CN110045048B - 一种测定人血浆中两种抗肿瘤药物浓度的hplc-msms方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定人血浆中两种抗肿瘤药物及代谢产物和代谢酶活性相关内源性物质浓度的方法，包括预处理及分别以伏立康唑和溴尿嘧啶为内标，经预处理后样本均使用高效液相色谱分离上清液中的药物成分，然后使用高分辨质谱多反应监测模式进行药物靶向性检测，并进行定量，实现对血浆中两种抗肿瘤药物及代谢产物和代谢酶活性相关内源性物质浓度进行分析测定。本方法在具有快捷性的同时，兼具极高的靶向性，表现出快速、高通量、高灵敏度、特异性强、精密度和准确度良好、稳定性好、提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应等优点。本方法可用于临床上伊立替康及其代谢产物和氟尿嘧啶及其代谢酶活性相关内源性物质的血药浓度监测。
Description
技术领域
本发明涉及血药监测技术领域，具体地说，是一种测定人血浆中两种抗肿瘤药物及代 谢产物和代谢酶活性相关内源性物质浓度的HPLC-MSMS方法。
背景技术
临床上常使用伊立替康联合氟尿嘧啶和亚叶酸钙作为结直肠癌的一线用药。临床应用 实践中发现，患者对氟尿嘧啶的耐受存在明显的差异，而其用药后毒副反应轻重与患者体 内氟尿嘧啶代谢相关的二氢嘧啶脱氢酶(DPD)活性相关。DPD酶活性可通过测定人体内 源性尿嘧啶(U)及二氢尿嘧啶(UH2)的浓度，并计算其比值UH2/U得出。
伊立替康(CPT-11)是一种半合成喜树碱衍生物，其在体内经羧酸酯酶代谢成主要活 性代谢产物7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)，SN-38活性比CPT-11强100-1000倍。SN-38经肝脏尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶生成葡萄糖醛酸化SN-38(SN-38G)。当SN-38G分泌 进入肠道，肠道中β-葡萄糖醛酸酶又使之变回SN-38，存在肝肠循环。故伊立替康的药物 不良反应与SN-38及SN-38G血药浓度密切相关。
为了保证治疗效果和避免毒副反应，临床上需监测伊立替康、SN-38、SN-38G、氟尿嘧啶血药浓度并测定内源性尿嘧啶及二氢尿嘧啶，以制定个体化给药方案。
迄今为止，研究人员通过不同方法分别测定上述两种抗肿瘤药物及代谢产物和两种内 源性物质的浓度，方法主要包括高效液相色谱法和质谱法。这些方法检测标准不统一，方 法不一致，导致同一患者同一份血浆样品可能需要用不同方法甚至用不同仪器进行检测。 不仅增加了工作量浪费了实验资源，还浪费了大量患者血样，增加了患者等待时间。
因此，有必要建立一种能够同时应用于上述两种药物及其代谢产物和两种内源性物质 的方法，以减少实验成本、降低临床样本使用量以及减少患者等待时间。同时，有利于不 同检测点或者实验室的数据互相参考和使用。
文献：氟尿嘧啶血药浓度检测方法的建立及其临床应用(何光照1，2薛宏波1杨全良 1毕延智1雷凯2张程亮2(1.常州市肿瘤医院，江苏常州213032；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部))记载了一种氟尿嘧啶血药浓度检测方法，通过使用AgelaInnovalNH2色谱柱(2.1mm×50mm，5μm)，使用甲醇-超纯水(2∶98)为流动相等度 洗脱，流速为0.3ml·min－1，柱温为40℃。5-Fu和内标5-溴尿嘧啶在负离子电喷雾电离 模式下的定量离子对分别为m/z128.8→42.1和m/z188.6→42.1(内标5-溴尿嘧啶)。根 据“生物样品定量分析方法验证指导原则(中国药典2015年版四部)”对该方法进行验证。 结果:5-Fu浓度在10～1000ng·ml－1范围内线性良好，定量下限为10ng·ml－1。在线性 范围内精密度、准确度、基质效应、稳定性均符合生物样品分析的要求。但该文献记载的 方法仅能用于监测血药中氟尿嘧啶的浓度，且最终的数据结果表明，该方法测得效果没有 本发明的方法测得的效果佳。本发明的方法具有靶向性高、快速、高通量、高灵敏度、特 异性强、精密度和准确度良好、稳定性好、提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应的 优点。可用于临床上伊立替康及其代谢产物和氟尿嘧啶及其代谢酶活性相关内源性物质的 血药浓度监测。关于本发明一种测定人血浆中两种抗肿瘤药物及代谢产物和代谢酶活性相 关内源性物质浓度的HPLC-MSMS方法目前还未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种同时检测人血浆中两种抗肿瘤药物及 代谢产物和代谢酶活性相关内源性物质浓度的LC-MS/MS检测方法，本发明检测时间短、 灵敏度高、定量准确。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
建立一种基于高效液相色谱联合质谱的检测方法，先对血浆样本进行液相分离，随后 采用质谱中的多反应监测(MRM)模式，即通过质谱中的四级杆对母离子进行选择性筛选， 筛选后的离子进入碰撞池发生碰撞碎裂，产生的碎片离子进行高分辨率扫描，然后选择特 征性二级碎片离子进行定量，能够有效地增强选择性，提高准确度、灵敏度。为临床上抗 肿瘤个体化治疗提供了可靠的实验数据，反馈异常结果，协助临床调整化疗方案，在保证 药物疗效的同时，规避不良反应的发生。
一种同时检测人血浆中两种抗肿瘤药物及代谢产物和代谢酶活性相关内源性物质浓度 的LC-MS/MS检测方法，所述两种抗肿瘤药物包括伊立替康和氟尿嘧啶；所述代谢产物包 括伊立替康的两种代谢产物7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)和葡萄糖醛酸化SN-38(SN-38G)；所述代谢酶活性相关内源性物质包括氟尿嘧啶代谢酶活性相关内源性物质：尿嘧啶和二氢尿嘧啶。所述方法包括以下步骤：
(1)求得第一标准曲线：
取空白血浆，加入药物的甲醇水溶液和内标伏立康唑的甲醇水溶液，分别制得各种药 物一系列浓度的标准曲线血浆样本；采用3倍体积的含甲酸体积分数0.1％的甲醇沉淀标准 曲线血浆样本中蛋白；再在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录标准曲线血浆样本 的色谱图，计算药物峰面积和内标峰面积的比值，然后以药物浓度为横坐标，以药物峰面 积和内标峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得回归方程即为第一 标准曲线；
其中，所述药物是指两种抗肿瘤药物中的伊立替康及其代谢产物7-乙基-10-羟基喜树碱 (SN-38)和葡萄糖醛酸化SN-38(SN-38G)，标准曲线血浆样本中各药物浓度范围如下： 伊立替康2.5-625ng/mL；SN-38：0.5-120ng/mL；SN-38G：1.0-250ng/mL；标准曲线血浆样 本中内标伏立康唑浓度为5.0ng/mL；
(2)求得第二标准曲线：
另取空白血浆，加入药物的甲醇水溶液和内标溴尿嘧啶的甲醇水溶液，分别制得各种 药物一系列浓度的标准曲线血浆样本；采用5倍体积的乙酸乙酯-异丙醇(85:15，v:v)对 其中待测成分进行提取，取上清用氮气吹干后，再用体积分数5％的甲醇水溶液和二氯甲烷 复溶；离心取上清在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录标准曲线血浆样本的色谱 图，计算药物峰面积和内标峰面积的比值，然后以药物浓度为横坐标，以药物峰面积和内 标峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得回归方程即为第二标准曲 线；
其中，所述药物是指所述两种抗肿瘤药物中的氟尿嘧啶及其代谢酶活性相关内源性物 质尿嘧啶和二氢尿嘧啶，标准曲线血浆样本中各药物浓度范围如下：氟尿嘧啶 10-1000ng/mL；尿嘧啶5-500ng/mL；二氢尿嘧啶10-1000ng/mL；标准曲线血浆样本中内标 溴尿嘧啶浓度为330ng/mL；
(3)血浆样本预处理：
取血浆样本两份，分别加入内标伏立康唑的甲醇水溶液和溴尿嘧啶的甲醇水溶液，使 内标浓度分别达到5.0ng/mL和300ng/mL，得到患者待测血浆样本；分别采用3倍体积的含 甲酸体积分数0.1％的甲醇沉淀所述患者血浆样本中蛋白以及采用5倍体积的乙酸乙酯-异丙 醇(85:15，v:v)对其中待测成分进行提取，取上清用氮气吹干后，再用体积分数5％的甲 醇水溶液和二氯甲烷复溶；再在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录血浆样本的色 谱图，计算药物峰面积和内标峰面积的比值，再根据标准曲线计算得到患者待测血浆样本 中药物浓度。
其中，液相色谱条件：Waters Atlantis T3(100mm×3.0mm，3μm)；流动相为流动相A和流动相B，流动相梯度洗脱条件见表1，进样量10μL。其中，流动相A为100％甲醇； 流动相B为体积分数为0.1％的甲酸水溶液。
表1洗脱梯度
| 时间(min) | 有机相比例(％) | 流速(mL/min) |
| 2.0 | 5 | 0.35 |
| 2.1 | 40 | 0.35 |
| 5.0 | 40 | 0.35 |
| 5.1 | 75 | 0.30 |
| 8.5 | 75 | 0.30 |
| 9.0 | 5 | 0.35 |
| 12.0 | 5 | 0.35 |
质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)，正负离子交替检测，选择多反应监测(MRM)工作方式进行一/二级质谱分析。质谱检测工作参数见表2。
表2质谱检测工作参数
| 母离子(m/z) | 子离子(m/z) | Q1(V) | CE | Q2(V) | |
| 氟尿嘧啶 | 129 | 42 | 14 | 17 | 17 |
| 二氢尿嘧啶 | 115 | 55 | -22 | -25 | -23 |
| 尿嘧啶 | 113 | 70 | -14 | -21 | -25 |
| 溴尿嘧啶 | 189 | 42 | 13 | 21 | 17 |
| 伊立替康 | 587 | 167 | -32 | -47 | -30 |
| SN-38 | 393 | 349 | -15 | -27 | -22 |
| SN-38G | 569 | 393 | -30 | -30 | -25 |
| 伏立康唑 | 350.3 | 127.1 | -11 | -38 | -21 |
在本发明的一个具体实施例中，步骤(1)中，所述标准曲线血浆样本按以下方法制得：
取90μL空白血浆，加入10μL用体积分数为50％的甲醇水稀释后的药物储备液和内标储备液，制得药物某一浓度的标准曲线血浆样本，并依此法分别制得药物的不同标准浓度的标准曲线血浆样本。其中，所述的药物储备液是以甲醇作为溶剂配制的药物浓度为1mg/mL的药物甲醇溶液；所述内标储备液是以甲醇作为溶剂配制的伏立康唑浓度为 1mg/mL的内标甲醇溶液。
所述标准曲线血浆样本中最终内标浓度为5.0ng/mL，最终伊立替康浓度为2.5ng/mL、 5.0ng/mL、12.5ng/mL、31.25ng/mL、78.125ng/mL、156.25ng/mL、312.5ng/mL、625ng/mL； SN-38浓度为0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、6.25ng/mL、15.625ng/mL、31.25ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL；SN-38G浓度为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、12.5ng/mL、 31.25ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(2)中，所述标准曲线血浆样本按以下方法制得：
取90μL空白血浆，加入10μL用体积分数为50％的甲醇水稀释后的药物储备液和内标储备液，制得药物某一浓度的标准曲线血浆样本，并依此法分别制得药物的不同标准浓度的标准曲线血浆样本。其中，所述的药物储备液是以甲醇作为溶剂配制的药物浓度为1mg/mL的药物甲醇溶液；所述内标储备液是以甲醇作为溶剂配制的伏立康唑浓度为 1mg/mL的内标甲醇溶液。
所述标准曲线血浆样本中最终内标浓度为330ng/mL，最终氟尿嘧啶浓度为10ng/mL、 20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL；尿嘧啶浓度为5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL；二氢尿嘧啶浓度为10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(1)中，用3倍体积的含甲酸体积分数0.1％的甲 醇沉淀标准曲线血浆样本中蛋白，包括：将所述标准曲线血浆样本涡旋20s，然后加入300 μL含甲酸体积分数0.1％的甲醇，涡旋1min后在4℃下13000rad/min离心5分钟，取上清液100μL置进样管中，待进样分析。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(2)中，用5倍体积的乙酸乙酯-异丙醇(85:15， v:v)对其中待测成分进行提取，取上清用氮气吹干后，再用体积分数5％的甲醇水溶液和二 氯甲烷复溶，包括：将所述标准曲线血浆样本涡旋20s，然后加入1mL乙酸乙酯-异丙醇(85:15，v:v)进行萃取，涡旋混匀5min。以13000rpm转速离心10min。取900μL上清， 转移至另一离心管中，在35℃条件下用氮气吹干后，用50μL体积分数5％的甲醇水溶液 和10μL二氯甲烷复溶，以12000rpm转速离心10min，取上清液40μL置进样管中，待进 样分析。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(3)中，分别采用3倍体积的含甲酸体积分数0.1％ 的甲醇沉淀所述患者血浆样本中蛋白以及采用5倍体积的乙酸乙酯-异丙醇(85:15，v:v) 对其中待测成分进行提取，取上清用氮气吹干后，再用体积分数5％的甲醇水溶液和二氯甲 烷复溶，包括：将一份所述患者血浆样本涡旋20s，然后加入300μL含甲酸体积分数0.1％ 的甲醇，涡旋1min后在4℃下13000rad/min离心5分钟，取上清液100μL置进样管中，待进样分析；及将另一份所述患者血浆样本涡旋20s，然后加入1mL乙酸乙酯-异丙醇(85:15， v:v)进行萃取，涡旋混匀5min。以13000rpm转速离心10min。取900μL上清，转移至另 一离心管中，在35℃条件下用氮气吹干后，用50μL体积分数5％的甲醇水溶液和10μL 二氯甲烷复溶，以12000rpm转速离心10min，取上清液40μL置进样管中，待进样分析。
在本发明的一些具体实施例中，步骤(1)和(2)中，标准曲线血浆样本的进样体积为10μL。
在本发明的一些具体实施例中，步骤(3)中，血浆样本的进样体积为10μL。
本发明优点在于：
本发明的检测方法能够有效地增强选择性，提高准确度、灵敏度，具有快捷性的同时， 兼具极高的靶向性，表现出快速、高通量、高灵敏度、特异性强、精密度和准确度良好、稳定性好、提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应的优点。为临床上抗肿瘤个体化治疗提供了可靠的实验数据，反馈异常结果，协助临床调整化疗方案，在保证药物疗效的同时，规避不良反应的发生。
附图说明
附图1是氟尿嘧啶二级离子图。
附图2是为尿嘧啶二级离子图。
附图3是为二氢尿嘧啶二级离子图。
附图4是为溴尿嘧啶二级离子图。
附图5是为伊立替康二级离子图。
附图6是为SN-38二级离子图。
附图7是为SN-38G二级离子图。
附图8是为伏立康唑二级离子图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。
实施例1
本实验采用一种基于高效液相色谱联合质谱的检测方法，先对血浆样本进行液相分离， 随后采用质谱中的多反应监测(MRM)模式，即通过质谱中的四级杆对母离子进行选择性 筛选，筛选后的离子进入碰撞池发生碰撞碎裂，产生的碎片离子进行高分辨率扫描，然后 选择特征性二级碎片离子进行定量。并根据标准曲线计算得到患者血药浓度。
一、实验仪器与试剂如下：
仪器：色谱柱：Waters Atlantis T3(100mm×3.0mm，3μm)、离心机、振荡器、WATERS2790型液质联用仪，包括WATERS2790高效液相，MICRO MASSQU ATTRO三 重四级杆质谱仪；
试剂：流动相(流动相A和流动相B，流动相A为100％甲醇；流动相B为体积分数 为0.1％的甲酸水溶液)、甲酸甲醇溶液、甲醇水溶液、内标伏立康唑样品、内标溴尿嘧啶样品、伊立替康样品、氟尿嘧啶样品。
二、实验方法：
(一)标准曲线血浆样本和质控血浆样本的制备
1.1储备液的制备
用50％甲醇水溶液作为溶剂，分别配制两种抗肿瘤药物(氟尿嘧啶、伊立替康)，两种 活性代谢产物(SN-38、SN-38G)，两种内源性物质(尿嘧啶、二氢尿嘧啶)，内标伏立康 唑和内标溴尿嘧啶的储备液，六种药物和两种内标的浓度均为1.0mg/mL；所有储备液均存 放于-20℃冰箱。
1.2标准曲线血浆样品制备
取90μL空白血浆，加入一定体积的前述的1.1项得到的药物贮备液和内标贮备液(或 者加入一定体积的用体积分数为50％的甲醇水稀释后的上述1.1项所制得的一种药物贮备 液和内标贮备液)，制得该药物某一标准浓度的标准曲线血浆样本，并依此法分别制得各种 药物的不同标准浓度的标准曲线血浆样本。标准曲线血浆样本中，最终血浆药物浓度如下 表3所示，最终内标浓度分别为5.0ng/mL(伏立康唑)和330ng/mL(溴尿嘧啶)。
表3.各药物的标准曲线血浆样本的最终浓度
1.3质控血浆样品制备
取90μL空白血浆，加入一定体积的前述的1.1项所制得的一种药物贮备液和内标贮备 液(或者加入一定体积的用体积分数为50％的甲醇水稀释后的上述1.1项所制得的一种药物 贮备液和内标贮备液)，制得该药物某一质控浓度的质控血浆样本，并依此法分别制得各个 药物的不同质控浓度的质控血浆样本。质控血浆样本中，最终血浆药物浓度如下表4所示， 最终内标浓度为5.0ng/mL(伏立康唑)和330ng/mL(溴尿嘧啶)。
表4.各药物的质控血浆样本的最终浓度
(二)实验方法
2.1血浆样品预处理
取100μL血浆样品置于1.5mLEP管中，加10μL内标伏立康唑的甲醇水溶液，涡旋 震荡10s后，加入300μL甲醇(含甲酸体积分数0.1％)，涡旋振荡3min，于13000r/min 离心10min；分取上清液100μL，自动进样10μL进行LC-MS/MS分析，峰面积内标法定 量检测。
另取200μL血浆样品置于1.5mLEP管中，加20μL内标溴尿嘧啶的甲醇水溶液，涡 旋震荡10s后，加入1mL体积分数之比为85％：15％的乙酸乙酯-异丙醇溶液，涡旋震荡5min，于13000r/min离心10min；取900μL上清，转移至另一离心管中，用氮气吹干(35℃)， 取900μL上清，转移至另一离心管中，在35℃条件下用氮气吹干后，用50μL体积分数 5％的甲醇水溶液和10μL二氯甲烷复溶，以12000rpm转速离心10min，分取上清液100μ L，自动进样10μL进行LC-MS/MS分析，峰面积内标法定量检测。
2.2色谱条件
液相色谱条件：WatersAtlantisT3(100mm×3.0mm，3μm)；流动相为流动相A和流动相B，流动相梯度洗脱条件见表1，进样量10μL。其中，流动相A为100％甲醇；流动 相B为体积分数为0.1％的甲酸水溶液。
表1洗脱梯度
| 时间(min) | 有机相比例(％) | 流速(mL/min) |
| 2.0 | 5 | 0.35 |
| 2.1 | 40 | 0.35 |
| 5.0 | 40 | 0.35 |
| 5.1 | 75 | 0.30 |
| 8.5 | 75 | 0.30 |
| 9.0 | 5 | 0.35 |
| 12.0 | 5 | 0.35 |
2.3质谱条件
质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI)，正负离子交替检测，选择多反应监测(MRM)工作方式进行一/二级质谱分析。质谱检测工作参数见表2。
表2质谱检测工作参数
| 母离子(m/z) | 子离子(m/z) | Q1(V) | CE | Q2(V) | |
| 氟尿嘧啶 | 129 | 42 | 14 | 17 | 17 |
| 二氢尿嘧啶 | 115 | 55 | -22 | -25 | -23 |
| 尿嘧啶 | 113 | 70 | -14 | -21 | -25 |
| 溴尿嘧啶 | 189 | 42 | 13 | 21 | 17 |
| 伊立替康 | 587 | 167 | -32 | -47 | -30 |
| SN-38 | 393 | 349 | -15 | -27 | -22 |
| SN-38G | 569 | 393 | -30 | -30 | -25 |
| 伏立康唑 | 350.3 | 127.1 | -11 | -38 | -21 |
(三)方法学评价
方法学验证主要包括线性、灵敏度、精密度、准确度、回收率、基质效应和稳定性。
3.1标准曲线和定量下限
对于按照“表1”中所列的某一药物的各标准浓度配制的各个标准曲线血浆样本中的每 个样本进行以下操作：按照“2.1血浆样品预处理”项操作后，取10μL置于进样管中，依照“2.2”和“2.3”的条件，进行HPLC-MS/MS(使用MRM模式)测定，记录色谱图；并计 算药物峰面积和内标峰面积的比值；全部样本完成上述操作后，以药物浓度为横坐标，以 药物峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标，用加权(1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得该 药物的直线回归方程，即为该药物的标准曲线。依照同样的步骤，制备各药物的标准曲线。 各药物的直线回归方程以及定量下限的结果如表5所示。
表5.各药物线性回归方程、相关系数、线性范围及定量下限
3.2精密度和准确度
对于按照“表2”中所列的各质控浓度配制的各药物的质控血浆样本(每个药物每个浓 度各制备6份，每天制备一批样品，连续3天，一共制备3批作为考察精密度和准确度的样品)中的每个样本进行以下操作：按照“2.1血浆样品预处理”项操作后，取10μL置于 进样管中，依照“2.2”和“2.3”的条件，进行HPLC-MS/MS(使用MRM模式)测定，记 录色谱图；并计算药物峰面积和内标峰面积的比值；代入当天所得的标准曲线求测试浓度， 最后计算批内和批间精密度(绝对值小于15％为合格)和准确度(85％-115％为合格)。具 体结果见表6。
表6.各药物准确度和精密度测试结果
由表6可见，血浆中各药物的各测试浓度的准确度均在85％-115％的区间内，血浆中 各药物的各测试浓度的批内和批间精密度绝对值均小于15％。由此证明本发明方法对血浆 中上述3个药物的检测具有良好的精密度和准确度。
3.3基质效应和绝对回收率
取6份不同来源的人血浆，按血浆前处理方法处理得空白基质，以该空白基质配制低、 高浓度上述3个药物的质控溶液各3份进行LC-MS/MS分析。峰面积与相应浓度的药物标准溶液峰面积比值即为基质效应结果。取低、中、高血浆样品(n＝6)，按“2.1血浆样品预 处理”项步骤操作，获得血浆中药物峰面积，与相同浓度对照品的峰面积比较，计算血浆 中药物的绝对回收率。基质效应及绝对回收率结果见表7。
表7人血浆内基质效应和提取回收率实验(n＝6)
结果血浆基质对上述三个药物及内标影响程度基本一致。
3.4稀释效应(十倍稀释)
对于按照“表1”中所列的各药物的浓度7配制的各个药物血浆样本(每个药物均制备3 份)分别进行以下操作：用空白血浆稀释十倍后，按照“2.1血浆样品预处理”项操作后，取 10μL置于进样管中，依照“2.2”和“2.3”的条件，进行HPLC-MS/MS(使用MRM模式) 测定，记录色谱图；并计算药物峰面积和内标峰面积的比值；代入当天所得的标准曲线求 测试浓度，将浓度结果乘以10，计算出未稀释时的血浆药物浓度。
将计算到的各药物浓度与所对应的浓度7进行比较，结果显示：10倍稀释后，各药物 的精密度均在15％以内，准确度均在85％-115％之间，表明在该稀释条件下，未出现明显 的稀释效应，样品的精密度和准确度不受影响。
3.5稳定性
观察血浆样品不同条件下测得的药物与内标峰面积比与血浆制备即刻(0小时)的初始 峰面积比值，RE％值均小于15％。血浆样品处理后进样器放置24小时、28天稳定性及冻 融三次后提取均稳定，结果见表8。
表8.稳定性测试
由表8可见：血浆中各药物的各浓度在上述考察条件下检测得出的准确度均在85％-115％之间，提示在上述考察条件下本发明方法对血浆中上述3个药物的检测具有较强 稳定性。
本发明建立一种检测人血浆内两种抗肿瘤药物伊立替康和氟尿嘧啶及伊立替康的两种 代谢产物：7-乙基-10-羟基喜树碱和葡萄糖醛酸化SN-38、氟尿嘧啶代谢酶活性相关内源性 物质：尿嘧啶和二氢尿嘧啶的方法，包括分别以伏立康唑和溴尿嘧啶为内标。其中，伊立 替康及其代谢产物血浆样本用3倍体积的含甲酸体积分数0.1％的甲醇对其中的蛋白进行沉 淀；氟尿嘧啶及其代谢酶活性相关内源性物质血浆样本以体积分数85％乙酸乙酯15％异丙 醇溶液对其中待测成分进行提取，氮气吹干后，再用体积分数5％的甲醇水溶液和二氯甲烷 复溶并沉淀残余蛋白。上述经前处理后样本均使用高效液相色谱分离上清液中的药物成分， 然后使用高分辨质谱多反应监测模式进行药物靶向性检测，并进行定量，实现对血浆中两 种抗肿瘤药物及代谢产物和代谢酶活性相关内源性物质浓度进行分析测定。本发明的方法 在具有快捷性的同时，兼具极高的靶向性，表现出快速、高通量、高灵敏度、特异性强、 精密度和准确度良好、稳定性好、提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应的优点。本 发明方法可用于临床上伊立替康及其代谢产物和氟尿嘧啶及其代谢酶活性相关内源性物质 的血药浓度监测。可以减少实验成本、降低临床样本使用量以及减少患者等待时间。且， 有利于不同检测点或者实验室的数据互相参考和使用，具有很强的实用性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员， 在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本 发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种测定人血浆中两种抗肿瘤药物及代谢产物和代谢酶活性相关内源性物质浓度的方法，其特征在于，所述两种抗肿瘤药物分别是伊立替康和氟尿嘧啶，所述代谢产物是伊立替康的两种代谢产物：7-乙基-10-羟基喜树碱和葡萄糖醛酸化SN-38；所述代谢酶活性相关内源性物质是氟尿嘧啶代谢酶活性相关内源性物质：尿嘧啶和二氢尿嘧啶；
所述方法为高效液相色谱-串联质谱法，所述方法包括如下步骤：
(1)求得第一标准曲线；
(2)求得第二标准曲线；
(3)血浆样本预处理：
取血浆样本，首先加入内标伏立康唑的甲醇水溶液，然后加入含甲酸体积分数0.1％的甲醇沉淀，取上清用氮气吹干后，再用体积分数5％的甲醇水溶液和二氯甲烷复溶，得到第一血浆样本；
取血浆样本，首先加入内标溴尿嘧啶的甲醇水溶液，然后加入乙酸乙酯和异丙醇体积比为85:15的溶液沉淀，取上清用氮气吹干后，再用体积分数5％的甲醇水溶液和二氯甲烷复溶，得到第二血浆样本；
(4)将步骤(3)预处理后得到的第一、第二血浆样本分别于高效液相色谱质谱联用仪上进样分析：色谱条件：色谱柱为：Waters Atlantis T3柱；流动相为流动相A和流动相B，流动相梯度洗脱条件见下表，流动相A为100％甲醇；流动相B为体积分数为0.1％的甲酸水溶液；
质谱条件：
离子源：电喷雾离子源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；质谱检测工作参数见下表：
(5)计算：采用内标法，分别将伊立替康/7-乙基-10-羟基喜树碱/葡萄糖醛酸化SN-38与内标伏立康唑的峰面积比值带入第一标准曲线方程分别计算得到血浆中伊立替康、7-乙基-10-羟基喜树碱和葡萄糖醛酸化SN-38的浓度；
将氟尿嘧啶/尿嘧啶/二氢尿嘧啶和内标溴尿嘧啶的峰面积比值带入第二标准曲线方程计算得到血浆中氟尿嘧啶、尿嘧啶和二氢尿嘧啶的浓度。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中求得第一标准曲线的方法如下：
取空白血浆，加入药物的甲醇水溶液和内标伏立康唑的甲醇水溶液，分别制得各种药物一系列浓度的标准曲线血浆样本；采用3倍体积的含甲酸体积分数0.1％的甲醇沉淀标准曲线血浆样本中蛋白；再在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录标准曲线血浆样本的色谱图，计算药物峰面积和内标峰面积的比值，然后以药物浓度为横坐标，以药物峰面积和内标峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得回归方程即为第一标准曲线；
其中，所述药物是伊立替康及其代谢产物7-乙基-10-羟基喜树碱和葡萄糖醛酸化SN-38，标准曲线血浆样本中各药物浓度范围如下：伊立替康：2.5-625ng/mL；7-乙基-10-羟基喜树碱：0.5-120ng/mL；葡萄糖醛酸化SN-38：1.0-250ng/mL；标准曲线血浆样本中内标伏立康唑浓度为5.0ng/mL。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中求得第二标准曲线的方法如下：
取空白血浆，加入药物的甲醇水溶液和内标溴尿嘧啶的甲醇水溶液，分别制得各种药物一系列浓度的标准曲线血浆样本；采用5倍体积的乙酸乙酯和异丙醇体积比为85:15的溶液对其中待测成分进行提取，取上清用氮气吹干后，再用体积分数5％的甲醇水溶液和二氯甲烷复溶；离心取上清在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录标准曲线血浆样本的色谱图，计算药物峰面积和内标峰面积的比值，然后以药物浓度为横坐标，以药物峰面积和内标峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得回归方程即为第二标准曲线；
其中，所述药物是氟尿嘧啶及其代谢酶活性相关内源性物质尿嘧啶和二氢尿嘧啶，所述标准曲线血浆样本中各药物浓度范围如下：氟尿嘧啶10-1000ng/mL；尿嘧啶5-500ng/mL；二氢尿嘧啶10-1000ng/mL；标准曲线血浆样本中内标溴尿嘧啶浓度为330ng/mL。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中加入3倍体积的含甲酸体积分数0.1％的甲醇沉淀；
步骤(3)中加入5倍体积的乙酸乙酯和异丙醇体积比为85:15的溶液沉淀。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)中，色谱柱长度为100mm，内径为3mm，填料粒径为3μm。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述血浆为人的血浆。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法还包括方法学评价，评价内容为：线性、灵敏度、精密度、准确度、回收率、基质效应和稳定性。
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