CN109959743A - 固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测农业污水中7种结合态雌激素的方法 - Google Patents

固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测农业污水中7种结合态雌激素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测农业污水中7种结合态雌激素的方法。该方法包括：(1)水样预处理，加入17β‑雌二醇D3 3‑β‑D‑葡糖苷酸、17β‑雌二醇硫酸钠‑D4、这两种指示回收率的内标物；(2)使用固相萃取柱富集净化目标结合态雌激素；(3)采用内标法，使用液质联用仪检测农业污水中7种结合态雌激素的含量。该方法采用单因素实验，通过优选内标物，优化检测条件，可一次性同时检测出农业污水中7中结合态雌激素的残留情况，具有高精密度、高灵敏度、高稳定性、高选择性和检出限低等优点。由于内标物质选用恰当，使得最终结果更真实可靠。

Description

固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测农业污水中7种 结合态雌激素的方法
技术领域
本发明属于污水中有机污染物的检测技术领域，特别涉及一种农业污水中同时检测痕量7种结合态雌激素的检测方法，尤其涉及一种固相萃取前处理结合液质联用 技术同时检测农业污水中7种结合态雌激素的方法。
背景技术
牲畜、家禽的粪尿污水是农业污水的主要来源。近年来研究发现，集约化养殖 场对环境中雌激素的贡献很大，主要源于畜禽动物正常的生理分泌排泄以及饲料中 促生长素(同化激素)的添加，包括激素类药物的使用、畜禽饲料添加剂及动物本 身的合成和排放，最终通过农业污水或畜禽粪便的排放而进入环境，进而对土壤、 水体环境产生毒害作用。环境中天然雌激素总量的90％均来自于大规模集约化畜禽 养殖，随着畜禽养殖业向现代化、规模化和集约化的方向快速发展，畜禽养殖污染 日益严重。
农业污水不加以处理直接做肥料使用会造成严重的环境污染问题。研究发现， 结合态雌激素是由动物体产生的，是生物体内天然雌激素代谢循环中的一类主要代 谢产物。动物为了排出多余的雌激素，通过酶促反应，在生物体内磺基转移酶(sulfotransferases)或葡萄糖苷酸基转移酶(glucuronosyltransferase)的作用下，将葡糖醛酸或者硫酸根结合到自由态雌激素分子上，硫酸根或葡萄糖苷酸根取代了C-3 或C-17上的对应基团而形成酯键，导致雌激素分子极性增大，从而增加了其水溶性， 更利于通过尿液或粪便排出。目前，对于农业污水中结合态雌激素还没有完善的检 测方法。
畜禽场牲畜粪尿的排泄量大，用未充分消毒灭菌的粪尿水浇灌菜地和农田，会 造成土壤污染；粪尿被雨水流冲到河溪塘沟，会造成饮用水源污染。在畜禽场临近 河岸和冬季土地冻结的情况下，这种污水对周围水生、陆生生态系统的影响更大。
要对畜禽粪便中结合态雌激素进行控制，结合态雌激素的前处理方法和检测技术至关重要，因为它们是影响分析测定结果准确性的关键。因需要检测的结合态雌 激素种类较多，各物理化学性质也不相同，且结合态雌激素在环境中易水解为自由 态雌激素，理想的环境样品前处理方法是不破坏待测组分的形态，减少污染，并且 能使待测组分与基质有效分离。同时，高灵敏度、高准确性、成本低的检测手段是 保证结合态雌激素残留检测的关键。
固相萃取-高效液相色谱串联质谱技术(HPLC-MS/MS)具有速度、灵敏度及分 离度较高，分析时间短，节省溶剂，降低分析成本等优点，目前已成为有机物预防 处理和分析的重要方法之一。现有的HLB固相萃取柱-高效液相色谱串联质谱技术用 于检测农业污水中的雌激素时，大多由于固相萃取前处理条件、液相色谱条件或质 谱条件选择不当，或多或少存在着杂质不能有效去除、基质干扰太大、检测结果不 稳定、干扰多、检测结合态雌激素数量有限和回收率低等一系列问题，或者，由于 内标物选取不当，影响检测结果的真实可靠性。
发明内容
本发明的目的旨在：克服现有技术存在的不稳定、干扰多、检测结合态雌激素 数量和回收率有限等问题的不足，提供一种检测结果稳定、干扰小、快速、高效的 同时检测农业污水中残留的7种结合态雌激素的方法，即一种固相萃取前处理结合液 质联用技术同时检测农业污水中7种结合态雌激素的方法。该方法通过固相萃取前处 理条件的优化、优选内标物、液相色谱条件和质谱检测条件的优化，最终能够实现 灵敏度高、选择性好、准确度高，该方法适合实际农业污水中结合态雌激素的检测。
本发明的技术构思如下：
本发明的方法采用固相萃取(SPE)前处理结合高效液相色谱串联质谱技术 (SPE-HPLC-MS/MS)，通过固相萃取前处理条件的优化、优选内标物、液相色谱 条件和质谱检测条件的优化，最终能够实现准确、稳定，干扰小、快速并高效地对 农业污水中7种结合态雌激素的同时富集和定量测定。该方法可一次性同时检测出7 种结合态雌激素的残留情况，具有高精密度、高灵敏度、高稳定性、高选择性和检 出限低等优点。该方法将指示回收率的内标物加在固相萃取前，能够很好地表示前 处理过程中目标物质的损失，使最终结果真实可靠。该方法可为农业污水中残留的 结合态雌激素，包括雌酮3-硫酸钠(E1-3S)、雌酮3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐(E1-3G)、 BETA-雌二醇3-硫酸钠盐(E2-3S)、17β-雌二醇3-(β-D-葡糖苷酸)钠盐(E2-3G)、 17β-雌二醇-17-β-D葡糖苷酸(E2-G)、17β-雌二醇17-硫酸钾盐(E2-S-K)和雌三醇 -3-O-β-D葡糖苷酸钠盐(E3-3G)7种结合态雌激素，提供有效准确的检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供了一种固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测农业污水中7种结合态雌激素的方法。该方法包括：(1)水样预处理，在目标物富集之前加入17β- 雌二醇D33-β-D-葡糖苷酸(E2-3G-D3)，17β-雌二醇硫酸钠-D4(E2-3S-D4)这两种 指示回收率的内标物；(2)使用固相萃取柱富集净化目标结合态雌激素；(3)采 用内标法，使用液质联用仪检测农业污水中7种结合态雌激素的含量。
本发明提供了一种固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测农业污水中7种结合态雌激素的方法，具体按如下步骤进行：
(1)水样的预处理
水样经滤膜过滤除去悬浮物后，分别加入17β-雌二醇D3 3-β-D-葡糖苷酸 (E2-3G-D3)，17β-雌二醇硫酸钠-D4(E2-3S-D4)这两种指示回收率的内标物；调 节水样pH；
(2)固相萃取富集目标结合态雌激素
依次用甲基叔丁基醚、甲醇、超纯水活化固相萃取柱；将步骤(1)中处理过的 水样过已活化的固相萃取柱；富集完成后用淋洗液淋洗固相萃取柱并真空干燥；再 用一定体积的洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液并在氮气流下吹干，所得残渣重新 溶解，定容；过滤后转移至进样瓶中，待测；
(3)高效液相色谱串联质谱法测定农业污水中7种结合态雌激素的含量
采用内标法，在高效液相色谱串联质谱仪上，定量检测经步骤(2)处理得到的 进样瓶内的待测样品中从农业污水中富集到的7种结合态雌激素的含量；所述的7种 结合态雌激素包括雌酮、17β-雌二醇和雌三醇的硫酸盐或葡糖苷酸盐结合态。7种结 合态雌激素分别为雌酮3-硫酸钠(E1-3S)、雌酮3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐(E1-3G)、 BETA-雌二醇3-硫酸钠盐(E2-3S)、17β-雌二醇3-(β-D-葡糖苷酸)钠盐(E2-3G)、 17β-雌二醇-17-β-D葡糖苷酸(E2-G)、17β-雌二醇17-硫酸钾盐(E2-S-K)和雌三醇 -3-O-β-D葡糖苷酸钠盐(E3-3G)。
进一步地，步骤(1)中，固相萃取前分别加入100ng的17β-雌二醇D3 3-β-D-葡 糖苷酸(E2-3G-D3)，17β-雌二醇硫酸钠-D4(E2-3S-D4)这两种内标物指示回收率。
进一步地，步骤(1)中，水样经玻璃纤维滤膜过滤除去颗粒状悬浮物后，先加 入指示回收率的内标物，再用稀盐酸调节pH值至3左右，pH值大致范围在3±0.1。
更进一步地，步骤(1)中，样品过滤采用孔径为0.7μm Whatman GF/F系列玻 璃纤维滤膜。其目的是过滤去除颗粒悬浮物质，防止影响后续对目标物的富集和检 测。
进一步地，上述步骤(2)中，浓缩富集样品所用的固相萃取柱是Waters公司OasisHLB小柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一 定比例聚合成的大孔共聚物，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂。
更进一步地，上述步骤(2)中，活化固相萃取柱所用的甲基叔丁基醚、甲醇和 水用量各为固相萃取柱体积的1倍，活化固相萃取柱的流速控制在1-4mL/min；水样 过柱流速(水样上样速度)控制在3-5mL/min；淋洗固相萃取柱所用的三种淋洗液各 为固相萃取柱体积的1-2倍；淋洗后抽干，时间为5-10min；洗脱固相萃取柱所用的 洗脱溶剂为甲醇，甲醇洗脱溶剂的量为固相萃取柱体积的2倍，洗脱液流速控制在 4-5mL/min。
更进一步地，上述步骤(2)中，淋洗固相萃取柱所用的三种淋洗液依次为体积 浓度在10％以下的甲醇-水溶液、pH＝3的超纯水溶液、体积浓度比为2:10:88的氨水- 甲醇-水溶液(即V氨水/V甲醇/V超纯水＝2/10/88)，目的是去除杂质，减少噪声干 扰。
更进一步地，上述步骤(2)中，洗脱固相萃取柱所用的甲醇采用HPLC级甲醇 洗脱，结束后真空将柱子里残留的甲醇收集。洗脱后，洗脱液在水浴加热40℃条件 下氮吹至近干。
更进一步地，上述步骤(2)中，采用体积浓度为70％的甲醇-水溶液定容，超声2min后，用针式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，待测。针式滤器选用孔径为0.22μm 的聚四氟乙烯针式滤头。
进一步地，上述步骤(3)中，选用美国AB公司的AB5500Q-trap高效液相色谱 串联质谱仪，配岛津30A液相色谱对7种目标结合态雌激素进行检测；液相色谱的色 谱柱选用Shim-pack XR-ODSⅡ型号柱，2.0×75mm。
进一步地，上述步骤(3)中，液相色谱分离参数为：色谱柱柱温40℃；进样 量4μL；进样室温度10℃；流动相流速0.3mL·min-1；流动相A是体积浓度为0.1％的氨 水-水溶液，其中的水为Milli-Q超纯水；流动相B为甲醇；梯度洗脱程序：0-2min， 10％B；2.0-2.2min，10％B-50％B；2.2-3.5min，50％B；3.5-3.8min，50％B-97％B； 3.8-5.5min，97％B；5.5-5.6min，97％B-10％B；10min，10％B。
进一步地，上述步骤(3)中，质谱检测条件为：采用电喷雾离子源负离子模式ESI-，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式MRM进行检测；离子源 温度为550℃，离子化电压为-4500V，气帘气CUR为35psi，喷雾气GS1为50psi，辅 助加热气GS2为50psi，碰撞气CAD为Medium，碰撞气为高纯氮气。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种采用固相萃取前处理结合高效液相色谱串联质谱技术 (SPE-HPLC-MS/MS)同时检测农业污水中残留的7种结合态雌激素的方法。该方法 通过筛选合适的固相萃取柱，并对固相萃取富集过程中活化方法、淋洗方法、洗脱 方法进行了优化，同时通过选用合适的内标物，最终能够实现灵敏度高、选择性好、 准确度高，该方法适合实际农业污水中残留结合态雌激素的测定。
本发明的方法具有以下优点：
(1)本发明的方法选择Waters公司的Oasis HLB固相萃取柱对7种结合态雌激 素进行富集净化，去除了干扰杂质，降低了基质效应，提高了选择性和富集倍数； 回收率高而稳定，选择性强，吸附容量大，达到了对目标结合态雌激素有效分离富 集的目的。
(2)本发明采用内标法定量，测定结合态雌激素的浓度更准确，线性关系好， 相对标准偏差小，提高了检测分析的精密度。
(3)本发明的方法将内标物质(指示回收率替代物)加在固相萃取过程前，能 够很好地表示前处理过程中目标物质的损失，同时，考虑不同取代基团的结合态雌 激素结构和性质存在很大的差别，前处理过程中会有不同程度的损失，所以，分别 选用17β-雌二醇D33-β-D-葡糖苷酸(E2-3G-D3)作为葡糖苷酸盐结合态雌激素(雌 酮3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐(E1-3G)、17β-雌二醇3-(β-D-葡糖苷酸)钠盐(E2-3G)、 17β-雌二醇-17-β-D葡糖苷酸(E2-G)和雌三醇-3-O-β-D葡糖苷酸钠盐(E3-3G))的 内标物，选用17β-雌二醇硫酸钠-D4(E2-3S-D4)作为硫酸盐结合态雌激素(雌酮3- 硫酸钠(E1-3S)、BETA-雌二醇3-硫酸钠盐(E2-3S)和17β-雌二醇17-硫酸钾盐 (E2-S-K))的内标物，由于内标物选用恰当，使得最终检测结果更加真实可靠。
(4)本发明的检测方法，一次上机进样可以同时检测出农业污水中多种结合态 雌激素(7种结合态雌激素)，检测过程耗时少(耗时10min)，检测的精确度和灵 敏度高，检出限低，可以检测出农业污水中痕量结合态雌激素的残留情况；同时， 本发明方法还具有较高回收率，相对标准偏差较小，这说明本申请的前处理方法及 检测方法可靠且重复效果好。
(5)本发明的检测方法操作简便，有机试剂使用量少，环境毒性低。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明 的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1：自来水加标回收率实验
采用内标法，检验按本发明的固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测农业污水中7种结合态雌激素的加标回收率。加标回收率实验以自来水为样品：分别向样 品中添加10μL、20μL的结合态雌激素混合标准溶液(该结合态雌激素混合标准溶液 为7种结合态雌激素的混合标准溶液，其中，7种结合态雌激素的浓度分别为10mg/L)
本发明的固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测农业污水中7种结合态雌激素的方法，具体按以下步骤实施：
(1)水样预处理
设立三种加标浓度(三组样品)。每组样品设三个平行，分别准确量取1L水样 于洁净烧杯中。其中两组样品，按上述添加量分别加入结合态雌激素混合标准液， 即分别向水样中添加10μL、20μL的浓度为10mg/L的结合态雌激素混合标准液，使添 加到水体中的结合态雌激素的最终浓度分别为100ng/L和200ng/L。第三组样品设为空 白组(空白组不添加任何结合态雌激素)。加标后样品充分混合均匀，经玻璃纤维 滤纸过滤除去颗粒状悬浮物。
固相萃取前，分别向样品中加入100ng的17β-雌二醇D3 3-β-D-葡糖苷酸 (E2-3G-D3)，17β-雌二醇硫酸钠-D4(E2-3S-D4)这两种指示回收率的内标物，与 水样充分混合均匀。即分别选用17β-雌二醇D3 3-β-D-葡糖苷酸(E2-3G-D3)作为葡 糖苷酸盐结合态雌激素(雌酮3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐(E1-3G)、17β-雌二醇3-(β-D- 葡糖苷酸)钠盐(E2-3G)、17β-雌二醇-17-β-D葡糖苷酸(E2-G)和雌三醇-3-O-β-D 葡糖苷酸钠盐(E3-3G))的内标物，选用17β-雌二醇硫酸钠-D4(E2-3S-D4)作为 硫酸盐结合态雌激素(雌酮3-硫酸钠(E1-3S)、BETA-雌二醇3-硫酸钠盐(E2-3S) 和17β-雌二醇17-硫酸钾盐(E2-S-K))的内标物。充分混合均匀后用稀盐酸调节pH 至3左右。
(2)固相萃取富集目标结合态雌激素
以下固相萃取过程利用全自动固相萃取仪完成，所用的固相萃取柱是Waters公司Oasis HLB小柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单 体按一定比例聚合成的大孔共聚物。固相萃取过程如下：
依次用5mL甲基叔丁基醚、甲醇、超纯水活化固相萃取小柱，流速为4mL/min。 预处理后的1000mL水样以5mL/min的速度过柱，上样结束后，依次用5mL体积浓度 为10％的甲醇-水溶液、pH＝3的超纯水溶液和体积浓度比为2:10:88的氨水-甲醇-水溶 液(即V氨水/V甲醇/V超纯水＝2/10/88)以4mL/min的速度淋洗萃取柱，真空干燥。 最后用10mL的甲醇(HPLC级甲醇)洗脱，流速控制在4mL/min，洗脱液收集至具塞 玻璃离心管中，洗脱液在水浴条件下(水浴加热40℃)，在氮气流作用下吹干，所 获残渣用体积浓度为70％的甲醇-水溶液定容至1mL，超声2min，经0.22μm PTFE针 式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，待测。
结合态雌激素属于类固醇类物质，属于微极性或非极性物质。本发明中通过实 验对比了依次用甲醇、超纯水活化固相萃取柱，以及依次用甲基叔丁基醚、甲醇、 超纯水活化固相萃取柱这两种情况，发现后者对结合态雌激素类物质具有相对较高 的回收率及重复率。本发明中还通过实验对比了分别用体积浓度为30％、10％、5％ 的甲醇-水溶液淋洗固相萃取柱这三种情况，发现用体积浓度为10％的甲醇-水溶液淋 洗固相萃取柱，相对回收率较高且能去除部分杂质，再依次用pH＝3的超纯水溶液和 体积浓度比为2:10:88的氨水-甲醇-水溶液(即V氨水/V甲醇/V超纯水＝2/10/88)分别 淋洗溶于酸性溶液和碱性溶液中的杂质，可更好地去除样品中的无机盐、大分子物 质及色素等杂质。
(3)高效液相色谱串联质谱法测定样品中7种结合态雌激素的含量
采用内标法，在高效液相色谱串联质谱仪上，定量检测棕色进样瓶内的从自来 水中富集到的7种结合态雌激素的浓度。
选用美国AB公司的AB5500Q-trap高效液相色谱串联质谱仪，配岛津30A液相色 谱对7种目标结合态雌激素进行检测；液相色谱的色谱柱选用Shim-pack XR-ODSⅡ 型号柱，2.0×75mm。
液相色谱分离参数为：色谱柱柱温40℃；进样量4μL；进样室温度10℃；流动 相流速0.3mL·min-1；流动相A是体积浓度为0.1％的氨水-水溶液，其中的水为Milli-Q 超纯水；流动相B为甲醇；梯度洗脱程序：0-2min，10％B；2.0-2.2min，10％B-50％ B；2.2-3.5min，50％B；3.5-3.8min，50％B-97％B；3.8-5.5min，97％B；5.5-5.6min， 97％B-10％B；10min，10％B。
质谱检测条件为：采用电喷雾离子源负离子模式ESI-，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式MRM进行检测；离子源温度为550℃，离子化电压为 -4500V，气帘气CUR为35psi，喷雾气GS1为50psi，辅助加热气GS2为50psi，碰撞气 CAD为Medium，碰撞气为高纯氮气。
考虑不同取代基团的结合态雌激素结构和性质存在很大的差别，前处理过程中会有不同程度的损失，所以，分别选用17β-雌二醇D3 3-β-D-葡糖苷酸(E2-3G-D3) 作为葡糖苷酸盐结合态雌激素(雌酮3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐(E1-3G)、17β-雌 二醇3-(β-D-葡糖苷酸)钠盐(E2-3G)、17β-雌二醇-17-β-D葡糖苷酸(E2-G)和雌三 醇-3-O-β-D葡糖苷酸钠盐(E3-3G))的内标物，选用17β-雌二醇硫酸钠-D4(E2-3S-D4) 作为硫酸盐结合态雌激素(雌酮3-硫酸钠(E1-3S)、BETA-雌二醇3-硫酸钠盐(E2-3S) 和17β-雌二醇17-硫酸钾盐(E2-S-K))的内标物，由于内标物选用恰当，使得最终 检测结果更加真实可靠。考虑内标物质本身性质比较稳定，在负电喷雾电离源(ESI-) 模式下响应良好且无明显基质干扰。
回收率计算：
采用步骤(1)至步骤(2)的前处理方法进行前处理，采用步骤(3)的方法进 行定量检测，对自来水水样进行加标回收率计算，计算结果见表1。
加标回收率(RE％)的计算公式为：
其中，RE：加标回收率，％；
C0：混合标准液的浓度，ng/L；
C1：未加入混合标准液的水样的检测浓度，ng/L；
C2：加入混合标准溶液的水样的检测浓度，ng/L；
V0：混合标准液的体积，L；
V1：未加入混合标准液的水样上机前定容体积，L；
V2：加入混合标准溶液的水样上机前定容体积，L。
由此可见，按本发明的方法测得的自来水中7种结合态雌激素的加标回收率在80％-110％，加标回收率存在差异，说明存在基质干扰；通过添加内标物计算加标回 收率，并用其对检验结果进行校正，可以在一定程度上降低基质干扰带来的影响。
表1.自来水样中的结合态雌激素实测浓度及不同加标浓度的加标回收率
实施例2：农业污水加标回收率实验
采用内标法，检验按本发明的固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测农业污水中7种结合态雌激素的加标回收率。加标回收率实验以牛尿为样品：分别向样品 中添加10μL、20μL的结合态雌激素混合标准溶液(该结合态雌激素混合标准溶液为 7种结合态雌激素的混合标准溶液，其中，7种结合态雌激素的浓度分别为10mg/L)
本发明的固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测农业污水中7种结合态雌激素的方法，具体按以下步骤实施：
(1)水样预处理
设立三种加标浓度(三组样品)。每组样品设三个平行，分别准确量取100mL 牛尿于洁净烧杯中。其中两组样品，按上述添加量分别加入结合态雌激素混合标准 液，即分别向牛尿中添加10μL、20μL的浓度为10mg/L的结合态雌激素混合标准液， 使添加到牛尿中的结合态雌激素的浓度分别为1000ng/L和2000ng/L。第三组样品设为 空白组(空白组不添加任何结合态雌激素)。加标后样品充分混合均匀，经玻璃纤 维滤纸过滤除去颗粒状悬浮物，用蒸馏水稀释至1000mL。
固相萃取前，分别向样品中加入100ng的17β-雌二醇D3 3-β-D-葡糖苷酸 (E2-3G-D3)，17β-雌二醇硫酸钠-D4(E2-3S-D4)这两种指示回收率的内标物，与 水样充分混合均匀。即分别选用17β-雌二醇D3 3-β-D-葡糖苷酸(E2-3G-D3)作为葡 糖苷酸盐结合态雌激素(雌酮3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐(E1-3G)、17β-雌二醇3-(β-D- 葡糖苷酸)钠盐(E2-3G)、17β-雌二醇-17-β-D葡糖苷酸(E2-G)和雌三醇-3-O-β-D 葡糖苷酸钠盐(E3-3G))的内标物，选用17β-雌二醇硫酸钠-D4(E2-3S-D4)作为 硫酸盐结合态雌激素(雌酮3-硫酸钠(E1-3S)、BETA-雌二醇3-硫酸钠盐(E2-3S) 和17β-雌二醇17-硫酸钾盐(E2-S-K))的内标物。充分混合均匀后用稀盐酸调节pH 至3左右。
(2)固相萃取富集目标结合态雌激素
以下固相萃取过程利用全自动固相萃取仪完成，所用的固相萃取柱是Waters公司Oasis HLB小柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单 体按一定比例聚合成的大孔共聚物。固相萃取过程如下：
依次用5mL甲基叔丁基醚、甲醇、超纯水活化固相萃取小柱，流速为4mL/min。 预处理后的1000mL水样以5mL/min的速度过柱，上样结束后，依次用5mL体积浓度 为10％的甲醇-水溶液、pH＝3的超纯水溶液和体积浓度比为2:10:88的氨水-甲醇-水溶 液(即V氨水/V甲醇/V超纯水＝2/10/88)以4mL/min的速度淋洗萃取柱，真空干燥。 最后用10mL的甲醇(HPLC级甲醇)洗脱，流速控制在4mL/min，洗脱液收集至具塞 玻璃离心管中，洗脱液在水浴条件下(水浴加热40℃)，在氮气流作用下吹干，所 获残渣用体积浓度为70％的甲醇-水溶液定容至1mL，超声2min，经0.22μm PTFE针 式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，待测。
(3)高效液相色谱串联质谱法测定样品中7种结合态雌激素的含量
采用内标法，在高效液相色谱串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的从稀释过的 牛尿中富集到的7种结合态雌激素的浓度。
选用美国AB公司的AB5500Q-trap高效液相色谱串联质谱仪，配岛津30A液相色 谱对7种目标结合态雌激素进行检测；液相色谱的色谱柱选用Shim-pack XR-ODSⅡ 型号柱，2.0×75mm。
液相色谱分离参数为：色谱柱柱温40℃；进样量4μL；进样室温度10℃；流动 相流速0.3mL·min-1；流动相A是体积浓度为0.1％的氨水-水溶液，其中的水为Milli-Q 超纯水；流动相B为甲醇；梯度洗脱程序：0-2min，10％B；2.0-2.2min，10％B-50％ B；2.2-3.5min，50％B；3.5-3.8min，50％B-97％B；3.8-5.5min，97％B；5.5-5.6min， 97％B-10％B；10min，10％B。
质谱检测条件为：采用电喷雾离子源负离子模式ESI-，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式MRM进行检测；离子源温度为550℃，离子化电压为 -4500V，气帘气CUR为35psi，喷雾气GS1为50psi，辅助加热气GS2为50psi，碰撞气CAD为Medium，碰撞气为高纯氮气。
考虑不同取代基团的结合态雌激素结构和性质存在很大的差别，前处理过程中会有不同程度的损失，所以，分别选用17β-雌二醇D3 3-β-D-葡糖苷酸(E2-3G-D3) 作为葡糖苷酸盐结合态雌激素(雌酮3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐(E1-3G)、17β-雌 二醇3-(β-D-葡糖苷酸)钠盐(E2-3G)、17β-雌二醇-17-β-D葡糖苷酸(E2-G)和雌三 醇-3-O-β-D葡糖苷酸钠盐(E3-3G))的内标物，选用17β-雌二醇硫酸钠-D4(E2-3S-D4) 作为硫酸盐结合态雌激素(雌酮3-硫酸钠(E1-3S)、BETA-雌二醇3-硫酸钠盐(E2-3S) 和17β-雌二醇17-硫酸钾盐(E2-S-K))的内标物，由于内标物选用恰当，使得最终 检测结果更加真实可靠。考虑内标物质本身性质比较稳定，在负电喷雾电离源(ESI-) 模式下响应良好且无明显基质干扰。
回收率计算：
采用步骤(1)至步骤(2)的前处理方法进行前处理，采用步骤(3)的方法进 行定量检测，对农业污水水样进行加标回收率计算，计算结果见表2。
加标回收率(RE％)的计算公式为：
其中，RE：加标回收率，％；
C0：混合标准液的浓度，ng/L；
C1：未加入混合标准液的尿液的检测浓度，ng/L；
C2：加入混合标准溶液的尿液的检测浓度，ng/L；
V0：混合标准液的体积，L；
V1：未加入混合标准液的尿液上机前定容体积，L；
V2：加入混合标准溶液的尿液上机前定容体积，L。
由此可见，按本发明的方法测得的农业污水中7种结合态雌激素的加标回收率在60％-120％，加标回收率存在差异，说明存在基质干扰；通过添加内标物计算加标回 收率，并用其对检验结果进行校正，可以在一定程度上降低基质干扰带来的影响。
表2.牛尿中的结合态雌激素实测浓度及不同加标浓度的加标回收率
实施例3：实际农业污水中结合态雌激素含量测定
7种结合态雌激素在奶牛场沼液和尿液中的浓度的测定
采集上海市某奶牛场的农业污水样品，先采用本发明步骤(1)的方法进行样品 预处理，再采用本发明步骤(2)的固相萃取方法进行富集净化前处理，之后采用本 发明步骤(3)的高效液相色谱串联质谱仪对样品的实际浓度进行检测分析，以此考 察本发明的方法对不同农业污水样品的适用性。
具体检测过程如下：
(1)水样预处理
每个样品设三个平行，经玻璃纤维滤膜过滤除去颗粒状悬浮物后，分别准确量 取100mL水样于洁净烧杯中，用蒸馏水稀释至1000mL，然后用稀盐酸调节pH至3左 右。
固相萃取前，分别向样品中加入100ng的17β-雌二醇D3 3-β-D-葡糖苷酸 (E2-3G-D3)，17β-雌二醇硫酸钠-D4(E2-3S-D4)这两种指示回收率的内标物，与 水样充分混合均匀。即：分别选用17β-雌二醇D3 3-β-D-葡糖苷酸(E2-3G-D3)作为 葡糖苷酸盐结合态雌激素(雌酮3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐(E1-3G)、17β-雌二醇 3-(β-D-葡糖苷酸)钠盐(E2-3G)、17β-雌二醇-17-β-D葡糖苷酸(E2-G)和雌三醇 -3-O-β-D葡糖苷酸钠盐(E3-3G))的内标物，选用17β-雌二醇硫酸钠-D4(E2-3S-D4) 作为硫酸盐结合态雌激素(雌酮3-硫酸钠(E1-3S)、BETA-雌二醇3-硫酸钠盐(E2-3S) 和17β-雌二醇17-硫酸钾盐(E2-S-K))的内标物。
(2)固相萃取富集目标结合态雌激素
依次用5mL甲基叔丁基醚、甲醇、超纯水活化固相萃取小柱，流速为4mL/min。 预处理后的1000mL水样以5mL/min的速度过柱，上样结束后，依次用5mL体积浓度 为10％的甲醇-水溶液、pH＝3的超纯水溶液和体积浓度比为2:10:88的氨水-甲醇-水溶 液(即V氨水/V甲醇/V超纯水＝2/10/88)以4mL/min的速度淋洗萃取柱，真空干燥。 最后用10mL的甲醇(HPLC级甲醇)洗脱，流速控制在4mL/min，洗脱液收集至具塞 玻璃离心管中，洗脱液在水浴条件下(水浴加热40℃)，在氮气流作用下吹干，所 获残渣用体积浓度为70％的甲醇-水溶液定容至1mL，超声2min，经0.22μm PTFE针 式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，待测。
其中，浓缩富集样品采用的固相萃取柱是Waters公司Oasis HLB小柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔 共聚物，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂。
(3)高效液相色谱串联质谱法测定农业污水中7种结合态雌激素的含量
采用内标法，在高效液相色谱串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的从农业污水 中富集到的7种结合态雌激素的浓度。所述的7种结合态雌激素包括雌酮、17β-雌二 醇和雌三醇的硫酸盐或葡糖苷酸盐结合态。包括雌酮3-硫酸钠(E1-3S)、雌酮 3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐(E1-3G)、BETA-雌二醇3-硫酸钠盐(E2-3S)、17β- 雌二醇3-(β-D-葡糖苷酸)钠盐(E2-3G)、17β-雌二醇-17-β-D葡糖苷酸(E2-G)、17β- 雌二醇17-硫酸钾盐(E2-S-K)和雌三醇-3-O-β-D葡糖苷酸钠盐(E3-3G)。
选用美国AB公司的AB5500Q-trap高效液相色谱串联质谱仪，配岛津30A液相色 谱对7种目标结合态雌激素进行检测；液相色谱的色谱柱选用Shim-pack XR-ODSⅡ 型号柱，2.0×75mm。
液相色谱分离参数为：色谱柱柱温40℃；进样量4μL；进样室温度10℃；流动 相流速0.3mL·min-1；流动相A是体积浓度为0.1％的氨水-水溶液，其中的水为Milli-Q 超纯水；流动相B为甲醇；梯度洗脱程序：0-2min，10％B；2.0-2.2min，10％B-50％ B；2.2-3.5min，50％B；3.5-3.8min，50％B-97％B；3.8-5.5min，97％B；5.5-5.6min， 97％B-10％B；10min，10％B。
质谱检测条件为：采用电喷雾离子源负离子模式ESI-，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式MRM进行检测；离子源温度为550℃，离子化电压为 -4500V，气帘气CUR为35psi，喷雾气GS1为50psi，辅助加热气GS2为50psi，碰撞气 CAD为Medium，碰撞气为高纯氮气。
实际检测所得某奶牛场沼液和尿液中7种结合态雌激素含量如表3所示。实验结果表明，本发明的方法可以应用到奶牛场沼液和尿液中结合态雌激素含量的测定， 具有灵敏度高、稳定性高且重现性好的优点。
表3某奶牛场沼液和尿液中7种结合态雌激素的检测含量

Claims (10)

1.一种固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测农业污水中7种结合态雌激素的方法，其特征在于，按以下步骤进行：
(1)水样的预处理
水样经滤膜过滤除去悬浮物后，分别加入17β-雌二醇D3 3-β-D-葡糖苷酸、17β-雌二醇硫酸钠-D4这两种指示回收率的内标物；调节水样pH；
(2)固相萃取富集目标结合态雌激素
依次用甲基叔丁基醚、甲醇、超纯水活化固相萃取柱；将步骤(1)中处理过的水样过已活化的固相萃取柱；富集完成后用淋洗液淋洗固相萃取柱并真空干燥；再用一定体积的洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液并在氮气流下吹干，所得残渣重新溶解，定容；过滤后转移至进样瓶中，待测；
(3)高效液相色谱串联质谱法测定农业污水中7种结合态雌激素的含量
采用内标法，在高效液相色谱串联质谱仪上，定量检测经步骤(2)处理得到的进样瓶内的待测样品中从农业污水中富集到的7种结合态雌激素的含量；所述的7种结合态雌激素包括雌酮、17β-雌二醇和雌三醇的硫酸盐或葡糖苷酸盐结合态；7种结合态雌激素分别为雌酮3-硫酸钠、雌酮3-(BETA-D-葡糖苷酸)钠盐、BETA-雌二醇3-硫酸钠盐、17β-雌二醇3-(β-D-葡糖苷酸)钠盐、17β-雌二醇-17-β-D葡糖苷酸、17β-雌二醇17-硫酸钾盐、雌三醇-3-O-β-D葡糖苷酸钠盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，分别加入100ng的17β-雌二醇D33-β-D-葡糖苷酸、17β-雌二醇硫酸钠-D4这两种内标物指示回收率。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，水样经玻璃纤维滤膜过滤除去颗粒状悬浮物后，先加入指示回收率的内标物，再用稀盐酸调节pH值至3±0.1。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，水样过滤所用的玻璃纤维滤膜为孔径0.7μm Whatman GF/F系列玻璃纤维滤膜。
5.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所用的固相萃取柱是Waters公司Oasis HLB小柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂。
6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，活化固相萃取柱所用的甲基叔丁基醚、甲醇和水用量各为固相萃取柱体积的1倍，活化固相萃取柱的流速控制在1-4mL/min；水样过柱流速控制在3-5mL/min；淋洗固相萃取柱所用的三种淋洗液各为固相萃取柱体积的1-2倍；淋洗后抽干，时间为5-10min；洗脱固相萃取柱所用的洗脱溶剂为甲醇，甲醇洗脱溶剂的量为固相萃取柱体积的2倍，洗脱液流速控制在4-5mL/min。
7.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，淋洗所用的三种溶液依次为体积浓度在10％以下的甲醇-水溶液、pH＝3的超纯水溶液、体积浓度比为2:10:88的氨水-甲醇-水超纯水溶液；洗脱所用的甲醇为HPLC级甲醇；定容残渣所用的甲醇是体积浓度为70％的甲醇-水溶液；洗脱液在水浴加热40℃条件下氮吹至近干；用甲醇定容后，超声2min，再用针式滤器过滤；针式滤器选用孔径小于0.22μm的聚四氟乙烯针式滤头。
8.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，选用美国AB公司的AB5500Q-trap高效液相色谱串联质谱仪，配岛津30A液相色谱对7种目标结合态雌激素进行检测；液相色谱的色谱柱选用Shim-pack XR-ODSⅡ型号柱，2.0×75mm。
9.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，液相色谱分离参数为：色谱柱柱温40℃；进样量4μL；进样室温度10℃；流动相流速0.3mL/min；流动相A是体积浓度为0.1％的氨水-水溶液，其中的水为Milli-Q超纯水；流动相B为甲醇；梯度洗脱程序：0-2min，10％B；2.0-2.2min，10％B-50％B；2.2-3.5min，50％B；3.5-3.8min，50％B-97％B；3.8-5.5min，97％B；5.5-5.6min，97％B-10％B；10min，10％B。
10.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，质谱检测条件为：采用电喷雾离子源负离子模式ESI-，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式MRM进行检测；离子源温度为550℃，离子化电压为-4500V，气帘气CUR为35psi，喷雾气GS1为50psi，辅助加热气GS2为50psi，碰撞气CAD为Medium，碰撞气为高纯氮气。
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