CN108776185A - 一种含羟基的胆固醇及其代谢物的检测分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析化学领域,具体涉及一种含羟基的胆固醇及其代谢物的检测分析方法。该检测分析方法具体为：所述含羟基的胆固醇及代谢物与衍生试剂d 0‑/d 3‑3‑N‑甲基‑2’‑羧基罗丹明6G发生稳定同位素标记衍生反应，磁分散固相萃取后得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱分析系统进行检测。本发明利用带有永久正电荷d 0‑/d 3‑MCR6G的稳定同位素标记衍生试剂对生物样品中含羟基的胆固醇及代谢物进行标记，衍生化反应条件温和、快速，衍生化效率高，利用磁分散固相萃取技术提高了萃取效率、减少了样品前处理时间，能够显著提高分析物的色谱分离度和质谱离子化效率，并降低基质干扰。

Description

一种含羟基的胆固醇及其代谢物的检测分析方法
技术领域
本发明涉及分析化学领域, 具体涉及一种含羟基的胆固醇及其代谢物的检测分析方法，尤其是涉及一种利用d 0-/d 3-3-N-甲基-2’-羧基罗丹明6G（d 0-/d 3-MCR6G）作为衍生试剂，微波辅助-稳定同位素标记衍生-磁分散固相萃取联合超高效液相色谱三重四极杆串联质谱检测的分析方法。
背景技术
含羟基的胆固醇及其代谢物是一类含有游离羟基且浓度较低的生物有机分子，存在于生物样品中，如血浆、脑脊液、肝组织、尿液和粪便等。这些化合物在大量生物体中都扮演着细胞膜的信号传导、调节和新陈代谢的重要角色。近期研究表明，含羟基的胆固醇及代谢物的浓度水平与神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化有紧密关系。
多种分析方法已被开发用于生物样品中含羟基的胆固醇及代谢物的分析，包括免疫分析、薄层层析、气相色谱-质谱和液相色谱-质谱等。文献《Simultaneousdetermination of oxysterols, cholesterol and 25-hydroxy-vitamin D3 in humanplasma by LC-UV-MS》（PLoS One 2015, 10: e0123771）采用LC-UV-MS检测法对血浆样品中的羟基化合物进行分析，能够满足常规临床分析要求。文献《超高效液相色谱-串联质谱法测定食用植物油中胆固醇含量》（理化检验-化学分册，2012，48(7): 831-833）和《固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法同时测定婴幼儿配方食品中维生素 D2和 D3》（中国卫生检验杂志，2014，24 (22): 3203-3207）使用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）对相关羟基分析物进行检测，相比而言在色谱分离度和质谱选择性、灵敏度方面有所提高。以上三类分析方法都采用同位素内标法进行定量，达到了降低基质效应的目的，但需要购买昂贵的同位素内标物。同时，上述直接检测方法存在检测灵敏度低、潜在的色谱分离干扰、质谱离子化效率低等缺点。专利（CN 105954430 A）公开了一种以硅烷化试剂（Tri-Sil）作为衍生试剂，通过液质联用对血清胆固醇氧化物进行测定的分析方法，显著提高了胆固醇氧化物的灵敏度。但因其在生物样品中浓度低，存在内源性干扰等，方法的灵敏度和准确度仍不足。文献《Quantification of oxysterols in human plasma and red blood cell s byliquid chromatography high-resolution tandem mass spectrometry》（Journal ofChromatography A, 2016, 1439: 82–88）以N，N-二甲基甘氨酸（DMG）作为衍生试剂同时利用同位素内标法进行定量，提高了分析方法的准确度、灵敏度和选择性。但是，大量生物代谢物没有同位素标准品可供购买，且通常它们价格十分昂贵。因此，合成一种含有稳定同位素标签的衍生试剂，对代谢物标准品进行衍生后的产物作为内标物成为了亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何快速、准确且高灵敏的测定生物样品中含羟基的胆固醇及其代谢物。本发明的目的是提供一种含羟基的胆固醇及其代谢物的检测分析方法，本发明提供的稳定同位素标记衍生技术，通过轻/重标衍生试剂分别对实际样品和混合标准品溶液中的含羟基胆固醇及其代谢物进行衍生化，然后进行萃取和检测的分析方法。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种含羟基的胆固醇及其代谢物的检测分析方法，该检测方法具体为：所述含羟基的胆固醇及代谢物与衍生试剂d 0-/d 3-3-N-甲基-2’-羧基罗丹明6G（d 0-/d 3-MCR6G）发生稳定同位素标记衍生反应，磁分散固相萃取后得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱分析系统进行检测。
进一步的，本发明提供的检测分析方法具体包括以下步骤：
a. 微波辅助-稳定同位素标记衍生-磁分散固相萃取：取50-100 μL预处理的待测样品或标准品混合溶液，25 μL CMPI（2-氯-1-甲基碘代吡啶）和25 μL DMAP（4-二甲氨基吡啶）乙腈溶液加入离心管中，涡旋10秒后，加入100-200 μL d 0-MCR6G或d 3-MCR6G乙腈溶液，摇匀后密封并在微波反应器中反应7-8分钟，d 0-MCR6G标记的待测样品和d 3-MCR6G标记的标准品1:1（V/V）混合，摇匀得混合溶液，将5-6 mg吸附剂分散到混合溶液中，溶液pH调至6-7, 振荡4分钟；磁性分离，用解吸剂将吸附的目标物从吸附剂上解吸下来，磁性分离，氮气吹干，残余物用200-300 μL甲醇重新溶解，得到含羟基的胆固醇及代谢物的同位素标记衍生物萃取溶液；
b. 将含羟基的胆固醇及代谢物的同位素标记衍生物萃取溶液经滤膜过滤，利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。进一步的，步骤（a）中，所述CMPI乙腈溶液的浓度为5-7.5 wt%；所述DMAP乙腈溶液的浓度为10-15 wt%；所述d 0-MCR6G或d 3-MCR6G乙腈溶液的浓度均为1.0×10-3 mol/L；所述微波反应器的功率为650-800 W，在微波反应器中反应的温度为45-55℃；所述含羟基的胆固醇及其代谢物标准品混合溶液浓度介于2-3000pg/mL。
进一步的，所述吸附剂为Fe3O4/GO；所述解吸剂为含1% 甲酸的甲醇、乙腈、乙醇或丙酮；所述优化的解析剂为含1%甲酸的甲醇。
上述的Fe3O4/GO采用以下方法制备得到：将0.5 g Fe3O4分散在1 M HNO3中，然后0.1 g氧化石墨烯超声处理30 min制备得到1 mg/mL的氧化石墨烯水溶液分散体，将上述得到的Fe3O4溶液添加到GO分散液中，机械搅拌30 min后，经离心并施加外部磁铁从深黑色溶液分离出Fe3O4/GO固体，将该固体用高纯水洗涤5次，并在真空烘箱中60℃下干燥得到所述磁性材料。
本发明所使用的衍生试剂d 0-/d 3-MCR6G采用以下方法制备而成：将1g罗丹明6G溶于30 mLDMF中，室温下搅拌5分钟后，缓慢加入0.217 g NaH，反应3分钟，然后在3-5分钟内分两批加入330μL CH3I或CD3I，室温反应150分钟后，加入150 mL水；用150 mL氯仿萃取混合物两次，合并有机层并减压蒸馏得粗产物，经甲醇/氯仿（1:1, V/V）重结晶，得到紫红色固体d 0-MCR6G或d 3-MCR6G。
进一步的，所述NaH采用煤油作为载体；所述NaH在煤油中的质量百分含量为60%。
本发明所检测的含羟基的胆固醇及代谢物为：胆固醇（Cholesterol）、24-羟基胆固醇（24-HC）、25-羟基胆固醇（25-HC）、27-羟基胆固醇（27-HC）、7α-羟基胆固醇（7α-HC）、7-酮基胆固醇（7-KC）、7-脱氢胆固醇（7-DHC）、维生素D3（VD3）和25-羟基维生素D3（25-HVD3）。
进一步的，所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱：2.1 mm × 50 mm，1.8 µm，进样体积为2 µL，柱温30 °C，采用梯度洗脱法。
上述梯度洗脱法，时间为6.8 min，流速为0.2 mL/min，流动相A为10%甲醇水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为含有0.1%甲酸的甲醇，0 min流动相组成为75% A+25% B，5 min时15% A+85% B，5.5 min时2% A+98% B，6.8 min时2% A+98% B。
进一步的，所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中质谱的条件为：干燥气温度310 °C，流速12 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度300 °C，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。
本发明提供了一种同时检测生物样品中含羟基的胆固醇及其代谢物的分析方法，所述的含羟基的胆固醇及代谢物在最优化条件下与衍生试剂d 0-/d 3-MCR6G发生稳定同位素标记衍生反应，得到的衍生化产物经磁分散固相萃取和滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。
本发明流动相中各分数均指体积分数；所述解吸剂为含1% 甲酸的甲醇、乙腈、乙醇或丙酮中，1%为体积分数。
本发明所使用的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统由安捷伦1290系列超高效液相色谱，配备安捷伦6460三重四极杆串联质谱系统组成。
所述的含羟基的胆固醇及其代谢物化学结构和代谢途径关系如下：
本发明利用微波辅助-稳定同位素标记衍生-磁分散固相萃取技术联合超高效液相色谱三重四极杆质谱法，准确、灵敏、快速的测定生物样品中含羟基的胆固醇及代谢物。首次设计合成了一对含有同位素标签和永久正电荷的罗丹明6G类衍生化试剂（d 0-/d 3-MCR6G），用于标记含羟基的胆固醇及代谢物。因此，对分析物通过稳定同位素标记衍生化反应得到的衍生物进行检测时，衍生产物母离子能够产生特异性的含有永久正电荷和同位素标签的罗丹明报告离子，以d 3-MCR6G标记的标准品作为内标，可降低基质效应、提高定量准确度，这些优点显著提高了质谱检测的灵敏度、准确度、选择性。此外，含羟基的胆固醇及代谢物所含有的活性羟基，能够和同位素标记衍生试剂d 0-/d 3-MCR6G的活性羧基在微波作用下迅速反应。本发明克服了常规方法的衍生反应时间长、灵敏度低、基质干扰严重等问题。本发明为含羟基的胆固醇及代谢物的检测提供了一种可靠的技术手段。d 0-/d 3-MCR6G作为稳定同位素标记衍生试剂的衍生化反应过程如下所示：
本发明中采用微波辅助-稳定同位素标记衍生-磁分散固相萃取法对SD大鼠血浆、脑脊液、肝组织、尿液和粪便等生物样品中的含羟基的胆固醇及其代谢物进行前处理，该技术具有简单、快速、灵敏、高效等优点。
本发明的优点及有益效果：
1. 本发明利用首次设计合成的带有永久正电荷d 0-/d 3-MCR6G的稳定同位素标记衍生试剂对生物样品中含羟基的胆固醇及代谢物进行标记，衍生化反应条件温和、快速，衍生化效率高，同时利用磁分散固相萃取技术提高了萃取效率、减少了样品前处理时间，能够显著提高分析物的色谱分离度和质谱离子化效率，并降低基质干扰。
2. 本发明通过微波辅助衍生-磁分散固相萃取技术，联合多反应监测模式超高效液相色谱三重四极杆串联质谱的分析方法，具有简单、快速、准确、高选择性和高灵敏的优点。
3. 本发明的分析方法可应用于可能含羟基代谢物的血浆、脑脊液、肝组织、尿液和粪便等复杂生物样品，分析方法的适用性良好。
附图说明
图1为实施例1中9种含羟基的胆固醇及代谢物标准品衍生物的质谱检测分离图。
图2为实施例1中衍生物质谱裂解机理示意图：(A) d 0-MCR6G-胆固醇衍生物；(B)d 3-MCR6G-胆固醇衍生物。
图3为实施例2中大鼠血浆9种含羟基的胆固醇及代谢物的衍生物的质谱检测分离图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行进一步的阐述，下述说明仅为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
本发明所使用的甲醇、乙腈和甲酸等化学试剂为色谱纯，水为高纯水。
本发明中稳定同位素标记衍生物的萃取物经滤膜（0.22 μm）过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。
实施例1
含羟基的胆固醇及代谢物的色谱分离和质谱定性定量分析方法：
在2-3000 pg/mL范围内，配制7个不同浓度的d 0-MCR6G标记的含羟基的胆固醇及其代谢物标准溶液（10 pg/mL, 100 pg/mL, 500 pg/mL, 1000 pg/mL, 1500 pg/mL, 2000 pg/mL, 2500 pg/mL），其中以d 3-MCR6G标记的标准品（800 pg/mL）作为固定内标。具体的衍生化过程如下：上述不同浓度水平的混标溶液1份，25 μL CMPI（7.5 wt%）和25 μL DMAP（13wt%）乙腈溶液，100 μL d 0-MCR6G或d 3-MCR6G乙腈溶液，依次加入1.5 mL的离心管中，涡旋10秒。密封并在50 °C在微波反应器（750 W）中反应7.5分钟。将7个浓度水平的d 0-MCR6G混标衍生物和d 3-MCR6G标记的固定混标衍生物分别1:1（V/V）混合，摇匀。磁分散固相萃取过程如下：将5.5 mg Fe3O4/GO分散到上述混合溶液中，溶液pH调至7, 振荡4分钟以达到吸附平衡。磁性分离，倾去上清液，用甲醇（含1% 甲酸）将吸附的目标物从Fe3O4/GO上解吸下来，氮气吹干。残余物用200 μL甲醇重新溶解，经有机滤膜过滤后进样2 µL，进行超高效液相色谱三重四极杆串联质谱法检测分析。依据d 0-/d 3-MCR6G衍生物的峰面积比值（d 0-MCR6G混标衍生物/d 3-MCR6G固定内标）与d 0-MCR6G标记的标准品浓度进行线性回归，制作校准曲线，按照上述分析过程对实际样品进行测定的峰面积带入线性方程计算实际样品含量。
流动相A为10%甲醇水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为含有0.1%甲酸的甲醇，按照上述部分的梯度洗脱程序能得到较好的分离度，图1为9种含羟基的胆固醇及其代谢物标准品衍生物的质谱检测分离图，9种分析物之间分离度良好，轻重标衍生物的保留时间差不大于0.02 min。质谱分析实验结果表明，各种分析物的稳定同位素标记衍生物在多反应监测模式（MRM）下产生一对相同的子离子m/z 429.3（轻标）和m/z 432.3（重标）。以胆固醇衍生物为例，图2（A）为d 0-MCR6G-胆固醇衍生物质谱裂解机理示意图，母离子为[M]+ m/z 797.5，在MRM检测时产生特异性子离子m/z 429.3。图2（B）为d 3-MCR6G-胆固醇衍生物质谱裂解机理示意图，母离子为[M]+ m/z 800.5，在MRM检测时产生特异性子离子m/z 432.3。对MRM模式的参数进行了优化，分析物的母离子、子离子、最优化碎裂电压（V）和电离能（eV）以及线性方程的相关系数、检出限和回收率见表 1。
表1
实施例2
血浆中含羟基的胆固醇及代谢物的提取包括以下操作步骤：
吸取500 μL血浆, 加入200 μL 10% 三氯醋酸沉淀蛋白，振荡后离心, 取上清液, 室温下氮气吹干, 残渣以200 μL乙腈充分溶解，以备稳定同位素标记衍生。取50 µL血浆乙腈溶液或标准品混合溶液，25 μL CMPI（5.5 wt%）和25 μL DMAP（12 wt%）乙腈溶液加入1.5mL的离心管中。涡旋10秒后，加入100 μL d 0-MCR6G或d 3-MCR6G乙腈溶液。摇匀后密封并在55°C在微波反应器（800W）中反应7.5分钟。d 0-MCR6G标记的脑脊液样品和d 3-MCR6G标记的标准品1:1（V/V）混合，摇匀。将5.5 mg Fe3O4/GO分散到上述混合溶液中，溶液pH调至7, 振荡4分钟以达到吸附平衡。磁性分离，倾去上清液，用甲醇（含1% 甲酸）将吸附的目标物从Fe3O4/GO上解吸下来，氮气吹干。残余物用200 μL甲醇重新溶解，经有机滤膜过滤后进样2 µL，进行超高效液相色谱三重四极杆串联质谱法检测分析。血浆中含羟基的胆固醇及其代谢物的含量根据实施例1建立的定量方程计算得出。
实施例3
脑脊液中含羟基的胆固醇及代谢物的提取包括以下操作步骤：
取脑脊液200 μL到离心管中, 室温下氮气吹干, 残渣以200 μL乙腈充分溶解。取50 µL脑脊液乙腈复溶液或标准品混合溶液，25 μL CMPI（6 wt%）和25 μL DMAP（14 wt%）乙腈溶液加入1.5 mL的离心管中。涡旋10秒后，加入100 μL d 0-MCR6G或d 3-MCR6G乙腈溶液。摇匀后密封并在50 °C在微波反应器（750W）中反应7.5分钟。d 0-MCR6G标记的脑脊液样品和d 3-MCR6G标记的标准品1:1（V/V）混合，摇匀。将5 mg Fe3O4/GO分散到上述混合溶液中，溶液pH调至6, 振荡4分钟以达到吸附平衡。磁性分离，倾去上清液，用甲醇（含1% 甲酸）将吸附的目标物从Fe3O4/GO上解吸下来，氮气吹干。残余物用200 μL甲醇重新溶解，经有机滤膜过滤后进样2 µL，进行超高效液相色谱三重四极杆串联质谱法检测分析。脑脊液中含羟基的胆固醇及其代谢物的含量根据实施例1建立的定量方程计算得出。
实施例4
肝组织中含羟基的胆固醇及代谢物的提取包括以下操作步骤：
取约100 mg肝组织样品，生理盐水冲洗，滤纸吸干后称重。加入500 μL甲醇混匀, 匀浆，超声破碎细胞。4 °C离心20 min (15000 r/min), 取出上清液, 室温下氮气吹干, 残渣以200 μL乙腈充分溶解。取50 µL肝组织乙腈溶液或标准品混合溶液，25 μL CMPI（5.5wt%）和25 μL DMAP（12 wt%）乙腈溶液加入1.5 mL的离心管中。涡旋10秒后，加入100 μLd 0-MCR6G或d 3-MCR6G乙腈溶液。摇匀后密封并在55 °C在微波反应器（650 W）中反应7.5分钟。d 0-MCR6G标记的脑脊液样品和d 3-MCR6G标记的标准品1:1（V/V）混合，摇匀。将5 mgFe3O4/GO分散到上述混合溶液中，溶液pH调至7, 振荡4分钟以达到吸附平衡。磁性分离，倾去上清液，用甲醇（含1% 甲酸）将吸附的目标物从Fe3O4/GO上解吸下来，氮气吹干。残余物用200 μL甲醇重新溶解，经有机滤膜过滤后进样2 µL，进行超高效液相色谱三重四极杆串联质谱法检测分析。肝组织中含羟基的胆固醇及其代谢物的含量根据实施例1建立的定量方程计算得出。
实施例5
尿液中含羟基的胆固醇及代谢物的提取包括以下操作步骤：
取尿液500 μL，依次向尿液中加入 pH 5.5 NaAc-HAc缓冲溶液100 μL, β-葡萄糖苷酸酶和硫酸酯酶混合液 (15 units/mLβ-葡萄糖苷酸酶和 30 units/mL 硫酸酯酶) 20 μL,混合均匀，37 °C水浴2 h 后，冷却至室温。二氯甲烷-正己烷( 4:1，V/V) 混合液萃取两次，合并萃取液，室温下氮气吹干，残渣以200μL乙腈充分溶解。取50 µL尿液乙腈溶液或标准品混合溶液，25 μL CMPI（6.5 wt%）和25 μL DMAP（15 wt%）乙腈溶液加入1.5 mL的离心管中。涡旋10秒后，加入100 μL d 0-MCR6G或d 3-MCR6G乙腈溶液。摇匀后密封并在45 °C在微波反应器（750W）中反应7.5分钟。d 0-MCR6G标记的脑脊液样品和d 3-MCR6G标记的标准品1:1（V/V）混合，摇匀。将6 mg Fe3O4/GO分散到上述混合溶液中，溶液pH调至7, 振荡4分钟以达到吸附平衡。磁性分离，倾去上清液，用甲醇（含1% 甲酸）将吸附的目标物从Fe3O4/GO上解吸下来，氮气吹干。残余物用200 μL甲醇重新溶解，经有机滤膜过滤后进样2 µL，进行超高效液相色谱三重四极杆串联质谱法检测分析。尿液中含羟基的胆固醇及其代谢物的含量根据实施例1建立的定量方程计算得出。
实施例6
粪便中含羟基的胆固醇及代谢物的提取包括以下操作步骤：
称取100 mg冷冻干燥粪便样品，用1.0 mL柠檬酸酸化乙腈提取, 粪便样品在漩涡混匀器上混匀, 25 °C超声，4 °C下离心15 min (4500 r/min), 重复提取两次, 取上清液, 室温下氮气吹干, 残渣以200 μL乙腈充分溶解。取50 µL粪便乙腈溶液或标准品混合溶液，25μL CMPI（6 wt%）和25 μL DMAP（12 wt%）乙腈溶液加入1.5 mL的离心管中。涡旋10秒后，加入100 μL d 0-MCR6G或d 3-MCR6G乙腈溶液。摇匀后密封并在50 °C在微波反应器（700 W）中反应7.5分钟。d 0-MCR6G标记的脑脊液样品和d 3-MCR6G标记的标准品1:1（V/V）混合，摇匀。将5.5 mg Fe3O4/GO分散到上述混合溶液中，溶液pH调至7, 振荡4分钟以达到吸附平衡。磁性分离，倾去上清液，用甲醇（含1% 甲酸）将吸附的目标物从Fe3O4/GO上解吸下来，氮气吹干。残余物用200 μL甲醇重新溶解，经有机滤膜过滤后进样2 µL，进行超高效液相色谱三重四极杆串联质谱法检测分析。粪便中含羟基的胆固醇及其代谢物的含量根据实施例1建立的定量方程计算得出。
将实施例1-6进行超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析，使用安捷伦SBC18色谱柱：2.1 mm × 50 mm，1.8 µm，进样体积为2 µL，柱温30 ℃，采用梯度洗脱法；梯度洗脱法，时间为6.8 min，流速为0.2 mL/min，流动相A为10%甲醇水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为含有0.1%甲酸的甲醇，0 min流动相组成为75% A+25% B，5 min时15% A+85% B，5.5min时2% A+98% B，6.8 min时2% A+98% B；所述质谱的条件为：干燥气温度310 °C，流速12L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度300 °C，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。以SD大鼠血浆样品为例，质谱检测分离图见图3。上述各种实际样品中检测到含羟基的胆固醇及代谢物的含量（n=3) 如表2所示。
表2
-：未检测到。
对比例1
该对比例实验过程与实施例2相似，不同在于检测方法不同，对比例1采用了LC-UV-MS直接检测与部分成分衍生化的混合模式，胆固醇和氧固醇无衍生化技术，维生素D进行了衍生化，以4-苯基-1, 2, 4-三唑啉-3, 5-二酮 （PTAD）为衍生试剂，采用了商业化同位素内标物。
对比例2
该对比例过程与实施例2相同，不同在于无衍生化反应过程，内标不同，进行对比。
对比例3
该对比例过程与实施例2相同，不同在于无衍生化反应过程，内标不同，进行对比。
对比例4
该对比例过程与实施例2相同，不同在于衍生化反应过程中，衍生条件不同，采用Tri-Sil试剂作为衍生试剂，内标不同，进行对比。
对比例5
该对比例过程与实施例2相同，不同在于衍生化反应过程中，衍生条件不同，采用DMG作为衍生试剂，内标不同，进行对比。
下表3为实施例2同对比例1-5的实验结果对比。
表3
表3结果表明，本发明利用微波辅助-稳定同位素标记衍生-磁分散固相萃取技术，具有简便、快速、灵敏、回收率高等优点。本发明的检出限比对比例低800-30000倍左右。本发明使用稳定同位素标记衍生试剂，代替了传统的衍生试剂和同位素内标稀释法，显著降低了基质效应，提高了检测的准确度和灵敏度。
本分析方法中含羟基的胆固醇及其代谢物的线性范围2-3000pg/mL，检出限分布于0.24-0.31 pg/mL之间，定量限分布于1.5-1.8 pg/mL之间。表1-2结果表明，所建立的分析方法能够很好地应用于不同生物样品中的含羟基的胆固醇及其代谢物的含量测定。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，且本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种含羟基的胆固醇及其代谢物的检测分析方法，其特征在于：所述含羟基的胆固醇及代谢物与衍生试剂d 0-/d 3-3-N-甲基-2’-羧基罗丹明6G（d 0-/d 3-MCR6G）发生稳定同位素标记衍生反应，磁分散固相萃取后得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱分析系统进行检测。
2.根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
a. 微波辅助-稳定同位素标记衍生-磁分散固相萃取：取50-100 μL预处理的待测样品或标准品混合溶液，25 μL CMPI和25 μL DMAP乙腈溶液加入离心管中，涡旋10秒后，加入100-200 μL d 0-MCR6G或d 3-MCR6G乙腈溶液，摇匀后密封并在微波反应器中反应7-8分钟，d 0-MCR6G标记的待测样品和d 3-MCR6G标记的标准品1:1（V/V）混合，摇匀得混合溶液，将5-6mg吸附剂分散到混合溶液中，溶液pH调至6-7, 振荡4分钟；磁性分离，用解吸剂将吸附的目标物从吸附剂上解吸下来，磁性分离，氮气吹干，残余物用200-300 μL甲醇重新溶解，得到含羟基的胆固醇及代谢物的同位素标记衍生物萃取溶液；
b. 将含羟基的胆固醇及代谢物的同位素标记衍生物萃取溶液经滤膜过滤，利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。
3.根据权利要求2所述的检测分析方法，其特征在于，步骤（a）中，所述CMPI乙腈溶液的浓度为5-7.5 wt%；所述DMAP乙腈溶液的浓度为10-15 wt%；所述d 0-MCR6G或d 3-MCR6G乙腈溶液的浓度均为1.0×10-3 mol/L；所述微波反应器的功率为650-800 W，在微波反应器中反应的温度为45-55℃；所述含羟基的胆固醇及其代谢物标准品混合溶液浓度介于2-3000pg/mL。
4.根据权利要求2或3所述的检测分析方法，其特征在于，所述吸附剂为Fe3O4/GO；所述解吸剂为含1% 甲酸的甲醇、乙腈、乙醇或丙酮；所述优化的解析剂为含1%甲酸的甲醇。
5.根据权利要求2-4任一项所述的检测分析方法，所述d 0-/d 3-MCR6G采用以下方法制备而成：将1g罗丹明6G溶于30 mLDMF中，室温下搅拌5分钟后，缓慢加入0.217 g NaH，反应3分钟，然后在3-5分钟内分两批加入330μL CH3I或CD3I，室温反应150分钟后，加入150 mL水；用150 mL氯仿萃取混合物两次，合并有机层并减压蒸馏得粗产物，经甲醇/氯仿（1:1, V/V）重结晶，得到紫红色固体d 0-MCR6G或d 3-MCR6G。
6.根据权利要求5所述的检测分析方法，其特征在于，所述NaH采用煤油作为载体；所述NaH在煤油中的质量百分含量为60%。
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测分析方法，其特征在于，所述含羟基的胆固醇及代谢物为：胆固醇（Cholesterol）、24-羟基胆固醇（24-HC）、25-羟基胆固醇（25-HC）、27-羟基胆固醇（27-HC）、7α-羟基胆固醇（7α-HC）、7-酮基胆固醇（7-KC）、7-脱氢胆固醇（7-DHC）、维生素D3（VD3）和25-羟基维生素D3（25-HVD3）。
8.根据权利要求1-7任一项所述的检测分析方法，其特征在于，所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱：2.1 mm × 50 mm，1.8 µm，进样体积为2 µL，柱温30 °C，采用梯度洗脱法。
9.根据权利要求8所述的检测分析方法，其特征在于，所述梯度洗脱法，时间为6.8min，流速为0.2 mL/min，流动相A为10%甲醇水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为含有0.1%甲酸的甲醇，0 min流动相组成为75% A+25% B，5 min时15% A+85% B，5.5 min时2% A+98% B，6.8 min时2% A+98% B。
10.根据权利要求9所述的检测分析方法，其特征在于，所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中质谱的条件为：干燥气温度310 °C，流速12 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度300 °C，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109633141A (zh) * 2018-12-29 2019-04-16 辉源生物科技（上海）有限公司 一种胆固醇以及脂肪酸代谢抑制药物的高通量评价方法
CN111057055A (zh) * 2019-12-10 2020-04-24 曲阜师范大学 一种检测羟基多环芳烃的多通道质谱衍生试剂及其制备方法与应用
CN113237982A (zh) * 2021-04-30 2021-08-10 厦门市迈理奥科技有限公司 一种羟基类代谢物的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法
CN114487209A (zh) * 2022-03-08 2022-05-13 天津国科医工科技发展有限公司 基于磁性固相萃取的脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法
CN114487185A (zh) * 2022-01-21 2022-05-13 武汉迈特维尔生物科技有限公司 一种胆固醇通路的分离鉴定方法
CN114577949A (zh) * 2022-03-15 2022-06-03 北京华氏精恒医药科技有限公司 一种基于lc-ms/ms法检测25-羟基胆固醇的方法、试剂盒及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104807921A (zh) * 2015-05-21 2015-07-29 上海迪安医学检验所有限公司 高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的方法
CN105954430A (zh) * 2016-07-08 2016-09-21 大连大学 一种血清胆固醇氧化物的检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104807921A (zh) * 2015-05-21 2015-07-29 上海迪安医学检验所有限公司 高效液相色谱串联质谱技术检测血清中10种类固醇激素的方法
CN105954430A (zh) * 2016-07-08 2016-09-21 大连大学 一种血清胆固醇氧化物的检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAN-EN ZHAO ET AL.: "Sensitive determination of cholesterol and its metabolic steroid hormones by UHPLC–MS/MS via derivatization coupled with dual ultrasonic-assisted dispersive liquid–liquid microextraction", 《RAPID COMMUN. MASS SPECTROM.》 *
赵先恩等: "基于化学衍生的靶向代谢组学LC-MS分析", 《中国化学会第十九届全国有机分析及生物分析学术研讨会》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109633141A (zh) * 2018-12-29 2019-04-16 辉源生物科技（上海）有限公司 一种胆固醇以及脂肪酸代谢抑制药物的高通量评价方法
CN111057055A (zh) * 2019-12-10 2020-04-24 曲阜师范大学 一种检测羟基多环芳烃的多通道质谱衍生试剂及其制备方法与应用
CN111057055B (zh) * 2019-12-10 2022-03-25 曲阜师范大学 一种检测羟基多环芳烃的多通道质谱衍生试剂及其制备方法与应用
CN113237982A (zh) * 2021-04-30 2021-08-10 厦门市迈理奥科技有限公司 一种羟基类代谢物的衍生化方法及非靶向代谢组学高效分析方法
CN114487185A (zh) * 2022-01-21 2022-05-13 武汉迈特维尔生物科技有限公司 一种胆固醇通路的分离鉴定方法
CN114487185B (zh) * 2022-01-21 2024-05-28 武汉迈特维尔生物科技有限公司 一种胆固醇通路的分离鉴定方法
CN114487209A (zh) * 2022-03-08 2022-05-13 天津国科医工科技发展有限公司 基于磁性固相萃取的脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法
CN114577949A (zh) * 2022-03-15 2022-06-03 北京华氏精恒医药科技有限公司 一种基于lc-ms/ms法检测25-羟基胆固醇的方法、试剂盒及其应用

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