CN112834677A - 一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法 - Google Patents
一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112834677A CN112834677A CN202011617747.3A CN202011617747A CN112834677A CN 112834677 A CN112834677 A CN 112834677A CN 202011617747 A CN202011617747 A CN 202011617747A CN 112834677 A CN112834677 A CN 112834677A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- homocysteine
- solution
- internal standard
- sample
- acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 23
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims abstract description 22
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims abstract description 14
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 claims abstract description 11
- ZNOVTXRBGFNYRX-ABLWVSNPSA-N levomefolic acid Chemical compound C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 ZNOVTXRBGFNYRX-ABLWVSNPSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 8
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229940105150 5-methyltetrahydrofolic acid Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 238000010813 internal standard method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 20
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 13
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 9
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 claims description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 4
- 235000007635 levomefolic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011578 levomefolic acid Substances 0.000 claims description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical group SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 3
- ZIYVHBGGAOATLY-UHFFFAOYSA-N methylmalonic acid Chemical compound OC(=O)C(C)C(O)=O ZIYVHBGGAOATLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims description 3
- ZNOVTXRBGFNYRX-HPIGZBGKSA-N (2S)-2-[[4-[(2-amino-5-methyl-4-oxo-3,6,7,8-tetrahydropteridin-6-yl)methylamino]benzoyl]amino](1,2,3,4,5-13C5)pentanedioic acid Chemical compound CN1C(CNc2ccc(cc2)C(=O)N[13C@@H]([13CH2][13CH2][13C](O)=O)[13C](O)=O)CNc2[nH]c(N)nc(=O)c12 ZNOVTXRBGFNYRX-HPIGZBGKSA-N 0.000 claims description 2
- OVBPIULPVIDEAO-BCTWCYHZSA-N 2-[[4-[(2-amino-4-oxo-1h-pteridin-6-yl)methylamino]benzoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[13CH]([13CH2][13CH2][13C](O)=O)[13C](O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-BCTWCYHZSA-N 0.000 claims description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-PNSZSYODSA-N N1=[13C]([13CH3])[13C](O)=[13C](CO)C(CO)=C1 Chemical compound N1=[13C]([13CH3])[13C](O)=[13C](CO)C(CO)=C1 LXNHXLLTXMVWPM-PNSZSYODSA-N 0.000 claims description 2
- XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;formic acid Chemical compound CC#N.OC=O XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 2
- 238000004807 desolvation Methods 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 claims description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims 3
- ZIYVHBGGAOATLY-FIBGUPNXSA-N 2-(trideuteriomethyl)propanedioic acid Chemical compound [2H]C([2H])([2H])C(C(O)=O)C(O)=O ZIYVHBGGAOATLY-FIBGUPNXSA-N 0.000 claims 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 claims 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 abstract description 12
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract description 6
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 abstract description 5
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 abstract description 3
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 abstract description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 abstract description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 10
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 10
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 10
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 208000033892 Hyperhomocysteinemia Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000003225 hyperhomocysteinemia Effects 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010016880 Folate deficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000010188 Folic Acid Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010039966 Senile dementia Diseases 0.000 description 1
- 206010039984 Senile osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000018823 dietary intake Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000006694 eating habits Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 208000002670 vitamin B12 deficiency Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/884—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample organic compounds
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明涉及一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法。所述方法步骤包括：将血液样本经过前处理，在采用液相色谱‑串联质谱法进行分析检测，最后采用内标法进行定量。该方法可以同时检测人血清中同型半胱氨酸及其代谢相关物质(甲硫氨酸、吡哆醇、叶酸和5‑甲基四氢叶酸)的含量，并进行精确的定性和定量分析，是一种样本处理简单、通量高、结果可靠的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸和维生素联合检测的技术领域，具体涉及一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法。
背景技术
同型半胱氨酸是一种含硫氨基酸，主要来源于饮食摄取的甲硫氨酸代谢，是甲硫氨酸代谢过程中一个重要的中间产物，其本身并不参加蛋白质的合成。甲硫氨酸是构成人体的必需氨基酸之一，参与蛋白质合成。如果甲硫氨酸缺乏就会导致体内蛋白质合成受阻，造成机体损害。同型半胱氨酸在细胞内的代谢主要有两条代谢途径：一是甲硫氨酸的重甲基化，即同型半胱氨酸通过叶酸的循环重新合成甲硫氨酸；另一途径为转硫基途径。
人血液中同型半胱氨酸的正常含量一般为5～15μmol/L，当总同型半胱氨酸浓度超过15μmol/L，可导致高同型半胱氨酸血症的发生。引起高同型半胱氨酸血症的原因有多种，主要是由于不良的高甲硫氨酸饮食习惯，叶酸、维生素B12缺乏和肾功能不全等原因导致。多项研究显示高同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化症和冠心病的一个独立危险因素，目前已证实其还与呼吸系统疾病、妊娠相关疾病、糖尿病、老年痴呆症、肝病、肿瘤、老年性骨质疏松等存在密切关系。
目前，常用的氨基酸或维生素检测方法主要包括酶联免疫分析法、化学免疫发光法、高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等。免疫法检测时所用的抗体，也可识别其它维生素衍生物，且抗体抗原反应通常不足100％，因此结果差异较大，特异性较差，应用于临床检测可靠性不高，尤其是对于检测含量较低的维生素。液相色谱法由于检出限有限，主要用于氨基酸和维生素含量较高的样品测定，一般只能进行单组份或含量较高的几个组分的同时测定。LC-MS/MS具有检测灵敏度高，准确性好，易于高通量，且一次可检测多种代谢相关物质等多种优点，所以LC-MS/MS在氨基酸和水溶性维生素检测方面整逐渐倍推广。目前的LC-MS/MS检测方法只能对同型半胱氨酸一种氨基酸，三种含硫氨基酸或单独几种水溶性维生素做定量分析。由于血浆/血清成分复杂，且水溶性维生素含量较低，在进行定量分析时，杂质严重影响检测结果的准确性。所以为了降低检测时的基质效应，检测者都是对不同的氨基酸和维生素逐个指标进行检测分析。这样存在以下的缺点：检测成本较高，而且操作复杂，耗费的时间较长，检测需要的血量较多。目前还没有一种能够同时检测血清/血浆中同型半胱氨酸、甲硫氨酸和水溶性维生素的有效方法。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本申请提供一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法。该方法可以同时检测人血清中同型半胱氨酸及其代谢相关物质(甲硫氨酸、吡哆醇、叶酸和5-甲基四氢叶酸)的含量，并进行精确的定性和定量分析，是一种样本处理简单、通量高、结果可靠的检测方法。
一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法，所述方法步骤包括：将血液样本经过前处理，在采用液相色谱-串联质谱法进行分析检测，最后采用内标法进行定量。
进一步的，所述血液样本是血浆或血清。
进一步的，所述同型半胱氨酸及其代谢相关物质为：同型半胱氨酸Hcy、甲硫氨酸Met、甲基丙二酸MMA、吡哆醇PN、叶酸FA和5-甲基四氢叶酸5-MTHF。
进一步的，所述采用内标法进行定量的各分析物同位素内标为：同型半胱氨酸-D4、甲硫氨酸-13C5、甲基丙二酸-D3、吡哆醇-13C4、叶酸-13C5和5-甲基四氢叶酸-13C5。
进一步的，所述样本前处理操作为：取校准品和血清样本150μL，加入到2mL离心管中，加入20μL内标品溶液，再加入20μL还原剂溶液，涡旋孵育30min后，加入460μL甲醇沉淀蛋白，涡旋振荡3min后，吸取500μL样本混合溶液，经过蛋白磷脂过滤板过滤后，滤液氮气吹干，然后用超纯水复溶。
进一步的，所述采用液相色谱-串联质谱法进行分析检测具体操作步骤为：
(1)标准工作液的配制：以水配制各分析物标准品储存液，然后用BSA-PBS溶液制备不同浓度的混合标准溶液，分装后-20℃保存备用；
(2)内标品溶液的配制：以水配制各分析物同位素内标储存液，然后再用超纯水稀释后混合得到混合同位素内标品溶液，分装后-20℃保存备用；
(3)液相色谱串联质谱法检测：将待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离后，采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，对待测物质进行定性与定量检测；色谱条件：流动相A为含甲酸的水，流动相B为含甲酸的乙腈，梯度洗脱；质谱条件：正离子电喷雾离子化的多离子反应监测。
进一步的，色谱条件具体为：色谱柱：T3 C18柱，柱温：40℃；流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱条件：0～1min，99％A，1～1.5min，99％-30％A，1.5～2.5min，30％-5％A，2.5～3.5min，5％A，3.5～5.0min，99％A，流速0.4mL/min，进样量，10μL。
进一步的，质谱条件具体为：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，毛细管电压：3.90kV，锥孔电压：45V，离子源温度：150℃，脱溶剂气流量：650L/Hr，脱溶剂气温度：200℃。
进一步的，所述还原剂为二硫苏糖醇。
进一步的，所述BSA-PBS溶液为1.0％牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液。
有益效果：
本发明通过对样本前处理方法和液相色谱-串联质谱条件的优化，建立了一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法。采用本发明可以同时检测人血清中同型半胱氨酸及其代谢相关物质(甲硫氨酸、吡哆醇、叶酸和5-甲基四氢叶酸)的含量，并进行精确的定性和定量分析，是一种样本处理简单、通量高、结果可靠的检测方法。
本发明中使用的提取方法，可以较多的去除杂质，降低检测时的基质效应，且操作简单快捷，可以灵敏的检测出各分析物的含量，尤其是人体内含量较低的叶酸和吡哆醇。
本发明可以同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关共6种物质的含量，一是降低了检测成本，二是节省时间，三是减少采集被检测人的血量，四是可以辅助临床医生判断Hcy水平的高低，并辅助分析引起Hcy水平异常可能的原因，为维生素B6和叶酸的补充提供依据。
本发明用液相色谱-串联质谱法检测血清中同型半胱氨酸及其代谢相关物质，特异性强，灵敏性高，通量高，结果客观易于分析，尤其适合临床普及应用。
本发明的方法针对每种分析物分别选择特定的母离子、子离子，以分析物的相对保留时间作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量，保证检测结果的准确性。
本发明首次实现了应用LC-MS技术对一份血清样本中Hcy及其5种代谢相关物质同时检测的目的，选择分析物特定的母离子、子离子保证了检测物的特异性，降低了干扰物影响。该方法操作简便快速，分析时间仅6min，通量高、成本低，有效监测人体内同型半胱氨酸及其相关代谢物水平，对Hcy水平异常的可能原因进行辅助分析，对维生素B6和叶酸的合理、安全补充具有指导意义，易于临床推广及普及。
附图说明
图1为本发明实施例的总离子流图；
图2为本发明实施例的同型半胱氨酸及其内标的色谱图；
图3为本发明实施例的甲硫氨酸及其内标的色谱图；
图4为本发明实施例的的吡哆醇及其内标的色谱图；
图5为本发明实施例的甲基丙二酸及其内标的色谱图；
图6为本发明实施例的叶酸及其内标的色谱图；
图7为本发明实施例的5-甲基四氢叶酸及其内标的色谱图。
具体实施方式
实施例
一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法，步骤如下：
(1)样品处理：取血清样本120μL，加入到2mL离心管中，加入20μL内标品溶液，再加入20μL二硫苏糖醇溶液，涡旋孵育30min后，加入460μL甲醇沉淀蛋白，涡旋振荡3min后，吸取500μL样本混合溶液，经过96孔蛋白磷脂过滤板过滤后，收集滤液，然后滤液氮气吹干，吹干后用超纯水复溶。通过该处理，有效的分离沉淀蛋白，去除杂质，减少离子干扰，降低基质效应，同时可以最大程度的保留分析物，避免其分解或氧化，从而检测出最真实的待测分析物含量。
(2)标准工作液的配制：用超纯水溶解Hcy、Met和MMA标准品,用0.1mol/L盐酸溶液溶解PN标准品，用0.1mol/L氢氧化钠溶液溶解FA和5-MTHF标准品，得到各分析物标准品储存液。然后用含抗氧化剂的水溶液稀释制备6个梯度(Hcy：2、4、8、16、32、64μmol/L；Met：2、4、8、16、32、64μmol/L；MMA：2、4、8、16、32、64μmol/L；PN：8、16、32、64、128、256nmol/L；FA：8、16、32、64、128、256nmol/L；5-MTHF：8、16、32、64、128、256nmol/L)的混合标准溶液分装于2mL棕色瓶中，-70℃及以下温度保存备用；
(3)LC-MS检测：将待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离后(梯度洗脱条件如表1所示)，采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式(MRM质谱参数如表2所示)，对待测物质进行定量检测。
表1梯度洗脱条件
表2 MRM质谱参数
如图1至图7所示，应用标准品制作标准曲线，通过对各标准品中各分析物与相应内标峰面积的比值(y)进行计算，对校准品中的各分析物的标识浓度(x)与相应峰面积的比值(y)绘制标准曲线并拟合标准曲线方程，待测样品中各分析物的峰面积与相应内标峰面积的比值代入拟合的标准曲线方程，即可计算出样品中的各分析物的浓度。
通过具体实验，优化出通用的流动相和流速梯度，从而可以同时检测出同型半胱氨酸及5种代谢相关物质。另外，每种分析物选择特定的母离子、子离子、锥孔电压及碰撞能，从而提高各个分析物的信号强度，降低基质效应的影响，有利于检测各分析物含量，尤其是含量较低的水溶性维生素测定。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。
Claims (10)
1.一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法，其特征是：所述方法步骤包括：将血液样本经过前处理，在采用液相色谱-串联质谱法进行分析检测，最后采用内标法进行定量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血液样本是血浆或血清。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述同型半胱氨酸及其代谢相关物质为：同型半胱氨酸Hcy、甲硫氨酸Met、甲基丙二酸MMA、吡哆醇PN、叶酸FA和5-甲基四氢叶酸5-MTHF。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用内标法进行定量的各分析物同位素内标为：同型半胱氨酸-D4、甲硫氨酸-13C5、甲基丙二酸-D3、吡哆醇-13C4、叶酸-13C5和5-甲基四氢叶酸-13C5。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本前处理操作为：取校准品和血清样本150μL，加入到2mL离心管中，加入20μL内标品溶液，再加入20μL还原剂溶液，涡旋孵育30min后，加入460μL甲醇沉淀蛋白，涡旋振荡3min后，吸取500μL样本混合溶液，经过蛋白磷脂过滤板过滤后，滤液氮气吹干，然后用超纯水复溶。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用液相色谱-串联质谱法进行分析检测具体操作步骤为：
(1)标准工作液的配制：以水配制各分析物标准品储存液，然后用BSA-PBS溶液制备不同浓度的混合标准溶液，分装后-20℃保存备用；
(2)内标品溶液的配制：以水配制各分析物同位素内标储存液，然后再用超纯水稀释后混合得到混合同位素内标品溶液，分装后-20℃保存备用；
(3)液相色谱串联质谱法检测：将待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离后，采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，对待测物质进行定性与定量检测；色谱条件：流动相A为含甲酸的水，流动相B为含甲酸的乙腈，梯度洗脱；质谱条件：正离子电喷雾离子化的多离子反应监测。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述色谱条件具体为：色谱柱：T3 C18柱，柱温：40℃；流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱条件：0～1min，99％A，1～1.5min，99％-30％A，1.5～2.5min，30％-5％A，2.5～3.5min，5％A，3.5～5.0min，99％A，流速0.4mL/min，进样量，10μL。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述质谱条件具体为：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，毛细管电压：3.90kV，锥孔电压：45V，离子源温度：150℃，脱溶剂气流量：650L/Hr，脱溶剂气温度：200℃。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述还原剂为二硫苏糖醇。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述BSA-PBS溶液为1.0％牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011617747.3A CN112834677A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011617747.3A CN112834677A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112834677A true CN112834677A (zh) | 2021-05-25 |
Family
ID=75923931
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011617747.3A Pending CN112834677A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112834677A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113341012A (zh) * | 2021-06-01 | 2021-09-03 | 山东英盛生物技术有限公司 | 一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法、试剂盒及其应用 |
| CN114280178A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-04-05 | 上海市徐汇区中心医院 | 一种多种水溶性维生素的检测方法 |
| CN115436540A (zh) * | 2022-09-26 | 2022-12-06 | 汤臣倍健股份有限公司 | 一种同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸含量的方法及试剂盒 |
| CN116165309A (zh) * | 2022-06-16 | 2023-05-26 | 苏州帕诺米克生物科技有限公司 | 稀释溶剂、同型半胱氨酸质控品及应用 |
| CN116818966A (zh) * | 2023-06-29 | 2023-09-29 | 山东英盛生物技术有限公司 | Lc-ms/ms测定甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103163226A (zh) * | 2011-12-14 | 2013-06-19 | 刘丽宏 | 30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备 |
| US20160195510A1 (en) * | 2014-12-31 | 2016-07-07 | Castle Medical, LLC | Methods for determination of total homocysteine |
| CN106568880A (zh) * | 2016-10-11 | 2017-04-19 | 郭嘉亮 | 一种高效液相色谱‑串联质谱检测血浆甲基丙二酸的方法及试剂盒 |
| CN106841488A (zh) * | 2017-03-06 | 2017-06-13 | 辽宁润生康泰生物医药科技有限公司 | 一种非衍生化法检测血浆中含硫氨基酸的液相色谱串联质谱方法 |
| CN108362795A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-08-03 | 杭州佰辰医学检验所有限公司 | 干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法 |
-
2020
- 2020-12-31 CN CN202011617747.3A patent/CN112834677A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103163226A (zh) * | 2011-12-14 | 2013-06-19 | 刘丽宏 | 30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备 |
| US20160195510A1 (en) * | 2014-12-31 | 2016-07-07 | Castle Medical, LLC | Methods for determination of total homocysteine |
| CN106568880A (zh) * | 2016-10-11 | 2017-04-19 | 郭嘉亮 | 一种高效液相色谱‑串联质谱检测血浆甲基丙二酸的方法及试剂盒 |
| CN106841488A (zh) * | 2017-03-06 | 2017-06-13 | 辽宁润生康泰生物医药科技有限公司 | 一种非衍生化法检测血浆中含硫氨基酸的液相色谱串联质谱方法 |
| CN108362795A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-08-03 | 杭州佰辰医学检验所有限公司 | 干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113341012A (zh) * | 2021-06-01 | 2021-09-03 | 山东英盛生物技术有限公司 | 一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法、试剂盒及其应用 |
| CN114280178A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-04-05 | 上海市徐汇区中心医院 | 一种多种水溶性维生素的检测方法 |
| CN116165309A (zh) * | 2022-06-16 | 2023-05-26 | 苏州帕诺米克生物科技有限公司 | 稀释溶剂、同型半胱氨酸质控品及应用 |
| CN115436540A (zh) * | 2022-09-26 | 2022-12-06 | 汤臣倍健股份有限公司 | 一种同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸含量的方法及试剂盒 |
| CN116818966A (zh) * | 2023-06-29 | 2023-09-29 | 山东英盛生物技术有限公司 | Lc-ms/ms测定甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112834677A (zh) | 一种同时检测同型半胱氨酸及其代谢相关物质的方法 | |
| US10672600B2 (en) | Methods of detecting reverse triiodothyronine by mass spectrometry | |
| US9063119B2 (en) | Methods for detecting vitamin C by mass spectrometry | |
| Alam et al. | Measurement of homocysteine: a historical perspective | |
| Rafii et al. | Measurement of homocysteine and related metabolites in human plasma and urine by liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry | |
| Álvarez-Sánchez et al. | Automated determination of folate catabolites in human biofluids (urine, breast milk and serum) by on-line SPE–HILIC–MS/MS | |
| CN108362795B (zh) | 干血片中同型半胱氨酸含量快速检测方法 | |
| CN105954453A (zh) | 一种同时定量检测烟酸、烟酰胺和泛酸的试剂盒 | |
| CN105911160A (zh) | 血清或血浆中25-羟基维生素d液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒 | |
| CN114720704B (zh) | 一种测定血清中游离睾酮的试剂盒及方法 | |
| CN114509509A (zh) | 一种血清中全谱维生素的检测方法 | |
| CN111912921A (zh) | 一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中3种脂质的方法 | |
| CN113075305A (zh) | 定量检测末梢血样本中脂溶维生素含量的方法 | |
| CN112964814A (zh) | 一种生物体液总同型半胱氨酸的检测方法 | |
| CN112964808A (zh) | 一种生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒和检测方法 | |
| Ivanov et al. | Determination of total homocysteine in blood plasma by capillary electrophoresis with mass spectrometry detection | |
| CN112485340A (zh) | 一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中1,5-脱水山梨醇的方法 | |
| CN116381113B (zh) | 干血片中同时检测五种脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法 | |
| CN117129605B (zh) | 一种液相色谱串联质谱法检测11种抗高血压药物和3种代谢物的方法 | |
| CN118112113A (zh) | 一种液相色谱串联质谱法检测母乳中曲美他嗪的方法 | |
| CN114487185A (zh) | 一种胆固醇通路的分离鉴定方法 | |
| CN114563504A (zh) | 一种测定血浆中游离醛固酮含量的方法及试剂盒 | |
| CN115436540A (zh) | 一种同时测定血液中叶酸和同型半胱氨酸含量的方法及试剂盒 | |
| CN116735739A (zh) | 一种快速检测尿液中新蝶呤、生物蝶呤、蝶呤和7-生物蝶呤的方法 | |
| CN117147712A (zh) | 一种检测血液中11种维生素d的液相色谱质谱分析方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210525 |