动相A和流动相B的初始比例为99:1。
在一种优选方案中，流速为0.2～0.4mL/min，优选为0.3mL/min。
进一步地，柱温为40～50℃，优选为45℃。
在一种方案中，进样体积为0.2～2μL，优选为1μL。
在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的11种抗肿瘤药物时，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.1％甲酸，2mM乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Phenomenex Kinetex XB-C18(3.0×50mm,2.6μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，所述流动相A和流动相B的初始比例为99:1；所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由99:1匀速渐变至70:30；在1.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98；在3.0-4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持为2:98，在4.0-6.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98变至初始比例，每个样品采集时间为6.5分钟；梯度洗脱方式具体见表1；流速为0.3mL/min，柱温为45℃，进样体积为1μL。
表1流动相梯度洗脱参数
| 时间(min) | 流速(mL/min) | ％A | ％B | Curve |
| 0.0 | 0.3 | 99 | 1 | - |
| 1.0 | 0.3 | 70 | 30 | 6 |
| 3.0 | 0.3 | 2 | 98 | 6 |
| 4.0 | 0.3 | 2 | 98 | 6 |
| 6.5 | 0.3 | 99 | 1 | 1 |
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为3.0kV(ESI+)；干燥气温度为300℃；雾化气压力为45psi，鞘气温度350℃，鞘气流速11L/min；同时监测了各目标物及其对应内标；质谱源参数如表2所示，同时监测了各目标物及其对应内标，各个目标物的质谱参数见表3。
表2质谱源参数
| 项目 | 参数 |
| 毛细管电压(kV) | 3.0 |
| 干燥气温度(℃) | 300 |
| 雾化器压力(psi) | 45 |
| 鞘气温度(℃) | 350 |
| 鞘气流速(L/min) | 11 |
表3 11种抗肿瘤药物检测质谱参数
本发明提及的血清为人或动物的血清。
本发明提及的经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清中加入含内标的蛋白沉淀剂，再振荡离心取上清液上机。其中含内标的蛋白沉淀剂是由内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，内标溶液与蛋白沉淀剂的体积比为0.1～0.3:19.9～19.7。所述蛋白沉淀剂为甲醇与乙腈混合溶液；优选地，蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈体积比为1:1～3；更优选地，蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为1:2。
在一种优选方案中，本发明提及的经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标工作的蛋白沉淀剂，振荡3～10min，在12000～15000r/min，4～20℃离心4～10min后，取上清到进样瓶中，待进样；所述蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为1:2。
在一种更优选方案中，本发明提及的经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比为1:2),振荡5min，在14000r/min，15℃离心5min后，取上清60μL到进样瓶中，进样1μL。
在一种方案中，本发明提及的含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：
以甲醇水配制如下内标母液：阿法替尼-d6 1mg/mL、阿帕替尼-d8 1mg/mL、吉非替尼-d3 1mg/mL、伊马替尼-d8 1mg/mL、舒尼替尼-d4 0.1mg/mL、N-去乙基舒尼替尼-d50.1mg/mL、他莫昔芬-d5 0.1mg/mL、卡培他滨-d11 0.1mg/mL和克唑替尼-d5 1mg/mL；
移取内标母液：阿法替尼-d6 2.5μL、阿帕替尼-d8 1μL、吉非替尼-d3 1μL、伊马替尼-d8 2.5μL、舒尼替尼-d4 2μL、N-去乙基舒尼替尼-d5 2μL、他莫昔芬-d5 2.5μL、卡培他滨-d11 5μL和克唑替尼-d5 1μL；再加入至480.5μL甲醇水中得到500μL标准储备溶液；
取20μL上述内标溶液加入至19.98mL蛋白沉淀剂中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
在一种方案中，上述蛋白沉淀剂为甲醇与乙腈混合溶液；优选地，蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为1:1～3。更优选地，蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为1:2。
在一种优选方案中，本发明提及的含内标的蛋白淀剂按照如下方法制备：
以甲醇水配制如下内标母液：以甲醇水配制如下内标母液：阿法替尼-d6 1mg/mL、阿帕替尼-d8 1mg/mL、吉非替尼-d3 1mg/mL、伊马替尼-d8 1mg/mL、舒尼替尼-d4 0.1mg/mL、N-去乙基舒尼替尼-d5 0.1mg/mL、他莫昔芬-d5 0.1mg/mL、卡培他滨-d11 0.1mg/mL和克唑替尼-d5 1mg/mL；
移取内标母液：阿法替尼-d6 2.5μL、阿帕替尼-d8 1μL、吉非替尼-d3 1μL、伊马替尼-d8 2.5μL、舒尼替尼-d4 2μL、N-去乙基舒尼替尼-d5 2μL、他莫昔芬-d5 2.5μL、卡培他滨-d11 5μL和克唑替尼-d5 1μL；再加入至480.5μL甲醇水中得到500μL标准储备溶液。
取20μL上述内标溶液加入至19.98mL蛋白沉淀剂中，即得含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈为1:2)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。其中，蛋白沉淀剂中包含：阿法替尼-d65ng/mL、阿帕替尼-d8 2ng/mL、吉非替尼-d3 2ng/mL、伊马替尼-d8 5ng/mL、舒尼替尼-d40.4ng/mL、N-去乙基舒尼替尼-d5 0.4ng/mL、他莫昔芬-d5 0.5ng/mL、卡培他滨-d11 1ng/mL和克唑替尼-d5 2ng/mL。
在一种更优选方案中，本发明提及的含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：
分别以50％甲醇水配制内标母液，移取标准品母液至480.5μL 50％甲醇水中，混匀得到500μL内标溶液，取20μL上述混合内标溶液加入至19.98mL甲醇与乙腈混合溶液(甲醇与乙腈的体积比为1:2)中，即得含内标的蛋白沉淀剂，浓度参下表4。建议分装冻存在-80℃冰箱，即取即用。
表4含内标的蛋白沉淀剂配制
在一种方案中，本发明提及的标准品按照如下方法制备：
配制成如下浓度的标准品母液：阿法替尼0.1mg/mL、阿帕替尼0.1mg/mL、吉非替尼5mg/mL、盐酸埃克替尼2mg/mL、克唑替尼0.1mg/mL、伊马替尼2mg/mL、舒尼替尼0.1mg/mL、N-去乙基舒尼替尼0.1mg/mL、厄洛替尼2mg/mL、他莫昔芬2mg/mL和卡培他滨2mg/mL；
移取标准品母液：阿法替尼20μL、阿帕替尼40μL、吉非替尼4μL、盐酸埃克替尼5μL、克唑替尼50μL、伊马替尼10μL、舒尼替尼20μL、N-去乙基舒尼替尼20μL、厄洛替尼20μL、他莫昔芬10μL和卡培他滨5μL；再加入至296μL甲醇水中得到500μL标准储备溶液。
将上述混合标准储备溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
阿法替尼、舒尼替尼和N-去乙基舒尼替尼的七个浓度点为依次为：0.4ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL；
阿帕替尼的七个浓度点为依次为：0.8ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、200ng/mL、400ng/mL；
克唑替尼的七个浓度点为依次为：1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL；
盐酸埃克替尼和卡培他滨的七个浓度点为依次为：2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL；
吉非替尼、伊马替尼和他莫昔芬的七个浓度点为依次为：4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL；
厄洛替尼的七个浓度点为依次为：8ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、2000ng/mL、4000ng/mL。
在一种优选方案中，空白血清基质为不含目标药物的空白血清。
在一种优选方案中，标准品溶液按照如下方法制备：
移取11种抗肿瘤药物的标准品母液，再加入至296μL 50％甲醇水中得到500μL标准储备溶液，浓度参下表5。
表5标准品储备溶液
本发明将标准品储备液以空白血清基质(不含目标药物的空白血清)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：
取10μL标准储备液加入至190μL空白血清基质中作为第一个高值浓度点；取50μL第一高值浓度点用50μL空白血清基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用5倍体积空白血清基质稀释得第七高值浓度点。
本发明采用梯度稀释法进行标曲配制，从-80℃冰箱取出标准溶液后，涡旋10s，2min内使用标准溶液配制标曲最高浓度点，配制好后-80℃保存，具体过程如下表6。
表6标曲配制
| 标曲 | 移取溶液(μL) | 空白血清基质(μL) |
| S7 | 混合标准储备溶液10 | 190 |
| S6 | S7 50 | 50 |
| S5 | S7 20 | 180 |
| S4 | S6 20 | 180 |
| S3 | S5 20 | 180 |
| S2 | S4 20 | 180 |
| S1 | S3 25 | 125 |
七个不同校准品样本每个浓度点取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比为1:2),振荡5min，在14000r/min，15℃离心5min后，取上清60μL到进样瓶中，进样1uL。
本发明还包括制备质控品，其中，质控品为含有11种抗肿瘤药物的空白血清，分低、中、高三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)；
QC(L)为上述标准储备溶液以空白血清基质稀释至5000倍。
QC(M)为上述标准储备溶液以空白血清基质稀释至500倍。
QC(H)为上述标准储备溶液以空白血清基质稀释至50倍。
优选地，空白血清基质为不含目标药物的空白血清。
在一种优选方案中，质控品按照如下方法制备：取上述标准储备溶液以不含目标药物的空白血清配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体见表7所示。
表7质控品对应浓度(单位：ng/mL)
QC(L)中包含：阿法替尼0.8ng/mL、阿帕替尼1.6ng/mL、吉非替尼8ng/mL、盐酸埃克替尼4ng/mL、克唑替尼2ng/mL、伊马替尼8ng/mL、舒尼替尼0.8ng/mL、N-去乙基舒尼替尼0.8ng/mL、厄洛替尼16ng/mL、他莫昔芬8ng/mL、卡培他滨4ng/mL。
QC(M)中包含：阿法替尼8ng/mL、阿帕替尼16ng/mL、吉非替尼80ng/mL、盐酸埃克替尼40ng/mL、克唑替尼20ng/mL、伊马替尼80ng/mL、舒尼替尼8ng/mL、N-去乙基舒尼替尼8ng/mL、厄洛替尼160ng/mL、他莫昔芬80ng/mL、卡培他滨40ng/mL。
QC(H)中包含：阿法替尼80ng/mL、阿帕替尼160ng/mL、吉非替尼800ng/mL、盐酸埃克替尼400ng/mL、克唑替尼200ng/mL、伊马替尼800ng/mL、舒尼替尼80ng/mL、N-去乙基舒尼替尼80ng/mL、厄洛替尼1600ng/mL、他莫昔芬800ng/mL、卡培他滨400ng/mL。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
一、实验材料与仪器
1.材料
样本来自于南京鼓楼医院2019年10月份门诊收集的血清样本。
(1)仪器：Qlife Lab 9000plus三重四级杆质谱仪(品生医学)；Qlife Lab 9000超高效液相色谱系统(配G7167A自动进样器，品生医学)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
(2)试剂耗材：MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；MS级乙酸铵(Sigma，美国)色谱柱型号：Phenomenex Kinetex XB-C18(3.0×50mm,2.6μm)。
(3)标准品：标准品及其对应的内标物，见下表8。
表8标准品和内标
| 序号 | 中文名称 | 厂家 |
| 1 | 卡培他滨(CPT) | TRC |
| 2 | 卡培他滨-d11(CPT-d11) | TRC |
| 3 | 阿法替尼(AFT) | TRC |
| 4 | 阿法替尼-d6(AFT-d6) | TRC |
| 5 | 他莫昔芬(TMX) | TRC |
| 6 | 他莫昔芬-d5(TMX-d5) | TRC |
| 7 | 吉非替尼(GFT) | TRC |
| 8 | 吉非替尼-d3(GFT-d3) | TRC |
| 9 | 伊马替尼(IMT) | TRC |
| 10 | 伊马替尼-d8(IMT-d8) | TRC |
| 11 | 舒尼替尼(SNT) | TRC |
| 12 | 舒尼替尼-d4(SNT-d4) | TRC |
| 13 | 厄洛替尼(ELT) | TRC |
| 14 | N-去乙基舒尼替尼(NSNT) | TRC |
| 15 | N-去乙基舒尼替尼-d5(NSNT-d5) | TRC |
| 16 | 阿帕替尼-d8(APT-d8) | TRC |
| 17 | 盐酸埃克替尼(ICT) | zzstandard |
| 18 | 阿帕替尼(APT) | 中检所 |
| 19 | 克唑替尼(CZP) | 阿拉丁 |
| 20 | 克唑替尼-d5(CZP-d5) | isoreag |
(4)质控品：含有11种抗肿瘤药物的空白血清，分低、中、高三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体见表7所示。
二、液质条件
(1)色谱条件：流动相A：0.1％甲酸，2mM乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈。色谱柱型号：Phenomenex Kinetex XB-C18(3.0×50mm,2.6μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.3mL/min，柱温为45℃，进样体积为1μL。
(2)在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为3.0kV(ESI+)；干燥气温度为300℃；雾化气压力为45psi，鞘气温度350℃，鞘气流速11L/min；同时监测了各目标物及其对应内标；质谱源参数如表2所示，同时监测了各目标物及其对应内标，各个目标物的质谱参数见表3。
三、实验过程
(1)标准品配制：
将11种抗肿瘤药物配制成如下浓度的标准品母液：阿法替尼0.1mg/mL、阿帕替尼0.1mg/mL、吉非替尼5mg/mL、盐酸埃克替尼2mg/mL、克唑替尼0.1mg/mL、伊马替尼2mg/mL、舒尼替尼0.1mg/mL、N-去乙基舒尼替尼0.1mg/mL、厄洛替尼2mg/mL、他莫昔芬2mg/mL和卡培他滨2mg/mL；
移取标准品母液：阿法替尼20μL、阿帕替尼40μL、吉非替尼4μL、盐酸埃克替尼5μL、克唑替尼50μL、伊马替尼10μL、舒尼替尼20μL、N-去乙基舒尼替尼20μL、厄洛替尼20μL、他莫昔芬10μL和卡培他滨5μL；再加入至296μL50％甲醇水中得到500μL标准储备溶液。详见表5。
将上述标准储备溶液以空白血清基质(不含目标药物的空白血清)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，详见表6，所述校准品溶液的七个浓度点为：
阿法替尼、舒尼替尼和N-去乙基舒尼替尼的七个浓度点为依次为：0.4ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL；
阿帕替尼的七个浓度点为依次为：0.8ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、200ng/mL、400ng/mL；
克唑替尼的七个浓度点为依次为：1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL；
盐酸埃克替尼和卡培他滨的七个浓度点为依次为：2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL；
吉非替尼、伊马替尼和他莫昔芬的七个浓度点为依次为：4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL；
厄洛替尼的七个浓度点为依次为：8ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、2000ng/mL、4000ng/mL。
(2)含内标的蛋白沉淀剂配制
配制如下内标母液：阿法替尼-d6 1mg/mL、阿帕替尼-d8 1mg/mL、吉非替尼-d31mg/mL、伊马替尼-d8 1mg/mL、舒尼替尼-d4 0.1mg/mL、N-去乙基舒尼替尼-d5 0.1mg/mL、他莫昔芬-d5 0.1mg/mL、卡培他滨-d11 0.1mg/mL和克唑替尼-d5 1mg/mL；
移取内标母液：阿法替尼-d6 2.5μL、阿帕替尼-d8 1μL、吉非替尼-d3 1μL、伊马替尼-d8 2.5μL、舒尼替尼-d4 2μL、N-去乙基舒尼替尼-d5 2μL、他莫昔芬-d5 2.5μL、卡培他滨-d11 5μL和克唑替尼-d5 1μL；再加入至480.5μL。得到500μL标准储备溶液，其中阿法替尼-d6 5000ng/mL、阿帕替尼-d8 2000ng/mL、吉非替尼-d3 2000ng/mL、伊马替尼-d85000ng/mL、舒尼替尼-d4 400ng/mL、N-去乙基舒尼替尼-d5 400ng/mL、他莫昔芬-d5500ng/mL、卡培他滨-d11 1000ng/mL和克唑替尼-d5 2000ng/mL。
取20μL上述混合内标溶液加入至19.98mL蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈为1:2)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。其中，蛋白沉淀剂中包含：阿法替尼-d6 5ng/mL、阿帕替尼-d8 2ng/mL、吉非替尼-d3 2ng/mL、伊马替尼-d8 5ng/mL、舒尼替尼-d4 0.4ng/mL、N-去乙基舒尼替尼-d50.4ng/mL、他莫昔芬-d5 0.5ng/mL、卡培他滨-d11 1ng/mL和克唑替尼-d5 2ng/mL。
(3)质控品配制：
取上述标准储备溶液以不含目标药物的空白血清配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体如表7所示。
QC(L)中包含：阿法替尼0.8ng/mL、阿帕替尼1.6ng/mL、吉非替尼8ng/mL、盐酸埃克替尼4ng/mL、克唑替尼2ng/mL、伊马替尼8ng/mL、舒尼替尼0.8ng/mL、N-去乙基舒尼替尼0.8ng/mL、厄洛替尼16ng/mL、他莫昔芬8ng/mL、卡培他滨4ng/mL。
QC(M)中包含：阿法替尼8ng/mL、阿帕替尼16ng/mL、吉非替尼80ng/mL、盐酸埃克替尼40ng/mL、克唑替尼20ng/mL、伊马替尼80ng/mL、舒尼替尼8ng/mL、N-去乙基舒尼替尼8ng/mL、厄洛替尼160ng/mL、他莫昔芬80ng/mL、卡培他滨40ng/mL。
QC(H)中包含：阿法替尼80ng/mL、阿帕替尼160ng/mL、吉非替尼800ng/mL、盐酸埃克替尼400ng/mL、克唑替尼200ng/mL、伊马替尼800ng/mL、舒尼替尼80ng/mL、N-去乙基舒尼替尼80ng/mL、厄洛替尼1600ng/mL、他莫昔芬800ng/mL、卡培他滨400ng/mL。
(4)样品处理
1)标准品处理：七个不同校准品样本每个浓度点取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比为1:2),振荡5min，在14000r/min，15℃离心5min后，取上清60μL到进样瓶中，进样1μL。
2)血清样品前处理：取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比为1:2),振荡5min，在14000r/min，15℃离心5min后，取上清60μL到进样瓶中，进样1μL。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血清样品前处理一致，此处不再赘述。
四、方法验证
1.提取离子流色谱图：11种抗肿瘤药物的标准品和血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为11种抗肿瘤药物标准品提取离子流谱图，图2为血清中11种抗肿瘤药物提取离子流谱图。
2.校准曲线：采用内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。11种抗肿瘤药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表9。
表9 11种抗肿瘤药物线性回归方程及线性相关系数
| 序号 | 化合物 | 保留时间(min) | 线性范围(ng/mL) | 线性方程 | 相关系数(r) |
| 1 | CPT | 2.38 | 2-1000 | Y＝0.0320653X-0.000255631 | 0.9999 |
| 2 | NSNT | 2.14 | 0.4-200 | Y＝0.303602X+0.00287262 | 1.0000 |
| 3 | TMX | 2.96 | 4-2000 | Y＝0.00998427X+0.00125094 | 0.9997 |
| 4 | ICT | 2.17 | 2-1000 | Y＝0.00329827X+0.000402538 | 0.9993 |
| 5 | ELT | 2.29 | 8-4000 | Y＝0.00278333X+0.0041508 | 0.9987 |
| 6 | APT | 2.49 | 0.8-400 | Y＝0.022791X-0.000140478 | 0.9999 |
| 7 | SNT | 2.22 | 0.4-200 | Y＝0.0388942X-5.34357*10^-5 | 0.9999 |
| 8 | GFT | 1.86 | 4-2000 | Y＝0.00523359X+0.000739265 | 0.9992 |
| 9 | CZP | 1.91 | 1-500 | Y＝0.0282835X+0.000904958 | 0.9999 |
| 10 | AFT | 1.92 | 0.4-200 | Y＝0.0653094X-0.00071353 | 1.0000 |
| 11 | IMT | 2.01 | 4-2000 | Y＝0.00422609X-0.00111276 | 0.9999 |
3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血清样品，分别加入低、中、高3个浓度的混合标准品，以相同步骤重复处理测定5次，结果显示，11种抗肿瘤药物的加标回收率在96.16％-107.13％之间，5次重复试验的RSD在1.45％-6.68％范围，统计结果见表10。
表10 11种抗肿瘤药物添加回收率结果
4.精密度试验：取无干扰空白血清样本，加入不同浓度的11种抗肿瘤药物标准品标准品，得到低、中、高三个浓度血清样本，一天内重复处理6批，连续处理三天，以内标法定量测定11种抗肿瘤药物的浓度，批内精密度为2.34％～13.90％，三日内分3批处理，计算批间精密度为0.38％～7.78％，结果见表11。
表11批内及批间精密度试验结果
本发明采用ID-HPLC-MS/MS方法测定了人体血清中的11种抗肿瘤药物的浓度。同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，与此同时，采用内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。
以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，11种抗肿瘤药物的加标回收率为加标回收率在90.63％-107.13％之间，5次重复试验的RSD在1.45％-8.55％，准确度良好。
方法的重现性结果表明，11种抗肿瘤药物的批内精密度为2.34％～13.90％，批间精密度为0.38％～13.49％。且建立的血清样品前处理过程非常简单，血清用量仅50μL。
总之，本发明的检测方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，6.5分钟之内可完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血清中11种抗肿瘤药物浓度的定量分析，为临床上11种抗肿瘤药物浓度治疗监测提供一种可靠的检测方法。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (7)
1.一种检测血清中11种抗肿瘤药物浓度的方法，其特征在于：将待测血清样本进行预处理后，先利用超高效液相色谱将待测物与血清基质分离，再利用质谱内标定量法，根据已经建立的校准曲线，计算得到11种抗肿瘤药物的含量；
所述预处理是向待测血清样本中加入含内标的蛋白沉淀剂，经振荡、离心后取上清，所述蛋白沉淀剂为甲醇与乙腈的混合溶液，甲醇与乙腈体积比为1: 1~3；
所述校准曲线是以标准品与内标物的浓度比为X轴、标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立；
所述11种抗肿瘤药物为：卡培他滨、阿法替尼、他莫昔芬、吉非替尼、伊马替尼、舒尼替尼、厄洛替尼、N-去乙基舒尼替尼、盐酸埃克替尼、阿帕替尼和克唑替尼；
所采用的色谱条件如下：
（1）超高效液相色谱条件：
流动相A为0.01%~0.2%甲酸和1mM~3mM乙酸铵水溶液的混合溶液，流动相B为乙腈；
色谱柱为Phenomenex Kinetex XB-C18，型号为3.0×50 mm, 2.6µm；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，流动相A和流动相B的初始比例为85~100:25~0，梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85~100:25~0匀速渐变至70:30，在1.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98，在3.0-4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持为2:98，在4.0-6.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98变至初始比例，每个样品采集时间为6.5分钟；
流速为0.2~0.4mL/min，柱温为40~50℃，进样体积为0.2~2µL；
（2）质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为3.0kV ESI+；干燥气温度为300℃；雾化气压力为45 psi，鞘气温度350℃，鞘气流速11L/min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述11种抗肿瘤药物对应的内标物为：卡培他滨-d11、阿法替尼-d6、他莫昔芬-d5、吉非替尼-d3、伊马替尼-d8、舒尼替尼-d4、N-去乙基舒尼替尼-d5、阿帕替尼-d8和克唑替尼-d5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流动相A为0.1%甲酸和2mM乙酸铵水溶液的混合溶液，流动相B为乙腈，流动相A和流动相B的初始比例为99:1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流速为0.3mL/min，柱温为45℃，进样体积为1µL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛋白沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比为1:2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述预处理的具体过程是：取50 μL血清于1.5 mL离心管中，向其中加入200 μL含内标的蛋白沉淀剂，振荡3~10 min，在12000~15000r/min，4~20℃离心4~10 min后，取上清。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含内标的蛋白沉淀剂是将内标溶液加入至蛋白沉淀剂中后得到，内标溶液与蛋白沉淀剂的体积比为 0.1~0.3 : 19.9~19.7；所述内标溶液中内标物的浓度为：卡培他滨-d11 1000 ng/mL、阿法替尼-d6 5000 ng/mL、他莫昔芬-d5 500 ng/mL、吉非替尼-d3 2000 ng/mL、伊马替尼-d8 5000 ng/mL、舒尼替尼-d4400 ng/mL、N-去乙基舒尼替尼-d5 400 ng/mL、阿帕替尼-d8 2000 ng/mL和克唑替尼-d52000 ng/mL。
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