CN101692073B - 一种测定畜牧粪便中抗生素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于环境中痕量污染物分析领域，具体地说是一种测定畜牧粪便中抗生素的方法。该方法以EDTA-McIlvaine缓冲液和甲酸酸化的乙腈为提取液，用微波辅助萃取仪萃取，固相萃取小柱纯化浓缩，最后用液相色谱串联二级质谱(LC-MS/MS)分析测定，从而准确快捷地分析粪便中的抗生素。具体的分析测定方法为：取一定量冷冻干燥后的粪便，放到聚四氟乙烯萃取罐中，加入EDTA-McIlvaine缓冲液和甲酸酸化的乙腈，利用调试后的微波辅助萃取仪进行萃取，然后经过优化后固相萃取小柱浓缩纯化，氮气吹干，定容，最后用调试后的HPLC-MS/MS准确测定。本发明开发的测定方法简单，快捷，并具有高回收率、低检出限、高灵敏性、抗基质干扰等特点。
Description
【技术领域】
本发明属于环境中痕量污染物分析领域，具体地说是一种准确快捷测定畜牧粪便中抗生素的方法。
【背景技术】
在畜牧行业中，抗生素长期以来用于动物疾病的治疗预防，监管不力和盲目滥用的情况十分严重。抗生素以原形或其降解产物通过粪便和尿液的形式排放到环境当中，研究表明粪便中土霉素浓度高达29mg/kg，金霉素26mg/kg，磺胺二甲嘧啶浓度高达100mg/L，可能对环境产生难以估量的影响。
提取粪便中的抗生素可以利用无机溶剂或者有机溶剂，其中无机溶剂EDTA-McIlvaine缓冲液被广泛应用于环境样品中抗生素的测定。对于不同粪便的种类，物化性质相差很大，例如猪粪便蛋白质、纤维素、脂肪等有机成分相对于鸡粪便要高，单独的使用无机溶剂或者有机溶剂势必不能同事很好的提取两种粪便中的抗生素，应该针对不同的粪便选择合适的提取溶剂。
测定粪便中的抗生素有超声波溶剂萃取、加压液相萃取和加速流体萃取。超声波溶剂萃取是目前应用于粪便中抗生素测定的最广泛的一种手段，该方法在固/液萃取系统中，将有机溶剂加入到固体样品中，在超声条件下萃取。这个技术基于气泡的崩解导致的空穴效应，在水液中产生了高于50MPa的短期空气脉冲，温度高达5000K。随着粪便样品结构的破坏，附着分析物分子被释放从而增强了萃取效率。通常要样品需要剧烈振荡并超声波处理15-30min，重复萃取几次，回收率在60-80％左右。加压液相萃取常用来代替传统的索氏萃取。样品置于不锈钢提取容器中，在高压(大于20MPa)和高温(大于200℃)下进行，以提高溶解度和物质传输。由于压力高，溶剂表现为液态，导致扩散系数显著增加。有机溶剂、液态的酸性以及中性的溶剂都可以用于该法萃取。改方法的其它优点是溶剂使用量少，萃取时间短，而且全自动化操作，缺点是操作技术要求比较高，购买仪器比较昂贵。
加速流体萃取技术是用溶剂对固体或半固体样品中欲分析组分进行萃取的技术，具有萃取速度快，萃取效率高，可萃取的样品量范围宽，所用溶剂量较少以及易于自动化等优点。然而，因为加速流体萃取是在高温高压下进行的，所以要特别注意分析组分是否会分解，特别是对一些热不稳定化合物，更要注意分解问题，不适合处理热稳定的抗生素。微波辅助溶剂萃取技术利用微波对萃取体系各组分选择性加热，可使欲分析组分直接从基体中浸出，此时被萃取物是自由流向溶剂的，受溶剂亲和力影响小，固可选择的溶剂种类比较多.由于微波萃取可将萃取液瞬间加热到常压沸点以上，提高了萃取液的温度，又不致使被分析组分分解，缩短了萃取时间，提高了萃取效率。但是还没有发现利用该技术处理粪便中抗生素。
抗生素在环境中为痕量存在，因此抗生素的检测方法成为相关研究的制约因素。最早抗生素的检测采用的是生物学方法，该方法耗时长，灵敏度低，后来逐渐为高效液相色谱法所取代，成为抗生素类药物检测的标准方法。液相色谱-紫外联用和液相色谱-荧光联用等被广泛应用于环境中抗生素的检测，但是由于环境样品成分复杂，紫外和荧光监测器的灵敏度和选择性往往不能满足实际样品的测定。随着技术的发展，液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)用由于其高灵敏度和定性能力，近年来广泛应用于环境中抗生素的分析。毛细管电泳和放射性免疫也用于环境样品中抗生素测定，但该方法是半定量方法，还需要采用液相色谱串联质谱做进一步确证。
综上所述，选择合适的提取溶剂，选用恰当的提取仪器和分析仪器，并优化其条件才能建立一种准确快捷的测定畜牧粪便中抗生素的方法，以满足社会的需求。
【发明内容】
本发明的目的旨在为解决现有技术的问题，而提供一种准确快捷测定畜牧粪便中抗生素的方法，该测定方法简单，快捷，并具有高回收率、低检出限、高灵敏性、抗基质干扰，为进一步研究粪便中抗生素奠定基础。
本发明为解决上述问题所采用的方案是设计一种准确快捷测定畜牧粪便中抗生素的方法。它的特征在于所述方法以EDTA-McIlvaine缓冲液或甲酸酸化的乙腈为提取液，微波辅助萃取仪为提取装置，用固相萃取小柱进行浓缩净化，然后再用氮气吹捕浓缩仪浓缩，最后用液相色谱串联质谱仪测定。
本发明的有益效果是：
1.使用的溶剂比较少。该方法采用的微波辅助萃取重复两次，使用的溶剂量为30ml，，而常用的超声萃取重复两次，使用的溶剂量为60ml，且前者的提取效率要高于后者。
2.消耗的时间比较短。该方法采用的微波辅助萃取消耗的时间约是常用的超声萃取时间的1/2。
3.回收率比较高。应用该方法通过选择不同的溶剂和不同的萃取方法，测定的粪便中几种典型抗生素，回收率均高于70％，优越于常规的单一溶剂萃取和超声萃取。图1和图2给出了微波辅助萃取与超声萃取抗生素回收率的比较数据，证明了这一效果；图3和图4则通过两种提取液分别对鸡粪便和猪粪便进行提取，从回收率的数据比较得出：EDTA-McIlvaine缓冲液适宜鸡粪便的提取，甲酸酸化的乙腈更适宜猪粪便的提取。
4.准确性比较高。该方法选用液相色谱串联质朴，灵敏度比较高，选择性比较好，降低了基质干扰，从而提高了分析的准确性。
5.处理方法简单。该方法对设备要求不高，反应条件温和，操作步骤简单。
【附图说明】
图1为微波萃取与超声萃取鸡粪便中抗生素回收率比较；
图2为微波萃取与超声萃取猪粪便中抗生素回收率比较；
图3为不同提取溶液测定鸡粪便中抗生素回收率比较；
图4为不同提取溶液测定猪粪便中抗生素回收率比较。
以下结合本发明的实施例进行详细叙述。
【具体实施方式】
本发明以EDTA-McIlvaine缓冲液或甲酸酸化的乙腈为提取液，微波辅助萃取仪为提取装置，用固相萃取小柱进行浓缩净化，然后再用氮气吹捕浓缩仪浓缩，最后用液相色谱串联质谱准确快速测定。
本发明测定畜牧粪便中抗生素的方法中，检测鸡粪便包括以下步骤：
提取过程：称取0.5g冷冻干燥后的鸡粪便样品到聚四氟乙烯萃取罐中，加入0.1MEDTA-McIlvaine缓冲液15ml，用微波辅助萃取仪提取15min，将萃取后得到的悬浊液转移到离心管中，然后重新加入缓冲液再萃取一次，两次提取的悬浊液转移到同一离心管中冷冻离心30min；
浓缩纯化过程：离心后的鸡粪便的上清液通过固相萃取小柱，用甲醇脱洗小柱，然后用氮气吹去甲醇溶剂，定容到1ml；定容后的样品，再通过聚四氟乙烯过滤膜，进一步纯化样品；
测定过程：纯化后的样品直接进入液相色谱串联质谱仪测定。
本发明测定畜牧粪便中抗生素的方法中，检测猪粪便包括以下步骤：
提取过程：称取0.5g质量冷冻干燥后的猪粪便样品到聚四氟乙烯萃取罐中，加入甲酸酸化的乙腈，Ph＝4提取液15ml，用微波辅助萃取仪提取15min，将萃取后得到的悬浊液转移到离心管中，然后重新加入缓冲液再萃取一次，两次提取的悬浊液转移到同一离心管中冷冻离心30min；
浓缩纯化过程：离心后的猪粪便上清液经氮气吹到约5ml的时候，加入200ml蒸馏水稀释，通过固相萃取小柱，用甲醇洗脱小柱，然后用氮气在30℃条件下吹去甲醇溶剂，定容到1ml；定容后的样品，再通过聚四氟乙烯过滤膜，进一步纯化样品；
测定过程：纯化后的样品直接进入液相色谱串联质谱仪测定。
检测中，所述微波辅助萃取仪提取温度40℃，功率200w，压力2apm。
所述浓缩纯化过程中的固相萃取小柱是：先用15ml超纯水活化，然后通过10ml甲醇，最后用15ml超纯水洗掉小柱上残留的甲醇，样品以2ml/min的速度通过固相萃取小柱，然后用12ml甲醇脱洗。
所述氮气吹干温度设定为30℃。
所述浓缩纯化过程中的聚四氟乙烯过滤膜是0.45μm聚四氟乙烯过滤膜。
所述测定过程中，液相色谱串联质谱仪测定流动相使用0.25％甲酸和乙腈的混合液。纯化后的样品直接进入液相色谱串联质谱仪测定。液相色谱质谱条件见表1和表2。
表1LC-MS/MS和微波辅助萃取操作条件
表2选择性离子分析条件设置
实施例1
选择天津市两个集约化养殖小区A和B的鸡粪便作为分析对象，分析方法及效果如下：
提取过程：称取0.5g质量冷冻干燥后的鸡粪便样品到聚四氟乙烯萃取罐中，加入0.1M EDTA-McIlvaine缓冲液15ml，40℃条件下微波辅助萃取15min，将萃取后得到的悬浊液转移到离心管中，然后重新加入缓冲液再萃取一次，两次提取的悬浊液转移到同一离心管中冷冻离心30min；
浓缩纯化过程：15ml蒸馏水，10ml甲醇和15ml蒸馏水依次通过固相萃取小柱。离心后的鸡粪便的上清液通过预处理后的固相萃取小柱，然后用10ml甲醇脱洗固相萃取小柱，最后用温柔的氮气在30℃条件下吹去甲醇溶剂，甲醇定容到1m。定容后的样品，再通过聚四氟乙烯过滤膜过滤。
测定过程：以0.25％甲酸和乙腈作为流动相，纯化后的样品直接进入液相色谱串联质谱仪测定。
表3不同养殖小区鸡粪便中抗生素残留
实施例2
选择天津市两个集约化养殖小区C和D的猪粪便作为分析对象，分析方法及效果如下：
提取过程：称取0.5g质量冷冻干燥后的猪粪便样品到聚四氟乙烯萃取罐中，加入甲酸酸化的乙腈(pH＝4)15ml，40℃条件下微波辅助萃取15min，将萃取后得到的悬浊液转移到离心管中，然后重新加入缓冲液再萃取一次，两次提取的悬浊液转移到同一离心管中冷冻离心30min；
浓缩纯化过程：15ml蒸馏水，10ml甲醇和15ml蒸馏水依次通过固相萃取小柱。离心后的猪粪便上清液经氮气吹到约5ml的时候，加入200ml蒸馏水稀释，然后通过固相萃取小柱，最后用甲醇洗脱，用温柔氮气在30℃条件下吹去甲醇溶剂，定容到1ml。定容后的样品，再通过聚四氟乙烯过滤膜。
测定过程：以0.25％甲酸和乙腈作为流动相，纯化后的样品直接进入液相色谱串联质谱仪测定。
表4不同养殖小区猪粪便中抗生素残留
不同提取溶液测定鸡(猪)粪便中抗生素回收率比较”一种提取液用来提取猪粪便样品比较好，另外一种提取液提取鸡粪便样品比较好。柱状图中回收率比较高表明了提取效果比较好。
Claims (7)
1.一种测定畜牧粪便中抗生素的方法，用于检测鸡粪便，其特征在于所述方法包括以下步骤：
提取过程：称取0.5g冷冻干燥后的鸡粪便样品到聚四氟乙烯萃取罐中，加入0.1MEDTA-McIlvaine缓冲液15ml，用微波辅助萃取仪提取15min，将萃取后得到的悬浊液转移到离心管中，然后重新加入缓冲液再萃取一次，两次提取的悬浊液转移到同一离心管中冷冻离心30min；
浓缩纯化过程：离心后的鸡粪便的上清液通过固相萃取小柱，用甲醇脱洗小柱，然后用氮气吹去甲醇溶剂，定容到1ml；定容后的样品，再通过聚四氟乙烯过滤膜，进一步纯化样品；
测定过程：纯化后的样品直接进入液相色谱串联质谱仪测定。
2.一种测定畜牧粪便中抗生素的方法，用于检测猪粪便，其特征在于所述方法包括以下步骤：
提取过程：称取0.5g质量冷冻干燥后的猪粪便样品到聚四氟乙烯萃取罐中，加入甲酸酸化的乙腈，Ph＝4提取液15ml，用微波辅助萃取仪提取15min，将萃取后得到的悬浊液转移到离心管中，然后重新加入缓冲液再萃取一次，两次提取的悬浊液转移到同一离心管中冷冻离心30min；
浓缩纯化过程：离心后的猪粪便上清液经氮气吹到约5ml的时候，加入200ml蒸馏水稀释，通过固相萃取小柱，用甲醇洗脱小柱，然后用氮气吹去甲醇溶剂，再用甲醇定容到1ml；定容后的样品，再通过聚四氟乙烯过滤膜，进一步纯化样品；
测定过程：纯化后的样品直接进入液相色谱串联质谱仪测定。
3.根据权利要求1或2所述的测定畜牧粪便中抗生素的方法，其特征在于所述微波辅助萃取仪提取温度40℃，功率200w，压力2.0apm。
4.根据权利要求1或2所述的测定畜牧粪便中抗生素的方法，其特征在于所述浓缩纯化过程中的固相萃取小柱是：先用15ml超纯水活化，然后通过10ml甲醇，最后用15ml超纯水洗掉小柱上残留的甲醇，样品以2ml/min的速度通过固相萃取小柱，然后用12ml甲醇脱洗。
5.根据权利要求1或2所述的测定畜牧粪便中抗生素的方法，其特征在于所述氮气吹去甲醇溶剂时温度设定为30℃。
6.根据权利要求1或2所述的测定畜牧粪便中抗生素的方法，其特征在于所述浓缩纯化过程中的聚四氟乙烯过滤膜是0.45μm聚四氟乙烯过滤膜。
7.根据权利要求1或2所述的测定畜牧粪便中抗生素的方法，其特征在于所述液相色谱串联质谱仪测定流动相使用0.25％甲酸和乙腈的混合液。
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