JP6324321B2 - 標識化学およびｌｃ−ｍｓｍｓを使用するエストラジオールおよびフェノール性ｏｈを有する分析物の分析 - Google Patents

Description

関連する米国出願
本出願は、米国仮出願第６１／５８８９０２号からの優先権の利益を主張し、それの全教示は、参照により本明細書で援用される。

分野
本教示は、マススペクトロメトリー分野およびマススペクトロメトリーに有用なタグ付け試薬（ｔａｇｇｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）に関する。

標識化学（ｌａｂｅｌｉｎｇ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）は、概して、マススペクトロメトリーシグナルを改善するために使用される。

試薬４−フェニル−３Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３，５（４Ｈ）−ジオン（一般にＰＴＡＤまたはクックソン試薬として公知である）を使用してチロシンを誘導体化するのに水性エン型反応を使用するコンジュゲーションは、二重特異性抗体の合成のために特に有用なコンジュゲートを提供可能である（Ｈｉｔｏｓｈｉ Ｂａｎ、Ｊｉｌｉａ Ｇａｖｒｉｌｙｕｋ、Ｃａｒｌｏｓ Ｆ． Ｂａｒｂａｓ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１０年、１３２巻、１５２３〜１５２５頁（非特許文献１））。ＰＴＡＤはまた、マススペクトロメトリー分析のために、ビタミンＤクラスの化合物とのコンジュゲーションに使用されている（Ｋａｚｕｔａｋｅ Ｓｈｉｍａｄａ、Ｔｏｍｏｙｕｋｉ Ｏｅ、Ｔａｔｓｕｈｉｔｏ Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ、Ａｎａｌｙｓｔ、１９９１年、１１６巻、１３９３〜１３９７頁（非特許文献２））。

ＰＴＡＤと同じ反応性コアを有する試薬である第四級アミノオキシクックソン（「ＱＡＯＣ」）は、米国特許出願公開第２０１１／０２１２５３４号（特許文献１）に記載のように、ビタミンＤ３代謝産物の分析のために開発され、当該米国特許出願公開は、その全体が参照によって本明細書で援用される。この試薬は、ビタミンＤ３のコンジュゲート化ジエン官能基と反応して、ビタミンＤ３のマススペクトロメトリー（ＭＳ）分析についてイオン化特性およびフラグメンテーション特性を改善することが見出された。

ホルモンとフェノール性ＯＨを含む他の化合物との正確な分析および定量化は、ますます重要になっている。例えばエストロゲンおよびエストロゲン様化合物は、ホルモン補充療法を通して、今日の社会におけるその役割がますます大きくなっている。また、エストロゲンおよびエストロゲン様化合物の分析および定量化は、乳癌などのエストロゲン関連疾患を管理する手助けになる。

しかし、フェノール性ＯＨを含む化合物、例えばステロイドまたはエストロゲンの、マススペクトロメトリー分析を改善するための標識に対する必要性が、依然として存在する。従来、エストラジオールなどのホルモンを含み得るこれらの化合物をマススペクトロメトリーによって分析することは、困難であった。例えば、これらの化合物の多くは、イオン化可能な基を含んでいない。ゆえに、生物学的なマトリックス中に特に低濃度で存在するこれらの分子、例えばエストラジオールを定量することは、困難な場合がある。

マススペクトロメトリーを使用してエストラジオールを分析するための誘導体化の戦略では、一般的に、ペンタフルオロベンジルブロミドおよびダンシルクロリドなどの試薬が使用されるが、フェノール性ＯＨを含む分析物のこのような誘導体化を活用するのにＬＣ／ＭＳＭＳを伴う現在の戦略は、臨床アッセイで必要とされる検出限界を達成できない（Ｓｈｉｍａｄａら、Ａｎａｌｙｓｔ、１１６巻、１３９３〜１３９７頁（１９９１年）（非特許文献２）；Ｈｉｇａｓｈｉら、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．、５４巻（１１号）、１４７９〜１４８５頁（２００６年）（非特許文献３））。こうした欠点を克服するこれらの分析物の定量化方法の必要性が存在する。

米国特許出願公開第２０１１／０２１２５３４号明細書

Ｈｉｔｏｓｈｉ Ｂａｎ、Ｊｉｌｉａ Ｇａｖｒｉｌｙｕｋ、Ｃａｒｌｏｓ Ｆ． Ｂａｒｂａｓ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１０年、１３２巻、１５２３〜１５２５頁 Ｋａｚｕｔａｋｅ Ｓｈｉｍａｄａ、Ｔｏｍｏｙｕｋｉ Ｏｅ、Ｔａｔｓｕｈｉｔｏ Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ、Ａｎａｌｙｓｔ、１９９１年、１１６巻、１３９３〜１３９７頁 Ｈｉｇａｓｈｉら、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．、５４巻（１１号）、１４７９〜１４８５頁（２００６年）

様々な実施形態に従い、本教示は、１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ部分およびその代謝産物を有する化合物を定量する方法を提供し、それらの化合物は、本明細書ではまとめてフェノール性ＯＨ分析物と呼ばれる。

様々な実施形態に従い、フェノール性ＯＨ分析物のマススペクトロメトリー分析方法が開示され、この方法は、分析物をＱＡＯＣ試薬で標識して付加物を作製すること、およびマススペクトロメトリー（ＭＳ）を使用してその付加物を分析することを含み得る。いくつかの実施形態では、付加物は、ＬＣ−ＭＳＭＳを使用して同定および定量可能である。いくつかの実施形態では、付加物は、ＬＣ−ＭＳＭＳおよび多重反応モニタリング（ＭＲＭ）ワークフローを使用して分析可能である。いくつかの実施形態では、付加物は、逆相カラムで特徴的な保持時間を有し、特徴的な質量を有することができる。いくつかの実施形態では、レポーター基は、高エネルギー衝突下で作製され得る。いくつかの実施形態では、各レポーター基ごとに検出された強度またはピーク面積は、同定だけでなく定量化にも使用可能である。様々な実施形態に従い、該方法はまた、例えば分析物をＱＡＯＣ試薬で標識する前に、試料を濃縮することを含み得る。

いくつかの実施形態では、付加物は、例えば三連四重極ＭＳプラットフォームを使用する親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を使用して分析可能である。

いくつかの実施形態では、ＱＡＯＣ試薬で標識されたフェノール性ＯＨ基を有する複数の異なる分析物を、マススペクトロメトリーを使用して同時に分析可能である。例えば、異なる複数のＱＡＯＣ試薬を利用して、異なる複数の分析物を標識可能であり、標識された分析物は、マススペクトロメトリー、例えばＬＣ−ＭＳＭＳを使用して分析可能である。いくつかの実施形態では、ＱＡＯＣ試薬は、１つまたはそれよりも多くの同位体標識された原子を含む。

様々な実施形態に従い、フェノール性ＯＨ分析物は、ステロイドおよびエストロゲンであり得る。例えば、フェノール性ＯＨ分析物は、エストロゲン化合物、例えばエストロン（Ｅ１）、エストロンサルフェート（Ｅ１ｓ）、１７α−エストラジオール（Ｅ２ａ）、１７β−エストラジオール（Ｅ２ｂ）、エストラジオールサルフェート（Ｅ２ｓ）、エキリン（ＥＱ）、１７α−ジヒドロエキリン（ＥＱａ）、１７β−ジヒドロエキリン（ＥＱａ）、エキレニン（ＥＮ）、１７α−ジヒドロエキレニン（ＥＮａ）、１７β−ジヒドロエキレニン（ＥＮｂ）、Δ８，９−デヒドロエストロン（ｄＥ１）、Δ８，９−デヒドロエストロンサルフェート（ｄＥ１ｓ）、エストリオール、１６−エピエストリオール、１７−エピエストリオールおよび１６，１７−エピエストリオールであり得る。

いくつかの実施形態では、カルボニル置換フェニル−３Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３，５（４Ｈ）−ジオン（カルボニル−ＰＴＡＤ）ベースの試薬を、アミノオキシタグ付け剤とカップリングさせた後、フェノール性ＯＨ分析物を標識可能である（この過程は、本明細書では１ステップ標識反応と呼ばれる）。他の実施形態では、アミノオキシタグ付け剤を含まないカルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬を、フェノール性ＯＨ分析物と反応させて、分析物を標識可能である。次いで、標識した分析物を質量分析可能である。代替的に、標識した分析物は、そのカルボニル部分をアミノオキシタグでタグ付けした後に、質量分析可能である（この過程は、本明細書では２ステップ標識反応と呼ばれる）。

ＱＡＯＣ試薬は、次式によって記載可能であり、

式中、Ｒ_１は、

であるか、またはＲ_１は、

であり、
Ｒ_２は、環式、分岐もしくは直鎖の、置換もしくは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキン、または置換もしくは非置換芳香族基であり、
Ｒ_３は、存在しないか、または同じかもしくは異なっている１つもしくはそれよりも多くの置換基であり、この置換基は、環式、分岐もしくは直鎖Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキン；ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩもしくはＦ）；−ＮＯ_２；置換もしくは非置換芳香族（アリール）基；保護されているかもしくは保護されていないアミノ基、アシル基、カルボン酸基もしくはチオール基；−ＳＯ_３Ｈ、−ＰＯ_４ ⁻、チオエーテル、エーテル、エポキシド、チオ−エポキシド、アジドもしくはアジリジンであり、
各Ｒ_４は、独立して、Ｈ、または環式、分岐もしくは直鎖Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキンであり、
ｍは、１〜２０の整数であり、
Ｘは、アニオンであり、
Ｌ１およびＬ２は、独立して、結合またはリンカーであり、
Ａｒは、結合、アリール基、またはヘテロアリール基である。

いくつかの実施形態では、Ａｒは、アリールである。いくつかの実施形態では、Ａｒは、フェニル基またはナフチル基である。いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、独立して、結合、ペプチド、オリゴマー、ＰＥＧ、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキレン鎖、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキレン鎖、またはＣ_２〜Ｃ_４アルキレン鎖である。いくつかの実施形態では、Ｘは、ペルフルオロカルボキシレートである。いくつかの実施形態では、Ｘは、ＣＦ_３ＣＯＯ−、ＣＦ_３ＣＦ_２ＣＯＯ−、ＣＦ_３ＣＦ_２ＣＦ_２ＣＯＯ−、ＣＦ_３ＳＯ_３ＣＯＯ、または（Ｃ_６Ｈ_５）_４Ｂ−である。

いくつかの実施形態では、ＱＡＯＣ試薬は、次式によっ記載可能である。

いくつかの実施形態では、ＱＡＯＣ試薬は、アミノオキシタグ付け剤を含むことができ、例えば１ステップ標識反応で使用されるＱＡＯＣ試薬は、Ｌ２がＣ_１〜Ｃ_２０アルキレン基である上記の構造を有することができる。

いくつかの実施形態では、上記の構造のいずれかにおいて、Ｒ_２は、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ_３は存在しない。いくつかの実施形態では、Ｒ_４はメチルである。いくつかの実施形態では、ｍは、１〜６の整数、または１〜３の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、１〜１０の整数、１〜５の整数、または２〜４の整数である。いくつかの実施形態では、Ｘは、ペルフルオロカルボキシレートである。いくつかの実施形態では、Ｘは、ＣＦ_３ＣＯＯ−、ＣＦ_３ＣＦ_２ＣＯＯ−、ＣＦ_３ＣＦ_２ＣＦ_２ＣＯＯ−、ＣＦ_３ＳＯ_３ＣＯＯ、または（Ｃ_６Ｈ_５）_４Ｂ−である。

いくつかの実施形態では、ＱＡＯＣ試薬は、下記の化合物である。

さらなる態様では、試料中の１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ分析物を同定および定量するための方法が開示され、該方法は、試料をＱＡＯＣ試薬で処理して、試料中にもしあれば、１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ分析物を標識することを含む。次いで、処理した試料をマススペクトロメトリーによって分析して、１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ分析物を同定および定量可能である。例えば、処理された試料は、１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ分析物を同定および定量するために、ＬＣ−ＭＳＭＳ分析にかけることができる。

いくつかの実施形態では、試料は、生物学的試料、例えば血液、血漿、血清、尿または唾液である。さらに、いくつかの実施形態では、フェノール性ＯＨ分析物は、ステロイドまたはエストロゲン、例えば、エストロン（Ｅ１）、エストロンサルフェート（Ｅ１ｓ）、１７α−エストラジオール（Ｅ２ａ）、１７β−エストラジオール（Ｅ２ｂ）、エストラジオールサルフェート（Ｅ２ｓ）、エキリン（ＥＱ）、１７α−ジヒドロエキリン（ＥＱａ）、１７β−ジヒドロエキリン（ＥＱｂ）、エキレニン（ＥＮ）、１７α−ジヒドロエキレニン（ＥＮａ）、１７β−ジヒドロエキレニン（ＥＮｂ）、Δ８，９−デヒドロエストロン（ｄＥ１）、Δ８，９−デヒドロエストロンサルフェート（ｄＥ１ｓ）、エストリオール、１６−エピエストリオール、１７−エピエストリオールおよび１６，１７−エピエストリオールである。いくつかの実施形態では、上記の方法において、フェノール性ＯＨ分析物はステロイドであり、該方法は、フェノール性ＯＨ分析物が枯渇した公知の量の生物学的試料に、公知の量の１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ内標準物質、および公知の増分濃度を有する１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ分析物をスパイク添加（ｓｐｉｋｉｎｇ）することによって、一組の較正マトリックスを作り出すステップと、ステップ（ａ）から得られた試料を、ＱＡＯＣ試薬で処理し、その結果、少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物および対応する内標準物質を標識するステップと、ステップ（ｂ）の較正マトリックスを、ＬＣ−ＭＳＭＳを使用して分析するステップと、ステップ（ｃ）の分析から得られたデータを使用して、較正曲線を作製するステップと、試料中の上記フェノール性ＯＨ分析物に、公知の量の１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ内標準物質をスパイク添加するステップと、上記較正曲線を使用して、試料中のステロイドであり得る上記少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物の量を推定するステップとをさらに含む。いくつかの実施形態では、該方法は、試料調製を行って、較正マトリックス中のフェノール性ＯＨ分析物および１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ内標準物質を濃縮するステップか、または浄化するステップのいずれかをさらに含むことができる。

いくつかの実施形態では、上記の方法において、フェノール性ＯＨを含む公知の濃度の分析物、例えばフェノール性ＯＨを含むステロイド分析物を含む内標準物質または外標準物質を、ＱＡＯＣ試薬で処理し、標準物質中の少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物を標識して、フェノール性ＱＡＯＣ標準物質を作り出す。次いで、標準物質および分析物を、例えば液体クロマトグラフィー（ＬＣ）／マススペクトロメトリー（ＭＳ）によって分析可能である。標準物質と分析物は、混合物として分析しても、別個に分析してもよい。較正曲線は、フェノール性ＱＡＯＣ標準物質の分析から得られたデータから作製可能であり、上記少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物（例えば、試料中のステロイド）の量を推定可能である。標準物質と分析物の混合物では、その混合物を例えばＬＣ分離にかけて、標識された標準付加物および標識された分析物を、ＬＣカラム上の異なる保持時間に起因して時間を隔てて溶出させることができる。次いで、各溶出液をマススペクトロメトリーによって分析可能である。例えば、親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を用いることができる。標識された試料に関して、標識された標準物質から作製されたレポーターシグナルのピーク面積のシグナル強度の比によって、試料中の標識された分析物の相対濃度を得ることができる。標識された標準付加物の濃度は公知なので、試料中の標識された分析物の具体的な濃度を求めることができる。

いくつかの実施形態では、公知の濃度の１つまたはそれよりも多くの選択されたフェノール性ＯＨ分析物を含む標準物質を、ＱＡＯＣ試薬で標識して、１つまたはそれよりも多くの標準付加物を形成可能である。例えば、標準付加物は、上記で論じた１ステップまたは２ステップ標識反応のいずれかによって作製可能である。標準付加物は、マススペクトロメトリーを使用して分析可能であり、次いでこの分析から得られたデータを、もしあれば試料中のフェノール性ＯＨ分析物を標識するためにＱＡＯＣ試薬と反応させた試料を分析して得られたデータと比較して、試料のフェノール性ＯＨ分析物(単数または複数)の特定の濃度を求めることができる。

さらなる態様では、ＱＡＯＣ試薬と、公知の濃度の、ＱＡＯＣ試薬で標識された選択されたフェノール性ＯＨ分析物を含む１つまたはそれよりも多くの標準物質とを含むキットが提供される。

さらなる態様では、ＱＡＯＣ試薬と、公知の濃度の、選択されたフェノール性ＯＨ分析物を含む１つまたはそれよりも多くの標準物質とを含むキットが提供される。

いくつかの実施形態では、フェノール性ＯＨ分析物およびビタミンＤを、同時に分析可能である。例えば、フェノール性ＯＨ分析物およびビタミンＤを含んでいる試料を、ＱＯＡＣ試薬で処理して、フェノール性ＯＨ分析物およびビタミンＤを標識可能である。次いで、標識された試料を、例えば単回のＬＣ／ＭＳＭＳ分析計の実施で分析して、フェノール性ＯＨ分析物およびビタミンＤの両方を定量可能である。

いくつかの実施形態では、多重化能を可能にする２ステップ標識反応を提供可能である。例えば、いくつかの実施形態では、異なる複数のフェノール性ＯＨ分析物を、異なる複数のＱＡＯＣ試薬で標識可能である。他の実施形態では、異なる複数のフェノール性ＯＨ分析物を、単一のＱＡＯＣ試薬で標識可能であり、得られた付加物を、異なる複数のアミノオキシタグと反応可能である。

本教示は、添付の図を参照することによってさらに完全に理解される。図は例示的であり、本教示を制限するものではないことが意図される。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
試料のマススペクトロメトリー分析方法であって、
前記試料をＱＡＯＣ試薬で処理し、その結果として、前記試料中の少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物を標識することにより、フェノール性ＱＡＯＣ付加物を作り出すステップと、
前記フェノール性ＱＡＯＣ付加物を質量分析計を使用して分析するステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記ＱＡＯＣ試薬が次式を有し、

式中、Ｒ _１ は、

であり、
Ｒ _２ は、環式、分岐もしくは直鎖の、置換もしくは非置換Ｃ _１ 〜Ｃ _１８ アルキル、Ｃ _１ 〜Ｃ _１８ アルケン、もしくはＣ _１ 〜Ｃ _１８ アルキン、または置換もしくは非置換芳香族基であり、
Ｒ _３ は、存在しないか、または同じかもしくは異なっている１つもしくはそれよりも多くの置換基であり、この置換基は、環式、分岐もしくは直鎖Ｃ _１ 〜Ｃ _１８ アルキル、Ｃ _１ 〜Ｃ _１８ アルケン、もしくはＣ _１ 〜Ｃ _１８ アルキン；ハロゲン；−ＮＯ _２ ；置換もしくは非置換芳香族基；保護されているかもしくは保護されていないアミノ基、アシル基、カルボン酸基もしくはチオール基；−ＳＯ _３ Ｈ、−ＰＯ _４ ⁻ 、チオエーテル、エーテル、エポキシド、チオ−エポキシド、アジドもしくはアジリジンであり、
各Ｒ _４ は、独立して、Ｈ、または環式、分岐もしくは直鎖Ｃ _１ 〜Ｃ _１８ アルキル、Ｃ _１ 〜Ｃ _１８ アルケン、もしくはＣ _１ 〜Ｃ _１８ アルキンであり、
ｍは、１〜２０の整数であり、
Ｘは、アニオンであり、
Ｌ１およびＬ２は、独立して、結合またはリンカーであり、
Ａｒは、結合、アリール基、またはヘテロアリール基である、
項目１に記載の方法。
（項目３）
Ｒ _２ が、メチルもしくはエチルであり、Ｒ _３ が存在せず、
かつ／またはＬ１およびＬ２が、独立して、結合、ペプチド、オリゴマー、ＰＥＧもしくはＣ _１ 〜Ｃ _２０ アルキレン鎖である、
項目２に記載の方法。
（項目４）
前記少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物が、ステロイドであり、必要に応じて、
前記ステロイドが、エストリオール、１６−エピエストリオール、１７−エピエストリオールおよび１６，１７−エピエストリオール、エストロン（Ｅ１）、エストロンサルフェート（Ｅ１ｓ）、１７α−エストラジオール（Ｅ２ａ）、１７β−エストラジオール（Ｅ２ｂ）、エストラジオールサルフェート（Ｅ２ｓ）、エキリン（ＥＱ）、１７α−ジヒドロエキリン（ＥＱａ）、１７β−ジヒドロエキリン（ＥＱｂ）、エキレニン（ＥＮ）、１７α−ジヒドロエキレニン（ＥＮａ）、１７β−ジヒドロエキレニン（ＥＮｂ）、Δ８，９−デヒドロエストロン（ｄＥ１）、Δ８，９−デヒドロエストロンサルフェート（ｄＥ
１ｓ）からなる群から選択されたエストロゲン化合物である、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記ＱＡＯＣ試薬が、構造

を有する化合物をアミノオキシタグと反応させることにより、構造

［式中、ｎは、１〜２０の整数である］、
を有するタグ付きＱＡＯＣ試薬を形成することによって作製される、項目２に記載の方法。
（項目６）
Ｒ _２ が、メチルもしくはエチルであり、Ｒ _３ が存在せず、Ｒ _４ がメチルであり、ｍが１〜５の整数であり、Ｘがペルフルオロカルボキシレートであり、かつ／またはＬ１が結合であり、Ａｒがフェニル基であり、ｎが１〜８の整数である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記タグ付きＱＡＯＣ試薬が、構造

を有する、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記フェノール性ＱＡＯＣ付加物をアミノオキシタグと反応させることにより、下記の下位構造

を有するタグ付き付加物を形成するステップをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目９）
Ｒ _２ が、メチルまたはエチルであり、Ｒ _３ が存在せず、Ｒ _４ がメチルであり、ｎが２〜４の整数であり、Ｘがペルフルオロカルボキシレートである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
Ｘが、ＣＦ _３ ＣＯＯ−、ＣＦ _３ ＣＦ _２ ＣＯＯ−、ＣＦ _３ ＣＦ _２ ＣＦ _２ ＣＯＯ−、ＣＦ _３ ＳＯ _３ ＣＯＯ−、（Ｃ _６ Ｈ _５ ） _４ Ｂ−である、項目２または８に記載の方法。
（項目１１）
前記タグ付き付加物が、下位構造

を有する、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記試料が、生物学的試料であり、前記生物学的試料が、血液、血漿、血清、尿または唾液、脳脊髄液、組織、毛髪、体液から必要に応じて選択される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物が、ステロイドであり、前記方法が、
（ａ）公知の量の、１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ分析物が枯渇した生物学的試料に、公知の量の１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ内標準物質、および公知の増分濃度を有する１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ分析物をスパイク添加することによって、一組の較正マトリックスを作り出すステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）から得られた前記試料をＱＡＯＣ試薬で処理し、その結果、少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物および対応する内標準物質を標識するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記較正マトリックスを、ＬＣ−ＭＳＭＳを使用して分析するステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）の分析から得られたデータを使用して、較正曲線を作成するステップと、
（ｅ）前記試料中の前記フェノール性ＯＨ分析物に、公知の量の１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ内標準物質をスパイク添加するステップと、
（ｆ）前記較正曲線を使用して、試料中のステロイドである前記少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物の量を推定するステップと
をさらに含み、
必要に応じて、前記混合物を分析するステップが、マススペクトロメトリーを使用する前に前記標準付加物および前記フェノール性ＱＡＯＣ付加物を時間を隔てて溶出させることを含み、必要に応じて、前記方法が、試料調製を行って、前記較正マトリックス中の前記フェノール性ＯＨ分析物および前記１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ内標準物質を濃縮または浄化するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記混合物を分析することが、三連四重極ＭＳプラットフォームを使用して、前記フェノール性ＱＡＯＣ付加物の親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を行うことをさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物が、ステロイドであり、前記方法が、
（ａ）フェノール性ＯＨを含む公知の濃度のステロイド分析物を含む内標準物質または外標準物質を提供するステップと、
（ｂ）前記標準物質を前記ＱＡＯＣ試薬で処理することにより、標準付加物を形成するステップと、
（ｃ）前記標準付加物をマススペクトロメトリーを使用して分析するステップと、
（ｄ）前記試料中のステロイドである前記少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物の量を推定するステップと
をさらに含み、
必要に応じて、前記フェノール性ＱＡＯＣ付加物を分析するステップおよび前記標準付加物を分析するステップが、三連四重極ＭＳプラットフォームを使用して、前記フェノール性ＡＯＣ付加物および前記標準付加物の親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を行うことを含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
少なくとも２つのフェノール性ＯＨ分析物、および必要に応じて４つのフェノール性ＯＨ分析物が、同時に測定される、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記フェノール性ＯＨ分析物を、前記ＱＡＯＣ試薬の１つまたはそれよりも多くの同位体変種と反応させることにより、少なくとも１つのフェノール性ＯＨ内標準物質を形成することのステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
１つまたはそれよりも多くのビタミンＤ−ＱＡＯＣおよびフェノール性ＱＡＯＣ付加物を、同時に定量することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
試料のマススペクトロメトリー分析で使用するためのキットであって、
１つのパッケージ内に、
ＱＡＯＣ試薬と、
フェノール性ＯＨを含む公知の濃度のステロイド分析物を含む標準物質と
を含み、
必要に応じて、前記ＱＡＯＣ試薬は、アミノオキシマススペクトロメトリータグ付け剤を含む、
キット。
（項目２０）
試料のマススペクトロメトリー分析で使用するためのキットであって、
１つのパッケージ内に、
カルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬と、
アミノオキシマススペクトロメトリータグ付け剤と、
フェノール性ＯＨを含む公知の濃度のステロイド分析物を含む標準物質と
を含む、キット。

図１は、本出願人らの教示の一実施形態に従うＱＡＯＣ試薬の一実施形態である。

図２Ａは、本教示の様々な実施形態に従って四重（ｆｏｕｒ−ｐｌｅｘ）アッセイで使用可能である４種類のアミノオキシタグ付け剤の例示的な一組を示す。

図２Ｂは、本教示の様々な実施形態に従って四重アッセイで使用可能である４種類のアミノオキシタグ付け剤の例示的な一組を示す。

図３Ａは、本教示の様々な実施形態に従って四重アッセイで使用可能である４種類の異なる試薬を含む４つの質量差タグの例示的な一組を示す。

図３Ｂは、本教示の様々な実施形態に従って四重アッセイで使用可能である４種類の異なる試薬を含む４つの質量差タグの例示的な一組を示す。

図４は、本教示の様々な実施形態に従い、エストラジオールをＱＡＯＣ試薬と反応させると同じ質量の２つの異性体種が形成することを示す反応スキーム、およびレポーターイオンを作製するこれらの２つの異性体のフラグメンテーションパターンである。

図５Ａは、図３に示した反応混合物の、ＡＰＩ−５５００ＱＴＲＰ^ＴＭ質量分析計を使用するＱ１−ＭＳ−Ｑ１スキャンである。期待値Ｍ^＋＝６０４．３５、実測値６０４．２。

図５Ｂは、エストラジオール−ＱＡＯＣ付加物の、両方の異性体形態の化学構造を示す。

図６Ａは、図５Ｂでｍ／ｚ＝６０４．３において示される化合物の衝突エネルギースキャン、およびｍ／ｚ＝５４５．１において中性損失フラグメントを含むＭＲＭフラグメントのいくつかを示す。

図６Ｂは、図５Ａの付加物の化学構造、および図６ＡのＭＲＭフラグメントを示す。

図７は、図４の反応混合物のＬＣ−ＭＲＭプロファイルを示し、点線と実線によって２つのＭＲＭ遷移を示している。

図８は、図１のＱＡＯＣ試薬で標識されたエストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）およびエストリオール（Ｅ３）を含む反応物のＬＣ−ＭＲＭプロファイルを提供する。

様々な実施形態の詳細な説明を、例えば下記の図を参照しながら本明細書で以下に記載する。図は単に例示的であり、図へのあらゆる言及は、単に例示目的であり、本明細書で以下に任意の方式で説明された実施形態の範囲を制限するものではないことが、理解される。便宜上、類似の成分または特徴を示すために、図全体にわたり参照符号を（枝符号（ｏｆｆｓｅｔ）をつけてまたはつけずに）反復する場合もある。

（様々な実施形態の詳細な説明）
明確にするために、下記の論述によって、本出願人らの教示による実施形態の様々な態様を詳説するが、好都合または適切な場合には、いくつかの具体的な詳細を省いていることが、理解される。例えば、代替的な実施形態における同様または類似の特徴の論述は、ある程度省略され得る。周知の発想または概念についても、簡潔にするために詳細には論じていない場合がある。いくつかの実施形態は、実施ごとに具体的に説明された詳細のいくつかを必要としない場合があり、これらは、それらの実施形態を十分な理解を提供するためだけに本明細書に記載されることを、当業者は認識する。同様に、記載の実施形態には、本開示の範囲から逸脱することなく、一般的な共通の知識に従ってわずかな変更または変動を受け入れる余地のあることが明らかとなる。本出願人らの教示の態様は、下記の実施例および様々な実施形態の記載を考慮することにより、さらに理解され得るが、それらは、本出願人らの教示の範囲をいかなる方式であっても制限するものと解釈されるべきでない。

様々な実施形態に従い、フェノール性ＯＨを含む分析物、例えばエストロゲンを、ＱＡＯＣ試薬で定量する方法が提供される。いくつかの実施形態では、該方法は、試料の濃縮、誘導体化およびＬＣ−ＭＳＭＳ分析を含むことができる。試料は、１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ分析物またはその代謝産物を含み得る。様々な実施形態に従い、試料は、複数の異なるフェノール性ＯＨ分析物を含み得るが、標識化は、各分析物を異なるＱＡＯＣ試薬で標識することを含み得る。

フェノール性ＯＨ分析物は、フェノール基

を含む。いくつかの実施形態では、フェノール性ＯＨ分析物は、中性であり得る。いくつかの実施形態では、フェノール性ＯＨ分析物は、イオンである。特定の実施形態では、フェノール性ＯＨ分析物は、約５０〜１０００ｇ／ｍｏｌの範囲にある分子量を有することができる。いくつかの実施形態では、フェノール性ＯＨ分析物は、約１００〜４００ｇ／ｍｏｌの範囲にある分子量を有することができる。いくつかの実施形態では、フェノール性ＯＨ分析物は、２つ、３つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ部分を有する。

いくつかの実施形態では、分析される試料は、１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ分析物またはその代謝産物を含有可能である。例えば、様々な実施形態に従い、試料は、１つまたはそれよりも多くのステロイド、ステロイド様化合物、エストロゲン、エストロゲン様化合物、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）、１７α−エストラジオール、１７β−エストラジオール、エストリオール（Ｅ３）、１６−エピエストリオール、１７−エピエストリオールおよび１６，１７−エピエストリオール、ならびに／またはその代謝産物を含み得る。様々な実施形態では、代謝産物は、例えばエストリオール、１６−エピエストリオール（１６−ｅｐｉＥ３）、１７−エピエストリオール（１７−ｅｐｉＥ３）、１６，１７−エピエストリオール（１６，１７−ｅｐｉＥ３）、１６−ケトエストラジオール（１６−ｋｅｔｏＥ２）、１６α−ヒドロキシエストロン（１６α−ＯＨＥ１）、２−メトキシエストロン（２−ＭｅＯＥ１）、４−メトキシエストロン（４−ＭｅＯＥ１）、２−ヒドロキシエストロン−３−メチルエーテル（３−ＭｅＯＥ１）、２−メトキシエストラジオール（２−ＭｅＯＥ２）、４−メトキシエストラジオール（４−ＭｅＯＥ２）、２−ヒドロキシエストロン（２ＯＨＥ１）、４−ヒドロキシエストロン（４−ＯＨＥ１）、２−ヒドロキシエストラジオール（２−ＯＨＥ２）、エストロン（Ｅ１）、エストロンサルフェート（Ｅ１ｓ）、１７α−エストラジオール（Ｅ２ａ）、１７β−エストラジオール（Ｅ２ｂ）、エストラジオールサルフェート（Ｅ２ｓ）、エキリン（ＥＱ）、１７α−ジヒドロエキリン（ＥＱａ）、１７β−ジヒドロエキリン（ＥＱｂ）、エキレニン（ＥＮ）、１７α−ジヒドロエキレニン（ＥＮａ）、１７β−ジヒドロエキレニン（ＥＮｂ）、Δ８，９−デヒドロエストロン（ｄＥ１）、Δ８，９−デヒドロエストロンサルフェート（ｄＥ１ｓ）であり得る。いくつかの実施形態では、フェノール性ＯＨ分析物は、ステロイドまたはステロイド様化合物であり得、それは、ｓｐ^２混成しているＡ環と、そのＡ環の３位にＯＨ基とを有する。

様々な実施形態に従い、１ステップ標識反応を用いて、フェノール性ＯＨ分析物を標識可能である。例えば、該方法は、下記の構造のうちの１つを有するＱＡＯＣ試薬を、分析物のフェノール性ＯＨ基と反応させることを含むことができ、ここでＱＡＯＣ試薬は、次式によって記載され、

式中、Ｒ_１は、

であるか、またはＲ_１は、

であり、
Ｒ_２は、環式、分岐もしくは直鎖の、置換もしくは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキン、または置換もしくは非置換芳香族基であり、
Ｒ_３は、存在しないか、または同じかもしくは異なっている１つもしくはそれよりも多くの置換基であり、この置換基は、環式、分岐もしくは直鎖Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキン；ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩもしくはＦ）；−ＮＯ_２；置換もしくは非置換芳香族（アリール）基；保護されているかもしくは保護されていないアミノ基、アシル基、カルボン酸基もしくはチオール基；−ＳＯ_３Ｈ、−ＰＯ_４ ⁻、チオエーテル、エーテル、エポキシド、チオ−エポキシド、アジドもしくはアジリジンであり、
各Ｒ_４は、独立して、Ｈ、または環式、分岐もしくは直鎖Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキンであり、
ｍは、１〜２０の整数であり、
Ｘは、アニオンであり、
Ｌ１およびＬ２は、独立して、結合またはリンカーであり、
Ａｒは、結合、アリール基、またはヘテロアリール基である。

用語「アリール」は、別段に指定されない限り、置換または非置換の多価不飽和の芳香族炭化水素置換基を意味し、これは、単一の環であっても、一緒に縮合しているかもしくは共有結合によって連結している複数の環（好ましくは、１〜３個の環）であってもよい。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含むアリール基（または環）を指し、ここで、この窒素、炭素および硫黄原子は、必要に応じて酸化されており、窒素原子（単数または複数）は、必要に応じて四級化されている。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残りに付着していてもよい。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的な例には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが含まれる。上記で記述したアリールおよびヘテロアリール環系の各々に対する置換基は、下記の許容可能な置換基の群から選択される。「アリール」および「ヘテロアリール」はまた、１つまたはそれよりも多くの非芳香環系が、縮合しているか、またはそうでなければアリールもしくはヘテロアリール系に結合している環系を包含する。

用語「リンカー」または「リンキング剤（ｌｉｎｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」は、２つの分子をつなぐ二官能性部分（アルキレン鎖、ペプチド、モノマー、オリゴマーまたはポリマーなど）を指す。リンカーの非限定的な例は、アルキル鎖、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびペプチド鎖またはペプチド模倣鎖（ｐｅｐｔｉｄｏｍｅｍｅｔｉｃ ｃｈａｉｎ）である。

いくつかの実施形態では、Ａｒはアリールである。いくつかの実施形態では、Ａｒは、フェニル基またはナフチル基である。

いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、独立して、結合、ペプチド、オリゴマー、ＰＥＧ、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキレン鎖、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキレン鎖、またはＣ_２〜Ｃ_４アルキレン鎖である。いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、独立して、結合、ペプチド、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキレン鎖、またはＣ_２〜Ｃ_４アルキレン鎖である。

いくつかの実施形態では、Ｒ_２は、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ_３は、存在しないか、またはＣ_１〜Ｃ_８アルキル（分岐または直鎖）、ハロ、ＮＯ_２、アミノ、アシルもしくはカルボン酸基である。いくつかの実施形態では、Ｒ_３は存在しない。いくつかの実施形態では、各Ｒ_４は、独立して、Ｈ、または分岐もしくは直鎖Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキルであるか、あるいは各Ｒ_４は、独立して、Ｈ、または分岐もしくは直鎖Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ_４は同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ_４はメチルである。いくつかの実施形態では、ｍは、１〜６の整数であるか、または１〜３の整数である。いくつかの実施形態では、Ｘは、ペルフルオロカルボキシレートである。いくつかの実施形態では、Ｘは、ＣＦ_３ＣＯＯ−、ＣＦ_３ＣＦ_２ＣＯＯ−、ＣＦ_３ＣＦ_２ＣＦ_２ＣＯＯ−、ＣＦ_３ＳＯ_３ＣＯＯ、または（Ｃ_６Ｈ_５）_４Ｂ−である。

いくつかの実施形態では、ＱＡＯＣ試薬は、次式

または次式

によって記載可能であり、
式中、Ｒ_１は、

であるか、またはＲ_１は、

であり、
Ｒ_２は、環式、分岐もしくは直鎖の、置換もしくは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキン、または置換もしくは非置換芳香族基であり、
Ｒ_３は、存在しないか、または同じかもしくは異なっている１つもしくはそれよりも多くの置換基であり、この置換基は、環式、分岐もしくは直鎖Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキン；ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩもしくはＦ）；−ＮＯ_２；置換もしくは非置換芳香族（アリール）基；保護されているかもしくは保護されていないアミノ基、アシル基、カルボン酸基もしくはチオール基；−ＳＯ_３Ｈ、−ＰＯ_４ ⁻、チオエーテル、エーテル、エポキシド、チオ−エポキシド、アジドもしくはアジリジンであり、
各Ｒ_４は、独立して、Ｈ、または環式、分岐もしくは直鎖Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキンであり、
ｍおよびｎは、独立して、１〜２０の整数であり、
Ｘは、アニオンであり、
Ｌ２は、結合またはリンカーであり、
Ａｒは、存在しないか、アリール基、またはヘテロアリール基である。

いくつかの実施形態では、上記の構造において、Ｒ_２は、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ_３は存在しない。いくつかの実施形態では、Ｒ_４はメチルである。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、結合、ペプチド、オリゴマー、ＰＥＧ、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキレン鎖、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキレン鎖、またはＣ_２〜Ｃ_４アルキレン鎖である。いくつかの実施形態では、ｍは、１〜６の整数であるか、または１〜３の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、１〜１０の整数、１〜５の整数、または２〜４の整数である。いくつかの実施形態では、Ｘは、ペルフルオロカルボキシレートアニオンである。いくつかの実施形態では、Ｘは、ＣＦ_３ＣＯＯ−、ＣＦ_３ＣＦ_２ＣＯＯ−、ＣＦ_３ＣＦ_２ＣＦ_２ＣＯＯ−、ＣＦ_３ＳＯ_３ＣＯＯ−、または（Ｃ_６Ｈ_５）_４Ｂ−である。

様々な実施形態に従い、フェノール性ＯＨ分析物は、２ステップ標識反応を介して標識可能であり、ここで、フェノール性ＯＨ基の芳香環を、最初、アミノオキシタグ付け剤を含んでいないカルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬と反応させて付加物を形成し、その後、その付加物をアミノオキシタグ付け剤でタグ付けして、タグ付き付加物を形成する。例えば、様々な実施形態に従い、２ステップ標識反応は、フェノール性ＯＨ基を、下記の構造を有するカルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬と反応させることを含み得、

式中、Ｒ_２は、環式、分岐もしくは直鎖の、置換もしくは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキン、または置換もしくは非置換芳香族基であり、
Ｒ_３は、存在しないか、または同じかもしくは異なっている１つもしくはそれよりも多くの置換基であり、この置換基は、環式、分岐もしくは直鎖Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキン；ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩもしくはＦ）；−ＮＯ_２；置換もしくは非置換芳香族（アリール）基；保護されているかもしくは保護されていないアミノ基、アシル基、カルボン酸基もしくはチオール基；−ＳＯ_３Ｈ、−ＰＯ_４ ⁻、チオエーテル、エーテル、エポキシド、チオ−エポキシド、アジドもしくはアジリジンであり、
Ａｒは、結合、アリール基、またはヘテロアリール基であり、
Ｌ１は、結合またはリンカーである。

いくつかの実施形態では、Ａｒはアリールである。いくつかの実施形態では、アリールは、フェニル基またはナフチル基である。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、結合、ペプチド、オリゴマー、ＰＥＧ、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキレン鎖、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキレン鎖、またはＣ_２〜Ｃ_４アルキレン鎖である。いくつかの実施形態では、Ｒ_３は、存在しないか、またはＣ_１〜Ｃ_８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_８アルケン、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキン、ハロゲンもしくは−ＮＯ_２である。いくつかの実施形態では、Ｒ_３は存在しない。フェノール性ＯＨ基の芳香環と、上記のカルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬との反応によって、下記の下位構造を含む付加物を作り出すことができる。

次いで、その付加物を、下記の構造を有するタグなどのアミノオキシタグと反応させて、タグ付き付加物を形成可能である

［式中、ｎは、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５または２〜４であり、Ｒ_１は、第四級アミンであるか、または下記の構造を有する置換基であり、

式中、各Ｒ_４は、独立して、Ｈ、または環式、分岐もしくは直鎖Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキンであり、
ｍは、１〜２０の整数であり、Ｘはアニオンである］。タグ付き付加物は、下記の下位構造を有する。

ゆえに、様々な実施形態に従う２ステップ反応は、フェノール性ＯＨ試料をカルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬で処理して付加物を作り出し、その付加物をアミノオキシタグと反応させて、分析のためのタグ付き付加物を形成することを含む。いくつかの実施形態では、タグ付き付加物は、下記の下位構造を含む。

図４は、エストラジオールとＱＡＯＣ試薬との間の例示的な反応を示している。例示的な反応は、１ステップ反応であるが、例えば２ステップ反応などの複数ステップの反応も可能である。いくつかの実施形態では、１ステップ標識反応が使用され、ここで、例えば図１に例示したように、アミノオキシＭＳタグにカップリングしたカルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬（ＱＡＯＣ試薬）を用いて、フェノール性ＯＨ分析物を標識する。本明細書で使用される場合、用語「アミノオキシＭＳタグ」は、「アミノオキシタグ」と交換可能に使用される。他の実施形態では、該方法は、最初にフェノール性ＯＨ分析物をカルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬で処理して付加物を生成し、次いでその付加物をアミノオキシマススペクトロメトリー（ＭＳ）タグ付け剤でタグ付けして、標識された付加物を形成することを含む。本明細書で使用される場合、用語「アミノオキシＭＳタグ付け剤」は、「アミノオキシタグ付け剤」と交換可能に使用される。標識された付加物は、マススペクトロメトリーを使用して分析可能である。

該方法はさらに、公知のフェノール性ＯＨ分析物を含む標準物質を提供すること、標準物質の公知のフェノール性ＯＨ分析物をＱＡＯＣ試薬で処理して、標準付加物を形成することを含み得る。様々な実施形態では、標準物質を、本教示に従う１ステップまたは２ステップ標識反応を介して、ＱＡＯＣ試薬またはカルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬で処理して、標準付加物を形成可能である。次いで、標準付加物を、フェノール性ＯＨ分析物をＱＡＯＣ試薬またはカルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬で標識し、その後アミノオキシＭＳタグと反応させることによって形成した付加物と混合して、混合物を形成可能である。次いで、その混合物を、マススペクトロメトリー、例えばＬＣ−ＭＳＭＳスペクトロメトリーを使用して分析可能である。いくつかの実施形態では、フェノール性ＯＨ分析物の相対濃度を得ることができる。他の実施形態では、公知の濃度の標準物質を使用することによって、フェノール性ＯＨ分析物を絶対的定量を得ることが可能である。

様々な実施形態に従い、１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ分析物を相対的に定量するための方法は、１つまたはそれよりも多くの分析物を標識し、その後マススペクトロメトリーを使用して分析することを含み得る。いくつかの実施形態に従い、１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ分析物および／あるいはその代謝産物を定量可能である。いくつかの実施形態に従い、アミノオキシタグ付け剤は、一組の同重体タグを含むことができる。いくつかの実施形態に従い、第１のステップにおいて、標準物質中の少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物をカルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬で標識して、標準付加物を形成可能である。第２のステップでは、標準付加物を、一組の同重体タグ由来の第１の同重体タグでタグ付け可能である。試験試料をカルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬と反応させて、もしあれば試験試料中の１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ分析物を標識可能である。次いで、試験試料中の標識されたフェノール性ＯＨ分析物を、第１の同重体タグとは異なるが同じ組の同重体タグに由来する第２の同重体タグでタグ付け可能である。次いで、標識された標準物質および標識された試験試料を、組み合わせることができ、得られた混合物を、逆相カラムでの液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離にかけることができる。標識されたフェノール性ＯＨおよび／またはフェノール性ＯＨ代謝産物は、特徴的な保持時間を有し得、カラムから時間を隔てて溶出させることができる。溶出ピークは、標識された分析物を含むピーク、および標識された標準物質を含むピークを含み得る。その後、カラムからの溶出液を、マススペクトロメトリーを使用して分析可能である。

フェノール性ＯＨ分析物の絶対的な定量は、標準物質が公知の濃度のフェノール性ＯＨ分析物を有している場合、相対的な定量について上記で説明したのと同じ方式で実施できることが、理解されるべきである。また、フェノール性ＯＨ分析物および／またはフェノール性ＯＨ分析物の代謝産物が、先で言及されている場合には、任意のフェノール性ＯＨ分析物が使用され得ることが、理解されるべきである。

様々な実施形態に従い、複数の異なるフェノール性ＯＨ分析物を含む１つの試料を、異なる複数のＱＡＯＣ試薬で処理して、フェノール性ＯＨ分析物の２つまたはそれよりも多くのうちの各々を、上記複数の試薬のうちの異なる１つで標識可能である。次いで、標識された試料を、マススペクトロメトリー、例えばＬＣ／ＭＳＭＳを使用して分析して、標識されたフェノール性分析物を定量可能である。いくつかの実施形態では、試料のこのような分析は、スペクトル計の単回実施で行うことができる。上記で論じた通り、いくつかの実施形態では、フェノール性ＯＨ分析物は、ステロイドまたはステロイド様分析物であり得る。

様々な実施形態に従い、フェノール性ＯＨを有する１つまたはそれよりも多くの化合物を含んでいる試料を、分析する前に様々な方法で濃縮し得る。濃縮法は、血液（新鮮なまたは乾燥させた）、血漿、血清、尿または唾液などの試料のタイプに依り得る。例示的な濃縮法は、タンパク質沈殿法、液液抽出、固液抽出、親和性捕捉／放出、抗体媒介性濃縮および限外濾過を含むことができるが、それらに限定されない。他の濃縮法、または２つまたはそれよりも多くの濃縮法の組合せを使用し得る。例示的な試料濃縮過程を、下記の実施例１で提供する。

いくつかの実施形態では、フェノール性ＯＨ分析物の分析は、例えば、質量分析計における高エネルギー衝突によってレポーターイオンを作製することと、レポーターイオンの強度またはピーク面積を定量のために利用することとを含み得る。例えば、上記で示したＱＡＯＣ試薬は、高エネルギー衝突（ＭＳＭＳ）の最中に中性損失を受けて、荷電分析物種をレポーターイオンとして残すことができ、次いで、そのレポーターイオンをＭＳ^３分析にかけることができる。いくつかの実施形態では、ＱＡＯＣ試薬は、高エネルギー衝突時にタグフラグメントを作製可能なので、次いで、そのタグフラグメントをＭＳ^３分析にかけることができる。

様々な実施形態に従い、１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ分析物および／または本教示に従って形成されたその付加物を標識するために、複数のマススペクトロメトリー（ＭＳ）タグ付け剤を使用可能である。いくつかの実施形態に従い、アミノオキシタグ付け剤は、強力なレポーターイオンを提供するのに十分にフラグメント化（ｆｒａｇｍｅｎｔ）可能である。いくつかの実施形態に従い、アミノオキシタグ付け剤は、マススペクトロメトリーのために特定して設計されているタグ付け剤を含むことができ、いくつかの実施形態に従い、アミノオキシタグ付け剤は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイのために特定して設計されている。いくつかの実施形態では、アミノオキシタグ付け剤を使用して、フェノール性ＯＨ分析物を標識することによって作製された付加物をタグ付け可能である。標準付加物がフェノール性ＯＨ分析物の定量のために使用されるいくつかの実施形態では、アミノオキシタグ付け剤を使用して、標準付加物をタグ付け可能である。様々な実施形態では、標準付加物は、標準付加物と比較して分析物を相対的に定量するために使用可能である。標準付加物の濃度が公知であるいくつかの実施形態では、標準付加物は、分析物を絶対的に定量するために使用可能である。いくつかの実施形態では、様々なアミノオキシＭＳタグ付け剤を使用して、様々な分析物を標識可能である。例えば、アミノオキシＭＳタグ付け剤は、異なる同重体タグまたは異なる質量差タグであり得る。例えば、標準付加物をタグ付けするために使用されるアミノオキシＭＳタグ付け剤が、一組の同重体タグに由来する第１の同重体タグを含むことができる一方で、試料に由来する付加物をタグ付けするために使用されるアミノオキシＭＳタグ付け剤は、第１の同重体タグとは異なるが同じ組の同重体タグに由来する第２の同重体タグを含むことができる。

いくつかの実施形態に従い、少なくとも２つの異なるカテゴリのアミノオキシタグ付け剤を使用して、高エネルギー衝突下でレポーター基を作製可能である。ＱＡＯＣ試薬は、１ステップまたは２ステップタグ付け反応のいずれかを使用することによって、これらのアミノオキシタグ付け剤を下記の構造を有する化合物（カルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬）と組み合わせて使用し形成可能であり、

Ｒ_２は、環式、分岐もしくは直鎖の、置換もしくは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキン、または置換もしくは非置換芳香族基であり、
Ｒ_３は、存在しないか、または同じかもしくは異なっている１つもしくはそれよりも多くの置換基であり、この置換基は、環式、分岐もしくは直鎖Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキン；ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩもしくはＦ）；−ＮＯ_２；置換もしくは非置換芳香族（アリール）基；保護されているかもしくは保護されていないアミノ基、アシル基、カルボン酸基もしくはチオール基；−ＳＯ_３Ｈ、−ＰＯ_４ ⁻、チオエーテル、エーテル、エポキシド、チオ−エポキシド、アジドもしくはアジリジンであり、
Ｌ１は、結合またはリンカーであり、
Ａｒは、結合、アリール基、またはヘテロアリール基である。

使用できるアミノオキシＭＳタグ付け剤の第１および第２のカテゴリまたは組に由来する例示的な化合物を、下記に示す。

第１のカテゴリでは、アミノオキシＭＳタグ付け剤は、
Ｒ_１−（ＣＨ_２）_ｎ−ＯＮＨ_２
であり、式中、Ｒ_１は、第四級アミンもしくはホスフェート、または例えば下記の構造を有する置換基であり、

式中、各Ｒ_４は、独立して、Ｈ、または環式、分岐もしくは直鎖Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキンであり、ｍは、１〜２０、１〜１５、１〜１０または１〜５の整数であり、Ｘはアニオンである。

第２のカテゴリでは、アミノオキシＭＳタグ付け剤は、
Ｒ_１−（ＣＨ_２）_ｎ−ＯＮＨ_２
であり、式中、Ｒ_１は、限定されるものではないが、下記の５つの構造のうちの１つまたはそれよりも多くであってよく、

ｎは、１〜２０、１〜１５、１〜１０または１〜５であり得る。

第１のカテゴリのアミノオキシＭＳタグ付け剤に由来するアミノオキシＭＳタグ付け剤は、高エネルギー衝突（ＭＳＭＳ）の最中に中性損失を受けて、荷電分析物種（ｃｈａｒｇｅｄ ａｎａｌｙｔｅ ｓｐｅｃｉｅｓ）をレポーターイオンとして残すことができ、次いで、それをＭＳ^３分析にかけることができる。第２のカテゴリのアミノオキシＭＳタグ付け剤に由来するアミノオキシＭＳタグ付け剤によって、高エネルギー衝突時にタグフラグメントをレポーターイオンとして得ることができる。

上記で説明したように、アミノオキシＭＳタグ付け剤を、フェノール性ＯＨ分析物をカルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬で標識することによって形成された付加物のカルボニル部分と組み合わせて、タグ付き付加物を作り出すことができる。

様々な実施形態に従い、アミノオキシＭＳタグ付け剤の各タイプについて、複数の同重体タグ付け剤または質量差タグ付け剤を配合および使用可能である。各図２Ａおよび２Ｂには、それぞれ一組の同重体四重アミノオキシＭＳタグ付け剤が図示されている。同重体タグ付け剤の各組は、同一の化学構造および質量を有し得るが、同位体の異なる組合せおよび／または位置を含み得る。

いくつかの実施形態では、標識されたフェノール性ＯＨ分析物の親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を、三連四重極ＭＳプラットフォームを使用して実施可能である。ＰＤＩＴＭおよびその使用に関するさらなる詳細については、その全体が参照によって本明細書で援用される米国特許出願公開第２００６／０１８３２３８Ａ１号に記載されている。本明細書に記載のように、標識されたフェノール性ＯＨ分析物に対して実施されるマススペクトロメトリー分析のタイプは、限定されない。様々な実施形態では、ＬＣ−ＭＳＭＳを用いることができる。いくつかの実施形態では、アミノオキシＭＳタグ付け剤は、ＭＳＭＳの最中に中性損失を受け、荷電分析物種であるレポーターイオンを残す。いくつかの実施形態では、アミノオキシＭＳタグ付け剤は、ＭＳＭＳの最中にタグフラグメントであるレポーターイオンを形成する。

いくつかの実施形態では、本教示に従うフェノール性ＯＨ分析物を含んでいる試料の分析のための方法では、内標準物質を用いることができる。いくつかの実施形態では、このような内標準物質は、フェノール性ＯＨ分析物を、ＱＡＯＣ標識試薬の１つまたはそれよりも多くの同位体変種（ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｖａｒｉａｎｔ）と反応させることによって生成可能である。本教示のタグ付け化学および方法論によって、公知の方法よりも高い感度を提供可能であり、様々な実施形態において、フェノール性ＯＨ分析物の^２Ｈ含有標準物質、^１３Ｃ含有標準物質、^１５Ｎ含有標準物質および^１８Ｏ含有標準物質の必要性を排除し得る。いくつかのフェノール性ＯＨ分析物の同位体標識された標準物質は、市販されておらず、それによって、本教示なしでこれらの分析物を絶対的に定量することは困難となる。本教示によれば、いくつかの実施形態では、各分析物は、それ自体の内標準物質を有し得る。レポーターシグナルは、標準試料および試験試料に特異的であり得る。

いくつかの実施形態では、標識された標準物質のために使用されるＱＡＯＣ試薬は、一組の質量差タグに由来する第１の質量差タグを含むことができる。標識された試料は、第１の質量差タグとは異なるが同じ組の質量差タグに由来する第２の質量差タグを含むことができる。次いで、標識された試料を、標識された試料のマススペクトロメトリー、ＬＣ−ＭＳＭＳ分析、それらの組合せ等を使用して分析可能である。様々な実施形態に従い、１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ分析物を定量するための方法は、マススペクトロメトリーを使用して質量分析する前に、分析物を修飾する２ステップの化学反応を含むことができる。様々な実施形態に従い、２ステップの化学反応は、最初に、フェノール性ＯＨ分析物中のフェノール性ＯＨ官能基の芳香環を、カルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬で誘導体化して付加物を形成することと、次いで、その付加物を、（ＭＳ）タグ付け剤、例えばアミノオキシＭＳタグ付け剤で標識することとを含み得る。いくつかの実施形態に従い、液体クロマトグラフィー−タンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳＭＳ）を使用して、修飾された分析物を分析可能である。異なる分析物の付加物は、逆相カラムで異なる特徴的な保持時間を有し得、特徴的な質量を有し得るので、カラムから時間を隔てて溶出させることができる。カラムからの溶出液は、ＭＳＭＳ分析にかけることができる。レポーター基は、高エネルギー衝突下で作製され得る。レポーター基の強度またはピーク面積は、同定および／または定量のために使用可能である。

同重体タグによって多重化が可能になり、試料当たりの処理能力が高く、費用がより低いフェノール性ＯＨ分析物の多重分析のための方法が提供される。フェノール性ＯＨ分析物のすべてに１つの共通の官能基が存在するので、様々な実施形態では、各分析物ごとに１つのタグしか必要としない。いくつかの実施形態では、ＰＤＩＴＭを使用すると、特異度が増大し、誤差の危険性が低下する。試薬設計により、その試薬がＦｌａｓｈＱｕａｎｔ^ＴＭ適用にとって良好な手段となり、分析物の同一性を確認するのを手助けするＭＳ^３能を可能にし得る。

様々な実施形態に従い、一組の同重体試薬に由来する第１の同重体タグは、例えば公知の濃度で、公知のフェノール性ＯＨ分析物を含み得る標準物質と接触させることができる。この接触は、第１の同重体タグと標準物質との間の反応にとって好ましい条件下で行うことができる。第１の同重体タグと同じ組の同重体試薬に由来する第２の同重体タグは、未知の濃度のフェノール性ＯＨ分析物を含む試料と接触させることができる。下記でさらに記載する通り、標準物質および試料のタグ付けされた分析物を一緒に混合し、分析して、試料中の分析物の濃度を求めることができる。この分析は、混合物を分離して、分離した分析物を形成することと、分離した分析物を分析することとを含み得る。使用可能である分離方法には、ガスクロマトグラフィー法、液体クロマトグラフィー法、他のクロマトグラフィー法、電気泳動法、電気浸透法、質量差分離法等が含まれる。例示的な一実施形態では、液体クロマトグラフィーを使用して、混合物中の様々な分析物を分離し、それで、分離した分析物を形成する。

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーによる分離は、逆相カラムで実施可能であり、カラムから溶出するピークを、その後の分析にかけることができる。いくつかの実施形態では、その後の分析は、マススペクトロメトリー、またはより具体的には親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を含むことができる。下記でより詳細に説明するように、ＰＤＩＴＭから得られた結果を比較することによって、試料中のフェノール性ＯＨ分析物の濃度を求めることができる。ＰＤＩＴＭおよびその使用に関するさらなる詳細については、その全体が参照によって本明細書で援用される米国特許出願第２００６／０１８３２３８Ａ１号に見出すことができる。

いくつかの実施形態に従い、同重体タグ付け試薬の代わりに、質量差タグ付け剤を使用可能である。例示的な質量差剤の対は、図３Ａおよび３Ｂに図示されている。様々な実施形態に従い、アミノオキシＭＳタグ付け剤は、多重アッセイにおける相対的かつ絶対的な定量のために使用できる。いくつかの実施形態に従い、アミノオキシＭＳタグ付け剤は、二重、三重、四重、および他の多重アッセイで使用可能である。

いくつかの実施形態では、試薬は、参照によって本明細書で援用される米国特許出願公開第２０１１／０２１２５３４号に記載のように、１つまたはそれよりも多くのビタミンＤ化合物を含む試料と反応可能であり、両方のクラスの化合物の多重分析のために本明細書に記載のフェノール性ＯＨ分析物と反応させることもできる。

いくつかの実施形態では、ＱＡＯＣ試薬は、フェノール性ＯＨ部分と等モル濃度で試料と組み合わされる。いくつかの実施形態では、フェノール性ＯＨ部分に対して過剰（例えば約１０％、約２０％、約２倍過剰、または約４倍過剰）のＱＡＯＣ試薬が、フェノール性ＯＨ試料に加えられる。いくつかの実施形態では、等モル濃度未満のＱＡＯＣが使用され、例えば、ＱＡＯＣ濃度は、フェノール性ＯＨ部分のモル濃度の約２５％、約５０％または約７５％であり得る。いくつかの実施形態では、ＱＡＯＣ試薬は、試料溶液中１μｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で試料と組み合わされる。

いくつかの実施形態では、タグ付け化学および方法は、任意の三連四重極装置、例えばＦｌａｓｈＱｕａｎｔ^ＴＭをＭＡＬＤＩ源と共に含む装置で実施可能である。いくつかの実施形態では、フェノール性ＯＨ分析物およびそれらの代謝産物のための分析器として、試薬キット、データ分析ソフトウェアおよびＭＳプラットフォームが提供される。

本教示の様々な実施形態に従って使用できる異なる液体クロマトグラフィーおよびマススペクトロメトリー法、システム、およびソフトウェアには、２００９年５月３１日出願の米国仮特許出願第６１／１８２，７４８号、および２００６年８月１７日公開の米国特許出願第２００６／０１８３２３８Ａ１号に記載されているものが含まれる。これらの参考文献は、共に参照によって本明細書で援用される。

本教示のさらに他の実施形態に従い、上記で論じたものなどのＱＡＯＣ試薬を含むキットが提供される。他の実施形態では、カルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬、および１つまたはそれよりも多くのアミノオキシＭＳタグ付け剤を含むキットが提供される。アミノオキシＭＳタグ付け剤は、上記で説明した第１のおよび／または第２のカテゴリまたは組のアミノオキシＭＳタグ付け剤に由来する化合物を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、公知のフェノール性ＯＨ分析物を含む標準物質を含むことができる。

本教示の様々な実施形態に従い、カルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬およびアミノオキシＭＳタグ付け剤のうちの１つまたはそれよりも多くを含むことができるキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、フェノール性ＯＨを含む公知の濃度のステロイド分析物を含む標準物質を含むことができる。

いくつかの実施形態では、キットは、公知の濃度の公知のフェノール性ＯＨ分析物を含む少なくとも１つの標準物質を含むことができる。いくつかの実施形態に従い、アミノオキシＭＳタグ付け剤は、一組の同重体タグに由来する同重体タグであってよく、いくつかの実施形態では、キットは、一組の同重体タグに由来する複数の異なる同重体タグを含むことができる。いくつかの実施形態に従い、アミノオキシＭＳタグ付け剤は、一組の質量差タグに由来する質量差タグであってよく、いくつかの実施形態では、キットは、一組の質量差タグに由来する複数の異なる質量差タグを含むことができる。いくつかの実施形態に従い、キットは、カルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬、アミノオキシＭＳタグ付け剤、公知のフェノール性ＯＨ分析物を含む標準物質、および／または公知の濃度の公知のフェノール性ＯＨ分析物を含むことができ、さらに、フェノール性ＯＨ分析物を標識するための指示を含むこともできる。

本教示のさらに他の実施形態に従い、キットは、図１に示したＱＡＯＣ試薬、異なるＱＡＯＣ試薬、それらの組み合わせ等を含むことができる。キットはまた、公知のフェノール性ＯＨ分析物を含む標準物質を含むことができる。いくつかの実施形態では、標準物質は、公知の濃度の公知のフェノール性ＯＨ分析物を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットに含まれるＱＡＯＣ試薬は、一組の同重体タグに由来する１つまたはそれよりも多くの同重体タグを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、一組の同重体タグに由来する複数の異なる同重体タグを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットに含まれるＱＡＯＣ試薬は、一組の質量差タグに由来する１つまたはそれよりも多くの質量差タグを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、一組の質量差タグに由来する複数の異なる質量差タグを含むことができる。

様々な実施形態に従い、キットは、緩衝液、１つまたはそれよりも多くのクロマトグラフィーカラム、ならびに必要に応じて、アッセイを実施するのに有用な他の試薬および／または成分を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、使用者が試料を加えることのみを必要とするように、例えば均一系アッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｓｓａｙ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、較正用または標準化用の試薬または標準物質を含むことができる。アッセイを実施するために使用できるか、または使用すべき機器設定に関する情報も、キットに含まれ得る。いくつかの実施形態では、試料の調製、操作条件、容積測定量、温度設定等に関する情報が、キットに含まれる。

キットは、１つまたはそれよりも多くの試薬容器および適切な指示を含む密封容器内にパッケージ可能である。１つまたはそれよりも多くのアッセイ、測定値、遷移ペア（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｐａｉｒ）、操作指示、操作を実施するためのソフトウェア、それらの組み合わせ等に関連する電子情報を保存した電子媒体が、キットに含まれ得る。様々な実施形態に従い、ＱＡＯＣ試薬およびその中間体を合成するための方法が提供され得る。

本教示の態様は、下記の実施例を考慮することによりさらに理解可能であるが、これらの実施例は、いかなる方式でも本教示の範囲を制限すると解釈されるべきでない。

（実施例１）
標識されたＱＡＯＣ試薬の合成におけるステップの例示

ｐ−アセチル−４−フェニル−１−カルボエトキシセミカルバジド（ｃａｒｂｅｔｈｏｘｙｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ）（１）の合成

カルバジド酸エチル（６．４６ｇ、６２．０５ｍｍｏｌ）のトルエン（１００ｍＬ）溶液に、イソシアン酸４−アセチルフェニル（１０ｇ、６２．０５ｍｍｏｌ）のトルエン（２５０ｍＬ）溶液を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、次いで８０℃で２時間撹拌した。反応で形成された沈殿物を濾過し、真空オーブン中で乾燥させて、ｐ−アセチル−４−フェニル−１−カルボエトキシセミカルバジド１（ｐ−ａｃｅｔｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−ｌ−ｃａｒｂｅｔｈｏｘｙｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ １）（１６．５ｇ、９０％）を得た。これを、さらなる精製なしに次の反応ステップで使用した（合成は、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ、Ｃｏｌｌ． ６巻、９３６頁（１９８８年）；５１巻、１２１頁（１９７１年）から採用。４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン）。様々な態様では、この実施例で使用される成分のそれぞれの値は、約５％〜約２０％の範囲にある量で増加または減少する場合があり、例えば各成分は、この実施例で使用される値よりも５％少ない量から５％多い量で使用可能であり、各成分は、この実施例で使用される値よりも１０％少ない量から１０％多い量で使用可能であり、各成分は、この実施例で使用される値よりも１５％少ない量から１５％多い量で使用可能であり、または各成分は、この実施例で使用される値よりも２０％少ない量から２０％多い量で使用可能である。様々な態様では、その値は、±約５％〜２０％で変わり得る。
ｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール（２）の合成

ｐ−アセチル−４−フェニル−１−カルボエトキシセミカルバジド１（１５ｇ、５６ｍｍｏｌ）を、４ＭのＫＯＨ水溶液（２８ｍＬ、１１２ｍｍｏｌ）と共に７０℃で約２時間加熱した。焼結フィルター漏斗を使用して、残った粒状固体を濾別した。濾液を室温に冷却し、濃ＨＣｌで酸性にした。形成された沈殿物を濾過し、真空オーブン中で乾燥させて、ｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール２を淡黄色固体として得た（１２．４ｇ、８５％）。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：ｓ＝１．６５（ｓ，３Ｈ）、６．７０（ｄ，２Ｈ）、７．１０（ｄ，２Ｈ）、９．５０（ｓ，２Ｈ）（合成は、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ、Ｃｏｌｌ． ６巻、９３６頁（１９８８年）；５１巻、１２１頁（１９７１年）から採用。４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン）。様々な態様では、この実施例で使用される成分のそれぞれの値は、約５％〜約２０％の範囲にある量で増加または減少する場合があり、例えば各成分は、この実施例で使用される値よりも５％少ない量から５％多い量で使用可能であり、各成分は、この実施例で使用される値よりも１０％少ない量から１０％多い量で使用可能であり、各成分は、この実施例で使用される値よりも１５％少ない量から１５％多い量で使用可能であり、または各成分は、この実施例で使用される値よりも２０％少ない量から２０％多い量で使用可能である。様々な態様では、その値は、±約５％〜２０％で変わり得る。
ｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール第四級アミノオキシ付加臭化物（４）の合成

ｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール２（２．１０ｇ、９．５８ｍｍｏｌ）および第四級アミノオキシタグ３（メタノール−酢酸（９５：５ｖ／ｖ）１００ｍＬ中６．７４ｇ、２０．６ｍｍｏｌ（標識試薬としての第四級アミノオキシタグは、その全体が参照によって本明細書で援用される米国特許出願公開第２０１１−０００３３９５号に記載されている）の懸濁液を、周囲温度で４８時間撹拌した。この段階でＨＰＬＣ分析を行うと、２が、生成物であるｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール第四級アミノオキシ付加物４に９５％変換されたことが示された。カラム：ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ１８、３．９×１５０ｍｍ、緩衝液Ａ：水＋０．１％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ：アセトニトリル＋０．０８５％ＴＦＡ、波長（シグナル＝２５４ｎｍ、参照＝３６０ｎｍ）、流速＝１ｍＬ／分。分析物の濃度は、メタノール中およそ０．２５ｍｇ／ｍＬであった。ｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール２の保持時間＝５．１分、ｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール第四級アミノオキシ付加物４の保持時間＝５．５分。ＥＳ−ＭＳデータ：Ｍ＋（算出値Ｍ＋＝Ｃ_１６Ｈ_２４Ｎ_５Ｏ_３＋＝３３４．１９、観測値Ｍ＋＝３３４．２０および２７５．５０（−Ｍｅ_３Ｎ））。メタノールを除去した後、粗製生成物を白色固体として単離した。様々な態様では、この実施例で使用される成分のそれぞれの値は、約５％〜約２０％の範囲にある量で増加または減少する場合があり、例えば各成分は、この実施例で使用される値よりも５％少ない量から５％多い量で使用可能であり、各成分は、この実施例で使用される値よりも１０％少ない量から１０％多い量で使用可能であり、各成分は、この実施例で使用される値よりも１５％少ない量から１５％多い量で使用可能であり、または各成分は、この実施例で使用される値よりも２０％少ない量から２０％多い量で使用可能である。様々な態様では、その値は、±約５％〜２０％で変わり得る。

対イオン交換：こうして得られた固体を、水４０ｍＬに溶解し、そのうち３０ｍＬ（１１．５０ｍｍｏｌの４）を、交換のために使用した。この溶液に（５０ｍＬのＦａｌｃｏｎ管中）、ヘプタフルオロ酪酸銀の溶液（脱イオン水１５ｍＬ中３．６９ｇ、１１．５３ｍｍｏｌ）を一度に加え、管を振って簡単に混合した。沈殿物を、３０００ｒｐｍで２分間遠心分離処理することによって分離した。ヘプタフルオロ酪酸銀の希釈溶液（１滴）を加えることによって、任意の臭化物イオン（Ｂｒ⁻）について上清をチェックした。濁りが生じたら、Ｂｒ⁻が存在することを示す。臭化物イオンが完全に沈殿したことを確かめるために、別の０．２当量（水５ｍＬ中０．７３８ｍｇ）のヘプタフルオロ酪酸銀を加え、混合し、遠心分離処理し、Ｂｒ⁻についてチェックした。透明溶液は、すべてのＢｒ⁻全体が消費されたことを示す。濾液をシリンジに入れ、５ミクロンフィルター（２５ｍｍ、Ｍｉｌｌｅｘ ＬＣＲ、ＰＴＥＦ、２５ｍＬ／フィルター）を介して再び濾過し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製した（２つのバッチで精製した：４３ｇ、Ｃ１８Ｉｓｃｏカラム、流速＝４０ｍｌ／分、溶媒Ａ：水、溶媒Ｂ：メタノール。カラムを、１００ｍＬの５０％Ｂ、次いで２５０ｍＬの２％Ｂで平衡化した。試料を溶液としてカラムに入れる。２％Ｂで０〜６分、次いで２〜８５％Ｂで６〜３５分、波長＝２５４ｎｍ）。生成物を含む画分を、分析ＨＰＬＣによって純度について分析し、純粋な（＞９５％）画分をプールし、ロータリーエバポレーターで乾燥させて、ｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール第四級アミノオキシ付加ヘプタフルオロブチレート５を白色固体として得た。固体をトルエン２０ｍＬと共に蒸発させ、真空下で乾燥させて、水を完全に除去した。最終収率およびＨＰＬＣ純度は、２．６ｇ（６５％）および＞９８％であった。様々な態様では、この実施例で使用される成分のそれぞれの値は、約５％〜約２０％の範囲にある量で増加または減少する場合があり、例えば各成分は、この実施例で使用される値よりも５％少ない量から５％多い量で使用可能であり、各成分は、この実施例で使用される値よりも１０％少ない量から１０％多い量で使用可能であり、各成分は、この実施例で使用される値よりも１５％少ない量から１５％多い量で使用可能であり、または各成分は、この実施例で使用される値よりも２０％少ない量から２０％多い量で使用可能である。様々な態様では、その値は、±約５％〜２０％で変わり得る。
標識されたＱＡＯＣ試薬（６）の合成

冷却したｐ−アセチル−４−フェニルウラゾール第四級アミノオキシ付加ヘプタフルオロブチレート５（８００ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ、アルゴン雰囲気下）の懸濁液に、ｔＢｕＯＣｌ溶液（無水アセトニトリル７ｍＬ中０．１７５ｍＬ、１．４６ｍｍｏｌ）を、撹拌しながら滴加した（２〜３分間加えた）。滴加が完了したら、反応混合物を０〜５℃で３０分間撹拌した。アセトニトリルをロータリーエバポレーター（窒素を通気）で除去し、ピンク色の固体を無水ＥｔＯＡｃで洗浄した（アルゴンブランケット下でパスツールピペットによって上部から除去した）。真空下で乾燥させた後、０．６５ｇ（８０％）の６を、オレンジ色から赤色固体として得た。生成物を、湿気がない状態で−４０℃において保存し、明るい光から保護した。様々な態様では、この実施例で使用される成分のそれぞれの値は、約５％〜約２０％の範囲にある量で増加または減少する場合があり、例えば各成分は、この実施例で使用される値よりも５％少ない量から５％多い量で使用可能であり、各成分は、この実施例で使用される値よりも１０％少ない量から１０％多い量で使用可能であり、各成分は、この実施例で使用される値よりも１５％少ない量から１５％多い量で使用可能であり、または各成分は、この実施例で使用される値よりも２０％少ない量から２０％多い量で使用可能である。様々な態様では、その値は、±約５％〜２０％で変わり得る。
（実施例２）
試料の濃縮

試料、抽出溶媒およびそれらの組成物の体積、試薬溶液、抽出培地の量、ならびに分子量カットオフ膜タイプは、典型的なものである。

乾燥血斑：濾紙上にある乾燥させたヒトまたは動物の血液試料（３〜１０μＬ）に、内標準物質（単数または複数）をスパイク添加し、好ましくは１：１の組成の酢酸エチル−ヘキサン１００μＬで、より好ましくは複数回抽出した（抽出効率を強化するのに、超音波処理が必要な場合がある）。次いで、組み合わせた酢酸エチル−ヘキサン層を、真空遠心濃縮器または熱を用いるガス流またはそれらすべての組合せを使用して乾燥させた。乾燥させた試料に、試薬溶液５０μＬ（アセトニトリル中２ｍｇ／ｍＬ）を加えた。試料をボルテックス混合し、次いで室温で少なくとも３０分間インキュベートした。水（２０μＬ）を加え、試料をボルテックス混合し、次いで、試料をＬＣ−ＭＳＭＳによって分析した。

タンパク質沈殿：内標準物質（単数または複数）を含むヒトまたは動物の血清または血漿試料（２００μＬ）に、アセトニトリル０．８ｍＬを加えた。試料をボルテックス混合し、次いで、１０，０００×ｇで５分間、遠心分離処理した。上清（７５０μＬ）を除去し、次いで、真空遠心濃縮器または熱を用いるガス流またはそれらすべての組合せを使用して乾燥させた。乾燥させた試料に、試薬溶液５０μＬ（アセトニトリル中２ｍｇ／ｍＬ）を加えた。試料をボルテックス混合し、次いで、室温で少なくとも３０分間インキュベートした。水（２０μＬ）を加え、試料をボルテックス混合し、次いで、試料をＬＣ−ＭＳＭＳによって分析した。

液液抽出（ＬＬＥ）：内標準物質（単数または複数）を含むヒトまたは動物の血清または血漿試料（２００μＬ）を、好ましくは１：１の組成の酢酸エチル−ヘキサン１ｍＬで、好ましくは複数回抽出した。次いで、組み合わせた酢酸エチル−ヘキサン層を、真空遠心濃縮器または熱を用いるガス流またはそれらすべての組合せを使用して乾燥させた。乾燥させた試料に、試薬溶液５０μＬ（アセトニトリル中２ｍｇ／ｍＬ）を加えた。試料をボルテックス混合し、次いで、室温で少なくとも３０分間インキュベートした。水（２０μＬ）を加え、試料をボルテックス混合し、次いで、試料をＬＣ−ＭＳＭＳによって分析した。

固液抽出（ＳＬＥ）：内標準物質（単数または複数）を含むヒトまたは動物の血清または血漿試料（２００μＬ）を、好ましくはカートリッジまたは９６ウェルプレートまたは任意の他の適切なフォーマットにおいて、珪藻土培地２００ｍｇ上に適用し、５〜１０分間吸着させ、次いで、ジイソプロピルエーテル１ｍＬで、好ましくは複数回抽出した。次いで、組み合わせたジイソプロピルエーテル抽出物を、真空遠心濃縮器もしくは熱を用いるガス流またはそれらすべての組合せを使用して乾燥させた。乾燥させた試料に、試薬溶液５０μＬ（アセトニトリル中２ｍｇ／ｍＬ）を加えた。試料をボルテックス混合し、次いで、室温で少なくとも３０分間インキュベートした。水（２０μＬ）を加え、試料をボルテックス混合し、次いで、試料をＬＣ−ＭＳＭＳによって分析した。

遊離（非結合）エストロゲン：ヒトまたは動物の血清または血漿試料（４００μＬ）を、３０ｋＤａ限外濾過（ＵＦ）膜またはデバイスに適用し、３０００〜５０００ｇで１時間遠心分離処理した。次いで、濾液に内標準物質（単数または複数）をスパイク添加し、ジイソプロピルエーテル１ｍＬで、好ましくは複数回抽出した。次いで、組み合わせたジイソプロピルエーテル抽出物を、真空遠心濃縮器または熱を用いるガス流またはそれらすべての組合せを使用して乾燥させた。乾燥させた試料に、試薬溶液５０μＬ（アセトニトリル中２ｍｇ／ｍＬ）を加えた。試料をボルテックス混合し、次いで、室温で少なくとも３０分間インキュベートした。水（２０μＬ）を加え、試料をボルテックス混合し、次いで、試料をＬＣ−ＭＳＭＳによって分析した。
（実施例３）
マススペクトロメトリー分析

試料を、ＬＣ−ＭＳＭＳ分析において下記のパラメータを使用して分析し得る。

ＨＰＬＣパラメータ
カラム：ＡＡＡ Ｃ１８カラム（Ｃ１８逆相、５μｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）
温度：５０℃
移動相：Ａ＝Ｈ_２Ｏ＋０．１％ＦＡ Ｂ＝アセトニトリル＋０．１％ＦＡ
注入量：２０μＬ

ＨＰＬＣおよびＭＳパラメータは、典型的な値であり、それらに限定されるものではない。
（実施例４）
ＡＰＩ−５５００ＱＴＲＰでのエストロゲンの分析

類似の過程を使用して、エストラジオールを、図４に示した機序に従って式Ｉの標識されたＱＡＯＣと反応させ、Ｑ１−ＭＳ−Ｑ１スキャンを使用して分析した。図５Ａは、ＡＢ ＳＣＩＥＸ製のＡＰＩ−５５００ＱＴＲＰ^ＴＭ質量分析計を使用する反応混合物のスキャンを提供している。示されている通り、期待値はＭ^＋＝６０４．３５であり、実測値は６０４．２であった。

いくつかの実施形態に従い、同重体タグがアミノオキシＭＳタグ付け剤である場合、レポーターシグナルを、さらなるフラグメンテーション（ＭＳ^３）にかけることができる。レポーターシグナルをさらなるフラグメンテーションにかけることによってピークを得ることができ、そのピークを標準データベースと比較することによって、分析物の同定を確証可能である。いくつかの実施形態に従い、カラムからの溶出液を、親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）にかけることができる。ｍ／ｚ ６０４．３におけるこの生成物イオンを、衝突エネルギースキャンにかけた。その結果を図６Ａに示す。親イオンならびに５４５．１における中性損失フラグメントを含むＭＲＭフラグメントのうちのいくつかは、図６Ｂに見ることができる。次いで、この反応混合物を、両方のＭＲＭ遷移：６０４．３→５４５．１および６０４．３→２１７．２についてＬＣ−ＭＲＭプロファイルにかけた。それらのプロファイルを図７に示す（点線および実線）。反応混合物を、Ｗａｔｅｒｓ製Ａｃｑｕｉｔｙ Ｃ８ ＵＰＬＣカラムに、８分間でアセトニトリル−水（０．１％ギ酸）勾配５→９５％Ｂにより０．７ｍＬ／分、注入量５μＬ、カラム区画４０℃で流した。
実施例５−３２００ＱＴＲＡＰでのエストロゲンの分析

エストロン、エストラジオールおよびエストリオールを、各々、濃縮し、式Ｉの標識されたＱＡＯＣ試薬と反応させ、生成物イオンのフラグメンテーションパターンを求めた。３２００ＱＴＲＡＰ機器を使用して、下記のようにＭＳＭＳパラメータを得た。

使用した供給源／ガスパラメータは、下記のとおりであった。

図８は、図１のＱＡＯＣ試薬で標識されたエストロン、エストラジオールおよびエストリオールを含む反応物のＬＣ−ＭＲＭプロファイルを提供している。

本明細書で使用した各節の見出しは、単に構成上の目的のためであり、いかなる方式でも記載された主題を制限するものとして解釈されるべきではない。

本出願人らの教示を、様々な実施形態と併せて記載してきたが、本出願人らの教示は、このような実施形態に限定されることを意図されない。対照的に、本出願人らの教示は、当業者によって理解されるように、様々な変更、改変および等価物を包含する。

上記の説明が、実施例および様々な実施形態の特定の詳細を提供してきたが、説明された実施形態のいくつかの特徴および／または機能は、説明された実施形態の範囲から逸脱することなく改変が認められることが、理解される。上記の説明は、本発明を例示するように意図され、その範囲は、添付の特許請求の範囲の文言によってのみ制限される。本教示の他の実施形態は、本明細書を考慮し、本明細書に開示されている本教示を実施することによって、当業者に明らかとなる。本明細書および実施例は、単に例示的と考えられるように意図される。

Claims (27)

1. 試料のマススペクトロメトリー分析方法であって、
   前記試料をＱＡＯＣ試薬で処理し、その結果として、前記試料中の少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物を標識することにより、フェノール性ＱＡＯＣ付加物を作り出すステップと、
   前記フェノール性ＱＡＯＣ付加物を質量分析計を使用して分析するステップと
   を含む、方法。
2. 前記ＱＡＯＣ試薬が次式を有し、
   

   

   
   式中、Ｒ_１は、
   

   

   
   であり、
   Ｒ_２は、環式、分岐もしくは直鎖の、置換もしくは非置換Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキン、または置換もしくは非置換芳香族基であり、
   Ｒ_３は、存在しないか、または同じかもしくは異なっている１つもしくはそれよりも多くの置換基であり、この置換基は、環式、分岐もしくは直鎖Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキン；ハロゲン；−ＮＯ_２；置換もしくは非置換芳香族基；保護されているかもしくは保護されていないアミノ基、アシル基、カルボン酸基もしくはチオール基；−ＳＯ_３Ｈ、−ＰＯ_４ ⁻、チオエーテル、エーテル、エポキシド、チオ−エポキシド、アジドもしくはアジリジンであり、
   各Ｒ_４は、独立して、Ｈ、または環式、分岐もしくは直鎖Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルケン、もしくはＣ_１〜Ｃ_１８アルキンであり、
   ｍは、１〜２０の整数であり、
   Ｘは、アニオンであり、
   Ｌ１およびＬ２は、独立して、結合またはリンカーであり、
   Ａｒは、結合、アリール基、またはヘテロアリール基である、
   請求項１に記載の方法。
3. Ｒ_２が、メチルもしくはエチルであり、Ｒ_３が存在せず、
   かつ／またはＬ１およびＬ２が、独立して、結合、ペプチド、オリゴマー、ＰＥＧもしくはＣ_１〜Ｃ_２０アルキレン鎖である、
   請求項２に記載の方法。
4. 前記少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物が、ステロイドである、請求項２に記載の方法。
5. 前記ステロイドが、エストリオール、１６−エピエストリオール、１７−エピエストリオールおよび１６，１７−エピエストリオール、エストロン（Ｅ１）、エストロンサルフェート（Ｅ１ｓ）、１７α−エストラジオール（Ｅ２ａ）、１７β−エストラジオール（Ｅ２ｂ）、エストラジオールサルフェート（Ｅ２ｓ）、エキリン（ＥＱ）、１７α−ジヒドロエキリン（ＥＱａ）、１７β−ジヒドロエキリン（ＥＱｂ）、エキレニン（ＥＮ）、１７α−ジヒドロエキレニン（ＥＮａ）、１７β−ジヒドロエキレニン（ＥＮｂ）、Δ８，９−デヒドロエストロン（ｄＥ１）、Δ８，９−デヒドロエストロンサルフェート（ｄＥ１ｓ）からなる群から選択されたエストロゲン化合物である、請求項４に記載の方法。
6. 前記ＱＡＯＣ試薬が、構造
   

   

   
   を有する化合物をアミノオキシタグと反応させることにより、構造
   

   

   
   ［式中、ｎは、１〜２０の整数である］、
   を有するタグ付きＱＡＯＣ試薬を形成することによって作製される、請求項２に記載の方法。
7. Ｒ_２が、メチルもしくはエチルであり、Ｒ_３が存在せず、Ｒ_４がメチルであり、ｍが１〜５の整数であり、Ｘがペルフルオロカルボキシレートであり、かつ／またはＬ１が結合であり、Ａｒがフェニル基であり、ｎが１〜８の整数である、請求項６に記載の方法。
8. 前記タグ付きＱＡＯＣ試薬が、構造
   

   

   
   を有する、請求項６に記載の方法。
9. 前記フェノール性ＱＡＯＣ付加物をアミノオキシタグと反応させることにより、下記の下位構造
   

   

   
   を有するタグ付き付加物を形成するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
10. Ｒ_２が、メチルまたはエチルであり、Ｒ_３が存在せず、Ｒ_４がメチルであり、ｎが２〜４の整数であり、Ｘがペルフルオロカルボキシレートである、請求項９に記載の方法。
11. Ｘが、ＣＦ_３ＣＯＯ−、ＣＦ_３ＣＦ_２ＣＯＯ−、ＣＦ_３ＣＦ_２ＣＦ_２ＣＯＯ−、ＣＦ_３ＳＯ_３ＣＯＯ−、（Ｃ_６Ｈ_５）_４Ｂ−である、請求項２または９に記載の方法。
12. 前記タグ付き付加物が、下位構造
    

    

    
    を有する、請求項９に記載の方法。
13. 前記試料が、生物学的試料である、請求項１に記載の方法。
14. 前記生物学的試料が、血液、血漿、血清、尿または唾液、脳脊髄液、組織、毛髪、体液から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物が、ステロイドであり、前記方法が、
    （ａ）公知の量の、１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ分析物が枯渇した生物学的試料に、公知の量の１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ内標準物質、および公知の増分濃度を有する１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ分析物をスパイク添加することによって、一組の較正マトリックスを作り出すステップと、
    （ｂ）ステップ（ａ）から得られた前記試料をＱＡＯＣ試薬で処理し、その結果、少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物および対応する内標準物質を標識するステップと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）の前記較正マトリックスを、ＬＣ−ＭＳＭＳを使用して分析するステップと、
    （ｄ）前記ステップ（ｃ）の分析から得られたデータを使用して、較正曲線を作成するステップと、
    （ｅ）前記試料中の前記フェノール性ＯＨ分析物に、公知の量の１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ内標準物質をスパイク添加するステップと、
    （ｆ）前記較正曲線を使用して、試料中のステロイドである前記少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物の量を推定するステップと
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
16. ステップ（ｃ）が、マススペクトロメトリーを使用する前に前記標準付加物および前記フェノール性ＱＡＯＣ付加物を時間を隔てて溶出させることを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記方法が、試料調製を行って、前記較正マトリックス中の前記フェノール性ＯＨ分析物および前記１つまたはそれよりも多くのフェノール性ＯＨ内標準物質を濃縮または浄化するステップをさらに含む、請求項１５または１６に記載の方法。
18. ステップ（ｃ）が、三連四重極ＭＳプラットフォームを使用して、前記フェノール性ＱＡＯＣ付加物の親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を行うことをさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物が、ステロイドであり、前記方法が、
    （ａ）フェノール性ＯＨを含む公知の濃度のステロイド分析物を含む内標準物質または外標準物質を提供するステップと、
    （ｂ）前記標準物質を前記ＱＡＯＣ試薬で処理することにより、標準付加物を形成するステップと、
    （ｃ）前記標準付加物をマススペクトロメトリーを使用して分析するステップと、
    （ｄ）前記試料中のステロイドである前記少なくとも１つのフェノール性ＯＨ分析物の量を推定するステップと
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
20. 前記フェノール性ＱＡＯＣ付加物を分析するステップおよび前記標準付加物を分析するステップが、三連四重極ＭＳプラットフォームを使用して、前記フェノール性ＱＡＯＣ付加物および前記標準付加物の親娘イオン遷移モニタリング（ＰＤＩＴＭ）を行うことを含む、請求項１９に記載の方法。
21. 少なくとも２つのフェノール性ＯＨ分析物が、同時に測定される、請求項１に記載の方法。
22. 少なくとも４つのフェノール性ＯＨ分析物が、同時に測定される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記フェノール性ＯＨ分析物を、前記ＱＡＯＣ試薬の１つまたはそれよりも多くの同位体変種と反応させることにより、少なくとも１つのフェノール性ＯＨ内標準物質を形成することのステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
24. １つまたはそれよりも多くのビタミンＤ−ＱＡＯＣおよびフェノール性ＱＡＯＣ付加物を、同時に定量することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
25. 試料のマススペクトロメトリー分析で使用するためのキットであって、
    １つのパッケージ内に、
    ＱＡＯＣ試薬と、
    フェノール性ＯＨを含む公知の濃度のステロイド分析物を含む標準物質と
    を含む、
    キット。
26. 前記ＱＡＯＣ試薬が、アミノオキシマススペクトロメトリータグ付け剤を含む、請求項２５に記載のキット。
27. 試料のマススペクトロメトリー分析で使用するためのキットであって、
    １つのパッケージ内に、
    カルボニル置換ＰＴＡＤベースの試薬と、
    アミノオキシマススペクトロメトリータグ付け剤と、
    フェノール性ＯＨを含む公知の濃度のステロイド分析物を含む標準物質と
    を含む、キット。
    

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