CN112666287B - 基于gcmsms高通量分析动物肠道菌群代谢物的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于GCMSMS高通量分析动物肠道菌群代谢物的方法，包括：代谢物筛选及分类；标准品配制及衍生化；标准品SRM方法开发优化；样本制备以及衍生化；样本数据(含SRM数据以及FullScan数据)采集；数据鉴定以及分析；数据验证及整合。本发明还提供了所述方法在用于动物类样本的全谱检测以及肠道菌群代谢物定性、相对定量、绝对定量等检测分析及验证中的应用。本发明解决现有技术中存在的诸多问题，具有广泛良好应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物分析领域，具体涉及一种基于GCMSMS高通量分析动物肠道菌群代谢物的方法及应用。
背景技术
肠道菌群代谢物是生物体内共生存在的结构复杂、数量庞大的微生物群之间的总体代谢物的总称，常见有：氨基酸、脂肪酸、有机酸、酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚、胆汁酸等多类物质。越来越多的研究证据表明，肠道菌群失调与肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝、炎症性肠炎、消化道肿瘤等多种疾病的发生密切相关，因此对于肠道菌群代谢物的研究对于了解与宿主疾病发生的关联以及疾病的预防和治疗具有重要的意义。目前，常用于肠道菌群代谢物特别是亲水性代谢物的检测技术有：液相色谱质谱联用(反相体系)；液相色谱质谱联用(Hilic体系)；气相色谱质谱联用(衍生化)等。
液相色谱质谱联用(反相体系)技术是目前生物领域对于代谢组研究使用最为广泛的一门技术，它具有检测动态范围广、灵敏度高、线性范围宽等特点。但由于技术本身硬件以及各方面的影响，它也有着数据库无标准、各仪器公司的质谱仪产生的数据无法通用的限制，尤其是该技术对于强极性的代谢物的保留效果不佳，易发生极性代谢物在较早的时间内共流出、峰型以及分离度的效果差的现象。
液相色谱质谱联用技术(Hilic体系)是基于液相色谱质谱联用(反相体系)技术的一种技术补充，其目的也是为了让极性代谢物在柱子中更好的保留而达到较佳的分离效果，但该技术一直存在的问题在于：色谱柱本身填料的不稳定性以及和代谢物性质的兼容性不是很好，易出现化合物峰型不佳、重现性较差的情况。气相色谱质谱联用(衍生化)技术是目前用于代谢组学分析技术的一个重要组成部分，通常用来分析一些挥发性强、极性大的小分子代谢物。对于一些像氨基酸、糖醇类、有机酸、生物胺及有机磷酸盐等分子量较小、极性较大的代谢物则需要通过衍生化(硅烷化或者酯化等)的方式降低其沸点、增加其热稳定性来进行后续检测分析。虽然衍生化能有效解决极性化合物峰型不佳以及保留较差的问题，但是由于质谱本身单四级杆的灵敏度达不到很多代谢物的检出限，导致最终的数据结果可能会出现缺失以及部分代谢物无法检测到的情况。
所以，总体来说，由于肠道菌群代谢物的复杂性，代谢物之间的理化性质差异较大，以及各质谱平台技术之间的优劣差异，目前对于该类代谢物的检测一直存在各种各样的问题以及一些局限性。
发明内容
为克服现有技术存在的问题，本发明提出了一种基于GCMSMS高通量分析动物肠道菌群代谢物的方法及应用，具体涉及110种动物肠道菌群相关代谢产物的GCMSMS定性及绝对定量分析方法，以及Full Scan全扫描数据结合SRM方法进行代谢物验证的应用。
本发明通过SRM方法联合Full Scan全扫描技术采集，对氨基酸、苯甲酸及其衍生物、碳水化合物、吡啶类、吲哚类、嘧啶类、有机酸、脂肪酸、苯丙素类等9大类共计110种肠道菌群相关代谢物质进行高通量绝对定量分析。并将SRM模式下的采集到的数据与LUG数据库(LUG数据库参照授权专利：CN111402961B)中查找到的数据进行比对验证，为结果的准确性提供双重保障，极大地解决了目前针对肠道菌群相关代谢产物异构体多、基质复杂等分析难题。
其中，Untarget database ofGC-MS from Lumingbio(LUG数据库)中包含2543个能够采用GC-MS检测的内源性代谢物并且还在不断更新中，覆盖了包括脂类、氨基酸、脂肪酸、胺类、醇类、糖类、氨基糖类、糖醇类、糖酸类、有机磷酸盐类、羟基酸类、芳香类、嘌呤类和甾醇类等多种类型的内源性小分子代谢物。
本发明提供的基于GCMS高通量分析动物肠道菌群代谢物的方法，所述方法为：通过SRM方法联合Full Scan全扫描技术采集，对氨基酸、苯甲酸及其衍生物、碳水化合物、吡啶类、吲哚类、嘧啶类、有机酸、脂肪酸、苯丙素类的肠道菌群相关代谢物质进行高通量定性、定量、绝对定量分析以及验证。
所述方法具体包括如下步骤：
(1)代谢物筛选及分类
通过查阅文献及大量相关资料，确定肠道菌群代谢相关化合物，并对其按照类别进行划分。
(2)标准品配制及衍生化
标准品衍生化方案参照授权专利：CN 105866299 B中进行。
标准品配制及衍生化方法包括以下步骤：
①将标准品用甲醇溶解，得到标准储备液；
②用纯水梯度稀释标准储备液得到工作液1、工作液2、工作液3；
③分别移取工作液1、工作液2、工作液3进行挥干处理；
④挥干后加入衍生化试剂1，涡旋震荡后，于培养箱中进行肟化反应；
⑤将样本取出后再加入衍生化试剂2和正己烷，涡旋震荡后，于烘箱中进行反应；
步骤①中，所述甲醇可以用水替代。
步骤①中，所述标准储备液的浓度为1mg/ml。
步骤②中，所述工作液1指标准品水溶液(浓度为40000ng/ml)。
步骤②中，所述工作液2指标准品水溶液(浓度为4000ng/ml)。
步骤②中，所述工作液3指标准品水溶液(浓度为1000ng/ml)。
步骤③中，所述工作液1、工作液2、工作液3的体积分别为100μL。
步骤④中，所述衍生化试剂1的体积为80μL。
步骤④中，所述衍生化试剂1指溶剂为吡啶的15mg/mL甲氧胺盐酸盐溶液。
步骤④中，所述涡旋震荡的时长为1-3min；优选地，为2min。
步骤④中，所述培养箱的温度为37℃。
步骤④中，所述肟化反应的时长为80-100min；优选地，90min。
步骤⑤中，所述衍生化试剂2的体积为80μL。
步骤⑤中，所述衍生化试剂2指含1％TMCS的BSTFA。
步骤⑤中，所述正己烷的体积为20μL。
步骤⑤中，所述涡旋震荡的时长为1-3min；优选地，为2min。
步骤⑤中，所述烘箱的温度为70℃。
步骤⑤中，所述反应的时长为60min。
(3)标准品SRM方法开发优化
优化条件：
质谱仪：TSQ9000(赛默飞世尔科技，美国)；
气相色谱仪：Trace1310(配AI 1310自动进样器，赛默飞世尔科技，美国)；
色谱柱：毛细管色谱柱DB-5MS(30m×0.25μm×0.25μm)；
离子源：EI源；
进样口温度：300℃-330℃；优选地，为330℃；
离子源温度：300℃-350℃；优选地，为330℃；
传输线温度：250℃-300℃；优选地，为280℃；
进样量：1μL；
进样模式：不分流；
流速：1.0-1.5mL/min；优选地，为1.2mL/min；
洗针液：正己烷；
离子对查找及参数优化：
第一步：选择母离子：
根据第一步确定好的方法以及对应的化合物的保留时间，包括从数据库中提取到的母离子，确定所有标准品在仪器中的保留时间以及母离子；
第二步：选择子离子：
根据第一步选择好的母离子，进行离子碰撞，得到特征子离子，每一个母离子对应至少一个子离子，得到所有代谢物的母子离子对；
第三步：优化CE(碰撞能)
根据第一、第二步得到的母、子离子对，优化该特征离子对的最优碰撞能CE，最终得到完整的AUTO SRM方法信息表，包含化合物，保留时间，母离子，子离子，碰撞能等关键信息。整合采集到的标准品SRM信息，创建SRM方法后，通过标准曲线进行测试，保留线性以及峰型较好的物质。
步骤(3)中，每个化合物均保留两对离子对，一对用于定性分析，一对用于定量分析。
(4)样本制备以及衍生化
(4-1)样本前处理
将准备好的人血清(2*6＝12个)，人组织(2*5＝10个样本)，人粪便(2*6＝12个样本)共计34个样本进行样本前处理，各类样本前处理流程如下所示：
血清样本前处理包括以下步骤：
步骤①：取200μL人血清样本，加入第一提取溶剂后涡旋、超声提取后静置；
步骤②：将步骤①提取后的混合液离心取上清，将离心的上清液挥干。
步骤①中，所述第一提取溶剂为体积比为(2-3)：(1-2)的甲醇、乙腈混合液；优选地，为2：1。
其中，所述乙腈和甲醇的混合液中还包括0.1％的甲酸。
步骤①中，所述第一提取溶剂的体积为400-1000μL；优选地，为600μL。
步骤①中，所述涡旋的时间为1-3min；优选地，为2min。
步骤①中，所述超声提取的时间为5-15min；优选地，为10min。
步骤①中，所述超声提取的温度为4-15℃；优选地，为4℃。
步骤①中，所述静置的温度为-20℃。
步骤①中，所述静置的时长为30-50min；优选地，为45min。
步骤②中，所述离心的温度为4-15℃；优选地，为4-10℃；进一步优选地，为4℃。
步骤②中，所述离心的转速为11000-15000rpm；优选地，为11000-14000rpm；进一步优选地，为12000rpm。
步骤②中，所述离心的时间为5-20min；优选地，为5-15min；进一步优选地，为10min。
步骤②中，所述移取上清液的体积为100μL。
步骤②中，所述“挥干”是指通过真空冷冻浓缩机对样本进行溶剂挥发；其目的为对样本进行浓缩。
组织/粪便样本前处理包括以下步骤：
步骤①：称取组织/粪便样本放入冰箱预冷；
步骤②：样本中加入预冷的第一提取溶剂与两颗小钢珠后研磨、超声提取；
步骤③：将步骤②提取后的混合液离心取上清，然后向剩余的残渣中加入第一提取液与两颗小钢珠研磨，超声提取，提取混合液静置于冰箱；
步骤④：将步骤③提取后的混合液离心取上清；
步骤⑤：将步骤③与步骤④得到的上清液混合、涡旋后取上清液挥干。
步骤①中，所述样本的质量为20-50mg；优选地，为30mg。
步骤①中，所述冰箱温度为-20℃。
步骤①中，所述预冷时长为10-30min；优选地，为30min。
步骤②中，所述第一提取溶剂为体积比为(3-5)：(1-2)的甲醇、水的化合液；优选地，为4：1。
其中，所述水和甲醇的混合液中还包括0.1％的甲酸。
步骤②中，所述第一提取剂的体积为300-500μL；优选地，为400μL。
步骤②中，所述预冷提取剂的温度为-10℃。
步骤②中，所述研磨的时间为1-5min；优选地，为1-3min；进一步优选地，为2min。
步骤②中，所述研磨的频率为40-90Hz；优选地，为60Hz。
步骤②中，所述超声提取的时间为10-30min；优选地，为20min。
步骤③中，所述离心的温度为4-15℃；优选地，为4-10℃；进一步优选地，为4℃。
步骤③中，所述离心的转速为11000-15000rpm；优选地，为11000-14000rpm；进一步优选地，为12000rpm。
步骤③中，所述离心的时间为5-20min；优选地，为5-15min；进一步优选地，为10min。
步骤③中，所述上清液移取体积为200-400μL；优选地，为300μL。
步骤③中，所述第一提取剂的体积为100-300μL；优选地，为200μL。
步骤③中，所述冰箱的温度为-20℃。
步骤③中，所述静置的时长为20-50min；优选地，为30min。
步骤④中，所述上清液移取体积为100-200μL；优选地，为100μL。
步骤⑤中，所述涡旋的时间为0.5-3min；优选地，为1-3min；进一步优选地，为1min。
步骤⑤中，所述移取上清液的体积为100μL。
步骤⑤中，所述“挥干”是指通过真空冷冻浓缩机对样本进行溶剂挥发；其目的为对样本进行浓缩。
(4-2)样本衍生化
样本衍生化方案参照授权专利：CN 105866299 B中进行。
血清、组织、粪便样本衍生化包括以下步骤：
①挥干后的样本加入衍生化试剂1，涡旋震荡后，于培养箱中进行肟化反应；
②将样本取出后再加入衍生化试剂2和正己烷，涡旋震荡后，于烘箱中进行反应；
步骤①中，所述衍生化试剂1指溶剂为吡啶的15mg/mL甲氧胺盐酸盐溶液。
步骤①中，所述衍生化试剂1的体积为80μL。
步骤①中，所述涡旋震荡的时长为1-3min；优选地，为2min。
步骤①中，所述培养箱的温度为37℃。
步骤①中，所述肟化反应的时长为80-100min；优选地，90min。
步骤②中，所述衍生化试剂2指含1％TMCS的BSTFA。
步骤②中，所述衍生化试剂2的体积为80μL。
步骤②中，所述正己烷的体积为20μL。
步骤②中，所述涡旋震荡的时长为1-3min；优选地，为2min。
步骤②中，所述烘箱的温度为70℃。
步骤②中，所述反应的时长为50-100min；优选地，为60min。
(5)样本数据采集
将衍生化后的样本上机，采用SRM方法联合Full Scan全扫描技术采集，采用样本中的Full Scan全扫描数据进行全谱分析，每6个样本间插入QC样本进行质控，插入blank空白样进行残留评估。
(6)数据鉴定以及分析
利用TraceFinder 4.1 General Quan软件(赛默飞世尔科技，美国)，采用步骤(3)优化后的参数对各SRM transition进行自动识别和积分，并辅助人工检查。同时对FullScan全扫描模式下得到的数据进行LUG搜库鉴定。
(7)数据验证及整合。
将积分定量得到的代谢物与搜库鉴定得到的代谢物比对，整合重叠代谢物，进行生信分析。
在一具体实施方案中，本发明所述基于GCMSMS高通量分析动物肠道菌群相关代谢产物的方法包括以下步骤：
(1)代谢物筛选及分类
根据技术方法的目标需求，通过对大量肠道菌群代谢相关文献的整理，以及针对菌群代谢相关代谢通路中的代谢物进行整理汇总，将其中常见菌群相关的代谢物进行信息整理汇总和内容注释，然后在标准品库中筛选可进行硅烷化衍生的肠道菌群代谢物，共计筛选出110种化合物标准品。
(2)标准品配制及衍生化
2-1：用分析天平精密称取适量的标准品，用甲醇溶解，得到标准储备液，储备液浓度均为1mg/mL；
2-2：将标准品按照类别分为9组，每组配制成一管混标，混标浓度为40000ng/ml(工作液1)，梯度稀释混标至浓度为4000ng/ml(工作液2)、1000ng/ml(工作液3)，其中工作液1用于寻找母离子，工作液2用于寻找子离子，工作液3用于优化质谱参数；
2-3：用纯水作为溶剂梯度稀释工作液1，得到标准曲线，浓度分别为：10000ng/mL；5000ng/mL；2000ng/mL；1000ng/mL；500ng/mL；200ng/mL；100ng/mL；50ng/mL；20ng/mL；10ng/mL；5ng/mL；
2-4：移取100μL配制好的标准品工作液1、工作液2、工作液3以及标准曲线进行挥干处理；
2-5：向挥干后的小瓶中加入80μL的甲氧胺盐酸盐溶液(15mg/mL，吡啶配置(容易吸潮，现配现用，尽量不要隔夜放置))，涡旋震荡2min后，于震荡培养箱中37℃中90min进行肟化反应；
2-6：将样本取出后再加入80μL的BSTFA(含1％TMCS)衍生试剂和20μL的正己烷，涡旋震荡2min后，于70℃反应60min；
本发明中涉及到的样本以及标准品实验前处理均采用硅烷化的衍生化方式，具体为两步衍生化：
①肟化反应，该步骤主要是通过酮基和醛基与甲氧胺盐酸盐(吡啶)，此过程可以保护酮基和醛基，特别是对于糖类物质可以有效避免一些复杂反应的产生，因此对于含酮基和醛基的物质会先与甲氧胺盐盐酸反应生成基团“-C(R)＝N-O-”；
②硅烷化反应，此反应主要是物质中的活性氢(如含羟基-OH、羧基-COOH、氨基-NH2、巯基-SH及磷酸基团-H2PO4等物质)被硅烷基取代的过程，本研究所用的衍生化试剂为BSTFA(含1％TMCS)，因此衍生化过程中的活性氢被三甲基硅烷(trimethylsilyl,TMS)取代，主要反应如下所示：
肟化反应：
R1-C＝O-R2+CH3-O-NH2·HCl→R1-C(R2)＝N-O-CH3
常见活性氢硅烷化反应：
R-C(＝O)-OH→R-C(＝O)-O-Si(CH3)3
R-OH→R-O-Si(CH3)3
R-SH→R-S-Si(CH3)3
R-NH2→R-N-[Si(CH3)3]2
R1-NH-R2→R1-N[Si(CH3)3]-R2
(3)标准品SRM方法开发优化
3-1:具体仪器设备以及分析条件如下所示：
(1)质谱仪：TSQ9000(赛默飞世尔科技，美国)；
(2)气相色谱仪：Trace1310(配AI 1310自动进样器，赛默飞世尔科技，美国)；
(3)色谱柱：毛细管色谱柱DB-5MS(30m×0.25μm×0.25μm)；
(4)进样口温度：330℃；
(5)离子源温度：330℃；
(6)传输线温度：280℃；
(7)进样量：1μL；
(8)升温程序如表1所示；
(9)进样模式：不分流；
(10)流速：1.2mL/min；
(11)洗针液：正己烷；
3-2:离子对查找及参数优化
第一步：选择母离子：
根据第一步确定好的方法以及对应的化合物的保留时间，包括从数据库中提取到的母离子，确定所有标准品在仪器中的保留时间以及母离子；
第二步：选择子离子：
根据第一步选择好的母离子，进行离子碰撞，得到特征子离子，每一个母离子对应至少一个子离子，得到所有代谢物的母子离子对；
第三步：优化CE(碰撞能)
根据第一、第二步得到的母子离子对，优化该特征离子对的最优碰撞能CE，最终得到完整的AUTO SRM方法信息表(表3)，包含化合物，保留时间，母离子，子离子，碰撞能等关键信息。整合采集到的标准品SRM信息，创建SRM方法后，通过标准曲线进行测试，保留线性以及峰型较好的物质。110种肠道菌群相关代谢物标准品(纯度≥98％)，均购自上海源叶生物。
(4)样本制备以及衍生化
样本前处理：
将准备好的血清(2*6＝12个)，组织(2*5＝10个样本)，粪便(2*6＝12个样本)共计34个样本进行样本前处理，各类样本前处理流程如下所示：
血清样本前处理SOP：
1.取200μL样品，加入600μL甲醇：乙腈(2:1，含0.1％甲酸)
2.涡旋1min，超声10min，-20℃静置
3.离心10min(4℃，12000rpm)，取100μL和稀释10倍后100μL上清于宽衬管中进行衍生化
组织/粪便样本前处理SOP：
1.取组织/粪便样本30-50mg，精确称重并记录后装入1.5mL EP管中(EP管在-20℃冰箱预冷)；
2.加入400μL甲醇-水(4:1，v/v，0.1％甲酸)；
3.加入两颗小钢珠，在-20℃冰箱放置2min后，放入研磨机中研磨(60HZ，2min)；
4.冰浴超声10min，-20℃静置30min；
5.离心10min(4℃，12000rpm)，取300μL上清；
6.取完上清的残渣中继续加入200μL甲醇-水(4:1，v/v，0.1％甲酸)；
7.涡旋30s，冰浴超声5min，离心10min(4℃，12000rpm)，取100μL上清；
8.合并上清共计400μL，涡旋后取100μL和稀释10倍后100μL上清于宽衬管中进行衍生化。
样本衍生化：同标准品衍生化反应。
(5)样本数据采集(SRM+Full Scan)
将衍生化后的样本上机，采用SRM方法联合Full Scan全扫描技术采集，每6个样本间插入QC样本进行质控，插入blank空白样进行残留评估。
(6)数据鉴定以及分析
利用TraceFinder 4.1 General Quan软件(赛默飞世尔科技，美国)，采用步骤(3)优化后的参数对各SRM transition进行自动识别和积分，并辅助人工检查。同时对FullScan模式下得到的数据进行LUG搜库鉴定。
(7)数据验证及整合
将两种模式均检测到的代谢物进行分析对比。
本发明还提供了上述方法在动物肠道菌群代谢物定性分析及定量(包括相对定量、绝对定量)分析中的应用，包括应用于动物类样本的全谱检测以及肠道菌群代谢物的定性、相对定量检测及验证。
本发明有益效果包括：本发明基于Thermo Trace1310(配AI 1310自动进样器)气相色谱仪串接TSQ 9000三重四级杆质谱仪，采用SRM联合Full Scan全扫描采集模式，实现在60min内一针进样，同时对氨基酸、苯甲酸及其衍生物、碳水化合物、吡啶类、吲哚类、嘧啶类、有机酸、脂肪酸、苯丙素类等9大类共计110种肠道菌群相关代谢物质进行高通量绝对定量分析。同时，采集样本中的Full Scan数据，进行全谱分析，一部分重叠数据可与SRM数据进行验证对照；交集外部分可信代谢物数据可作为其他所需数据筛选依据。该方法前处理提取效率高，且仪器分析方法线性范围宽，宽至2-3个数量级，可同时检测分析含量差异较大的高丰度和低丰度代谢产物；线性相关性好，线性相关系数均高于0.990；部分物质定量限低至5ng/mL，方法灵敏度高；准确度为80.0％～120.0％，并通过SRM方法联合Full Scan全扫描采集模式，同时实现代谢物搜库鉴定与目标物定量检测，兼顾高通量及方法灵敏度，并实现一针进样即可进行部分代谢物的验证，可广泛用于不同动物样本中代谢产物分析。
本发明方法涉及110种能够使用GCMSMS检测的肠道菌群相关代谢物，并且在不断的更新中，其质荷比在40-600之间，覆盖包含了氨基酸、脂肪酸、有机酸、酚类、苯基或苄基衍生物、吲哚等多类物质，涉及与肠道菌群代谢相关的多条重要代谢通路，所有代谢物方法均使用标准品开发。
本发明研究通过衍生化之后的肠道菌群代谢物标准品，结合气质联用三重四级杆的质谱平台技术，对相关样本进行全谱采集和数据分析，进而对目标代谢物进行定性定量分析。
本发明解决了现有技术中存在的部分肠道菌群代谢物在液相色谱质谱连用技术中存在的检测效果不佳、峰型不好、线性较差以及在气质单四级杆中存在的灵敏度较差、全谱数据验证准确性的问题等，具有广泛应用前景。
附图说明
图1为本发明基于GCMSMS高通量分析动物肠道菌群相关代谢产物的方法的流程图。
图2为浓度为5000ng/ml的标准品混标色谱图。
图3为样本色谱图，其中，图3A为血清样本色谱图，图3B为组织样本色谱图，图3C为粪便样本色谱图。
注：图2-图3C中横坐标为保留时间(分钟)，纵坐标为相对丰度(比例为100)
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
1.基于GCMSMS高通量分析动物肠道菌群代谢物的方法
1.1.代谢物筛选及分类
根据技术方法的目标需求，通过对大量肠道菌群代谢相关文献的整理，以及针对菌群代谢相关代谢通路中的代谢物进行整理汇总，将其中常见菌群相关的代谢物进行信息整理汇总和内容注释，然后在标准品库中筛选可进行硅烷化衍生的肠道菌群代谢物，共计筛选出110种化合物标准品。
1.2.标准品配制及衍生化
1.2.1.用分析天平精密称取适量的标准品，用甲醇溶解，得到标准储备液，储备液浓度均为1mg/mL；
1.2.2.将标准品按照类别分为9组，每组配制成一管混标，混标浓度为40000ng/ml(工作液1)，梯度稀释混标至浓度为4000ng/ml(工作液2)、1000ng/ml(工作液3)，其中工作液1用于寻找母离子，工作液2用于寻找子离子，工作液3用于优化质谱参数；
1.2.3.用纯水作为溶剂梯度稀释工作液1，得到标准曲线，浓度分别为：10000ng/mL；5000ng/mL；2000ng/mL；1000ng/mL；500ng/mL；200ng/mL；100ng/mL；50ng/mL；20ng/mL；10ng/mL；5ng/mL；
1.2.4.移取100μL配制好的标准品工作液1、工作液2、工作液3以及标准曲线进行挥干处理；
1.2.5.向挥干后的小瓶中加入80μL的甲氧胺盐酸盐溶液(15mg/mL，吡啶配置(容易吸潮，现配现用，尽量不要隔夜放置))，涡旋震荡2min后，于震荡培养箱中37℃中90min进行肟化反应；
1.2.6.将样本取出后再加入80μL的BSTFA(含1％TMCS)衍生试剂和20μL的正己烷，涡旋震荡2min后，于70℃反应60min。
本发明中涉及到的样本以及标准品实验前处理均采用硅烷化的衍生化方式，具体为两步衍生化：
①肟化反应，该步骤主要是通过酮基和醛基与甲氧胺盐酸盐(吡啶)，此过程可以保护酮基和醛基，特别是对于糖类物质可以有效避免一些复杂反应的产生，因此对于含酮基和醛基的物质会先与甲氧胺盐盐酸反应生成基团
“-C(R)＝N-O-”；
②硅烷化反应，此反应主要是物质中的活性氢(如含羟基-OH、羧基-COOH、氨基-NH2、巯基-SH及磷酸基团-H2PO4等物质)被硅烷基取代的过程，本研究所用的衍生化试剂为BSTFA(含1％TMCS)，因此衍生化过程中的活性氢被三甲基硅烷(trimethylsilyl,TMS)取代，主要反应如下所示：
肟化反应：
R1-C＝O-R2+CH3-O-NH2·HCl→R1-C(R2)＝N-O-CH3
常见活性氢硅烷化反应：
R-C(＝O)-OH→R-C(＝O)-O-Si(CH3)3
R-OH→R-O-Si(CH3)3
R-SH→R-S-Si(CH3)3
R-NH2→R-N-[Si(CH3)3]2
R1-NH-R2→R1-N[Si(CH3)3]-R2
详细衍生化方案参照授权专利：CN 105866299 B中进行
2.3.标准品SRM方法开发优化
1.具体仪器设备以及分析条件如下所示：
(1)质谱仪：TSQ9000(赛默飞世尔科技，美国)；
(2)气相色谱仪：Trace1310(配AI 1310自动进样器，赛默飞世尔科技，美国)；
(3)色谱柱：毛细管色谱柱DB-5MS(30m×0.25μm×0.25μm)；
(4)进样口温度：330℃；
(5)离子源温度：330℃；
(6)传输线温度：280℃；
(7)进样量：1μL；
(8)进样模式：不分流；
(9)流速：1.2mL/min；
(10)洗针液：正己烷；
(11)升温程序如表1所示：
表1 升温程序
| / | 速率(摄氏度/分钟) | 温度(摄氏度) | 持续时长(分钟) |
| 初始 | / | 50 | 0.5 |
| 1 | 8 | 125 | 2 |
| 2 | 4 | 210 | 3 |
| 3 | 5 | 270 | 2 |
| 4 | 10 | 315 | 5 |
2.离子对查找及参数优化
第一步：选择母离子：
根据第一步确定好的方法以及对应的化合物的保留时间，包括从数据库中提取到的母离子，确定所有标准品在仪器中的保留时间以及母离子；
第二步：选择子离子：
根据第一步选择好的母离子，进行离子碰撞，得到特征子离子，每一个母离子对应至少一个子离子，得到所有代谢物的母子离子对；
第三步：优化CE(碰撞能)
根据第一第二步得到的母子离子对，优化该特征离子对的最优碰撞能CE，最终得到完整的AUTO SRM方法信息表3，包含化合物，保留时间，母离子，子离子，碰撞能等关键信息。整合采集到的标准品SRM信息，创建SRM方法后，通过标准曲线进行测试，保留线性以及峰型较好的物质。110种肠道菌群相关代谢物标准品(纯度≥98％)，均购自上海源叶生物。具体信息及离子对见表2、表3。色谱级试剂甲醇、乙腈、氯仿、水均购自Sigma-Aldrich。
表2 代谢物信息表
表3 代谢物离子对及保留时间
2.4.样本制备以及衍生化
样本前处理：
将准备好的人血清(2*6＝12个样本)，人组织(2*5＝10个样本)，人粪便(2*6＝12个样本)共计34个样本进行样本前处理，各类样本前处理流程如下所示：
血清样本前处理SOP：
1.取200μL样品，加入600μL甲醇：乙腈(2:1，含0.1％甲酸)
2.涡旋1min，超声10min，-20℃静置
3.离心10min(4℃，12000rpm)，取100μL和稀释10倍后100μL上清于宽衬管中进行衍生化
组织/粪便样本前处理SOP：
1.取组织/粪便样本30-50mg，精确称重并记录后装入1.5mL EP管中(EP管在-20℃冰箱预冷)
2.加入400μL甲醇-水(4:1，v/v，0.1％甲酸)
3.加入两颗小钢珠，在-20℃冰箱放置2min后，放入研磨机中研磨(60HZ，2min)
4.冰浴超声10min，-20℃静置30min
5.离心10min(4℃，12000rpm)，取300μL上清
6.取完上清的残渣中继续加入200μL甲醇-水(4:1，v/v，0.1％甲酸)
7.涡旋30s，冰浴超声5min，离心10min(4℃，12000rpm)，取100μL上清
8.合并上清共计400μL，涡旋后取100μL和稀释10倍后100μL上清于宽衬管中进行衍生化
样本衍生化：同标准品衍生化反应。
2.5.样本数据采集(SRM+Full Scan)
将衍生化后的样本上机，采用SRM方法联合Full Scan全扫描技术采集，每6个样本间插入QC样本进行质控，插入blank空白样进行残留评估。
2.6.数据鉴定以及分析
利用TraceFinder 4.1 General Quan软件(赛默飞世尔科技，美国)，采用步骤2.3优化后的参数对各SRM transition进行自动识别和积分，并辅助人工检查。同时对FullScan模式下得到的数据进行LUG搜库鉴定。
表4 SRM模式下110种肠道菌群相关代谢物最低定量限(LLOQ)、线性范围、回归方程及相关系数
将SRM模式采集到的样本数据进行积分处理，将Full Scan模式采集到的数据进行搜库鉴定，对于搜库鉴定到的化合物，只保留得分85分以上的物质，通过对比SRM模式检出的代谢物，保留两种模式下都检出的代谢物。代谢物检出的数量如表5所示：
表5 不同类别样本中110种肠道菌群相关代谢产物检出情况(n＝2*6)
2.7.数据验证及整合
将两种模式(SRM模式和Full Scan模式)均检测到的代谢物进行分析对比，结果如表6、表7、表8、表9：
表6 粪便样本肠道菌群相关代谢产物分析结果(n＝2*6)
表7 血清样本肠道菌群相关代谢产物分析结果(n＝2*6)
表8 组织样本肠道菌群相关代谢产物分析结果(n＝2*5)
表9 两种扫描模式下样本检出的物质结果对比
本发明通过对不同样本检测到的肠道菌群相关代谢物分析，可以得出：本发明方法检测限较低，能满足不同类型的动物样本检测要求，且能够同时检测出大部分目标化合物；通过对两种模式下检测到的化合物进行分析对比，可以得出：80％左右的代谢物趋势一致，在代谢组学验证层面是较为可靠的结果。因此，可以说明，本发明方法中，通过SRM方法联合Full Scan全扫描技术采集能方便快速的得到代谢物验证的结果，且能够极大提高检测结果的准确度。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
Claims (4)
1.一种基于GCMSMS高通量分析动物肠道菌群代谢物的方法，其特征在于，所述方法为：通过SRM方法联合Full Scan全扫描技术采集，对氨基酸、苯甲酸及其衍生物、碳水化合物、吡啶类、吲哚类、嘧啶类、有机酸、脂肪酸、苯丙素类的肠道菌群相关代谢物质进行高通量定性、定量分析以及验证；
所述方法具体包括以下步骤：
(1)代谢物筛选及分类；
(2)标准品配制及衍生化；
所述标准品实验前处理采用硅烷化的衍生化方式，具体为两步衍生化：
①肟化反应，该步骤通过酮基和醛基与甲氧胺盐酸盐吡啶反应，此过程可以保护酮基和醛基，对于糖类物质能有效避免复杂反应的产生，因此对于含酮基和醛基的物质会先与甲氧胺盐盐酸反应生成基团“-C(R)＝N-O-”；
②硅烷化反应，此反应是物质中的活性氢，选自含羟基-OH、羧基-COOH、氨基-NH2、巯基-SH及磷酸基团-H2PO4物质被硅烷基取代的过程，所用的衍生化试剂为BSTFA，含1％TMCS，因此衍生化过程中的活性氢被三甲基硅烷TMS取代，反应如下所示：
肟化反应：
R1-C＝O-R2+CH3-O-NH2·HCl→R1-C(R2)＝N-O-CH3
活性氢硅烷化反应：
R-C(＝O)-OH→R-C(＝O)-O-Si(CH3)3
R-OH→R-O-Si(CH3)3
R-SH→R-S-Si(CH3)3
R-NH2→R-N-[Si(CH3)3]2
R1-NH-R2→R1-N[Si(CH3)3]-R2
(3)标准品SRM方法开发优化；
所述步骤(3)中，所述优化条件包括：质谱仪：TSQ9000；气相色谱仪：Trace1310；色谱柱：毛细管色谱柱DB-5MS 30m×0.25mm×0.25μm；离子源：EI源；进样口温度：300℃-330℃；离子源温度：300℃-350℃；传输线温度：250℃-300℃；进样量：1μL；进样模式：不分流；流速：1.0-1.5mL/min；洗针液：正己烷；升温程序为：50℃保持0.5min，8℃/min升至125℃，4℃/min升至210℃，5℃/min升至270℃，10℃/min升至315℃；
每个化合物均保留两对离子对，一对用于定性分析，一对用于定量分析；所述代谢物离子对及保留时间如下表3所示；
(4)样本制备以及衍生化；
(4.1)样本前处理：
将准备好的血清：2*6＝12个，组织：2*5＝10个样本，粪便：2*6＝12个样本共计34个样本进行样本前处理，各类样本前处理流程如下所示：
(4.1.1)血清样本前处理SOP：
(4.1.1.1)取200μL样品，加入600μL含0.1％甲酸的体积比为2:1的甲醇-乙腈；
(4.1.1.2)涡旋1min，超声10min，-20℃静置；
(4.1.1.3)4℃，12000rpm离心10min，取100μL和稀释10倍后100μL上清于宽衬管中进行衍生化；
(4.1.2)组织/粪便样本前处理SOP：
(4.1.2.1)取组织/粪便样本30-50mg，精确称重并记录后装入1.5mL EP管中，所述EP管在-20℃冰箱预冷；
(4.1.2.2)加入400μL含有0.1％甲酸的体积比为4:1的甲醇-水；
(4.1.2.3)加入两颗小钢珠，在-20℃冰箱放置2min后，放入研磨机中60HZ研磨2min；
(4.1.2.4)冰浴超声10min，-20℃静置30min；
(4.1.2.5)4℃，12000rpm离心10min，取300μL上清；
(4.1.2.6)取完上清的残渣中继续加入200μL含0.1％甲酸的体积比为4:1的甲醇-水；
(4.1.2.7)涡旋30s，冰浴超声5min，4℃，12000rpm离心10min，取100μL上清；
(4.1.2.8)合并上清共计400μL，涡旋后取100μL和稀释10倍后100μL上清于宽衬管中进行衍生化；
所述样本衍生化同所述标准品衍生化；
(5)样本数据采集；采用SRM联合Full Scan全扫描采集模式，采用样本中的Full Scan全扫描数据进行全谱分析，每6个样本间插入QC样本进行质控，插入blank空白样进行残留评估；
(6)数据鉴定以及分析；对SRM模式采集到的数据进行软件自动积分并辅助人工检查，对Full Scan全扫描模式采集到的数据进行LUG搜库鉴定；
(7)：数据验证及整合；
线性相关系数均高于0.990；样本物质定量限低至5ng/mL；准确度为80.0％～120.0％；
所述方法，兼具高通量及高灵敏度，实现在60min内一针进样，同时对肠道菌群代谢物进行高通量绝对定量分析；
所述肠道菌群相关代谢物如下表2所示：
表2代谢物信息表
表3代谢物离子对及保留时间
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(7)中，分别对两种检测模式下得到的数据进行生信分析，比对结果。
3.如权利要求1所述的方法在定性/定量分析动物肠道菌群代谢物中的应用。
4.如权利要求1所述的方法在动物类样本的全谱采集和数据分析检测以及验证中的应用。
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