CN116818966A - Lc-ms/ms测定甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析检测领域，提供了一种LC‑MS/MS测定甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，包括：将血清样本进行前处理，加入还原剂涡旋混匀，孵育后，加入提取液，涡旋混匀后，离心，取上清液过滤板、再次离心，收集上清液，即为待测液；分别配制标准工作液和内标品混合溶液；采用液相色谱串联质谱法对待测物质进行定性与定检测，即得。前处理不需要通过衍生化的方法，仅通过优化色谱条件，即可实现甲基丙二酸和琥珀酸同分异构体的分离；大幅度缩短了样本检测时间，实现了甲基丙二酸的特异性检测，提高了检测的准确度；同时可兼顾同型半胱氨酸及其相关代谢物的检测。
Description
技术领域
本发明属于分析检测领域，特别涉及一种非衍生化液相色谱-串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法及试剂盒。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
甲基丙二酸(Methylmalonic acid，MMA)是一种二羧酸，是丙二酸的甲基化衍生物，琥珀酸(Succinic Acid，SA)的同分异构体。甲基丙二酸是钴胺素代谢缺陷和甲基丙二酸血症的特征标志物。人血清中甲基丙二酸的正常含量低于0.4μMol/L，如果甲基丙二酸浓度超过0.4μMol/L是维生素B12缺乏的表征，如果血清中甲基丙二酸浓度超过40μMol/L，则提示有很大的甲基丙二酸血症的风险。
在生物体内，甲基丙二酸与辅酶A通过硫酯键结合成甲基丙二酰辅酶A，再以维生素B12为辅酶通过甲基丙二酰辅酶A变位酶异构化为琥珀酰辅酶A，血清中维生素B12水平直接反应了循环维生素B12浓度，而甲基丙二酸累积会导致维生素B12缺乏，是反应维生素B12状态的功能性标志物，同时维生素B12缺乏会影响同型半胱氨酸的代谢，与心脑血管疾病有很大的相关性。甲基丙二酸血症(methylmalonic acidemia，MMA)是一种常见的有机酸血症，主要由于甲基丙二酰辅酶A变位酶或其辅酶钴胺素维生素B12代谢缺陷所致。
维生素B12、总同型半胱氨酸及甲基丙二酸对于早期诊断维生素B12缺乏都是非常有帮助的指标，直接的维生素B12检测是最常用的测试方法，它通过自动化免疫的方法直接测定全钴胺素和全钴胺素蛋白的总和，因此免疫的方法对标志物测定缺乏特异性。近年来的研究表明甲基丙二酸是比维生素B12、总同型半胱氨酸更敏感，更具有代表性的生物标志物。
目前没有比较经济的免疫方法来定量甲基丙二酸，常见的测试甲基丙二酸方法是气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。
气相色谱-质谱法(GC-MS)是检测甲基丙二酸的金标准，准确度高，特异性好；然而此方法有其缺点：1)成本高；2)前处理步骤繁琐；3)消耗样本体积大；4)分析时间长。
液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)因准确度高、特异性好等优势近年来越来越多的应用到甲基丙二酸的检测中，在前处理方法上有衍生化方法、非衍生化方法以及不同复杂程度的样本提取过程。同气相色谱-质谱法相比，液相色谱-串联质谱法更大程度上减少了样本前处理步骤，虽然在固相萃取、衍生化反应、蛋白沉淀或者超滤等方法中至少选择了1种，且加热、蒸发、孵育、氮吹浓缩或者离心步骤是其必须步骤之一。
甲基丙二酸和其同分异构体琥珀酸的分离是现有液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测甲基丙二酸的难点和挑战之一，它们具有相似的理化性质和接近的质谱特征碎片，且琥珀酸在生物体内的含量等同甚至高于甲基丙二酸，这对检测的特异性提出了很高的要求。大部分液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)采用衍生化的前处理方法实现甲基丙二酸和其同分异构体的分离，在衍生化的基础上又增加了氮吹浓缩的操作，前处理步骤相对繁琐，增加了分析时间。在检测通量或者检测项目上，绝大部分方法采取甲基丙二酸单独检测的形式，不能涵盖代谢通路上的其它指标，如果检测其它指标还需二次检测，造成检测成本提高，液相色谱-串联质谱法也失去了高检测通量的优势。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种非衍生化的方法及试剂盒直接检测人血清中的甲基丙二酸含量，实现甲基丙二酸和其同分异构体琥珀酸的分离，并同时检测人血清中同型半胱氨酸和其它代谢产物(蛋氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、4-吡哆酸、5-磷酸吡哆醛)含量。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种非衍生化液相色谱-串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，包括：
将血清样本进行前处理，加入还原剂涡旋混匀，孵育15～20min后，加入提取液，涡旋混匀5～6min后，离心，取上清液过滤板、再次离心，收集上清液，即为待测液；
分别配制标准工作液和内标品混合溶液；
采用液相色谱串联质谱法对待测物质进行定性与定检测，将待测样本通过色谱柱分离后，甲基丙二酸及其内标采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，其它化合物及其内标采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，即得。
本发明所述液相色谱-串联质谱方法(LC-MS/MS)及试剂盒，前处理操作简单便捷，只需要通过一步提取即可实现目标物的检测，不需要氮吹浓缩；前处理不需要通过衍生化的方法，仅通过优化色谱条件，即可实现甲基丙二酸和琥珀酸同分异构体的分离；一步提取，非衍生化样本前处理，大幅度缩短了样本检测时间，实现了甲基丙二酸的特异性检测，提高了检测的准确度；同时可兼顾同型半胱氨酸及其相关代谢物(蛋氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、4-吡哆酸、5-磷酸吡哆醛)的检测，为同型半胱氨酸血症的诊疗提供辅助手段。
本发明的第二个方面，提供了一种非衍生化液相色谱-串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物的检测试剂盒，包括：校准品、校准品稀释液、质控品、内标物、还原剂：40～60mg/mL二硫苏糖醇、提取液：10～12％三氯乙酸。
本发明的第三个方面，提供了上述的试剂盒在甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物同时测定中的应用。
本发明的有益效果
(1)本发明对前处理方法进行改良，不需要氮吹浓缩的前处理过程，只需要通过一步提取即可实现甲基丙二酸等7种目标化合物的检测；不需要甲基丙二酸的衍生化反应，仅通过调整流动相配方及使用Gemini 3μm NX-C18
110A,100x2mm色谱柱，即可实现甲基丙二酸和其同分异构体琥珀酸的有效分离；整个前处理过程步骤简单，方便快捷，大幅度缩短了样本检测时间，容易实现批量处理。
(2)本发明对甲基丙二酸及其相关代谢通路化合物的多指标检测，涵盖甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其它代谢产物，在实现甲基丙二酸特异性检测的同时，为同型半胱氨酸血症的诊疗提供辅助手段。
(3)本发明利用H-ESI离子化方式，通过优化质谱条件，提高了方法检测的灵敏度；方法学考察准确度、精密度、加标回收率均满足定量分析要求；本发明具有准确度高、特异性好、稳定重现的有点，可用于血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其它代谢物的检测。
(4)与目前常规液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)相比，本发明操作更加简单，省却衍生化等过多工序，节约了成本，简约了分析流程，该发明可以更方便的应用于血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其它代谢物的检测。
(5)本发明中保护剂和冻干工艺的使用，增加了5-甲基四氢叶酸、5-磷酸吡哆醛等不稳定化合物的稳定性，提高了检测的准确度。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示例性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例5的甲基丙二酸及其同分异构体琥珀酸分离色谱图。
图2为本发明实施例5的同型半胱氨酸及其同位素内标色谱图。
图3为本发明实施例5的蛋氨酸及其同位素内标色谱图。
图4为本发明实施例5的叶酸及其同位素内标色谱图。
图5为本发明实施例5的5-甲基四氢叶酸及其同位素内标色谱图。
图6为本发明实施例5的4-吡哆酸及其同位素内标色谱图。
图7为本发明实施例5的5-磷酸吡哆醛及其同位素内标色谱图。
图8为甲基丙二酸对应的标准曲线，线性范围：15.6-1000mg/mL。
图9为同型半胱氨酸对应的标准曲线，线性范围：312-20000mg/mL。
图10为蛋氨酸对应的标准曲线，线性范围：234.38-15000ng/mL。
图11为叶酸对应的标准曲线，线性范围：3.91-250ng/mL。
图12为5-甲基四氢叶酸对应的标准曲线，线性范围：0.78-50ng/mL。
图13为4-吡哆酸对应的标准曲线，线性范围：0.78-50ng/mL。
图14为5-磷酸吡哆醛对应的标准曲线，线性范围：3.91-250ng/mL。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
一种非衍生化液相色谱-串联质谱测定血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，所述方法步骤包括：将血清样本进行样本前处理，使用还原剂将样本中的同型半胱氨酸还原为游离态，进一步使用提取剂提取血清中的甲基丙二酸、游离同型半胱氨酸和其它代谢产物(蛋氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、4-吡哆酸、5-磷酸吡哆醛)，通过高效液相色谱的方法实现甲基丙二酸和其同分异构体琥珀酸的分离，最后使用同位素内标的方法对所有目标化合物进行定量。
在一些实施例中，所述方法还原剂为40～60mg/mL二硫苏糖醇，优选为50mg/mL。
在一些实施例中，所述方法提取液为10～12wt％三氯乙酸，优选为10wt％。
在一些实施例中，所述方法样本前处理操作为：取100μL人血清于1.5mL离心管中，加入内标工作液5μL，再加入20μL还原剂，涡旋混匀2min，室温静止孵育15min后，加入40μL提取液，涡旋震荡5min后，14000rpm，4℃低温离心15min，取上清液100μL过96孔过滤板，板式离心机3500rpm离心10min，将待测液收集于收集板中。
在一些实施例中，所述方法采用内标法进行定量的各分析物同位素内标为：甲基丙二酸-D3、同型半胱氨酸-D4、甲蛋氨酸-D3、叶酸-D4、5-甲基四氢叶酸13C，D3、4-吡哆酸-D3、5-磷酸吡哆醛-D3。
在一些实施例中，所述方法具体操作步骤：
(1)标准工作液的配制：使用抗坏血酸/柠檬酸/二硫苏糖醇(分别对应浓度0.1mg/mL、0.1mg/mL、15mg/mL)复合稳定剂(含50％甲醇)配制各标准品储备液及混合储备液，然后用校准品稀释液配制不同浓度的混合标准品工作液，分装后放于负20℃及以下温度保存备用。
(2)内标品混合溶液的配制：使用抗坏血酸/柠檬酸/二硫苏糖醇(分别对应浓度0.1mg/mL、0.1mg/mL、15mg/mL)复合稳定剂(含50％甲醇)配制各内标标准品储备液及相应浓度的混合内标品储备液，分装后放于负20℃及以下温度保存备用。
(3)液相色谱串联质谱法检测：将待测样本通过色谱柱分离后，甲基丙二酸及其内标采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，其它化合物及其内标采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，对待测物质进行定性与定量检测。
在一些实施例中，所述色谱条件为：
洗脱流动相A：含10mmoL/L甲酸铵、0.2mmoL/L氟化铵的水，pH为4.18；流动相B：纯甲醇，级别为LC-MS级；色谱柱型号：Gemini 3μm NX-C18
110A,100x2mm；色谱分析时长：8min；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.25ml/min，梯度洗脱条件：0～1min，1％B，1～3min，1％-100％B，3-5min，100％B，5～5.1min，100％-1％B，5.1～8min，1％B(其中，“0～1min，1％B”是指：在0到1min内，流动相B的比例始终为1％；“1～3min，1％-100％B”是指：从1min到3min，流动相B的比例由1％匀速升至100％，其他梯度洗脱段“时间、流动相比例”的含义也遵循以上规则)。
在一些实施例中，所述方法中校准品稀释液为空白人血清配制，含1g/L抗坏血酸作为保护剂。
本发明另一个方面为一种非衍生化液相色谱-串联质谱测定血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物试剂盒，所述试剂盒包括如下组分：
(1)校准品
所述试剂盒中校准品为高浓度校准品冻干粉S7，校准品冻干粉溶解后各化合物浓度：
甲基丙二酸1000ng/mL、同型半胱氨酸20000ng/mL、蛋氨酸15000.00ng/mL、叶酸250.00ng/mL、5-甲基四氢叶酸50.00ng/mL、4-吡哆酸50.00ng/mL、5-磷酸吡哆醛250ng/mL。
(2)校准品稀释液
所述试剂盒中校准品稀释液为冻干粉，主要成分为不含甲基丙二酸的空白人血清，含1g/L抗坏血酸作为保护剂。
(3)质控品
所述试剂盒中包含甲基丙二酸及其它化合物2个不同浓度质控，质控I和质控II,质控干粉溶解后甲基丙二酸和其它化合物浓度：
质控I：甲基丙二酸80ng/mL、同型半胱氨酸1600ng/mL、蛋氨酸1200ng/mL、叶酸20ng/mL、5-甲基四氢叶酸4ng/mL、4-吡哆酸4ng/mL、5-磷酸吡哆醛20ng/mL；
质控II：甲基丙二酸200ng/mL、同型半胱氨酸4000ng/mL、蛋氨酸3000ng/mL、叶酸50ng/mL、5-甲基四氢叶酸10ng/mL、4-吡哆酸10ng/mL、5-磷酸吡哆醛50ng/mL。
(4)内标：含甲基丙二酸及其它化合物干粉，内标干粉溶解后具体浓度：
甲基丙二酸-D3 10μg/mL、同型半胱氨酸-D4 200μg/mL、蛋氨酸-D3
1500μg/mL、叶酸-D4 2.5μg/mL、5-甲基四氢叶酸-13C，D3 1.5μg/mL、4-吡哆酸-D30.75μg/mL、5-磷酸吡哆醛-D3 12.5μg/mL。
(5)还原剂：50mg/mL二硫苏糖醇；
(6)提取液：10％三氯乙酸；
本发明提供一种非衍生化液相色谱-串联质谱测定血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，包括如下步骤：
(1)样本预处理：血清样本使用二硫苏糖醇解离，加入三氯乙酸沉淀，取上清液过96孔板过滤，收集待测液；
(2)HPLC色谱分离：将步骤(1)中预处理的样本5-10μL上样至Gemini 3μmNX-C18110A,100x2mm色谱柱，梯度洗脱分离8min，其中流动相A为含10mmoL/L甲酸铵、0.2mmoL/L氟化铵pH3.8-4.5的缓冲液；流动相B为质谱级纯甲醇；
(3)质谱检测：甲基丙二酸及其同位素内标选择H-ESI负离子模式，其它化合物及其同位素内标选择H-ESI正离子模式，按照表1和表2质谱参数进行检测
在一些实施例中，步骤(1)样本加入二硫苏糖醇解离之前，还加入了甲基丙二酸和其它化合物的内标混合液的操作。
在一些实施例中，步骤(1)样本蛋白沉淀后，还加入了过96孔板过滤的操作。
在一些实施例中，所述步骤(1)具体操作步骤为：取100μL人血清于1.5mL离心管中，加入内标工作液5μL，再加入20μL还原剂，涡旋混匀2min，室温静止孵育15min后，加入40μL提取液，涡旋震荡5min后，14000rpm，4℃低温离心15min，取上清液100μL过96孔过滤板，板式离心机3500rpm离心10min，将待测液收集于收集板中。
在一些实施例中，所述步骤(2)取预处理样本10μL上样至Gemini 3μmNX-C18110A,100x2mm色谱柱，以流速0.25mL/min，25℃柱温洗脱，通过色谱条件的优化，实现甲基丙二酸和其同分异构体琥珀酸的分离，以及其它化合物的分离，所述洗脱流动相A为pH4.18，10mmoL/L甲酸铵、0.2mmoL/L氟化铵缓冲液。
在一些实施例中，所述步骤(3)中甲基丙二酸和其它化合物质谱参数，离子源电压(负)3000V，离子源电压(正)3500V，载气40Arb，辅助气10Arb，离子传输管温度300℃，雾化室温度325℃，多离子反应MRM检测。
在一些实施例中，利用同位素内标的方法，以化合物与同位素内标峰面积的比值为纵坐标，化合物浓度为横坐标，建立校准曲线，对甲基丙二酸、同型半光氨酸及其它化合物进行定量。
本发明还提供一种非衍生化液相色谱-串联质谱测定血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物的试剂盒，其包括：校准品、校准品稀释液、质控品、内标、还原剂、提取液、96孔过滤板、96孔收集板、色谱柱。
本发明所述的试剂盒中所述校准品稀释液为冻干粉，主要成分为不含甲基丙二酸的空白人血清，含1g/L抗坏血酸作为保护剂；
所述校准品，为校准品稀释液配制冻干粉，校准品冻干粉溶解后各化合物浓度：
甲基丙二酸1000ng/mL、同型半胱氨酸20000ng/mL、蛋氨酸15000.00ng/mL、叶酸250.00ng/mL、5-甲基四氢叶酸50.00ng/mL、4-吡哆酸50.00ng/mL、5-磷酸吡哆醛250ng/mL。
所述质控品，为校准品稀释液配制冻干粉；
所述内标为干粉形式；
所述还原剂为50mg/mL二硫苏糖醇；
所述提取液为10％三氯乙酸；
所述色谱柱为Gemini 3μm NX-C18 110A,100x2mm色谱柱；
本发明还提供所述试剂盒在高效液相色谱串联质谱法检测甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其它代谢产物方法中的应用。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1：仪器、材料及试剂
YS EXACT 9900MD超高效液相色谱串联质谱检测系统(山东英盛生物技术有限公司)、甲基丙二酸、琥珀酸、同型半胱氨酸、4-吡哆酸及叶酸标准品粉末购自sigma、蛋氨酸标准品粉末购自EDOM，5-甲基四氢叶酸及5-磷酸吡哆醛标准品粉末购自TRC，所有化合物同位素内标标准品粉末均为TRC产品；质谱级甲醇购自MERK公司；三氯乙酸、抗坏血酸购自sigma，二硫苏糖醇购自上海生工，空白激素血清购自上海谱芬生物科技有限公司
实施例2：校准品、质控品及内标的制备及实验溶液配制方法，包括下列步骤：(1)校准品制备
1)稳定剂配制
分别准确称取10mg抗坏血酸、10mg柠檬酸以及1.5gDTT粉末加入100mL50％的甲醇溶液中，溶解混匀备用，配制容器100mL容量瓶。
2)标准品储备液配制：
分别称量甲基丙二酸、同型半胱氨酸、蛋氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、4-吡哆酸、5-磷酸吡哆醛标准品干粉，分别加入至洁净避光塑料试剂瓶内，使用稳定剂超声溶解，对于不易溶解的酸、5-甲基四氢叶酸、4-吡哆酸、5-磷酸吡哆醛这4种物质分别加入相应的酸或者碱促进其溶解，配制成高浓度的标准品储备液并进行标识，各化合物浓度甲基丙二酸1.0mg/mL、同型半胱氨酸2.0mg/mL、蛋氨酸2.0mg/mL、叶酸1.0mg/mL、5-甲基四氢叶酸1.0mg/mL、4-吡哆酸0.4mg/mL、5-磷酸吡哆醛0.5mg/mL，-70℃或以下保存备用。
3)标准品混合储备液配制：
将表1中的储备液经过稀释后得到混合标准品溶液，稀释步骤见表1，配制完成后贴标签，-70℃或以下保存备用，见表1
表1，混合标准品溶液各化合物浓度及配制方法
| 名称 | 储备液浓度mg/mL | 体积μL | 终浓度μg/mL | 配制体积mL |
| 甲基丙二酸 | 1 | 50.00 | 50.00 | 1.00 |
| 同型半胱氨酸 | 2 | 500.00 | 1000.00 | 1.00 |
| 蛋氨酸 | 2 | 375.00 | 750.00 | 1.00 |
| 叶酸 | 1 | 12.50 | 12.50 | 1.00 |
| 5-甲基四氢叶酸 | 1 | 2.50 | 2.50 | 1.00 |
| 4-吡哆酸 | 0.4 | 6.25 | 2.50 | 1.00 |
| 5-磷酸吡哆醛 | 0.5 | 25.00 | 12.50 | 1.00 |
| 稳定剂 | - | 28.75 | 1.00 |
4)校准品溶液配制
将混合标准品溶液加入校准品稀释液中，搅拌混匀后的浓度见表2，质检合格后按照0.25mL/瓶分装于3mL棕色冻干瓶内。
表2，校准品配制浓度(单位：ng/mL)
5)校准品冻干：
将分装好的校准品溶液置于冷冻干燥机内冻干。冻干粉质检合格后压盖、贴标签，保存于-18℃或以下。
6)校准品冻干粉的使用：
取0.25mL纯水溶解混匀即可得到实验所用最高点校准品溶液，将最高点校准品溶液用校准品稀释液稀释为6个不同浓度校准品溶液，总计7个校准品浓度点：甲基丙二酸：15.63ng/mL、31.25ng/mL、62.50ng/mL、125.00ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL；同型半胱氨酸：312.50ng/mL、625.00ng/mL、1250.00ng/mL、2500.00ng/mL、5000.00ng/mL、10000ng/mL、20000ng/mL；蛋氨酸：234.375ng/mL、468.75ng/mL、937.50ng/mL、1875ng/mL、3750ng/mL、7500ng/mL、15000ng/mL；叶酸：3.91ng/mL、7.81ng/mL、15.63ng/mL、31.25ng/mL、62.50ng/mL、125.00ng/mL、250.00ng/mL；5-甲基四氢叶酸：0.78ng/mL、1.56ng/mL、3.13ng/mL、6.25ng/mL、12.50ng/mL、25.00ng/mL、50.00ng/mL；4-吡哆酸：0.78ng/mL、1.56ng/mL、3.13ng/mL、6.25ng/mL、12.50ng/mL、25.00ng/mL、50.00ng/mL；5-磷酸吡哆醛：3.91ng/mL、7.81ng/mL、15.63ng/mL、31.25ng/mL、62.50ng/mL、125.00ng/mL、250ng/mL。
(2)质控品制备
1)质控I：
参照实施例2中(1)中第4)步，应用校准品稀释液将混合标准品储备液稀释12.5倍，按照0.25mL/瓶分装于3mL棕色冻干瓶内，置于冷冻干燥机内冻干，冻干粉质检合格后压盖、贴标签，保存于-18℃或以下。
2)质控II：
参照实施例2中(1)中第4)步，应用校准品稀释液将混合标准品储备液稀释5倍，按照0.25mL/瓶分装于3mL棕色冻干瓶内，置于冷冻干燥机内冻干，冻干粉质检合格后压盖、贴标签，保存于-18℃或以下。
3)质控品冻干粉的使用：
各250μL纯水加入至质控I、质控II干粉小瓶中，溶解混匀。
(3)内标制备
1)内标储备液配制：
分别称量甲基丙二酸、同型半胱氨酸、蛋氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、4-吡哆酸、5-磷酸吡哆醛标准品的同位素内标粉末，分别加入洁净避光塑料试剂瓶内，使用稳定剂超声溶解，对于不易溶解的叶酸、5-甲基四氢叶酸、4-吡哆酸、5-磷酸吡哆醛这4种物质的同位素内标分别加入相应的酸或者碱促进其溶解，配制成高浓度的内标原液，并进行标识，-70℃或以下保存备用。各化合物同位素内标的原液浓度如下：甲基丙二酸-D3 5mg/mL、同型半胱氨酸-D4 5mg/mL、甲蛋氨酸-D3 5mg/mL、叶酸-D4 1mg/mL、5-甲基四氢叶酸13C，D3 1mg/mL、4-吡哆酸-D3 0.5mg/mL、5-磷酸吡哆醛-D3 1mg/mL。
2)内标混合液配制：
将内标原液从-70℃冰箱取出，有序排列在试剂盒内，按照配方要求用稳定剂稀释至表3内标混合液浓度，混合均匀后质检，合格后按50μL/瓶分装于0.5mL棕色冻存管内。
表3内标混合液配制方法及浓度
3)内标干粉：
将分装后的内标混合液进行氮吹，氮吹15min，观察试剂瓶内物料，直至瓶内无液体，拧好瓶盖质检合格后贴标签，保存于-18℃或以下。
4)内标干粉的使用：
开盖前将内标干粉12000rpm离心1min，加入100μL纯水，超声2min，涡旋1min，瞬时离心30s，制备后的内标浓缩液放置于-18℃以下条件；实验时按1:20比例用还原剂溶液稀释内标浓缩液，将液体彻底混匀，还原剂-内标混合液现用现配。
实施例3：血清样本前处理流程，包括以下步骤：
取100μL人血清于1.5mL离心管中，加入含有内标液的还原剂20μL，涡旋混匀2min，室温静止孵育15min后，加入40μL提取液，涡旋震荡5min后，14000rpm，4℃低温离心15min，取上清液100μL过96孔过滤板，板式离心机3500rpm离心10min，将待测液收集于收集板中。
实施例4：液相色谱-串联质谱法检测
将96孔进样板放入自动进样器中，启用应用软件，建立样品列表。待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离后(梯度洗脱条件如下表4所示)，采用负离子和正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式(MRM质谱参数如下表5所示)，对待测物质进行定量检测。
(1)液相条件：
流速：0.25mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；梯度洗脱条件如下表4：
表4梯度洗脱条件
| 时间(min) | 流动相A比例％ | 流动相B比例％ |
| 0 | 99 | 1 |
| 1 | 99 | 1 |
| 3 | 0 | 100 |
| 5 | 0 | 100 |
| 5.1 | 99 | 1 |
| 8 | 99 | 1 |
(2)质谱条件
YS EXACT 9900MD：喷雾电压3500V(+)、3000V(-)，离子传输管温度300℃，蒸发温度325℃，鞘气40arb，辅助气10arb；采用MRM模式采集数据，条件如下表5：
表5MRM质谱参数
3)数据处理打开各仪器相应的适用软件(YS EXACT 9900MD：TraceFinder；ACQUITY I-S：MassLynx)，选择相应数据进行结果分析。首先以校准品浓度为横坐标，以校准品与内标峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性方程y＝bx+a，将样品与内标的峰面积比代入方程，计算出样品中待测物浓度。
实施例5：方法验证
(1)特异性：
所述甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物液相色谱-串联质谱检测方法MRM检测色谱图，甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物和其同位素内标在血清样本中峰型对称，基本没有杂质峰干扰；甲基丙二酸及其同分异构体琥珀酸能够实现理想的分离，表明该条件能够用于甲基丙二酸等目标化合物的定量分析。
(2)线性范围：
采用同位素内标法，建立校准品定量曲线，测试人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物浓度，各化合物线性范围及相关系数r：甲基丙二酸15.6-1000ng/mLr0.993；同型半胱氨酸156-10000ng/mL r0.997；蛋氨234.38-15000ng/mL r0.999；叶酸3.91-250ng/mL r0.994；5-甲基四氢叶酸0.78-50ng/mL r0.998；4-吡哆酸0.78-50ng/mL0.999；5-磷酸吡哆醛3.91-250ng/mLr0.995；各化合物线性均可覆盖临床参考区间。
(3)定量限：
取空白样本，加入标准溶液梯度稀释配制成评估的方法定量限浓度，平行处理5份，每份样品重复测定3次，得到各化合物定量限，cv均在15％以内：甲基丙二酸15.6ng/mL、同型半胱氨酸312ng/mL、蛋氨酸234.38ng/mL、叶酸3.91ng/mL、5-甲基四氢叶酸0.78ng/mL、4-吡哆酸0.78ng/mL、5-磷酸吡哆醛3.91ng/mL。
(4)精密度和回收率：
取100μL人血清分别加入低、中、高3个浓度水平的混合标准品储备液，每个浓度水平平行处理5份，使用校准曲线测定样本浓度，分别计算回收率。本实验测定3个分析批，2-3天内完成测试，以评价精密度。结果显示各化合物指标均符合要求：回收率满足85％-115％；批内精密度、批间精密度变异系数CV≤15％。结果如下：
甲基丙二酸：加标回收率91.52％-108.28％，批内精密度3.77％-9.26％，批间精密度7.47％-8.06％；同型半胱氨酸：加标回收率95.63％-104.20％，批内精密度0.74％-4.21％，批间精密度2.05％-4.76％；蛋氨酸：加标回收率96.69％-104.14％，批内精密度0.79％-2.35％，批间精密度2.44％-3.75％；叶酸：加标回收率92.31％-109.50％，批内精密度2.32％-7.01％，批间精密度5.0％-8.38％；5-甲基四氢叶酸：加标回收率100.55％-112.50％，批内精密度4.3％-7.5％，批间精密度5.26％-7.22％；4-吡哆酸：加标回收率94.37％-102.39％，批内精密度0.48％-3.85％，批间精密度3.12％-4.05％；5-磷酸吡哆醛：加标回收率94.43％-113％，批内精密度3.85％-12.89％，批间精密度6.18％-10.12％。
实施例6：非衍生化液相色谱-串联质谱测定血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物的试剂盒，试剂盒组分如下表6：
表6试剂盒组分
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实施例7：校准品稀释液配制及冻干
校准品稀释液配制：量取100mL空白人血清，称取0.1g抗坏血酸于空白人血清中，混匀溶解；
校准品稀释液冻干：将校准品稀释液1000μL/瓶分装于冻干瓶中，按照优化好的冻干参数，进行29h的冻干，冻干结束质检合格后压盖，贴标签放于负20℃或者以下保存。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种非衍生化液相色谱-串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，其特征在于，包括：
将血清样本进行前处理，加入还原剂涡旋混匀，孵育15～20min后，加入提取液，涡旋混匀5～6min后，离心，取上清液过滤板、再次离心，收集上清液，即为待测液；
分别配制标准工作液和内标品混合溶液；
采用液相色谱串联质谱法对待测物质进行定性与定检测，将待测样本通过色谱柱分离后，甲基丙二酸及其内标采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，其它化合物及其内标采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，即得；
其中，所述相关代谢产物选自：蛋氨酸、叶酸、5-甲基四氢叶酸、4-吡哆酸、5-磷酸吡哆醛中至少一种。
2.如权利要求1所述的非衍生化液相色谱-串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，其特征在于，所述还原剂为二硫苏糖醇，用量为40～60mg/mL。
3.如权利要求1所述的非衍生化液相色谱-串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，其特征在于，所述提取液为三氯乙酸，浓度为10～12％。
4.如权利要求1所述的非衍生化液相色谱-串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，其特征在于，所述离心的条件为14000～15000rpm，4～5℃下离心15～20min。
5.如权利要求1所述的非衍生化液相色谱-串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，其特征在于，所述再次离心采用板式离心机，3500～4000rpm离心10～15min。
6.如权利要求1所述的非衍生化液相色谱-串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，其特征在于，各分析物同位素内标为：甲基丙二酸-D3、同型半胱氨酸-D4、甲蛋氨酸-D3、叶酸-D4、5-甲基四氢叶酸13C，D3、4-吡哆酸-D3、5-磷酸吡哆醛-D3。
7.如权利要求1所述的非衍生化液相色谱-串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，其特征在于，用0.1mg/mL抗坏血酸、0.1mg/mL柠檬酸、15mg/mL二硫苏糖醇组成含50％甲醇的复合稳定剂配制各标准品储备液及混合储备液，然后用校准品稀释液配制不同浓度的混合标准品工作液，分装后放于-20℃及以下温度保存备用；
或，用0.1mg/mL抗坏血酸、0.1mg/mL柠檬酸、15mg/mL二硫苏糖醇组成含50％甲醇的复合稳定剂配制各内标标准品储备液及相应浓度的混合内标品储备液，分装后放于-20℃及以下温度保存备用。
8.如权利要求1所述的非衍生化液相色谱-串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物方法，其特征在于，所述色谱条件为：洗脱流动相A：含10mmoL/L甲酸铵、0.2mmoL/L氟化铵的水，pH为4.18；流动相B：纯甲醇，级别为LC-MS级；色谱柱型号：Gemini 3μm NX-C18 110A,100x2mm；色谱分析时长：8min；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.25ml/min，梯度洗脱条件：0～1min，1％B，1～3min，1％-100％B，3-5min，100％B，5～5.1min，100％-1％B，5.1～8min，1％B；
或，校准品稀释液为空白人血清配制，含1g/L抗坏血酸作为保护剂。
9.一种非衍生化液相色谱-串联质谱测定人血清中甲基丙二酸、同型半胱氨酸及其相关代谢产物的检测试剂盒，其特征在于，包括：校准品、校准品稀释液、质控品、内标物、还原剂：40～60mg/mL二硫苏糖醇、提取液：10～12％三氯乙酸。
10.权利要求9所述的试剂盒在同型半胱氨酸及其代谢物测定中的应用。
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