CN113777187A - 在线固相萃取、液相色谱-串联质谱法测定血浆中3种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，提供了在线固相萃取、液相色谱‑串联质谱法测定血浆中3种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，包括如下步骤：0～1min，固相萃取柱的进样端与萃取泵和自动进样器连通，出样端通过切换阀与排废口连通，分析泵通过切换阀与液相色谱‑串联质谱连通；新鲜血浆或血浆溶液直接进样在固相萃取柱内进行净化处理；1～3min，调整切换阀，将固相萃取柱的两端分别与液相色谱分析柱以及分析泵连通，分析泵将分析物从固相萃取柱转移至液相色谱分析柱内进行分析；3～5min，调整切换阀至0～1min时的连接状态，萃取泵冲洗固相萃取柱并将流动相平衡至初始状态，分析泵配合液相色谱‑串联质谱继续完成分析物的分离。

Description

在线固相萃取、液相色谱-串联质谱法测定血浆中3种酪氨酸 激酶抑制剂浓度的方法

技术领域

本发明属于生物医药检测技术领域，具体将在线固相萃取与液相色谱-串联质谱法在线连通，实现在线测定血浆中3种酪氨酸激酶抑制剂的浓度。

背景技术

肺癌是世界上最常见的癌症，也是癌症相关死亡的主要原因，每年死亡人数超过170万[1]。大约80-85％的肺癌病理上被归为非小细胞肺癌(Non-small-cell lungcancer,NSCLC)[2]。近三十年来，NSCLC的治疗已经由最初的化疗已经转向基于分子靶点的个体化分子靶向治疗，尤其是以EGFR为靶点的药物的发现，在NSCLC个体化治疗的发展中具有里程碑式的意义[3,4]。吉非替尼、奥希替尼、埃克替尼均为EGFR酪氨酸激酶抑制剂，对EGFR突变阳性的NSCLC患者的无进展生存期和总生存期均有明显改善，被批准用于非小细胞肺癌EGFR突变的一线治疗[5]。有研究表明，在固定剂量下，由于酪氨酸激酶抑制剂都经口服给药，且大多经肝药酶代谢，易与食物，伍用药物发生相互作用，个体间药代动力学表现出较大的差异[6]。此外，由于该类药物为长期服用的药物，这种差异可能会造成疗效不足或者引起不良反应[7-9]，为保证药物使用的合理性，有必要对这类药物进行血药浓度的监测。

高效液相色谱法或高效液相色谱串联质谱法是目前酪氨酸激酶抑制剂的常用检测技术。由于血浆样品中含有大量的蛋白和磷脂等大分子杂质，在样品分析前需要对其进行复杂的前处理，文献报导多采用蛋白沉淀，液液萃取或离线固相萃取等方式[10,11]。这些传统的前处理方法由于耗时，步骤繁琐，且重现性差等原因，使其不能满足医院大样本量快速检测的要求。因此，探究一种前处理简单、自动化程度高的分析方法实属必要。

发明内容

本发明为解决上述技术问题进行，将在线固相萃取与液相色谱-串联质谱联用，采用在线固相萃取对血浆样品进行净化处理，并基于阀切换将其与液相色谱-串联质谱连通，实现快速测定血浆中3种酪氨酸激酶抑制剂的浓度。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供的在线固相萃取、液相色谱-串联质谱法测定血浆中3种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，包括如下步骤：

0～1min，固相萃取柱的进样端通过切换阀与萃取泵以及自动进样器连通，出样端通过切换阀与排废口连通，分析泵通过切换阀与液相色谱-串联质谱连通；新鲜血浆或血浆溶液经所述萃取泵以及自动进样器进入所述固相萃取柱内进行净化处理；

1～3min，调整切换阀，将所述固相萃取柱的两端分别与液相色谱分析柱以及分析泵连通，分析泵将分析物从固相萃取柱转移至液相色谱分析柱内进行分析；

3～5min，调整切换阀至0～1min时的连接状态，萃取泵冲洗固相萃取柱并将流动相平衡至初始状态，分析泵配合液相色谱-串联质谱继续完成分析物的分离，

其中，固相萃取柱和液相色谱分析柱的流动相相同，流动相A为乙腈，流动相B为含有0.1％甲酸、浓度为5mmol/L的醋酸铵溶液；萃取及分析过程中，不同时间段，流动相A与流动相B件间的体积比不同。

进一步，分析过程中，在萃取段，0～0.5min时，流动相A与流动相B的体积比为10:90；0.51～1.0min时，流动相A与流动相B的体积比为80:20；1.0～5.0min时，流动相A与流动相B的体积比为10:90；在分析段，0～0.5min时，流动相A与流动相B的体积比为25:75；0.51～3.5min时，流动相A与流动相B的体积比为80:20；3.51～5min时，流动相A与流动相B的体积比为25:75。

进一步，固相萃取柱选自Welch Polar-RP，液相色谱分析柱选自Waters X BridgeC18，固相萃取泵流速为1.5mL·min^-1，分析泵流速为1.0mL·min^-1。

进一步，液相色谱分析柱后通过三通分流，3/10进入质谱分析，柱温为40℃，进样体积50μL。

进一步，质谱采用电喷雾离子源，正离子检测模式，选择MRM工作方式进行一/二级质谱检测；

离子源参数：气帘气25psi，碰撞气10psi，雾化气50psi，辅助气45psi，喷雾电压5500V，离子源温度500℃；

吉非替尼、奥希替尼、埃克替尼及内标伏立康唑的去簇电压、入口电压、碰撞电压、出口电压以及用于定量分析的离子通道相关信息见下表：

本发明中，通过十个阀门间的切换实现固相萃取柱与液相色谱-串联质谱系统间的断开与联用，实现在线检测。

本发明中，血浆样品为新鲜血浆样品或干血浆样品。新鲜血浆样品稀释后直接进样，干血浆样品经溶剂溶解后直接进样。

通过实验验证，采用上述提取方法，吉非替尼、奥希替尼、埃克替尼在各自质量浓度范围内与峰面积线性关系良好，精密度高、重复性及稳定性良好。

通过临床实际验证，能够精确得出三种药物的稳态血药谷浓度，且只需要10μL的血浆样品，采血量少。

发明的作用与效果

本文首次建立了基于在线固相萃取技术对人血浆样品中吉非替尼、奥希替尼及埃克替尼3种酪氨酸激酶抑制剂进行检测的方法，该方法采血量少，操作简单，自动化程度高，为临床检测药物浓度提供了技术支持。

实际应用中，医院不同患者可能服用不同的TKIs药物，建立三种药物同时检测的方法，不仅减小了工作量节省了资源，还缩短了患者及医生等待血药浓度结果的时间。本研究采用在线固相萃取结合LC-MS/MS快速测定干血浆样品中酪氨酸激酶抑制剂的浓度，只需要10μL的血浆样品，大大减少了患者的采血量，也减小了对患者身体的侵害。

附图说明

图1为在线固相萃取连接示意图，其中A：切换阀处于1-10状态；B：切换阀处于1-2状态。

图2为吉非替尼、奥希替尼、埃克替尼及内标伏立康唑的二级质谱碎裂图。

图3为吉非替尼、奥希替尼、埃克替尼和内标伏立康唑的典型图谱，A.空白血浆(blank plasma)；B.空白血浆+对照品(blankplasma with standard)；C.患者血浆。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。

实施例1：检测方法的建立

1仪器、材料与试药

1.1仪器与材料

Thermo U-3000超高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，API4000三重四级杆串联质谱仪和Analyst 1.6色谱质谱工作站(美国AB Sciex)；SCILOGEXMX-S涡旋混合器(美国Scilogex)；SORVALL LEGEND Micro 21R冷冻离心机(美国ThermoScientific)；SK5200H超声仪(上海科导超声仪器有限公司)；Hi-Tech水纯化系统(上海和泰仪器有限公司)；移液枪(德国Eppendorf公司)；Whatman 903滤纸(美国GE公司产品，批号：6887811W102)。

1.2试药

吉非替尼对照品(大连美仑生物技术有限公司,批号:A0902AS，纯度>99％)；奥希替尼对照品(Toronto Research Chemicals，批号:7-JTN-114-1，纯度:98％)；埃克替尼对照品(大连美仑生物技术有限公司，批号:J1605A，纯度:98％)；伏立康唑对照品(大连美仑生物技术有限公司，批号：J1211AS，纯度＞99％)；乙腈(色谱纯，美国天地股份有限公司)；甲酸(分析纯，上海CNW)；醋酸铵(分析纯，上海泰坦化学有限公司)。

2方法和结果

2.1溶液配制

2.1.1混合对照品溶液的配制精密称取各对照品10.00mg，置于10mL容量瓶中，吉非替尼、奥希替尼、埃克替尼分别用DMSO-甲醇(1：4，v/v)溶解并定容得到储备液，于-40℃冰箱保存。对照品各称取两份，分别用于标准曲线和质控工作溶液的配制。将各储备液使用甲醇溶液逐级稀释并混合，配制成含吉非替尼，奥希替尼，埃克替尼的混合系列工作溶液和混合质控工作溶液。

2.2HPLC-MS/MS条件

2.2.1液相色谱与在线固相萃取条件

固相萃取柱：Welch Polar-RP(30×4.6mm，5μm)，分析柱：Waters X Bridge C18(4.6×100mm，3.5μm)。固相萃取泵(右泵)和分析泵(左泵)流动相相同，流动相A为乙腈，流动相B为5mM醋酸铵(0.1％甲酸，v/v)；固相萃取泵流速为1.5mL·min^-1，分析泵流速为1.0mL·min^-1，柱后通过三通分流，3/10进入质谱分析；柱温为40℃；进样体积50μL。

在线固相萃取系统连接如图1所示，实验过程中，0-1min，切换阀处于1～10连接状态，固相萃取泵将样品上样至固相萃取柱；1-3min，切换阀处于1～2连接状态，分析泵将分析物从固相萃取柱转移至分析柱；3-5min，切换阀处于1～10连接状态，固相萃取泵冲洗固相萃取柱并将流动相平衡至初始状态，分析泵继续完成分析物的分离。具体梯度洗脱程序和阀切换参数见表1。

表1在线固相萃取、分析洗脱及阀切换的程序

2.2.2质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI),正离子检测模式，选择MRM工作方式进行一/二级质谱检测。离子源参数：气帘气25psi，碰撞气10psi，雾化气50psi，辅助气45psi，喷雾电压5500V，离子源温度500℃；吉非替尼、奥希替尼、埃克替尼及内标伏立康唑的去簇电压、入口电压、碰撞电压、出口电压以及用于定量分析的离子通道相关信息见表2。各分析物及内标的二级质谱图见图2。

表2吉非替尼、奥希替尼、埃克替尼和内标伏立康唑优化后质谱参数及用于定量分析的离子通道

实施例2：方法学考察

1专属性

取空白血浆、空白血浆标准添加混合标准溶液、患者血浆样品，按“2.2”项下方法处理，考察方法的专属性。结果如图3所示，空白血浆(A)、空白血浆标准添加混合标准溶液(B)、患者血浆样品(C)中吉非替尼、奥希替尼、埃克替尼的典型图谱一致，表明该方法有较好的专属性。

2线性范围

从吉非替尼、奥希替尼、埃克替尼系列混合工作溶液中精确吸取5μL，加入95μL空白血浆中，配制成含吉非替尼2、4、8、40、80、400、1000ng·mL^-1，含奥希替尼2、4、8、40、80、400、1000ng·mL^-1，含埃克替尼4、8、16、80、160、800、2000ng·mL^-1的血浆标准样品，按“2.2”项下方法处理。分别以吉非替尼、奥希替尼及埃克替尼与内标伏立康唑的峰面积比值为纵坐标，各分析物的浓度为横坐标，采用最小加权二乘法，选择1/χ2作为权重因子拟合标准曲线。结果表明，吉非替尼、奥希替尼及埃克替尼分别在2～1000，2～1000，4～2000ng·mL^-1范围内线性关系良好。

3精密度和准确度

配制含吉非替尼、奥希替尼、埃克替尼LLOQ、低、中、高不同浓度水平的质控样品，按“2.2”项下方法处理，每个浓度平行处理6份，连续测定3天。精密度以相对标准偏差(RSD)表示，准确度通过将QC代入相应标准曲线，通过测得值与实际值之间的相对误差(RE)来表示。结果见表3，表明该方法的精密度和准确度良好。

表3干血浆样品中吉非替尼、奥希替尼、埃克替尼的日内、日间精密度及准确度(n＝6)

4回收率、基质效应

配制低、中、高3个浓度水平的QC样品(n＝6)，按“2.2”项下方法处理，进行检测得各待测物峰面积A；另取6批不同人血浆样品，按“2.2”项下方法处理，；离心后得上清液，加入上述相应浓度得混合质控工作溶液，进样得各待测物峰面积B；直接进样低、高浓度的混合质控工作溶液得各待测物浓度C；按A/B×100％计算各浓度水平下待测物的基质效应，结果见表4：

表4干血浆样品中吉非替尼、奥希替尼、埃克替尼及内标的回收率和基质效应(n＝6)

5稳定性实验

考察了低、中、高3个浓度水平的QC样品在不同条件下(室温12h，进样盘12h，-40℃冷冻7d)的稳定性。干血浆样品中吉非替尼替尼在室温放置12h，预处理后进样盘放置12h，-40℃冷冻7d等条件下RE 98.73％～111.00％，RSD<11.99％；干血浆样品中奥希替尼在室温放置12h，预处理后进样盘放置12h，-40℃冷冻30d等条件下RE 89.50％～111.00％，RSD<13.76％；干血浆样品中埃克替尼在室温放置12h，预处理后进样盘放置12h，-40℃冷冻7d等条件下RE 89.48％～109.17％，RSD<13.79％。结果表明，干血浆样品中吉非替尼、奥希替尼、埃克替尼在室温放置12h，进样盘放置12h和-40℃冷冻30d均稳定。

6临床样本测定

本实验共收集了上海交通大学附属第一人民医院呼吸科及肿瘤科32例非小细胞肺癌患者的血样。根据3种酪氨酸激酶抑制剂在体内的药代动力学特征，在服药14天后，药物在体内都已经达到稳态血药浓度，因此在服药14天后，每次服药前半小时采血，测定稳态血药谷浓度。吉非替尼的平均谷浓度为373.58±117.19ng·mL^-1，奥希替尼的平均谷浓度为174.36±81.82ng·mL^-1，埃克替尼的平均谷浓度为809.94±274.84ng·mL^-1。

本文首次建立了基于在线固相萃取技术对人血浆样品中吉非替尼、奥希替尼及埃克替尼3种酪氨酸激酶抑制剂进行检测的方法，该方法采血量少，操作简单，自动化程度高，为临床检测药物浓度提供了技术支持。

实际应用中，医院不同患者可能服用不同的TKIs药物，建立三种药物同时检测的方法，不仅减小了工作量节省了资源，还缩短了患者及医生等待血药浓度结果的时间。本研究采用在线固相萃取结合LC-MS/MS快速测定干血浆样品中酪氨酸激酶抑制剂的浓度，只需要10μL的血浆样品，大大减少了患者的采血量，也减小了对患者身体的侵害。

参考文献

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以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (5)

1.在线固相萃取、液相色谱-串联质谱法测定血浆中3种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：

0～1min，固相萃取柱的进样端通过切换阀与萃取泵以及自动进样器连通，出样端通过切换阀与排废口连通，分析泵通过切换阀与液相色谱-串联质谱连通；新鲜血浆或血浆溶液经所述萃取泵以及自动进样器进入所述固相萃取柱内进行净化处理；

1～3min，调整切换阀，将所述固相萃取柱的两端分别与液相色谱分析柱以及分析泵连通，分析泵将分析物从固相萃取柱转移至液相色谱分析柱内进行分析；

3～5min，调整切换阀至0～1min时的连接状态，萃取泵冲洗固相萃取柱并将流动相平衡至初始状态，分析泵配合液相色谱-串联质谱继续完成分析物的分离，

其中，固相萃取柱和液相色谱分析柱的流动相相同，流动相A为乙腈，流动相B为含有0.1％甲酸、浓度为5mmol/L的醋酸铵溶液；萃取及分析过程中，不同时间段，流动相A与流动相B件间的体积比不同。

2.根据权利要求1所述的在线固相萃取、液相色谱-串联质谱法测定血浆中3种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，其特征在于：

其中，分析过程中，在萃取段，0～0.5min时，流动相A与流动相B的体积比为10:90；0.51～1.0min时，流动相A与流动相B的体积比为80:20；1.0～5.0min时，流动相A与流动相B的体积比为10:90；

在分析段，0～0.5min时，流动相A与流动相B的体积比为25:75；0.51～3.5min时，流动相A与流动相B的体积比为80:20；3.51～5min时，流动相A与流动相B的体积比为25:75。

3.根据权利要求1所述的在线固相萃取、液相色谱-串联质谱法测定血浆中3种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，其特征在于：

其中，固相萃取柱选自WelchPolar-RP，液相色谱分析柱选自WatersXBridgeC18，固相萃取泵流速为1.5mL·min^-1，分析泵流速为1.0mL·min^-1。

4.根据权利要求1所述的在线固相萃取、液相色谱-串联质谱法测定血浆中3种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，其特征在于：

其中，液相色谱分析柱后通过三通分流，3/10进入质谱分析，柱温为40℃，进样体积50μL。

5.根据权利要求1所述的在线固相萃取、液相色谱-串联质谱法测定血浆中3种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，其特征在于：

其中，质谱采用电喷雾离子源，正离子检测模式，选择MRM工作方式进行一/二级质谱检测；

离子源参数：气帘气25psi，碰撞气10psi，雾化气50psi，辅助气45psi，喷雾电压5500V，离子源温度500℃；

吉非替尼、奥希替尼、埃克替尼及内标伏立康唑的去簇电压、入口电压、碰撞电压、出口电压以及用于定量分析的离子通道相关信息见下表：

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