CN116735739A - 一种快速检测尿液中新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤的方法 - Google Patents
一种快速检测尿液中新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，公开了一种快速检测尿液中新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7‑生物蝶呤的方法。具体公开了全氟丁酸在提高基于液相色谱法检测尿液中蝶呤谱的检测效果中的应用。本发明将全氟丁酸用于尿液中蝶呤谱的测定，其作为疏水阴离子的离子对试剂，可显著增强各蝶呤谱(如生物蝶呤、新蝶呤、蝶呤和7‑生物蝶呤)的分离效果，可显著提高对蝶呤谱的检测准确度。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测尿液中新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤的方法。
背景技术
蝶呤类化合物是蝶啶的衍生物，在细胞代谢过程中蝶呤类化合物起重要的辅助作用。其广泛分布于人体的血液、尿液、脑脊液等体液中，但含量甚微，但当机体免疫系统被某些疾病如癌症激活后或由于先天性疾病引起代谢缺陷，体内蝶呤类化合物含量会发生显著的改变。
高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia，HPA)是一类常见的常染色体隐性遗传性代谢病，可导致严重智能障碍。HPA根据酶的缺乏情况，分为二大类：苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)缺乏、HPA辅酶四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)缺乏。BH4是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸羟化酶等酶的辅酶。BH4的合成或代谢过程中，某种酶的先天性缺陷导致一些芳香族氨基酸代谢障碍，影响脑内神经递质合成，患儿出现严重的神经系统损害症状和智能障碍。根据缺陷酶的不同，可将BH4缺乏分类可分为以下5类：(1)6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(6-pyruvoyl tetrahydropterinsynthase，PTPs)缺乏(最常见，96％左右)；(2)二氢蝶啶还原酶(dihydropteridinereductase，DHPR)缺乏(2.4％)；(3)鸟苷三磷酸环化水解酶(GTP cyclohydrolase，GTPCH)缺乏；(4)墨蝶呤还原酶(sepiapterinreductase，SR)缺乏；(5)蝶呤-4-甲醇氨脱水酶(pterin-4a-carbinolaminedehydratase，PCD)缺乏。BH4缺乏症的患者，其体液的蝶呤谱也会发生显著改变。
不同类型的HPA治疗方案与愈后截然不同，目前，对上述疾病进行鉴别分型的主要方法是采用液相色谱法分析尿中蝶呤谱的变化。灵敏、特异、准确的尿液蝶呤谱分析方法，无论是在HPA筛查阶段、治疗阶段，还是用于HPA亚型筛查和辅助鉴别都很重要。
蝶呤类物质熔点高、在有机溶剂中的溶解性差，但溶于氢氧化钠和稀盐酸溶液。某些蝶呤化学性质不稳定物质，在空气中易氧化或还原。大多数天然存在的蝶呤以还原形式存在于体液中，在进行液相色谱分析之前需要将其氧化成荧光物质。完全氧化的蝶呤化合物为蓝色或黄色荧光化合物。尿中蝶呤谱主要包括新蝶呤(Neopterin，NP)、生物蝶呤(Biopterin，BP)、BH4、二氢生物蝶呤(dihydrobiopterin BH2)、蝶呤(pterin PT)、7-生物蝶呤(7-Biopterin，7-BP)等。其中新蝶呤、生物蝶呤、7-生物蝶呤、蝶呤的完全氧化形式为蓝色荧光化合物。目前，常用的尿蝶呤检测方法是将HPA患者尿液中还原态的BH2、BH4，用酸性碘氧化为NP和BP，然后用高效液相色谱(HPLC)荧光检测法测定HPA患者尿液中NP、BP的含量。只检测了NP、BP两种蝶呤的含量，7-生物蝶呤是蝶呤-4-甲醇氨脱水酶(PCD)缺乏的筛查依据，是与其他型进行鉴别的特征性代谢产物。治疗上，PCD属于良性疾病，可用BH4治疗或者不用治疗。因此检测7-生物蝶呤对HPA患者的筛查与分型很重要。
尿蝶呤谱分析除了常用的高效液相色谱(HPLC)荧光检测法外，还有气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱质谱联用(LC/MS-MS)法等。现阶段国内、外检测的方法存在以下问题：1.尿液中含大量盐等水溶性强极性杂质，新蝶呤、生物蝶呤和7-生物蝶呤又极易发生水解，保存稳定性差，不适合在高有机相比例的HILIC模式下进行大量样本检测。2.传统方法多采用25cm的反相C18色谱柱，可增强保留和分离效果，但没有将生物蝶呤和7-生物蝶呤进行有效分离。3.采用反向键合硅胶色谱柱，以甲醇和乙酸铵缓冲液为流动相的方法，梯度洗脱虽然分析时间短，但只检测新蝶呤、生物蝶呤，未检测7-生物蝶呤。4.HPLC荧光检测法仅有少数能将生物蝶呤和7-生物蝶呤进行分离，但分析时间较长，不符合临床医学检验快速、高通量的要求。5.HILIC模式的LC/MS-MS法虽然可以检测新蝶呤、生物蝶呤、7-生物蝶呤，但液质联用仪器昂贵检测成本比较高，不利于推广使用。6.对于未知蝶呤的结构阐明，GC-MS法无疑是一种敏感和特异的方法。但是需要碘化、固相萃取、洗脱、氮吹、衍生化等步骤，更费时，亦只检测新蝶呤、生物蝶呤，未检测7-生物蝶呤。生物蝶呤与7-生物蝶呤是同分异构体，如未能进行有效分离会影响这两个物质的检测准确度，亦无法对BH4缺乏症中的PTPs型和PCD型进行鉴别，进而影响病人的精准治疗。蝶呤与生物蝶呤、7-生物蝶呤结构相近会对生物蝶呤、7-生物蝶呤检测产生干扰，同样需要有效分离。因此如何将生物蝶呤、新蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤进行有效分离，提高对蝶呤谱的检测准确度对HPA患者的筛查与分型很重要。
反相离子对色谱法具有操作简便和分离柱效高等优点，目前阴离子表面活性剂如烷基磺酸盐应用较多。有文献报道用辛基硫酸钠作离子对试剂分离生物蝶呤、蝶呤，但用的是柱后衍生化方法，操作繁复分析时间长。相对于烷基磺酸盐，全氟羧酸具有更低的表面活性能，沸点低的优点。全氟丁酸(HBFA)因能进行一步增加保留时间，平衡时间短，被更多地应用于分析氨基酸。目前未见有用于蝶呤谱分析的报道。
开发建立一种适合临床检测新蝶呤、生物蝶呤和7-生物蝶呤的方法，准确、快速、高通量地获得准确的数据，有助于鉴别苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺乏症与BH4缺乏症及BH4各型，对早期筛查、早期采用相应治疗以改善预后在临床上尤为重要。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供全氟丁酸在提高基于液相色谱法检测尿液中蝶呤谱的检测效果中的应用。
本发明第二方面的目的，在于提供一种检测尿液中蝶呤谱的方法。
本发明第三方面的目的，在于提供本发明第二方面的方法在鉴别PAH缺乏症和BH4缺乏症中的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供全氟丁酸在提高基于液相色谱法检测尿液中蝶呤谱的检测效果中的应用。
优选地，所述蝶呤谱包括新蝶呤、生物蝶呤、二氢生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤中的一种或多种。
本发明的第二个方面，在于提供一种检测尿液中蝶呤谱的方法，包括以下步骤：制备校准品溶液、制备供试品溶液，采用液相色谱对校准品溶液、供试品溶液进行分析检测；所述蝶呤谱包括新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤。
优选地，所述液相色谱中的流动相A为全氟丁酸水溶液，流动相B为甲醇溶液。
优选地，所述液相流动相A为1％～5％全氟丁酸水溶液，流动相B为0～5％甲醇溶液
进一步优选地，所述流动相A为2％～5％全氟丁酸水溶液，流动相B为0～2％甲醇溶液。
更进一步优选地，所述流动相A为3％全氟丁酸水溶液，流动相B为甲醇。
优选地，所述供试品溶液的制备方法为：待测样品与碘/碘化钾溶液和盐酸混合，反应，加入抗坏血酸，即得到供试品溶液。
优选地，所述校准标品溶液的制备方法为：校准品与碘/碘化钾溶液和盐酸混合，反应，加入抗坏血酸，即得到校准标品溶液。
进一步优选地，所述碘/碘化钾溶液的浓度为1～5wt％，使用量为20～50μL/100mL样品。
进一步优选地，所述反应的条件为室温避光反应40～50min。
进一步优选地，所述抗坏血酸的浓度为1～2mg/mL，使用量为50～70μL/100mL样品。
进一步优选地，所述加入抗坏血酸后震荡离心，并过滤上清液。
优选地，所述液相色谱中的洗脱采用恒流方式。
优选地，所述脱程序为95％～99％A液，1％～5％B液。
优选地，所述液相色谱中流动相的流速为0.2～1.5mL/min；进一步为0.4～1mL/min；更进一步为0.8～1mL/min。
优选地，所述液相色谱中的色谱柱为Eclipse XDB 80A-C18。
进一步优选地，所述色谱柱的Eclipse XDB 80A-C18，4.6×250mm，5μm。
优选地，所述液相色谱中检测条件为激发光波长为250～300nm，发射光波长为400～450nm，进样盘温度为2～8℃。
优选地，所述液相色谱中的柱温为28～32℃，进样量为1～2μL。
本发明的第三个方面，在于提供本发明第二方面的方法在鉴别PAH缺乏症和BH4缺乏症中的应用。
优选地，所述BH4缺乏症为6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏、二氢蝶啶还原酶缺乏、鸟苷三磷酸环化水解酶缺乏、墨蝶呤还原酶缺乏和蝶呤-4-甲醇氨脱水酶缺乏中的一种或多种。
本发明的有益效果是：
本发明将全氟丁酸用于尿液中蝶呤谱的测定，其作为疏水阴离子的离子对试剂，可显著增强各蝶呤谱(如新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤)的分离效果，可显著提高对蝶呤谱的检测准确度。
本发明提供的方法成本低，前处理简单，可实现批量处理检测，优化色谱方法缩短了分析时间，大大提高样本通量，特别适用于临床和日常检测对色谱方法的需求。
本发明采用样品柱前氧化-液相色谱分离-荧光检测器检测，通过优化流速、增加流动相中有机溶剂比例对新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤进行了有效分离，提高分析特异性，有助于鉴别苯丙氨酸羟化酶缺乏症与BH4缺乏症各型。
本发明提供的方法中，流动相添加全氟丁酸作为疏水阴离子的离子对试剂，可显著增强新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤分离效果，以提高检测的准确度。利用本发明所提供的方法对中尿液中的生物蝶呤、新蝶呤和7-生物蝶呤进行定量检测，结果表明生物蝶呤、新蝶呤和7-生物蝶呤在线性范围内，相关系数(R)均大于0.999，检出限为0.02～0.04μmol/L，定量限为0.04～0.11μmol/L，新蝶呤的回收率在95.2％～104.1％之间，生物蝶呤的回收率在95.9％～104.3％，7-生物蝶呤的回收率在96.0％～104.3％，满足一般样品测定的加标回收率85％～115％的范围，由此可见，该方法测定结果准确可靠。
附图说明
图1为实施例1检测标准品中新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤的色谱图。
图2为实施例1为检测正常人尿液样本中新蝶呤、生物蝶呤和7-生物蝶呤的色谱图。
图3为实施例1为检测6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(PTPs)缺乏病人尿液样本中新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤的色谱图。
图4为实施例1为检测蝶呤-4-甲醇氨脱水酶(PCD)缺乏病人尿液样本中新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤的色谱图。
图5为实施例2检测标准品中新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤的色谱图。
图6为实施例3检测标准品中新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤的色谱图。
图7为对比例1检测标准品中新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤的色谱图。
图8为对比例2检测标准品中新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤的色谱图。
图9为对比例3检测标准品中新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤的色谱图。
图10为对比例4检测标准品中新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤的色谱图。
图11为对比例5检测标准品中新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤的色谱图。
图12为对比例6检测标准品中新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤的色谱图。
图13为利用实施例1检测新蝶呤的线性回归曲线。
图14为利用实施例1检测生物蝶呤的线性回归曲线。
图15为利用实施例1检测7-生物蝶呤的线性回归曲线。
具体实施方式
现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
实施例1
一种快速检测尿液中新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤的检测方法，包括如下步骤:
(1)标准品溶液的配制
1)蝶呤标准品：新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤、7-生物蝶呤
2)标准品配制：
①标准品储存液
准确称取新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤新喋吟标准品各1mg，先加入0.1mol/L盐酸100μL超声30秒，再加入0.1mol/L氢氧化钠900μL溶解，配成每种蝶呤均为1mg/mL储存液。
②使用液：
a.STD3：标准品储存液用人工尿液(不含新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤)10倍稀释；
b.STD2:STD3使用液用人工尿液(不含新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤)10倍稀释；
c.STD1:STD2使用液用人工尿液(不含新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤)10倍稀释。
③校准曲线配制(表1)：
表1校准曲线配制
新蝶呤1ng/mL＝0.0039μmol/L，生物蝶呤1ng/mL＝0.0042μmol/L，7-生物蝶呤1ng/mL＝0.0042μmol/L。
(2)样品前处理
1)取样：采集新鲜的人员尿液样本，置于室温，混匀后取100μL至4mL棕色样品瓶；用作校准的样本按上述表1加样至4mL棕色样品瓶。
2)氧化：上述所有的样本均加入50μL的1％碘/碘化钾溶液，150μL 0.2mol/L盐酸，检测样本中加入700μL去离子水震荡1min，用作校准的样本按表1加去离子水震荡1min，置于室温避光反应45min；
3)中和：上述样本均加入50μL 2mg/mL抗坏血酸，涡旋震荡1min；
4)过滤：上述样本均采用2.0mL一次性注射器移取上清液过0.22μm水相滤膜，得到待检样品溶液。
(3)检测
将待检样品溶液进行液相色谱分析，所述分析条件为如下：
液相条件：
色谱柱：Eclipse XDB 80A-C18(4.6×250mm，5μm)；
流动相A：3％全氟丁酸水溶液；
流动相B：甲醇；
检测波长：激发光波长为280nm，发射光波长为444nm；
峰宽：74.07HZ；
柱温：28℃；
进样量：1μL；
进样盘温度：5℃；
流速(恒流方式)：0.8mL/min，97％A液，3％B液；
保留时间：NP 6.0min，BP 11.8min，PT 12.4min，7-BP 13.2min
保留时间窗：5％；
宽度：0.1；
阈值：50；
检测器：荧光检测器。
将样品溶液中的目标物质的保留时间和色谱峰图与标准品NP、BP、PT和7-BP的色谱进行比较，进行定性分析。将不同浓度梯度的目标物质标准品分别进行测定，以色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；在相同条件下将供试品溶液进行测定，测得样品液中各目标物质的色谱峰面积，代入标准曲线，进行定量分析。该方法应用示例中图1为的标准品分析色谱图，图2为正常人尿液的色谱图，图3为6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(PTPs)缺乏病人的色谱图，图4为蝶呤-4-甲醇氨脱水酶(PCD)缺乏病人的色谱图。
实施例2
本实施例其他条件与实施例1相同，仅存在如下差异：流速为1.0mL/min。由图1和图5可以看出，与实施例1(图1)相比，在同样前处理条件、色谱柱，同样使用荧光检测器的前提下，增加了流速，缩短了分析时间，会导致生物蝶呤、蝶呤与7-生物蝶呤分离效果不佳(图5)。
实施例3
本实施例其他条件与实施例1相同，仅存在如下差异：流动相B为2％ B液。
由图6可以看出，与实施例1(图1)相比，同样前处理条件、色谱柱，同样使用荧光检测器，降低有机溶剂甲醇浓度，各组分的保留时间延长，蝶呤与7-生物蝶呤分离效果更佳。但是新蝶呤出现了分叉，因为甲醇的含量低，导致的，所以影响了新蝶呤检测的准确度。
对比例1
本实施例其他条件与实施例1相同，仅存在如下差异：流动相A为水，不加全氟丁酸。
流动相对待测物的峰形和色谱保留时间具有较大影响。由图7可以看出，与实施例1相比，当流动相中的不含全氟丁酸，各组分的保留时间缩短，蝶呤与7-生物蝶呤分离效果不佳，这是因为全氟丁酸作为离子对试剂，与待测组分作用形成中性离子对可增加保留性。
对比例2
本实施例其他条件与实施例1相同，仅存在如下差异：流动相A为1％全氟丁酸水溶液。
由图8可以看出，与实施例1相比，当降低流动相中的全氟丁酸的浓度，各组分的保留时间缩短，蝶呤与7-生物蝶呤分离效果不佳，这是因为全氟丁酸作为离子对试剂，浓度越低，与待测组分作用形成中性离子对的保留性越弱。
对比例3
本实施例其他条件与实施例1相同，仅存在如下差异：流动相A为2％全氟丁酸水溶液。
由图9可以看出，与实施例1相比，当降低流动相中的全氟丁酸的浓度，各组分的保留时间缩短，蝶呤与7-生物蝶呤分离效果不佳，这是因为全氟丁酸作为离子对试剂，浓度越低，与待测组分作用形成中性离子对的保留性越弱。
对比例4
本实施例其他条件与实施例1相同，仅存在如下差异：色谱柱为Eclipse XDB C18(4.6×150mm，3.5μm)。
由图10可以看出，同样前处理条件、同样流动相、流速，使用同样填料更短、小粒径的色谱柱，虽然缩短了分析时间，但是生物蝶呤与蝶呤、7-生物蝶呤分离效果均较差，影响生物蝶呤、7-生物蝶呤检测准确性。
对比例5
本实施例其他条件与对比例4相同，仅流速存在差异：流速：0.6mL/min。
由图11可以看出，同样前处理条件、同样使用荧光检测器、同样流动相，使用同样填料更短、小粒径的色谱柱，流速降低为0.6mL/min，虽然延长了生物蝶呤和7-生物蝶呤出峰时间，但生物蝶呤与蝶呤没有分离，影响生物蝶呤检测准确性。
对比例6
本实施例其他条件与对比例4相同，仅流速存在差异：流速：0.4mL/min。
由图12可以看出，同样前处理条件、同样使用荧光检测器、同样流动相，使用同样填料更短、小粒径的色谱柱，流速降低为0.4mL/min，虽然延长了生物蝶呤和7-生物蝶呤出峰时间，但生物蝶呤与蝶呤没有分离，影响生物蝶呤检测准确性。
对实施例1作进一步地效果检测
1.检测方法的线性关系、检出限和定量限
按实施例1所述配制不同质量浓度的标准品溶液，对该系列标准品溶液进行测定(检测条件同实施例1)，以各目标组分的质量浓度为横坐标(x)，对应的峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，确定方法的线性范围、回归方程和相关系数。
结果显示，新蝶呤、生物蝶呤和7-生物蝶呤在相应线性范围内各目标组分均呈现良好的线性关系，相关系数(R)均大于0.999(图13～15)。实施例1方法的检出限和定量限见表2。
表2方法的检出限和定量限以及线性范围
2.检测方法的加标回收率
在阴性样品为人工尿液(不含新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤)中分别加入高、中、低浓度的标准溶液，按样品前处理方法进行提取并进一步测定。
结果表明，新蝶呤的回收率在95.2％～104.1％之间，生物蝶呤的回收率在95.9％～104.3％，7-生物蝶呤的回收率在96.0％～104.3％，满足一般样品测定的加标回收率85％～115％的范围，由此可见，该方法测定结果准确可靠。
3.检测方法的精密度
通过批内重复性实验和批间重复性实验考察实施例1的检测方法的精密度。结果如表3～5所示，实施例1的检测方法对新蝶呤、生物蝶呤和7-生物蝶呤的精批内和批间的变异系数均小于20％，符合要求。
表3实施例1的检测方法对新蝶呤(NP)的精密度实验结果
表4实施例1的检测方法对生物蝶呤(BP)的精密度实验结果
表5实施例1的检测方法对7-生物蝶呤(7-BP)的精密度实验结果
4.样本存放稳定性
采集三例新鲜人源尿液样本，各尿液平均分为4份，避光，并分别置于室温、2-8℃、-20℃和-70℃条件下存放，隔0、1、2、5、8、15、22天检测一次尿液中的新蝶呤、生物蝶呤和7-生物蝶呤的含量，检测方法同实施例1。
结果如同表6～表17，尿液样本可在避光条件下稳定存放。
表6新蝶呤避光室温存放的稳定性结果
表7生物蝶呤避光室温存放的稳定性结果
表8 7-生物蝶呤避光室温存放的稳定性结果
表9新蝶呤避光2～8℃存放的稳定性结果
表10生物蝶呤避光2～8℃存放的稳定性结果
表11 7-生物蝶呤避光2～8℃存放的稳定性结果
表12新蝶呤避光-20℃存放的稳定性结果
表13生物蝶呤避光-20℃存放的稳定性结果
表14 7-生物蝶呤避光-20℃存放的稳定性结果
表15新蝶呤避光-70℃存放的稳定性结果
表16生物蝶呤避光-70℃存放的稳定性结果
表17 7-生物蝶呤避光-70℃存放的稳定性结果
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.全氟丁酸在提高基于液相色谱法检测尿液中蝶呤谱的检测效果中的应用。
2.一种检测尿液中蝶呤谱的方法，包括以下步骤：
制备校准品溶液、制备供试品溶液，采用液相色谱法对校准品溶液、供试品溶液进行分析检测；所述蝶呤谱包括新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述色谱中的流动相A为全氟丁酸水溶液，流动相B为甲醇溶液；优选地，所述流动相A为1％～5％全氟丁酸水溶液，流动相B为0～5％甲醇溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述校准品溶液、供试品溶液的制备方法为：校准品、待测样品与碘/碘化钾溶液和盐酸混合，反应，加入抗坏血酸，即得到校准品溶液、供试品溶液。
5.根据权利要求2～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述液相色谱中的洗脱采用恒流方式；优选地，所述洗脱的程序为95％～99％A液，1％～5％B液。
6.根据权利要求2～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述液相色谱中流动相的流速为0.2～1.5mL/min。
7.根据权利要求2～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述液相色谱中的色谱柱为Eclipse XDB 80A-C18。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述液相色谱中检测条件为激发光波长为250～300nm，发射光波长为400～450nm，进样盘温度为2～8℃。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述液相色谱中的柱温为28～32℃，进样量为1～2μL。
10.权利要求2～9中任一项所述的方法在鉴别PAH缺乏症和BH4缺乏症中的应用；优选地，所述BH4缺乏症为6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏、二氢蝶啶还原酶缺乏、鸟苷三磷酸环化水解酶缺乏、墨蝶呤还原酶缺乏和蝶呤-4-甲醇氨脱水酶缺乏中的一种或多种。
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