CN114487185B - 一种胆固醇通路的分离鉴定方法 - Google Patents
一种胆固醇通路的分离鉴定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114487185B CN114487185B CN202210074015.7A CN202210074015A CN114487185B CN 114487185 B CN114487185 B CN 114487185B CN 202210074015 A CN202210074015 A CN 202210074015A CN 114487185 B CN114487185 B CN 114487185B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- analysis
- cholesterol
- ice
- 5min
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 title claims abstract description 62
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 230000037361 pathway Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims abstract description 5
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 20
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 claims description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 18
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 12
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 12
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 12
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 11
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 9
- 239000000401 methanolic extract Substances 0.000 claims description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 238000007872 degassing Methods 0.000 claims description 3
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000010959 steel Substances 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 39
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 20
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 101100348341 Caenorhabditis elegans gas-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 101100447658 Mus musculus Gas1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100447665 Mus musculus Gas2 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 2
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 1
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031773 Insulin resistance syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical class [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- XYYVYLMBEZUESM-UHFFFAOYSA-N dihydrocodeine Natural products C1C(N(CCC234)C)C2C=CC(=O)C3OC2=C4C1=CC=C2OC XYYVYLMBEZUESM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007878 drug screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000005672 electromagnetic field Effects 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- LLPOLZWFYMWNKH-CMKMFDCUSA-N hydrocodone Chemical compound C([C@H]1[C@H](N(CC[C@@]112)C)C3)CC(=O)[C@@H]1OC1=C2C3=CC=C1OC LLPOLZWFYMWNKH-CMKMFDCUSA-N 0.000 description 1
- 229960000240 hydrocodone Drugs 0.000 description 1
- OROGSEYTTFOCAN-UHFFFAOYSA-N hydrocodone Natural products C1C(N(CCC234)C)C2C=CC(O)C3OC2=C4C1=CC=C2OC OROGSEYTTFOCAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 238000005173 quadrupole mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- LLPOLZWFYMWNKH-UHFFFAOYSA-N trans-dihydrocodeinone Natural products C1C(N(CCC234)C)C2CCC(=O)C3OC2=C4C1=CC=C2OC LLPOLZWFYMWNKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000004724 ultra fast liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002562 urinalysis Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005282 vitamin D3 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011647 vitamin D3 Substances 0.000 description 1
- 229940021056 vitamin d3 Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明提供一种胆固醇通路的分离鉴定方法，所述的方法是将样本处理后利用超高效液相色谱串联质谱的方法进行检测；对所样本中胆固醇代谢通路相关物质进行定性定量分析，每个色谱峰的峰面积(Peak Area)代表对应抗生素的相对含量，最终得到样本中抗生素的定性和定量分析结果，所述的方法可以一次性检测八大类共88胆固醇代谢通路相关物质。
Description
技术领域
本申请涉及样本中标志物的检测，具体涉及胆固醇代谢通路物质的检测，属于生物检测领域。
背景技术
胆固醇是一种环戊烷多氢菲的衍生物，广泛存在于动物体内，是动物组织细胞内不可缺少的物质，同时也是类固醇激素、胆汁酸、维生素D3的前体。随着我国经济的快速发展，人们的生活水平有着显著提高，以肥胖、血脂异常等特征的代谢综合症的发病率显著提高。胆固醇通路涉及血糖代谢、血脂代谢、能量代谢等多种代谢过程，其作为信号分子在人体的代谢中发挥重要的调节作用，对胆固醇通路的分离鉴定，成为了肥胖、胰岛素抵抗、代谢综合征全新研究视角，对代谢组学发展具有重要研究价值，更全面、高效、快速的综合评估人体健康状况。
液相色谱法-质谱联用(英语：Liquid chromatography–mass spectrometry，简称液质联用，英文缩写LC-MS或HPLC-MS)是一种将高效液相色谱(High performance liquidchromatography，简称HPLC)的物理分离能力和质谱(mass spectrometry，简称MS)的质量分析能力结合起来的分析化学技术。LC-MS是一项具有非常高的敏感度和选择性的非常强而有力的分析技术，它使用于很多的领域。一般说来，它的使用方向是在多种其他化合物从在的复合混合物中，测出各种组分并有可能确定其详细结构。LC-MS在尿液中药物筛选分析中的局限性在于它常常不能区分特定的代谢产物，特别是对于氢可酮及其代谢物尤为明显。LC-MS尿液分析测试仅测定特定类别的药物，对于有些药物及其代谢物的测定需要用气相色谱法-质谱联用(Gas chromatography-mass spectrometry，简称GC-MS)。
液相色谱与串联质谱(LC-MS/MS)是基于LC-MS联用后的又一种强大的分析技术，它结合了液相色谱的分离能力和三重四极杆质谱的高灵敏度和选择性质量分析能力。通过在高压下流过的流动相将含有目标分析物的样品溶液泵送通过固定相(LC柱)。样品组分，固定相和流动相之间的化学相互作用影响通过LC柱影响分离的不同迁移速率。多种固定相和流动相组合允许定制分离以适应许多复杂的解决方案。
从LC柱洗脱后，将流出物导入质谱仪。用于LC/MS/MS系统的质谱仪具有电离源，其中LC柱流出物被雾化，去溶剂化和离子化，产生带电粒子。然后，这些带电粒子通过施加电磁场在高真空下通过一系列质量分析器(四极)迁移。目标特定质量/电荷前体离子(或母离子)通过第一个四极杆，排除所有其他质量/电荷比粒子。在碰撞室中，所选择的质量/电荷离子然后通过与惰性气体碰撞而碎裂成产物离子(或子离子)。第三个四极杆用于靶向特定产物离子片段。然后用电子倍增器对得到的分离的产物离子进行定量。离子从前体到产物离子的转变(也称为MS2)对目标化合物的结构具有高度特异性，因此提供高度选择性。该技术的优势在于LC对多种化合物的分离能力，以及MS根据独特的质量/电荷(M/Z)跃迁量化具有高灵敏度和选择性的化合物的能力。每种感兴趣的化合物。
目前现有技术中并没有利用LC-MS/MS的方法检测样本中胆固醇代谢物质的的方法，本发明针对人体重要的四大类胆固醇通路物质(88种)：维生素类、固醇类、类固醇激素类、胆汁酸类进行定性定量检测。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供88种胆固醇代谢通路物质的鉴定方法，该方法能够实现对，通过质谱分析仪鉴定样本中88种抗生素含量，从而指导人对其饮食结构与日常生活进行调整。
本发明的一个方面是提供一种检测样本中88种胆固醇通路物质的方法，所述的方法包括：
1)样本处理：
2)上机检测：
3)数据处理；
所述的检测是利用超高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的方法进行检测；
所述的数据处理是利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据。根据每种物质保留时间和离子对信息，对每种物质在样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。对所样本中胆固醇通路行定性定量分析，每个色谱峰的峰面积(Peak Area)代表对应物质的相对含量，最终得到样本中物质的定性和定量分析结果。
在一个具体的实施例中，所述的样本可以是液体样本、组织样本或细胞样本，其中优选的样本提取方法包括但不限于：
(1)样品为液体样品时：
a.样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后，涡旋10s混匀。
b.自该步骤开始，处理过程在冰上进行，取样本100μL加入到对应的已编号的离心管中，加入400μL纯甲醇提取液。
c.振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃下12000r/min离心10min。
d.取上清液于对应离心管中4℃条件浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶，4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液待用用于LC-MS上机分析；
(2)、组织样本提取方法：
a.样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后称取样本50mg于2mL EP管中。加入一颗小钢珠，30Hz匀浆4次，每次30s。(若样本不易称取，可先取一部分于EP管中，匀浆后再称取50mg。)
b.匀浆完后加入400μL纯甲醇提取液，振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃下12000r/min离心10min。
c.取上清液于对应进EP管中浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶。
d.复溶后于4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液用于LC-MS上机分析；
(3)、细胞样本提取方法：
a.样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后，加入400μL纯甲醇提取液，振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃条件下12000r/min离心10min。
b.取上清液于对应进EP管中浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶。
c.复溶后于4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液用于LC-MS上机分析。
在另外一个具体的实施例中，所述的上机检测中的超高效液相色谱条件主要包括：
色谱柱：Kinetex C18(1.7μm，100mm×2.1mm i.d.)；
流动相A：乙腈/水(30/70，含0.04％的乙酸)；
流动相B：乙腈/异丙醇(50/50，含0.04％的乙酸)；
洗针液：50％甲醇(超声脱气10min)；
柱温：40℃；流速：0.40mL/min；进样量：2μL；
洗脱梯度：0-1min，5％B；1-10min,5％-90％B；10.1-12.5min，90％B；12.6-15min，5％B；
在另外一个具体的实施例中，其中步骤2中的串联质谱的条件为：
| Ion Mode | ESI-/ESI+ | Curtain Gas | 40 |
| IonSpray Voltage | -4500/+5500 | Temperature | 550 |
| Ion Source Gas1 | 50 | Ion Source Gas2 | 60 |
| Collision Gas | Medium | Scan type | sMRM |
| Entrance Potential | -10/10 | Collision Cell Exit Potential | -12/12 |
| MRM detection | 50 | Target Scan Time | 0.1 |
在另外一个具体的实施例中，其中步骤3)数据分析的具体方法为：
(1)样本质控分析：通过对固定浓度的混标质谱检测分析的总离子流图(TIC图)进行重叠展示分析，以判断胆固醇通路相关代谢物提取和检测的重复性。
(2)标准曲线绘制：配制不同浓度的胆固醇通路相关代谢物标准品溶液，获取各个浓度标准品的对应定量信号的质谱峰强度数据；以标准品浓度(ng/mL)为横坐标，质谱峰的峰面积(Peak Area)为纵坐标，绘制不同抗生素的标准曲线。
(3)绝对定量：将检测到的所有样本的所有物质的积分峰面积分别代入标准曲线线性方程进行计算，将计算结果进一步代入含量计算公式计算后得到实际样本中每种胆固醇通路相关代谢物的绝对含量。
本发明的第二个方面提供所述的的方法在检测人体中胆固醇代谢通路中的应用，所述的应用为非诊断的应用。
本发明的第三个方面是提供所述的方法在检测环境或食品中胆固醇代谢通路物质含量中的应用。
本发明的有益效果为：
1.样品处理简单，可同时快速高效定量88种胆固醇通路。
2.质谱检测特异性强，灵敏度高。
3.88种胆固醇通路物质涵盖多个代谢过程，全面监测人体健康。
附图说明
图1为甘油三酯在两种不同能量下相应离子对的TIC重叠图，蓝色为CE＝30eV时的TIC图，红色为CE＝60eV时的TIC图，由图可以看出，两者在保留时间趋势上完全一致。
具体实施方式
实施例1样本提取方法
1、血清样本提取方法：
(1)样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后，涡旋10s混匀。
(2)自该步骤开始，处理过程在冰上进行，取血清样本100μL加入到对应的已编号的离心管中，加入400μL纯甲醇提取液。
(3)振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃下12000r/min离心10min。
(4)取上清液于对应离心管中4℃条件浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶，4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液待用用于LC-MS上机分析。
2、肝脏组织样本提取方法：(1)肝脏样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后称取样本50mg于2mL EP管中。加入一颗小钢珠，30Hz匀浆4次，每次30s。(若样本不易称取，可先取一部分于EP管中，匀浆后再称取50mg。)
(2)匀浆完后加入400μL纯甲醇提取液，振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃下12000r/min离心10min。
(3)取上清液于对应进EP管中浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶。
(4)复溶后于4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液用于LC-MS上机分析。
3、细胞样本提取方法：(1)样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后，加入400μL纯甲醇提取液，振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃条件下12000r/min离心10min。
(2)取上清液于对应进EP管中浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶。
(3)复溶后于4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液用于LC-MS上机分析。
实施例2质谱方法
仪器参数条件：本发明中LC-MS/MS检测所用的数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(Shimpack UFLC SHIMADZU CBM30A)和串联质谱MS/MS(AppliedBiosystems6500Quadrupole Trap)。
其中，超高效液相色谱条件主要包括：
色谱柱：Kinetex C18(1.7μm，100mm×2.1mm i.d.)；
流动相A：乙腈/水(30/70，含0.04％的乙酸)；
流动相B：乙腈/异丙醇(50/50，含0.04％的乙酸)；
洗针液：50％甲醇(超声脱气10min)；
柱温：40℃；流速：0.40mL/min；进样量：2μL；
洗脱梯度：0-1min，5％B；1-10min,5％-90％B；10.1-12.5min，90％B；12.6-15min，5％B；
质谱条件如下：
| Ion Mode | ESI-/ESI+ | Curtain Gas | 40 |
| IonSpray Voltage | -4500/+5500 | Temperature | 550 |
| Ion Source Gas1 | 50 | Ion Source Gas2 | 60 |
| Collision Gas | Medium | Scan type | sMRM |
| Entrance Potential | -10/10 | Collision Cell Exit Potential | -12/12 |
| MRM detection | 50 | Target Scan Time | 0.1 |
实施例3数据处理方法
利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据。根据每种物质保留时间和离子对(表1)信息，对每种物质在样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。对所样本中胆固醇通路行定性定量分析，每个色谱峰的峰面积(Peak Area)代表对应物质的相对含量，最终得到样本中物质的定性和定量分析结果。
(1)样本质控分析：通过对固定浓度的混标质谱检测分析的总离子流图(TIC图)进行重叠展示分析(图1)，以判断胆固醇通路相关代谢物提取和检测的重复性。
(2)标准曲线绘制：配制不同浓度的胆固醇通路相关代谢物标准品溶液，获取各个浓度标准品的对应定量信号的质谱峰强度数据；以标准品浓度(ng/mL)为横坐标，质谱峰的峰面积(Peak Area)为纵坐标，绘制不同抗生素的标准曲线。
(3)绝对定量：将检测到的所有样本的所有物质的积分峰面积分别代入标准曲线线性方程进行计算，将计算结果进一步代入含量计算公式(表2)计算后得到实际样本中每种胆固醇通路相关代谢物的绝对含量。
表1 88种胆固醇通路定量离子对
表2 88种胆固醇通路标曲
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但是并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可做各种改动和修饰，以本领域技术人员结合所属领域的常规技术概括获得的均在本发明的范围之内。
Claims (9)
1.一种检测样本中88种胆固醇通路物质的方法，所述的方法包括：
1)样本处理；
2)上机检测；
3)数据处理；
所述的检测是利用超高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的方法进行检测；
所述的数据处理是利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据；根据每种物质保留时间和离子对信息，对每种物质在样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确；对所述样本中胆固醇通路进行定性定量分析，每个色谱峰的峰面积(Peak Area)代表对应物质的相对含量，最终得到样本中物质的定性和定量分析结果；
其中步骤2)上机检测中的超高效液相色谱条件主要包括：
色谱柱：Kinetex C18，1.7μm，100mm×2.1mm i.d.；
流动相A：乙腈/水，30/70，含0.04％的乙酸；
流动相B：乙腈/异丙醇，50/50，含0.04％的乙酸；
洗针液：50％甲醇，超声脱气10min；
柱温：40℃；流速：0.40mL/min；进样量：2μL；
洗脱梯度：0-1min，5％B；1-10min,5％-90％B；10.1-12.5min，90％B；12.6-15min，5％B；
其中步骤2）中的串联质谱的条件为：
；
其中离子对信息和保留时间如下所示：
。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤1)样本处理的方法为：
(1)样品为液体样品时：
a.样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后，涡旋10s混匀；
b.自该步骤开始，处理过程在冰上进行，取样本100μL加入到对应的已编号的离心管中，加入400μL纯甲醇提取液；
c.振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃下12000r/min离心10min；
d.取上清液于对应离心管中4℃条件浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶，4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液待用用于LC-MS上机分析；
(2)组织样本提取方法：
a.样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后称取样本50mg于2mL EP管中，加入一颗小钢珠，30Hz匀浆4次，每次30s；若样本不易称取，可先取一部分于EP管中，匀浆后再称取50mg；
b.匀浆完后加入400μL纯甲醇提取液，振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃下12000r/min离心10min；
c.取上清液于对应进EP管中浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶；
d.复溶后于4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液用于LC-MS上机分析；
(3)细胞样本提取方法：
a.样本从-80℃冰箱中取出，冰上解冻，解冻后，加入400μL纯甲醇提取液，振荡5min，冰上静置5min，重复操作一次，4℃条件下12000r/min离心10min；
b.取上清液于对应进EP管中浓缩，浓缩后用100μL纯甲醇复溶；
c.复溶后于4℃下12000r/min离心1min，移取80μL上清液用于LC-MS上机分析。
3.权利要求1或2所述的方法，其中步骤3)数据分析的具体方法为：
(1)样本质控分析：通过对固定浓度的混标质谱检测分析的总离子流图(TIC图)进行重叠展示分析，以判断胆固醇通路相关代谢物提取和检测的重复性；
(2)标准曲线绘制：配制不同浓度的胆固醇通路相关代谢物标准品溶液，获取各个浓度标准品的对应定量信号的质谱峰强度数据；以标准品浓度(ng/mL)为横坐标，质谱峰的峰面积(Peak Area)为纵坐标，绘制不同抗生素的标准曲线；
(3)绝对定量：将检测到的所有样本的所有物质的积分峰面积分别代入标准曲线线性方程进行计算，将计算结果进一步代入含量计算公式计算后得到实际样本中每种胆固醇通路相关代谢物的绝对含量。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中标准曲线如下所示：
。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述的样本来自人或动物，样本是体液样本。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的样本是血液或尿液样本。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的样本是血清样本。
8.权利要求1或2所述的方法在检测人体中胆固醇代谢通路中的应用，所述的应用为非诊断的应用。
9.权利要求1-7任一项所述的方法在检测环境或食品中胆固醇代谢通路物质含量中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210074015.7A CN114487185B (zh) | 2022-01-21 | 2022-01-21 | 一种胆固醇通路的分离鉴定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210074015.7A CN114487185B (zh) | 2022-01-21 | 2022-01-21 | 一种胆固醇通路的分离鉴定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114487185A CN114487185A (zh) | 2022-05-13 |
| CN114487185B true CN114487185B (zh) | 2024-05-28 |
Family
ID=81472660
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210074015.7A Active CN114487185B (zh) | 2022-01-21 | 2022-01-21 | 一种胆固醇通路的分离鉴定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114487185B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101308122A (zh) * | 2007-06-01 | 2008-11-19 | 卫生部北京医院 | 一种高密度脂蛋白胆固醇分数酯化速率的测定方法 |
| CN103336065A (zh) * | 2013-01-15 | 2013-10-02 | 东南大学 | 一种同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法 |
| CN105954430A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-09-21 | 大连大学 | 一种血清胆固醇氧化物的检测方法 |
| CN108776185A (zh) * | 2018-07-24 | 2018-11-09 | 曲阜师范大学 | 一种含羟基的胆固醇及其代谢物的检测分析方法 |
| CN109125324A (zh) * | 2017-06-15 | 2019-01-04 | 北京蛋白质组研究中心 | 酰基辅酶a∶胆固醇酰基转移酶-1抑制剂的新用途 |
| CN110187043A (zh) * | 2019-04-25 | 2019-08-30 | 中南民族大学 | 一种同时检测血清中13种甾体激素的方法 |
| CN111487328A (zh) * | 2019-01-27 | 2020-08-04 | 上海歌特维生物科技集团有限公司 | 一种用质谱法检测人体中多种痕量激素的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006047022A1 (en) * | 2004-10-25 | 2006-05-04 | Virginia Commonwealth University | Nuclear sulfated oxysterol, potent regulator of cholesterol homeostasis, for therapy of hypercholesterolemia, hyperlipidemia, and atherosclerosis |
-
2022
- 2022-01-21 CN CN202210074015.7A patent/CN114487185B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101308122A (zh) * | 2007-06-01 | 2008-11-19 | 卫生部北京医院 | 一种高密度脂蛋白胆固醇分数酯化速率的测定方法 |
| CN103336065A (zh) * | 2013-01-15 | 2013-10-02 | 东南大学 | 一种同时提取和检测生物介质中多种激素及其代谢物的方法 |
| CN105954430A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-09-21 | 大连大学 | 一种血清胆固醇氧化物的检测方法 |
| CN109125324A (zh) * | 2017-06-15 | 2019-01-04 | 北京蛋白质组研究中心 | 酰基辅酶a∶胆固醇酰基转移酶-1抑制剂的新用途 |
| CN108776185A (zh) * | 2018-07-24 | 2018-11-09 | 曲阜师范大学 | 一种含羟基的胆固醇及其代谢物的检测分析方法 |
| CN111487328A (zh) * | 2019-01-27 | 2020-08-04 | 上海歌特维生物科技集团有限公司 | 一种用质谱法检测人体中多种痕量激素的方法 |
| CN110187043A (zh) * | 2019-04-25 | 2019-08-30 | 中南民族大学 | 一种同时检测血清中13种甾体激素的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Tudor Mocan等.Plasma fetal bile acids 7α‑hydroxy‑3‑oxochol‑4‑en‑24‑oic acid and 3‑oxachola‑4,6‑dien‑24‑oic acid indicate severity of liver cirrhosis.scientific reports.2021,1-12. * |
| 高效液相色谱法测定油类样品中的胆固醇含量;杨晓燕等;分析仪器(第3期);85-87 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114487185A (zh) | 2022-05-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12066446B2 (en) | Methods for detecting dihydroxyvitamin D metabolites by mass spectrometry | |
| US11821889B2 (en) | Vitamin B2 detection by mass spectrometry | |
| CA2856835C (en) | Methods for detecting reverse triiodothyronine by mass spectrometry | |
| CN105527364A (zh) | 超高效液相色谱串联质谱检测血清25羟基维生素d的方法 | |
| CN108776185B (zh) | 一种含羟基的胆固醇及其代谢物的检测分析方法 | |
| US11624737B2 (en) | Methods for detecting lacosamide by mass spectrometry | |
| Kamemura et al. | Sample-multiplexing by derivatization using multiple analogous reagents for enhancing throughput in LC/ESI-MS/MS assay of steroids: Plasma 17α-hydroxyprogesterone as an example | |
| CN114487185B (zh) | 一种胆固醇通路的分离鉴定方法 | |
| Ludovici et al. | Principles, current applications, and future perspectives of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical chemistry | |
| Jia et al. | Rapid determination of 20 bile acids in human serum by ultra performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry | |
| Li et al. | A new method based on dispersive liquid–liquid microextraction for fat‐soluble vitamin determination in serum by LC–MS/MS | |
| CN113341023B (zh) | 一种基于液质联用的血清二氨基庚二酸的检测试剂盒及检测方法与应用 | |
| CN118169296A (zh) | 一种鞣花酸及其代谢产物的检测方法 | |
| CN115047087A (zh) | 一种同时检测血清样本中氧化三甲胺类物质的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |