CN102866220B - 一种基于化学衍生的飞蝗血淋巴代谢物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于化学衍生的飞蝗血淋巴代谢物的检测方法，涉及动物生态学与分析化学领域。具体为：取血淋巴，加入乙醇-乙腈混合溶剂脱蛋白，超声提取，高速离心得代谢物提取液；提取液减压干燥后，加入盐酸甲氧胺-吡啶溶液，超声溶解，涡旋混匀，恒温水浴中肟化衍生；再加入N-甲基-N-三甲基硅烷-三氟乙酰胺试剂，涡旋混匀，恒温水浴中硅烷化衍生；最后加入油酸甲酯-正庚烷溶液补充体积，再次涡旋混匀后，备气相色谱-质谱联用技术分析。本发明的检测方法便捷高效，反应条件温和，重复性好，代谢物覆盖面广泛，适用于开展多中心、大样本的分析研究，能为认识各种飞蝗型变的生物规律与蝗灾的发生机制提供帮助。

Description

一种基于化学衍生的飞蝗血淋巴代谢物的检测方法

技术领域

本发明涉及动物生态学与分析化学领域，是一种基于两步化学衍生的飞蝗血淋巴代谢物的检测方法。

背景技术

昆虫纲直翅目蝗总科动物飞蝗(Locusta migratoria)是一种广泛分布于东半球的重大农业害虫，已知全球有9个亚种，其中我国有东亚飞蝗、亚洲飞蝗和西藏飞蝗三个亚种，是引发我国蝗灾爆发的罪魁祸首。飞蝗存在着多型性现象(polymorphism)，在自然界中具有不同的生态型，即：群居型和散居型。两型之间可以相互转化，这称之为飞蝗的型变现象。蝗灾爆发的主要特征就是散居型飞蝗型变为群居型，以及群居型飞蝗集群的大规模异地迁飞。研究证实，飞蝗的型变是由生态环境因素与内分泌系统相互作用、共同调节的结果，从而使得两型飞蝗在形态、生理、体色与行为等方面都存在着显著的差异。体液中的代谢物是机体基因型、内分泌与外部环境共同作用的产物，是机体生物功能与状态的直接反应，两型飞蝗之间的生物差异必然在血淋巴代谢物上有所体现。因此，建立一种便捷高效的飞蝗血淋巴代谢物的检测方法，将有助于深入探讨飞蝗型变的生物规律和中国蝗灾的爆发机制，进而有可能为新型生态友好型生物、化学农药的开发提供新的作用靶点。

经过文献检索得知，目前已知的一种分析蝗虫血淋巴中内源性代谢物的技术由E.M.Lenz等人发明(《Insect biochemistry and molecularbiology》杂志2001年第32期51-56页)，该发明使用500兆赫兹(MHz)核磁共振技术对沙漠蝗4龄期若虫血淋巴中的代谢物进行了检测。除此之外，尚未见其他对飞蝗血淋巴内小分子代谢物进行代谢指纹分析的报道。Lenz等人所发明的技术，能检测到包括氨基酸、碳水化合物和有机酸等多种类型的代谢物，但该发明也存在显而易见的缺陷：1)该发明的技术核心是500MHz核磁共振仪，造价与运行成本高昂，远非一般常规实验室所能拥有，满足不了大多数生物实验室的研究需要；2)由于蝗虫血淋巴中的代谢物组成复杂，化学结构多样，导致该发明采集到的代谢指纹中存在着严重的谱峰重叠现象，这不单对代谢物结构解析提出了严峻的挑战，而且也干扰了峰面积的积分结果，进而影响代谢物相对含量测定的准确度；3)更为关键的是，该技术获取的代谢信息有限，只从沙漠蝗血淋巴中解析出了20余种代谢物，生物信息覆盖面狭窄，远远满足不了从系统生物学层面上理解飞蝗生理代谢功能的需要。

而气相色谱质谱联用技术作为一种常规而强大的分析手段，相对于核磁共振技术具有以下应用优势：1)气相色谱质谱联用技术的造价与运行费用低廉，广泛易得，其在哺乳动物生物体液代谢物分析中的应用价值业已被广泛证实。2)气相色谱质谱联用技术集分离与检测于一身，对复杂体系具有强大的分离和结构解析能力，能大大降低生物谱中的代谢物重叠现象，从而获得更为准确的相对含量测定结果和更为可信的结构鉴定结果。3)相对于核磁共振技术而言，气相色谱质谱联用技术的灵敏度更高，这将有助于检测到更多痕量存在的代谢物，提高代谢信息的覆盖度，从而有助于更为全面地了解飞蝗的代谢状态。通过进一步的文献检索，迄今为止，尚未见基于化学衍生和气相色谱质谱联用技术开展飞蝗血淋巴代谢指纹检测的相关报道。

发明内容

本发明针对现有蝗虫血淋巴代谢物检测技术的不足，提出了一种基于化学衍生的飞蝗血淋巴代谢物的检测方法，以期快速地获取飞蝗血淋巴内小分子代谢物的组成种类与相对含量信息，进而为认识飞蝗型变的生物规律与中国蝗灾的发生机制提供依据。本方法便捷高效，反应条件温和，重复性高，代谢物覆盖范围广，适应多中心、大样本和多批次分析研究的需要。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种基于化学衍生的飞蝗血淋巴代谢物的检测方法：

(1)取50μL血淋巴，室温解冻后，使用含有100ng/μL香草酸内标的乙醇-乙腈混合溶剂(9/1，v/v)进行代谢物提取，涡旋1min，超声2min，4℃下15000g离心15min，吸取120μL上清液并减压干燥5h；实验设计理念与多元统计分析表明该溶剂体系对于血淋巴代谢物具有最佳的提取效率，所反映的生物学信息最为完整全面，且重现性良好。

(2)取50μL盐酸甲氧胺-吡啶溶液(20mg/mL)加入到前述所得的提取物中，超声1min溶解，涡旋混匀，40℃恒温水浴中肟化衍生90min；再加入50μLN-甲基-N-三甲基硅烷-三氟乙酰胺试剂，涡旋混匀，40℃恒温水浴中硅烷化衍生60min。先肟化再硅烷化的两步化学衍生方法能抑制代谢谱中的多重峰现象，减少代谢谱的复杂程度，从而有助于代谢物结构鉴定，并保证代谢物定量测定的准确度。

(3)最后加入20μL含有800ng/μL油酸甲酯的正庚烷溶液补充体积，涡旋混匀后备气相色谱-质谱联用技术分析。油酸甲酯作为外标能用于监控大样本分析时的质谱灵敏度变化，为开展多中心实验时评价分析性能的稳定性提供数据。

气相色谱的分离条件为：DB-5MS色谱柱(0.25μm，0.25mm×25m)，载气为氦气，恒定流量模式操作，流速1.2mL/min，采用程序升温程序：起始70℃维持3min，5℃/min升至170℃，4℃/min升至270℃，10℃/min升至300℃并维持5min，进样体积1μL，分流比30，该色谱分离条件能使血淋巴中复杂的代谢物间获得良好的分离。

质谱检测条件为：电子轰击电离源(EI)，电离电压70eV，离子源温度250℃，溶剂切割时间6.5min，电子倍增管检测器电压为1.0KV，质荷比扫描范围为33-500m/z，质谱扫描速率0.4s/谱图(即质谱扫描速率为每0.4s一张谱图)。

本发明方法的反应条件温和，能减少对热不稳定代谢物的潜在破坏。且方法便捷高效，重复性好，仪器要求低，适合于开展多中心、大样本分析的需要，能广泛用于各种蝗虫的代谢组学研究工作。

附图说明

图1本发明中确定血淋巴代谢物提取溶剂体系的决策结果；

图2本发明实施例1群居型东亚飞蝗血淋巴代谢物的检测结果(总离子流图)。

图3本发明实施例2敲除肉碱-乙酰转移酶carnitine-acetyltransferase的群居型东亚飞蝗血淋巴代谢物的检测结果(总离子流图)。

表1本发明实施例1中血淋巴代谢物的结构鉴定结果及其通路列表。

表2本发明的方法学验证结果。

具体实施方式

实施例1

取4龄期群居型东亚飞蝗，使用微量注射器穿刺前胸背板与腹部衔接处的表皮抽吸体液，4℃下13000g离心10min得血淋巴，分析前-80℃贮藏。室温解冻后，取50μL血淋巴置1.5mL Eppendorf管中，加入150μL乙醇-乙腈混合溶剂(9/1，v/v)沉淀蛋白，剧烈涡旋振荡1min，超声提取2min，4℃下15000g离心15min，吸取120μL上清提取液至另一1.5mL Eppendorf管中，冻干机中减压干燥5h。提取物中加入50μL盐酸甲氧胺-吡啶溶液(20mg/mL)，超声1min溶解，涡旋混匀，40℃恒温水浴中肟化反应90min；随后，加入50μLN-甲基-N-三甲基硅烷-三氟乙酰胺试剂，涡旋混匀，40℃恒温水浴中硅烷化衍生60min；反应完成后，加入20μL含有800ng/μL油酸甲酯的正庚烷溶液补充体积，涡旋混匀后转移至玻璃衬管中，进行气相色谱质谱联用分析。

色谱分离使用DB-5MS柱(0.25μm，0.25mm×25m)，载气为氦气，采用恒定流量模式操作，流速1.2mL/min，进样体积1μL，分流比30，程序升温程序为：起始柱温70℃，维持3min，5℃/min升温至170℃，4℃/min升温至270℃，10℃/min升温至300℃并维持5min。使用单四极杆质谱进行代谢物检测，采用电子轰击电离源，电离电压70eV，离子源温度250℃，溶剂切割时间6.5min，电子倍增管检测器电压为1.0KV，质荷比扫描范围为33-500m/z，质谱扫描速率0.4s/谱图。

采用实验设计理念(design of experiment)对乙腈、乙醇、甲醇与丙酮等四种与水互溶有机溶剂对血淋巴代谢物的提取效能进行了系统考察，以确定最佳代谢物提取体系。不同溶剂配比与提取效率进行PLS分析，结果如图1A所示，处于第二象限中乙醇具有较高的提取效率，而处于第三象限以乙腈为主的实验则效率较低。柱图显示乙醇的提取效率显著高于丙酮、乙腈以及四者的等量混合物(图1B)，且乙醇的提取重现性要优于甲醇。为进一步探索溶剂配比与代谢物间的关联性，实验又对溶剂配比(X矩阵)与所有XCMS提取到的代谢特征响应值(Y矩阵)进行了PLS回归分析，结果如图1C，乙醇与绝大多数代谢物间呈现出强烈的正相关关联，丙酮与大多数代谢特征间的关联性较弱，而乙腈则与大多数代谢特征间表现出较强的负相关性。由此可知，乙醇对绝大多数代谢物都具有较高的提取效率。采用等高线图来预测最佳提取溶剂配比，结果如图1D所示，等高线图三角形左下角处的溶剂配比提取效率高，最终实验确定使用乙醇/乙腈混合溶剂(体积比9/1)进行血淋巴代谢物提取，一方面该溶剂体系对代谢物的综合提取效率高，另一方面实验中也发现添加少量乙腈能增加脱蛋白效果，使沉淀更为密实，从而有助于提取液的吸取。

依据上述方法，群居型东亚飞蝗血淋巴代谢物的检测结果，如图1所示。解卷积处理从中检识出了165个代谢物，经NIST标准谱图比对，鉴定了其中87个代谢物的化学结构(结果见表1)，包括27个氨基酸及其衍生物，4个三羧酸循环中间代谢物，20种有机酸，5个甾体衍生物，2个多胺，12个糖、糖醇及其衍生物，4个嘌呤类衍生物以及13个其他类代谢物。这些物质涉及东亚飞蝗体内能量代谢，糖、氨基酸和脂质代谢，核苷酸代谢和神经递质类物质代谢等多条通路，具有可观的代谢信息覆盖度。相对于Lenz等人使用的NMR方法，本发明的技术大大拓展了对蝗虫血淋巴中代谢物的覆盖范围，检测到的代谢物由20余个扩展至近百个。而且不同于NMR技术，本发明的技术显著改善了复杂代谢谱中的峰重叠现象，从而使得代谢物的定量信息更为准确。

实施例1中，对本发明一种基于化学衍生的飞蝗血淋巴代谢物检测方法进行了方法学验证：一天内连续进样分析5次考察日内精密度，连续三天进样分析考察日间精密度，室温条件下同一样品分别在6、12、18、30和36h进样分析考察样品稳定性；平行操作制备5份样品考察方法重现性，结果如表2所示，绝大多数代谢物相对含量测定结果的日内、日间精密度与重现性都符合分析要求，且当贮藏于-20℃冰箱中时，绝大多数代谢物在衍生反应完成后36小时内稳定性良好。本发明重现性与稳定性俱佳，便捷易行，代谢物覆盖范围广泛，适应于开展多中心、大样本研究的需要。

表1

表2

实施例2

取敲除肉碱-乙酰转移酶的群居型东亚飞蝗，使用微量注射器穿刺前胸背板与腹部衔接处的表皮抽吸体液，4℃下13000g离心10min，得血淋巴，运输途中使用干冰降温。室温解冻后，取50μL血淋巴置于1.5mLEppendorf管中，加入150μL乙醇-乙腈混合溶剂(9/1，v/v)沉淀蛋白，剧烈涡旋振荡1min，超声2min提取代谢物，4℃下15000g离心15min，吸取120μL上清提取液至另一1.5mL Eppendorf管中，冻干机中减压干燥5h。提取物残渣中加入50μL盐酸甲氧胺-吡啶溶液(20mg/mL)，超声1min溶解，涡旋混匀，40℃恒温水浴中肟化反应90min；随后，加入50μLN-甲基-N-三甲基硅烷-三氟乙酰胺试剂，涡旋混匀，40℃恒温水浴中硅烷化衍生60min；反应完成后，加入20μL含有800ng/μL油酸甲酯的正庚烷溶液补充体积，涡旋混匀后转移至玻璃衬管中，进行气相色谱质谱联用技术分析。气质联用技术分析条件同实施例1中描述，检测结果如图2所示。从中检识出140个代谢物，并鉴定了其中的71代谢物的化学结构，包括25个氨基酸及其衍生物，20个有机酸类物质，2个神经递质，11个糖、糖醇及其衍生物，以及13个包括甾类、多胺和嘌呤代谢物等在内的其他物质。

本发明的一种基于化学衍生的飞蝗血淋巴代谢物检测方法，不单能用于实施例1中正常蝗虫的代谢物检测，而且也适用于本实施例中遗传干扰与生物技术操控后的蝗虫血淋巴检测。通过本发明的方法，在实施例2中我们发现敲除肉碱-乙酰转移酶后飞蝗体内的能量代谢发生了重大转变，包括葡萄糖、肌醇等物质在内的多种碳水化合物在血淋巴中的浓度水平显著下降，油酸、亚麻酸等长链脂肪酸也在基因干扰后浓度降低。本发明的一种基于化学衍生的飞蝗血淋巴代谢物的检测方法，适用于研究蝗虫型变的代谢物质调控途径、蝗虫在面对各种化学与生物农药胁迫时的代谢应答等昆虫生态学问题，将对于认识蝗灾的爆发机制、发现新的农药作用位点、评价与改进现有灭蝗农药的作用效价，乃至开发新型生态友好的生物农药具有重要指导意义。

Claims (7)

1.一种基于化学衍生的飞蝗血淋巴代谢物的检测方法，其特征在于，包括如下流程步骤：

（1）取血淋巴50-100 μL，加入3-4倍体积的乙醇-乙腈混合溶剂，其中溶解75-150 ng/μL的香草酸作为定量内标，提取代谢物，涡旋振荡，超声提取，离心分离上清液并减压干燥；

（2）每1 μL血淋巴提取液冻干物中加入0.8-1.2 μL盐酸甲氧胺-吡啶溶液，超声溶解，涡旋混匀，35-50℃恒温水浴中肟化衍生60-180 min；再加入与0.8-12倍吡啶用量体积的N-甲基-N-三甲基硅烷-三氟乙酰胺试剂，涡旋混匀，35-50℃恒温水浴中硅烷化衍生45-90 min；

（3）加入相当于步骤（1）中血淋巴用量体积40-60%的油酸甲酯-正庚烷溶液，混匀后进行气相色谱-质谱联用技术分析，室温条件下样品分析需在衍生后24 h内完成；

步骤（3）中采用的色谱分离条件为：DB-5MS色谱柱，规格为0.25 μm, 0.25 mm×25 m，载气为氦气，恒定流量模式操作，流速1.2 mL/min，采用程序升温程序，进样体积为1 μL，分流比30；

步骤（3）中采用的质谱检测条件为：电子轰击电离源（EI），电离电压70 eV，离子源温度250℃，溶剂切割时间6.5 min，电子倍增管检测器电压为1.0 KV，质荷比扫描范围为33-500 m/z，质谱扫描速率0.4s/谱图。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中提取溶剂的用量为血淋巴体积的3倍，溶剂组成为乙醇/乙腈体积比为10/1~4/1。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）涡旋时间1-3 min，超声时间2-4 min，吸取上清液120-240 μL。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中加入吡啶溶剂的比例为每1 μL血淋巴提取液使用1.0-1.2 μL体积吡啶，其中溶解15-20 mg/mL盐酸甲氧胺肟化衍生试剂。

5.根据权利要求1或4所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中超声溶解1-3 min，40℃水浴中肟化反应60-180 min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中加入与吡啶溶液等体积的N-甲基-N-三甲基硅烷-三氟乙酰胺，内含体积分数1%的三甲基氯硅烷。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（3）中加入相当于步骤（1）中血淋巴用量体积40-60%的正庚烷溶液，内含800 ng/μL油酸甲酯，用以监控大样本分析时的质谱信号稳定性。