CN112881550B - 一种测定饮料饮品中四种嘌呤的超高效液相色谱-串联质谱分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定饮料饮品中四种嘌呤的超高效液相色谱‑串联质谱分析方法。一种测定饮料饮品中四种嘌呤的超高效液相色谱‑串联质谱分析方法，包括如下步骤：(1)标准品溶液制备：取嘌呤标准品加入水溶解，配置浓度为0.5‑250ng/mL的标准品溶液；(2)供试品溶液制备：将饮料饮品样品采用混合酸水解提取嘌呤成分，将得到的嘌呤样品加入水溶解，配置浓度为1‑250ng/mL的供试品溶液；(3)测定：采用超高效液相色谱‑质谱联用技术对步骤(2)得到的供试品溶液中的嘌呤含量进行测定。本发明优化混合酸水解嘌呤前处理方法，水解后用碱中和所得的溶液澄清，无沉淀物或杂质，减少过滤离心等繁琐步骤，嘌呤损失少，回收率高，测定的总嘌呤含量更准确。

Description

一种测定饮料饮品中四种嘌呤的超高效液相色谱-串联质谱分析方法
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种测定饮料饮品中四种嘌呤的超高效液相色谱-串联质谱分析方法。
背景技术
嘌呤是一类由一个嘧啶环和一个咪唑环稠和而成的生物碱类物质，主要包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤及其衍生物。嘌呤不仅是生物体内核酸的重要组成，其在能量供应、组成辅酶、代谢调节等方面也发挥着关键作用。嘌呤经体内代谢会产生尿酸，如果嘌呤代谢失常或尿酸排泄出现障碍，血液中尿酸含量会异常升高，从而引发高尿酸血症，并可进一步发展为痛风、高血压、糖尿病等多种代谢慢性疾病。
嘌呤广泛存在于食品中，食物中嘌呤成分主要为4种：腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤，经食物摄入是人体外源获取嘌呤的主要途径。相关研究发现，长期大量地摄入高嘌呤食物会明显影响人体血液尿酸含量，并增加高尿酸血症和痛风等代谢疾病的发病率。因此，限制高嘌呤食物的摄入，并改善饮食结构是缓解相关疾病的重要方式。人们日常饮食中接触到的高嘌呤食物主要为畜禽肉类、鱼虾贝类、大豆及蔬菜类制品等，随着经济水平的发展，饮料饮品也逐渐成为饮食中的重要一环。以啤酒饮料为例，研究显示市售啤酒中的嘌呤物质含量较高，约为40~136 mg/L，相关研究也表明，长期饮用啤酒是高尿酸血症发作的重要诱因，啤酒与痛风之间存在着较高的依存关系。因此，充分了解饮料饮品中嘌呤含量的数据具有重要意义，能为膳食结构中饮料饮品的合理安排，以及高尿酸血症患者的科学膳食提供一定的指导。
目前饮料饮品的嘌呤含量的检测方法应用最多的是高效液相色谱法，通常采用C18色谱柱分离，甲醇和酸性缓冲盐溶液作为流动相，检测波长254 nm测定。由于嘌呤在C18色谱柱上的保留度较差，为了使4种嘌呤尽可能分离，有机相的比例通常不超过5%，这样会导致整体保留时间偏后，分析时间长，效率较低，试剂成本也较高。且鸟嘌呤和腺嘌呤的标准峰仅能基线分离，导致实际样品中的这两种嘌呤色谱峰重叠，影响测定结果。另外，采用紫外检测器仅依靠保留时间定性，而实际样品基质中的杂质在此条件下都可能会有响应并造成干扰，导致结果假阳性率高，准确度低。同时，嘌呤在紫外检测器中的最低检测浓度约为0.01 μg/mL，实际样品中由于基质干扰检出限会更高，因此灵敏度不高。
发明内容
本发明解决了现有技术存在的问题，提供一种测定饮料饮品中四种嘌呤的超高效液相色谱-串联质谱分析方法，本发明优化混合酸水解嘌呤前处理方法，水解后用碱中和所得的溶液澄清，无沉淀物或杂质，减少过滤离心等繁琐步骤，嘌呤损失少，回收率高，测定的总嘌呤含量更准确。
本发明的目的是提供一种测定饮料饮品中四种嘌呤的超高效液相色谱-串联质谱分析方法，包括如下步骤：
（1）标准品溶液制备：取嘌呤标准品加入水溶解，配置浓度为0.5-250 ng/mL的标准品溶液；
（2）供试品溶液制备：将饮料饮品样品采用混合酸水解提取嘌呤成分，将得到的嘌呤样品加入水溶解，配置浓度为1-250 ng/mL的供试品溶液；
（3）测定：采用超高效液相色谱-质谱联用技术对步骤（2）得到的供试品溶液中的嘌呤含量进行测定，液相色谱条件为：色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18 (3.0 mm×150 mm, 2.7 μm)；流动相：A相为甲醇，B相为水，梯度洗脱；流速：0.4 mL/min；柱温：35℃；进样量：2 μL；质谱条件为：离子源：带鞘气流的电喷雾离子源(AJS ESI)；扫描模式：正离子模式；检测模式：多反应监测（MRM）；离子源参数如下：干燥气温度 350℃；干燥气流速6.0L/min；鞘气温度 350 ℃；鞘气流速11.0 L/min；雾化气压力40 psi；毛细管电压4000 V。
优选地，步骤（1）所述的嘌呤标准品包括鸟嘌呤标准品、腺嘌呤标准品、次黄嘌呤标准品和黄嘌呤标准品。
进一步优选，步骤（3）中鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤的质谱条件参数具体如表1所示：
优选地，步骤（2）所述的将饮料饮品样品采用混合酸水解提取嘌呤成分，将得到的嘌呤样品加入水溶解，配置浓度为1-250 ng/mL的样品溶液具体步骤为：取样品于容器中，加入与样品相同体积的混合酸摇匀，置于沸水浴下水解30-60 min，取出，冷却至室温，用NaOH溶液调节pH至中性，加水定容混匀，配置浓度为1-250 ng/mL的样品溶液，样品溶液经0.22 μm滤膜过滤得到供试品溶液，以备分析。
进一步优选，所述的混合酸为三氯乙酸和甲酸的混合酸，所述的三氯乙酸和甲酸的体积比为8:2。
优选地，所述的梯度洗脱条件为所述的梯度洗脱程序如表2所示。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
 （1）本发明可同时测定饮料饮品中4种嘌呤成分含量，应用范围广；
 （2）本发明采用超高效液相色谱优化的色谱条件，4种嘌呤的分离效果较好，提高了测定的准确度，分析时间为11 min，4种嘌呤的保留时间在4.5~6.5 min之间，缩短了分析时间、提高了检测效率，降低了试剂成本；
 （3）本发明优化混合酸水解嘌呤前处理方法，水解后用碱中和所得的溶液澄清，无沉淀物或杂质，减少过滤离心等繁琐步骤，嘌呤损失少，回收率高，测定的总嘌呤含量更准确；
 （4）本发明采用ESI+-MS/MS多反应监测模式 (MRM)分析，定性更准确，假阳性率低；
 （5）本发明提出的4种嘌呤标准品峰高为噪音3倍时对应的浓度为0.6~1.2 ng/mL，以样品取样量为1mL计，饮料饮品中的4种嘌呤的检出限为6~12 ng/mL；本发明提出的分析方法重复性好，加标回收率满足分析测定的要求。
附图说明
图1为实施例1空白溶液、样品溶液和标准品溶液的总离子流（TIC）色谱图；
图2为实施例1空白溶液、样品溶液和标准品溶液的MRM色谱图，图2a为空白溶液的MRM色谱图，图2b为样品溶液的MRM色谱图，图2c为标准品溶液的MRM色谱图；
 图3为对比例1采用0.02 mol/L KH2PO4-H3PO4缓冲溶液（pH4.0）等度洗脱时标准品溶液的MRM色谱图；
图4为对比例1采用水：乙酸：四丁基氢氧化铵：甲醇=930:10:10:50等度洗脱时标准品溶液和样品溶液的MRM色谱图；
其中，图1-4中G：鸟嘌呤；H：次黄嘌呤；X：黄嘌呤；A：腺嘌呤。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
 除特别说明，本发明中的实验材料和试剂均为本技术领域常规市购产品。
 仪器、试剂及分析条件
 （1）仪器
 Agilent 1290 6460A超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪：美国Agilent 公司；BSA224S电子分析天平（精度为0.0001g）：赛多利斯科学仪器公司；KQ-2200 超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；WBK-4B电热恒温水浴锅：上海浦东荣丰科学仪器公司；Milli-Q超纯水机：美国Millipore公司。
 （2）试剂
 腺嘌呤标准品、鸟嘌呤标准品、次黄嘌呤标准品、黄嘌呤标准品（纯度＞98.0%）：中国药品生物制品检定所；甲醇（色谱纯）：美国Honeywell公司；甲酸（色谱纯，纯度＞98.0%）：阿拉丁试剂(上海)有限公司；三氯乙酸（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；实验用水为超纯水；其余试剂均为分析纯，购自广州化学试剂厂。
 （3）分析条件
 色谱条件：色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18 (3.0 mm×150 mm, 2.7 μm)；流动相：甲醇(A)-水(B)，液相色谱梯度洗脱程序见下表（如表3所示）；流速：0.4 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：2 μL。
 质谱条件：离子源：带鞘气流的电喷雾离子源(AJS ESI)；扫描模式：正离子模式；检测模式：多反应监测(MRM)。离子源参数如下：干燥气温度 350 ℃；干燥气流速6.0 L/min；鞘气温度 350 ℃；鞘气流速11.0 L/min；雾化气压力40 psi；毛细管电压4000 V。优化的质谱条件参数如表1所示：
实施例1:
 1、标准溶液的配制和分析：
 精密称取预先干燥好的标准品腺嘌呤标准品12.61 mg、鸟嘌呤12.95 mg、次黄嘌呤13.31 mg、黄嘌呤12.73 mg适量，分别置于25 mL容量瓶中，加入水超声溶解（嘌呤不易溶解于水可加入NaOH或HCl助溶），依次配制成浓度为504 μg/mL、510 μg/mL、526 μg/mL、504μg/mL的标准储备溶液，于4℃保存。分别准确移取4种标准储备溶液各1.0 mL于同一50 mL容量瓶中，用水稀释配制成浓度约为10 μg/mL的混合标准储备液，再取不同体积混合标准储备液，进一步稀释成一系列的标准工作溶液，浓度范围在0.5-250 ng/mL之间。
 对标准工作溶液进行进样分析，以各标准品的质量浓度( X，mg/L)为横坐标，定量离子的峰面积( Y)为纵坐标，进行线性回归分析，得回归方程，并按照各组分的3倍信噪比( S/N=3)对应的质量浓度计算检出限，以10倍信噪比( S/N=10) 对应的质量浓度计算定量限。结果表明（见表4），表4为4种嘌呤的标准曲线、相关系数、检出限与定量限，4种嘌呤组分在各自的质量浓度范围内和峰面积线性关系良好，相关系数（ r 2 ）均大于0.9990，检出限(LOD) 为6~12 ng/mL，定量限(LOQ) 为20~40 ng/mL，相比于目前常用的高效液相色谱法，检测灵敏度得到了提高。
 2、样品前处理及测定
 前处理：取茶饮料样品2.5 mL（精确值0.01 mL），于25 mL具塞试管中，加入2.5mL混合酸溶液（3.5 mol/L三氯乙酸：甲酸=8:2，即：摩尔浓度为3.5 mol/L的三氯乙酸与甲酸混合均匀得到混合酸溶液，三氯乙酸与甲酸的体积比为8:2），摇匀，置于沸水浴100 ℃下水解60 min，取出，冷却至室温，加入2.5 mol/L NaOH溶液约6.5 mL调节pH至中性，加水定容至25 mL，混匀，移取1 mL到10 mL容量瓶，用水定容并稀释10倍，经0.22 μm滤膜过滤得到供试品溶液，以备分析。测定供试品溶液的峰面积，通过上述的标准工作曲线计算得到样品中的4种嘌呤含量，并通过加和计算总嘌呤含量，检测结果见表5，表5为茶饮料中嘌呤的含量，相关色谱图见图1和图2。
对比例1
 1、仪器和试剂
 （1）仪器
 Agilent 1260液相色谱仪：美国Agilent 公司； BSA224S电子分析天平（精度为0.0001g）：赛多利斯科学仪器公司；KQ-2200 超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；WBK-4B电热恒温水浴锅：上海浦东荣丰科学仪器公司；Milli-Q超纯水机：美国Millipore公司。
 （2）试剂
 腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤标准品（纯度＞98.0%）：中国药品生物制品检定所；甲醇（色谱纯）：美国Honeywell公司；乙酸（色谱纯，纯度＞98.0%），四丁基氢氧化铵：阿拉丁试剂(上海)有限公司；三氟乙酸（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；高氯酸（分析纯）：广州化学试剂厂；实验用水为超纯水；其余试剂均为分析纯，购自广州化学试剂厂。
 2、采用HPLC进行测定
 分析条件：色谱柱：Welch XB-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。流动相：采用两种流动相0.02 mol/L KH2PO4-H3PO4缓冲溶液（pH4.0）（见图3）和水：乙酸：四丁基氢氧化铵：甲醇=930:10:10:50（见图4）进行等度洗脱分别测定。
从图3可知，四种嘌呤的峰形不佳，因洗脱中不使用有机相，实际样品分析中后续必须引入高比例的有机相进行洗脱，否则样品基质会使基线飘移，影响测定结果，从而导致整体的分析时间也较长。从图4可知，四种嘌呤的峰形虽对称尖锐，分析时间较短，但鸟嘌呤和腺嘌呤色谱峰重叠，不能达到基线分离，且在实际样品中由于基质的干扰较大，无法进行准确定量。
 与采用C18色谱柱和HPLC进行测定相比，本发明分析时间更短、检测效率更高，四种嘌呤的分离度相对更佳，采用ESI+-MS/MS多反应监测模式 (MRM)分析，定性准确，干扰更小，准确度高。
对比例2
 仪器、试剂同对比例1，三种酸水解条件的比对：
样品前处理：
 三氟乙酸和甲酸水解的前处理：取茶饮料样品2.5 mL（精确值0.01 mL），于25 mL具塞试管中，加入0.5 mL三氟乙酸和0.5 mL甲酸，摇匀，置于沸水浴100 ℃下水解60 min，取出，冷却至室温，加入2.5 mol/L NaOH溶液pH至中性，加水定容至25 mL，混匀，移取1 mL到10 mL容量瓶，用水定容并稀释10倍，经0.22 μm滤膜过滤得到供试品溶液，以备分析。
 高氯酸水解的前处理：取茶饮料样品2.5 mL（精确值0.01mL），于25 mL具塞试管中，加入2.5mL的高氯酸，摇匀，置于沸水浴100℃下水解60 min，取出，冷却至室温，加入NaOH溶液pH至中性，滤去沉淀物，加水定容至25 mL，混匀，移取1mL到10mL容量瓶，用水定容并稀释10倍，经0.22 μm滤膜过滤得到供试品溶液，以备分析。
 按实施例1中的分析条件进行测定，并与采用混合酸（3.5 mol/L三氯乙酸：甲酸=8:2）水解的效果进行比对，结果见表6。
 由表6可知，采用实施例1中的混合酸（3.5 mol/L三氯乙酸：甲酸=8:2）水解，所测得嘌呤的含量最高，说明嘌呤损失少，回收率高，水解后用碱中和所得的溶液澄清，无沉淀物或杂质，无须过滤或离心等步骤，操作更简便；采用三氟乙酸和甲酸水解，所得的溶液澄清，操作简便，但其测得嘌呤含量相对较低，特别是鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤的含量减少较多；使用高氯酸水解后用碱中和之后会产生沉淀物，需过滤去除，操作较为繁琐，水解过程中也会产生有毒的氯气，对环境不友好，所测得的嘌呤含量也相对较低。
实施例2
 加标回收率与精密度
 选择合适的茶饮料样品进行嘌呤含量的加标回收实验。先按本实验的条件处理分析测得本底值 ( n=4)，再以相对于本底值约50%、100%和150%的3个浓度水平添加嘌呤含量，每个加标水平平行测定6次，并通过校正样品本底值的方式计算平均回收率，同时计算相对标准偏差（RSD）。结果如表7所示，表7为加标回收率与相对标准偏差(RSD)( n=6)。
由表7得出，加标样品的平均回收率为81.7%~97.2%，RSD( N=6)为1.5%~4.3%，说明本方法的准确度符合一般检测的要求。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的技术方案及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (1)

1.一种测定饮料饮品中四种嘌呤的超高效液相色谱-串联质谱分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）标准品溶液制备：取嘌呤标准品加入水溶解，配置浓度为0.5-250 ng/mL的标准品溶液，所述的嘌呤标准品包括鸟嘌呤标准品、腺嘌呤标准品、次黄嘌呤标准品和黄嘌呤标准品；
（2）供试品溶液制备：取样品于容器中，加入与样品相同体积的混合酸摇匀，置于沸水浴下水解30-60 min，取出，冷却至室温，用NaOH溶液调节pH至中性，加水定容混匀，配置浓度为1-250 ng/mL的样品溶液，样品溶液经0.22 μm滤膜过滤得到供试品溶液，以备分析，所述的混合酸为三氯乙酸和甲酸的混合酸，所述的三氯乙酸和甲酸的体积比为8:2；
（3）测定：采用超高效液相色谱-质谱联用技术对步骤（2）得到的供试品溶液中的嘌呤含量进行测定，液相色谱条件为：色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18 3.0 mm×150mm, 2.7 μm；流动相：A相为甲醇，B相为水，梯度洗脱；流速：0.4 mL/min；柱温：35℃；进样量：2 μL；质谱条件为：离子源：带鞘气流的电喷雾离子源；扫描模式：正离子模式；检测模式：多反应监测；离子源参数如下：干燥气温度 350℃；干燥气流速6.0 L/min；鞘气温度350 ℃；鞘气流速11.0 L/min；雾化气压力40 psi；毛细管电压4000 V；
所述的鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤的质谱条件参数具体如下表所示：
所述的梯度洗脱程序见下表：
。
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