CN115015450A - 一种微波衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析土壤中代谢物的方法 - Google Patents

一种微波衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析土壤中代谢物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115015450A
CN115015450A CN202210585235.6A CN202210585235A CN115015450A CN 115015450 A CN115015450 A CN 115015450A CN 202210585235 A CN202210585235 A CN 202210585235A CN 115015450 A CN115015450 A CN 115015450A
Authority
CN
China
Prior art keywords
soil
derivatization
metabolites
extraction
gas chromatography
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210585235.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115015450B (zh
Inventor
蔡凯
高维常
高川川
林叶春
赵瑞娟
许冬青
潘文杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guizhou Institute of Tobacco Science
Original Assignee
Guizhou Institute of Tobacco Science
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guizhou Institute of Tobacco Science filed Critical Guizhou Institute of Tobacco Science
Priority to CN202210585235.6A priority Critical patent/CN115015450B/zh
Publication of CN115015450A publication Critical patent/CN115015450A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115015450B publication Critical patent/CN115015450B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/12—Preparation by evaporation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7206—Mass spectrometers interfaced to gas chromatograph
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/045—Standards internal
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/065—Preparation using different phases to separate parts of sample
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/12—Preparation by evaporation
    • G01N2030/121—Preparation by evaporation cooling; cold traps
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/12—Preparation by evaporation
    • G01N2030/126—Preparation by evaporation evaporating sample

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明公开了一种微波衍生‑拟靶标气相色谱‑质谱分析土壤中代谢物的方法，包括：1）将内标物质与提取溶剂加入到土壤样品中，涡旋提取并离心过滤得提取溶液；2）在低温条件下离心浓缩得冻干提取物；3）加入转移溶剂，转移上层清液于色谱瓶中，常温条件下氮气流下干燥，再加二氯甲烷干燥得完全干燥的土壤提取物；4）加入衍生化试剂后在微波加热反应条件下进行肟化和硅烷衍生化，得土壤代谢物衍生化产物；5）加入正十二烷吡啶溶液，混匀后取上层清液于微量色谱瓶中，采用拟靶标气相色谱‑质谱的方式进行分离、定性与定量。本发明建立的土壤代谢组分析方法可以较全面、综合地体现土壤代谢产物的差异情况，能广泛的应用于环境及土壤科学研究。

Description

一种微波衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析土壤中代谢物的 方法
技术领域
本发明涉及一种微波衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析土壤中代谢物的方法，属于土壤微生物代谢组学研究的定性与定量分析方法领域。
背景技术
代谢组学是对生物或细胞在特定生理时期内全部低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析，以样本中主要代谢物为变量，通过高通量的检测和数据处理手段，对数据信息进行建模与预测，研究土壤在外界环境发生变化后其代谢产物的变化规律。土壤代谢组学具有极大的应用前景，主要表现为：1、土壤微生物群落代谢组图谱提供了一种潜在的表征土壤及评估土壤生物群落代谢状态的方法；2、土壤代谢组学指纹图谱与土壤养分评价指标密切有关，如包括pH、土地利用、水分和盐度等指标；3、土壤代谢组学能够区分土壤类别及可作为土壤质量评价指标的潜在能力；4、土壤代谢组学为揭示土壤微生物群落中复杂的分子网络和代谢途径以及评价土壤功能提供了一定依据；5、土壤代谢组学能够揭示化感代谢物对微生物群落结构及功能的影响。
代谢组学技术能够识别相互作用代谢途径中的生化中间产物，潜在地提高了对土壤中生物过程的整体理解，并提高预测结果的能力。将代谢组学应用于土壤微生物组，可以提供一种表征微生物群落差异活动的方法，反映微生物基因组与环境的相互作用，从而提供一种评估土壤健康的新方法。这有利于对细胞途径及非生物和生物胁迫下群落的反应进行理解，也可以对土壤基本生化功能提出新的见解。结合互补的“组学”技术(基因组学、蛋白质组学、转录组学)，代谢图谱可以更全面地理解与环境线索相关的分子机制，更容易地区分代谢物诱导的酶抑制和基因组或蛋白质组调节，同时也有可能提供对土壤微生物分子途径及其与环境关联性的深入和整体的理解。
气相色谱-质谱能够覆盖绝大多数的初级代谢物与部分次生代谢物，标准谱库的物质鉴定结合其高分离能力，已成为代谢组学研究中重要的分析工具。但由于土壤的高复杂性和异质性，使其具有独特的物理和化学性质，如强吸附性和高含量的有机质、金属离子等，可能会影响到代谢物的提取效率和衍生反应效率。例如，氨基(如胺和氨基酸)对硅烷化反应的反应性低，不完全或部分衍生化往往导致单一分析物出现多个峰、峰重叠、峰小或缺失，从而导致定性与定量不准确。土壤基质中的代谢物丰度远低于植物，现已鉴定的代谢物类型和数量也有限，一般少于100种代谢物，无法全面地体现土壤代谢产物的差异情况。此外，在常规加热衍生化反应条件下，衍生化时间通常需要2-3h。因此，有必要开发一种提高特异性、通量、覆盖率的代谢组学分析方法，以适应土壤基质的特殊性。
发明内容
基于上述，本发明提供一种微波衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析土壤中代谢物的方法，目的是设计一种高特异性、通量、覆盖率的代谢组学分析方法，方法可以全面、综合地体现土壤代谢产物的差异情况，为研究土壤代谢组学提供一种速度快、高稳定性、高灵敏度、宽线性、高覆盖性的分析方法，以克服现有技术的不足。
本发明的技术方案是：一种微波衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析土壤中代谢物的方法，包括：
S1土壤样品提取：将内标物质与提取溶剂加入到土壤样品中，混匀，涡旋提取，离心过滤得土壤提取溶液；
S2土壤提取溶液低温干燥：将土壤提取溶液在0-8℃条件下离心浓缩，得到冻干提取物；采用低温冷冻干燥能最大程度降低微生物活性，减少代谢物降解。
S3土壤冻干提取物溶解：向冻干提取物中加入转移溶剂，涡旋溶解，离心，转移上层清液于色谱瓶中，常温条件下氮气流下干燥，再加二氯甲烷干燥，得到完全干燥的土壤提取物；对代谢物再次溶解与干燥处理能最大程度减少结晶水的衍生化的影响，也能减少有机质及金属离对硅烷化的基质效应。
S4土壤代谢物衍生化：向完全干燥的土壤提取物中加入衍生化试剂，涡旋混匀，在微波反应条件下进行肟化和硅烷衍生化，得土壤代谢衍生化产物；采用肟化和硅烷2步衍生化能有效保护羰基，减少糖类代谢物定量的多重异构体峰，减少色谱峰的复杂性，且使得衍生化产物具有较高的挥发性进行气相色谱-质谱分析。
S5土壤代谢物衍生化产物的转移：向土壤代谢衍生化产物中加入正十二烷吡啶溶液，涡旋混匀，离心后取上层清液于微量色谱瓶中；
S6土壤代谢衍生化产物的测定：采用拟靶标气相色谱-质谱的方式对土壤代谢衍生化产物进行分离、定性与定量，以保留时间、保留指数、标准品及质谱数据库比对进行定性，内标法定量。
可选的，在土壤样品提取中，内标物质为邻甲氧基苯酚-D3、L-(+)-正缬氨酸、己二酸、阿东糖醇、棕榈酸-D31和苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷水合物。
可选的，在土壤样品提取中，采用甲醇：水(v:v＝3:2)与水作为提取溶剂进行序列提取，甲醇：水提取2次，水提取1次。
可选的，在土壤冻干提取物溶解中，转移溶剂为甲醇溶液，转移进行衍生化的容器为螺旋颈回收瓶。
可选的，在土壤代谢物衍生化中，衍生化试剂先加入甲氧胺盐酸盐吡啶溶液肟化反应，再加入BSTFA+1％TMCS硅烷化反应，体积比为1:5-1:6(甲氧胺盐酸盐吡啶溶液与BSTFA+1％TMCS v/v)。
可选的，在土壤代谢物衍生化反应中，微波能量为800w，肟化微波加热反应分别3+2min；硅烷化衍生微波加热反应分别3+3+3min。
可选的，气相色谱-质谱分析的条件为：拟靶标气相色谱-质谱的方式采集数据进行定量；色谱柱：HP-5MS(60m×250μm×0.25μm)毛细管色谱柱，进样口温度：280℃；进样量：1.00uL；分流比：8:1；柱流速：1.0mL/min；升温程序：60℃保持2min，然后以5℃/min升到230℃保持5min，8℃/min升到290℃保持25.5min，一共运行74min；质谱条件：离子源温度：230℃，四级杆温度：150℃；电离能：70eV，传输线温度：280℃，全扫描质量数范围45-600aum，溶剂延迟：11.90min；采集模式：全扫描(Scan)采集；MS谱库：NIST14库和Willy08库，对定性的物质进行拟靶标代谢组学方法进行选择离子扫描定量。
本发明的有益效果是：发明了一种土壤中代谢物的前处理方法，主要包括提取、干燥及衍生化3个步骤，采用拟靶标气相色谱-质谱的方法对土壤代谢物衍生化产物进行定性与定量。合适的提取、干燥是决定衍生化反应程度的关键。本发明中提取方法能高覆盖度的提取土壤中的代谢物，且减少土壤干扰物质的提取，进一步的转移再干燥可以最大程度减少结晶水的衍生化的影响，也能减少有机质及金属离子对硅烷化的基质效应。本发明中的提取、干燥方法确保了高效率的肟化与硅烷化反应，获得最佳的线性、精密度与灵敏度。该分析方法简单易行，可以较全面、综合地体现土壤代谢产物的差异情况，可以广泛的应用于环境及土壤科学研究。方法为土壤代谢组学提供一种速度快、高稳定性、高灵敏度、宽线性、高覆盖性的分析方法。
与现有技术相比，本发明还具有以下优点：1)玻璃螺旋颈回收瓶进行衍生化能有效减少杂质的干扰，提高代谢物鉴定的准确度；2)微波反应衍生化，能减少代谢组学样品的分析时间，从2-3h减少到14min左右；3)拟靶标代谢组学定性与定量方法能分析更低丰度的代谢物，稳定性更高；4)土壤代谢物鉴定达到184个；5)衍生化试剂BSTFA替代MSTFA能够有效提高氨基酸、酚类、短链胺、糖醇等代谢物的反应衍生化效率；6)与常规加热衍生化反应比较，本发明分析速度快，高稳定性、高灵敏度、宽线性、高覆盖性。
附图说明
图1微波衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析土壤中代谢物的方法流程图；
图2质量控制土壤样品(QC)重复性分析(±2SD以内)；
图3土壤代谢物对根际土(Gjt)与非根际土(Fgjt)的主成分分析(左)与偏最小二乘-判别分析(右)；
图4S-plot对根际土(Gjt)与非根际土(Fgjt)中的差异代谢物筛选；
图5VIP图对根际土(Gjt)与非根际土(Fgjt)中的差异代谢物筛选；
图6微波辅助衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析质量控制土壤样品(QC)典型色谱图(A为全扫描图谱；B为选择性离子扫描图谱)。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1：一种微波衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析土壤中代谢物的方法
S1土壤样品提取：将0.5g过筛的土壤(冷冻干燥)置于10mL玻璃锥形管中，然后加入6μL内标混合液为邻甲氧基苯酚-D3、L-(+)-正缬氨酸、己二酸、阿东糖醇、棕榈酸-D31和苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷水合物(0.250mg/mL、0.272mg/mL、0.528mg/mL、0.210mg/mL、0.260mg/mL和0.520mg/mL，50％甲醇水作为溶剂)和1.5mL预冻(4℃)甲醇-水(v:v 3:2)。使用多管旋涡振荡器强旋涡(2500rpm)与4℃下提取土壤样品5min，然后，将样品离心5min(3000rpm，4℃)，并用0.22μm尼龙膜过滤于5mL玻璃锥形管中。依次用0.8mL甲醇：水(v:v 3:2)与0.8mL水重复提取1次。
S2土壤提取溶液低温干燥：根据上述步骤S1得到3次提取溶液合并到5mL玻璃锥形管中，约4℃条件下冷冻干燥离心浓缩18h，得到土壤冻干提取物。土壤样品提取应尽可能冷却，以限制微生物的活性，减少代谢物降解，最后得土壤冻干提取物。
S3土壤冻干提取物溶解：向冻干土壤提取物中加入300μL甲醇，2500rpm涡旋5min，3000rpm离心5min，转移上层清液于2mL螺旋颈回收瓶中常温氮气流下干燥，再加入300μL二氯甲烷干燥，得到完全干燥的土壤提取物。
S4土壤代谢物衍生化：向完全干燥的土壤提取物中通过加入17μL甲氧胺盐酸盐(25mg/mL，吡啶配制)进行肟化反应，微波反应3+2min，能量为800W。然后，加入103μL BSTFA+1％TMCS，进行3+3+3min的微波硅烷化反应。反应时间间隔稍微冷却1分钟的情况下进行。因为长时间会导致样品过热，从而导致压力升高，可能导致反应瓶爆炸。
S5土壤代谢物衍生化产物的转移：反应冷却后，加入5μL正十二烷吡啶溶液(1.00mg/mL)并混匀。将所得溶液离心5分钟(3000rpm)，取上层清液于150uL微量色谱瓶中进行拟靶标气相色谱-质谱分析。
S6土壤代谢衍生化产物的测定：采用拟靶标气相色谱-质谱的方式进行定性与定量，以保留时间、保留指数、标准品及质谱数据库等比对进行定性，内标法邻甲氧基苯酚-D3、L-(+)-正缬氨酸、己二酸、阿东糖醇、棕榈酸-D31和苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷水合物进行定量。采用气相色谱-质谱检测器进行色谱分析，色谱柱：HP-5MS(60m×250μm×0.25μm)毛细管色谱柱，进样口温度：280℃；进样量：1.00uL；分流比：8:1；柱流速：1.0mL/min；升温程序：60℃保持2min，然后以5℃/min升到230℃保持5min，8℃/min升到290℃保持25.5min，一共运行74min。质谱条件：离子源温度：230℃，四级杆温度：150℃；电离能：70eV，传输线温度：280℃，全扫描质量数范围45-600aum，溶剂延迟：11.90min；采集模式：全扫描(Scan)采集。MS谱库：NIST14库和Willy08库，对定性的代谢物采用拟靶标代谢组学方法进行选择离子扫描定量。
实施例2：土壤代谢物定性分析
在实施例1的基础上，通过质谱数据库、文献、保留指数、标准品等对土壤代谢物质进行鉴定，鉴定的物质组成如下：一共包含184种土壤代谢产物，主要包含了可以分为26类代谢物，主要有糖水化合物27种、氨基酸18种、长链脂肪酸18种、土壤酚酸15种、糖醇13种、短链脂肪酸12种、长链脂肪醇10种、多元醇10种、二元羧酸6种、磷酯6种、羟基羧酸6种、甾醇6种等。表明该方法定性定量的主要物质为初级代谢物，同时也包括少部分次生代谢物，这些物质包含了初级代谢产物中80-90％的代谢物，可以有效的进行代谢途径分析。
实施例3：土壤代谢物定量分析
在实施例2的基础上，土壤中代谢物的含量按照式(1)进行计算。
Figure BDA0003663219880000061
式中，
R——土壤样品中代谢物质的含量，单位为微克每克(μg/g)；
c——相对定量校正的内标物质浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；
v——添加内标的体积含量，单位为微升(μL)；
s1——土壤样品中代谢物质面积；
s2——土壤样品定量内标物质面积；
m——样品的质量，单位为克(g)；
取QC样品进行方法重现性及稳定性进行验证，结果表明重复性94％的土壤代谢物的相对标准偏差小于20％，重现性92.9％的土壤代谢物的相对标准偏差小于25％，稳定性表现为18h内偏差小于10％，24h偏差小于20％，且大部分土壤代谢物仍然小于10％。
应用例4：根际土壤与非根际土壤差异分析
根际土壤与非根际土壤按实施例1方法进行操作，采用微波衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析根际土与非根际土壤中代谢物，同时将等质量混匀的样品作为土壤质量控制样品QC进行分析以监测稳定性，对QC进行主成分分析，结果如图2所示，QC样品波动都小于2SD，且基本在0值波动较小，表明在样品分析中具有较好的稳定性，符合代谢分析的要求。对根际土与非根际土进行主成分差异分析，结果表明二者在第一成分上区分明显，表明二者差异较大，进一步采用偏最小二乘判别分析进行区分，获得类似的区分结果，以上结果说明烟草根际土与非根际土在代谢物上的差异显著，这与根系具有富集代谢物与微生物、同时还能够分泌代谢物等功能有关(图3)。
对根际土与非根际土起区分作用的关键代谢物分别用S-plot与VIP值进行筛选，结果表明大部分代谢物都在根系富集，富集上调的代谢物有55种，而下调的代谢物只有4种(图4和图5)。对关键代谢物进行分类，显示富集上调的代谢物主要为氨基酸类10种、糖类10种、高级脂肪酸10种、酚酸类8种、短链脂肪酸类4种、多元醇酸4种等，而下调的代谢物为胺类3种、磷酸化糖1种(表1)。富集代谢物主要表现氨基酸、糖类等，这些代谢物主要是微生物与烟草的营养物质，高级脂肪酸是合成微生物细胞膜的重要成分，而酚酸类是引起土壤连作障碍的一种关键化感物质，短链脂肪酸是一类显著改变微生物群落的一种有机酸。以上研究结果表明，烟草根际土与非根际土代谢物的分析值得进一步深入进行功能研究。
表1根际土与非根际土的差异代谢物种类与分类
Figure BDA0003663219880000071
Figure BDA0003663219880000081
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种微波衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析土壤中代谢物的方法，其特征在于，包括：
S1土壤样品提取：将内标物质与提取溶剂加入到土壤样品中，混匀，涡旋提取，离心过滤得土壤提取溶液；
S2土壤提取溶液低温干燥：将土壤提取溶液在0-8℃条件下离心浓缩，得到冻干提取物；
S3土壤冻干提取物溶解：向冻干提取物中加入转移溶剂，涡旋溶解，离心，转移上层清液于色谱瓶中，常温条件下氮气流下干燥，再加二氯甲烷干燥，得到完全干燥的土壤提取物；
S4土壤代谢物衍生化：向完全干燥的土壤提取物中加入衍生化试剂，涡旋混匀，在微波加热条件下进行肟化和硅烷衍生化反应，得土壤代谢物衍生化产物；
S5土壤代谢物衍生化产物的转移：向土壤代谢物衍生化产物中加入正十二烷吡啶溶液，涡旋混匀，离心后取上层清液于微量色谱瓶中；
S6土壤代谢衍生化产物的测定：采用拟靶标气相色谱-质谱的方式对土壤代谢物衍生化产物进行分离、定性与定量，以保留时间、保留指数、标准品及质谱数据库比对进行定性，内标法定量。
2.根据权利要求1所述的分析土壤中代谢物的方法，其特征在于，在土壤样品提取中，内标物质为邻甲氧基苯酚-D3、L-(+)-正缬氨酸、己二酸、阿东糖醇、棕榈酸-D31和苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷水合物。
3.根据权利要求1所述的分析土壤中代谢物的方法，其特征在于，在土壤样品提取中，采用甲醇：水(v:v＝3:2)与水作为提取溶剂进行序列提取，甲醇：水提取2次，水提取1次。
4.根据权利要求1所述的分析土壤中代谢物的方法，其特征在于，在土壤冻干提取物溶解中，转移溶剂为甲醇溶液，转移进行衍生化的容器为螺旋颈回收瓶。
5.根据权利要求1所述的分析土壤中代谢物的方法，其特征在于，在土壤代谢物衍生化中，衍生化试剂先加入甲氧胺盐酸盐吡啶溶液进行肟化反应，再加入BSTFA+1％TMCS进行硅烷化反应，甲氧胺盐酸盐吡啶溶液与BSTFA+1％TMCS的体积比为1:5-1:6。
6.根据权利要求5所述的分析土壤中代谢物的方法，其特征在于，在土壤代谢物衍生化反应中，微波能量为800w，肟化微波加热反应分别3+2min；硅烷化衍生微波加热反应分别3+3+3min。
7.根据权利要求1所述的分析土壤中代谢物的方法，其特征在于，气相色谱-质谱分析的条件为：拟靶标气相色谱-质谱的方式采集数据进行定量；色谱柱：HP-5MS(60m×250μm×0.25μm)毛细管色谱柱，进样口温度：280℃；进样量：1.00uL；分流比：8:1；柱流速：1.0mL/min；升温程序：60℃保持2min，然后以5℃/min升到230℃保持5min，8℃/min升到290℃保持25.5min，一共运行74min；质谱条件：离子源温度：230℃，四级杆温度：150℃；电离能：70eV，传输线温度：280℃，全扫描质量数范围45-600aum，溶剂延迟：11.90min；采集模式：全扫描(Scan)采集；MS谱库：NIST14库和Willy08库，对定性的物质进行拟靶标代谢组学方法进行选择离子扫描定量。
CN202210585235.6A 2022-05-26 2022-05-26 一种微波衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析土壤中代谢物的方法 Active CN115015450B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210585235.6A CN115015450B (zh) 2022-05-26 2022-05-26 一种微波衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析土壤中代谢物的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210585235.6A CN115015450B (zh) 2022-05-26 2022-05-26 一种微波衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析土壤中代谢物的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115015450A true CN115015450A (zh) 2022-09-06
CN115015450B CN115015450B (zh) 2024-05-14

Family

ID=83070542

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210585235.6A Active CN115015450B (zh) 2022-05-26 2022-05-26 一种微波衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析土壤中代谢物的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115015450B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115950979A (zh) * 2022-12-22 2023-04-11 江苏中烟工业有限责任公司 一种用于复杂基质烟草提取物产地溯源的方法

Citations (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4818405A (en) * 1988-01-15 1989-04-04 Vroom Kenneth B Sludge treatment
JP2007187653A (ja) * 2005-12-12 2007-07-26 Nittetsu Kankyo Engineering Kk 植物中のサイトカラシンｅの分析方法及び植物病害診断方法
CN101210908A (zh) * 2006-12-29 2008-07-02 中国科学院沈阳应用生态研究所 气质联机测定土壤氨基酸手性异构体同位素富集速率
CN101210864A (zh) * 2006-12-29 2008-07-02 中国科学院沈阳应用生态研究所 土壤中性糖的糖腈乙酰酯衍生毛细管气相色谱分析方法
CN101576543A (zh) * 2009-04-21 2009-11-11 新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种快速检测乳粉中三聚氰胺的方法
CN101629937A (zh) * 2009-08-18 2010-01-20 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 一种土壤中五氯苯酚的定量检测方法
JP2010038613A (ja) * 2008-08-01 2010-02-18 National Institute For Agro-Environmental Science 土壌中の塩素化シクロジエン系農薬の抽出分析方法、土壌中の塩素化シクロジエン系農薬の抽出剤、土壌のウリ類栽培適正鑑別方法および収穫するウリ類中の塩素化シクロジエン系農薬濃度の予測方法
CN101776656A (zh) * 2010-01-15 2010-07-14 新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种测定果蔬酱中棒曲霉素的方法
CN101900711A (zh) * 2010-07-22 2010-12-01 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法
CN102590412A (zh) * 2012-01-18 2012-07-18 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化gc-ms方法
CN104101662A (zh) * 2014-08-01 2014-10-15 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种检测新鲜烟叶萜类化合物代谢组学方法
EP2818861A1 (en) * 2013-06-26 2014-12-31 Metabolomic Discoveries GmbH Method for predicting the sugar content in a full-grown root vegetable
CN104297355A (zh) * 2013-07-17 2015-01-21 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于液相色谱/质谱联用的拟靶标代谢组学分析方法
CN104458934A (zh) * 2014-10-24 2015-03-25 贵州省烟草科学研究院 一种烟草及烟草制品中水溶性糖的检测方法
CN104777242A (zh) * 2014-01-14 2015-07-15 中国科学院大连化学物理研究所 用于诊断多囊卵巢综合征的联合标志物、试剂盒和系统
CN104931326A (zh) * 2015-07-03 2015-09-23 南开大学 一种斑马鱼代谢物的提取方法及其应用
CN105301163A (zh) * 2015-02-13 2016-02-03 天津桑尼匹克生物科技有限公司 一种测定生物体代谢产物的靶向代谢组学分析方法
CN105842376A (zh) * 2016-04-27 2016-08-10 江苏德旺化工工业有限公司 一种染料中多氯苯酚的检测方法
CN105866276A (zh) * 2016-04-07 2016-08-17 河南城建学院 一种同步提取和净化土壤中多种氯代多环芳烃的方法
CN105866299A (zh) * 2016-03-31 2016-08-17 上海青鹿投资有限公司 基于gc-ms的植物非靶向代谢组学样品预处理方法
CN106290617A (zh) * 2016-07-29 2017-01-04 云南省烟草农业科学研究院 一种基于气相色谱质谱的烟叶代谢组学分析方法
CN106338569A (zh) * 2016-07-29 2017-01-18 云南省烟草农业科学研究院 一种基于气相色谱质谱的烟草茎部代谢组学分析方法
CN106483217A (zh) * 2016-09-30 2017-03-08 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种gc‑ms检测新鲜烟叶中初生代谢物和次生代谢物的方法
CN107037160A (zh) * 2017-05-27 2017-08-11 四川中烟工业有限责任公司 烟叶中氨基酸的测定方法
CN107121517A (zh) * 2017-07-05 2017-09-01 赛思莱（厦门）生物科技有限公司 一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法
CN107655996A (zh) * 2017-11-02 2018-02-02 上海市农业技术推广服务中心 一种检测土壤中带羟基的脂肪酸甲酯类的方法
CN109975455A (zh) * 2019-03-29 2019-07-05 东北大学 一种污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法
CN110320303A (zh) * 2019-08-09 2019-10-11 东北大学 一种基于uplc-ms的土壤渗滤系统代谢组学分析方法
CN111103386A (zh) * 2020-01-15 2020-05-05 贵州省烟草科学研究院 一种应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法
CN111220722A (zh) * 2019-12-20 2020-06-02 广电计量检测(南宁)有限公司 一种同时测定土壤中8种对羟基苯甲酸酯类化合物的方法
AU2020102961A4 (en) * 2020-10-22 2020-12-24 Nanjing Forestry University A quantitative method for determining fatty acid methyl ester in soils and its application
CN113138246A (zh) * 2021-04-25 2021-07-20 深圳市中医院 一种靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法
CN113391015A (zh) * 2021-06-11 2021-09-14 河北省地质实验测试中心(国土资源部保定矿产资源监督检测中心、河北省金银宝玉饰品质量监督检验站) 一种土壤中14种酚类化合物的检测方法
US20210333250A1 (en) * 2020-04-26 2021-10-28 Nanjing University Method for high-throughput screening of non-target biomarkers based on metabolic perturbation caused by pollutants

Patent Citations (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4818405A (en) * 1988-01-15 1989-04-04 Vroom Kenneth B Sludge treatment
JP2007187653A (ja) * 2005-12-12 2007-07-26 Nittetsu Kankyo Engineering Kk 植物中のサイトカラシンｅの分析方法及び植物病害診断方法
CN101210908A (zh) * 2006-12-29 2008-07-02 中国科学院沈阳应用生态研究所 气质联机测定土壤氨基酸手性异构体同位素富集速率
CN101210864A (zh) * 2006-12-29 2008-07-02 中国科学院沈阳应用生态研究所 土壤中性糖的糖腈乙酰酯衍生毛细管气相色谱分析方法
JP2010038613A (ja) * 2008-08-01 2010-02-18 National Institute For Agro-Environmental Science 土壌中の塩素化シクロジエン系農薬の抽出分析方法、土壌中の塩素化シクロジエン系農薬の抽出剤、土壌のウリ類栽培適正鑑別方法および収穫するウリ類中の塩素化シクロジエン系農薬濃度の予測方法
CN101576543A (zh) * 2009-04-21 2009-11-11 新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种快速检测乳粉中三聚氰胺的方法
CN101629937A (zh) * 2009-08-18 2010-01-20 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 一种土壤中五氯苯酚的定量检测方法
CN101776656A (zh) * 2010-01-15 2010-07-14 新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种测定果蔬酱中棒曲霉素的方法
CN101900711A (zh) * 2010-07-22 2010-12-01 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法
CN102590412A (zh) * 2012-01-18 2012-07-18 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种检测新鲜烟叶中次生代谢物的衍生化gc-ms方法
EP2818861A1 (en) * 2013-06-26 2014-12-31 Metabolomic Discoveries GmbH Method for predicting the sugar content in a full-grown root vegetable
CN104297355A (zh) * 2013-07-17 2015-01-21 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于液相色谱/质谱联用的拟靶标代谢组学分析方法
CN104777242A (zh) * 2014-01-14 2015-07-15 中国科学院大连化学物理研究所 用于诊断多囊卵巢综合征的联合标志物、试剂盒和系统
CN104101662A (zh) * 2014-08-01 2014-10-15 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种检测新鲜烟叶萜类化合物代谢组学方法
CN104458934A (zh) * 2014-10-24 2015-03-25 贵州省烟草科学研究院 一种烟草及烟草制品中水溶性糖的检测方法
CN105301163A (zh) * 2015-02-13 2016-02-03 天津桑尼匹克生物科技有限公司 一种测定生物体代谢产物的靶向代谢组学分析方法
CN104931326A (zh) * 2015-07-03 2015-09-23 南开大学 一种斑马鱼代谢物的提取方法及其应用
CN105866299A (zh) * 2016-03-31 2016-08-17 上海青鹿投资有限公司 基于gc-ms的植物非靶向代谢组学样品预处理方法
CN105866276A (zh) * 2016-04-07 2016-08-17 河南城建学院 一种同步提取和净化土壤中多种氯代多环芳烃的方法
CN105842376A (zh) * 2016-04-27 2016-08-10 江苏德旺化工工业有限公司 一种染料中多氯苯酚的检测方法
CN106290617A (zh) * 2016-07-29 2017-01-04 云南省烟草农业科学研究院 一种基于气相色谱质谱的烟叶代谢组学分析方法
CN106338569A (zh) * 2016-07-29 2017-01-18 云南省烟草农业科学研究院 一种基于气相色谱质谱的烟草茎部代谢组学分析方法
CN106483217A (zh) * 2016-09-30 2017-03-08 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种gc‑ms检测新鲜烟叶中初生代谢物和次生代谢物的方法
CN107037160A (zh) * 2017-05-27 2017-08-11 四川中烟工业有限责任公司 烟叶中氨基酸的测定方法
CN107121517A (zh) * 2017-07-05 2017-09-01 赛思莱（厦门）生物科技有限公司 一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法
CN107655996A (zh) * 2017-11-02 2018-02-02 上海市农业技术推广服务中心 一种检测土壤中带羟基的脂肪酸甲酯类的方法
CN109975455A (zh) * 2019-03-29 2019-07-05 东北大学 一种污水地下渗滤系统微生物代谢产物检测方法
CN110320303A (zh) * 2019-08-09 2019-10-11 东北大学 一种基于uplc-ms的土壤渗滤系统代谢组学分析方法
CN111220722A (zh) * 2019-12-20 2020-06-02 广电计量检测(南宁)有限公司 一种同时测定土壤中8种对羟基苯甲酸酯类化合物的方法
CN111103386A (zh) * 2020-01-15 2020-05-05 贵州省烟草科学研究院 一种应用植物种子评价全生物降解材料生态毒性的方法
US20210333250A1 (en) * 2020-04-26 2021-10-28 Nanjing University Method for high-throughput screening of non-target biomarkers based on metabolic perturbation caused by pollutants
AU2020102961A4 (en) * 2020-10-22 2020-12-24 Nanjing Forestry University A quantitative method for determining fatty acid methyl ester in soils and its application
CN113138246A (zh) * 2021-04-25 2021-07-20 深圳市中医院 一种靶向测定生物样本中短链脂肪酸的检测方法
CN113391015A (zh) * 2021-06-11 2021-09-14 河北省地质实验测试中心(国土资源部保定矿产资源监督检测中心、河北省金银宝玉饰品质量监督检验站) 一种土壤中14种酚类化合物的检测方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
T.L. SWENSON ET AL.: "Untargeted soil metabolomics method s for analysis of extractable organic matter", 《SOIL BIOLOGY & BIOCHEMISTRY》, 22 October 2014 (2014-10-22), pages 189 - 198 *
李勇;林茜;逄涛;师君丽;邓小鹏;卢秀萍;: "基于气相色谱-质谱的烟草根部代谢组学方法建立及应用", 分析试验室, no. 08 *
杨敬坡;王文军;郭延凯;陈晓轩;都泽铭;: "一种利用QuEChERS-GC/MS测定苹果种植土壤中5种常见菊酯类农药的方法研究", 中国测试, no. 11 *
王晓燕;郇志博;: "气相色谱-串联质谱法测定土壤中16种邻苯二甲酸酯和2种邻苯二甲酸酯单酯代谢物", 理化检验(化学分册), no. 07 *
谭头云;蔡磊明;王立冬;郭鹏程;李国亮;: "气相色谱法测定苹果、土壤中代森铵及其代谢物的残留量", 农药, no. 08, 10 August 2009 (2009-08-10) *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115950979A (zh) * 2022-12-22 2023-04-11 江苏中烟工业有限责任公司 一种用于复杂基质烟草提取物产地溯源的方法
CN115950979B (zh) * 2022-12-22 2023-10-10 江苏中烟工业有限责任公司 一种用于复杂基质烟草提取物产地溯源的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN115015450B (zh) 2024-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Vuckovic Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography–mass spectrometry
Gika et al. Current practice of liquid chromatography–mass spectrometry in metabolomics and metabonomics
EP3850359A1 (en) Mass spectrometry assay method for detection and quantitation of microbiota-related metabolites
KR20150122191A (ko) 기체 크로마토그래피/질량 분석법에 의해 생물학적 샘플에서 박테리아 종을 동정하는 방법
Glaser et al. Compound‐specific δ13C analysis of individual amino sugars–a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization
Liang et al. GC-based detection of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid for microbial residue determination in soil
CN112666287B (zh) 基于gcmsms高通量分析动物肠道菌群代谢物的方法及应用
CN115015450B (zh) 一种微波衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析土壤中代谢物的方法
Straube et al. Analysis of nucleosides and nucleotides in plants: an update on sample preparation and LC–MS techniques
CN111060610B (zh) 同时测定天然硝酸盐和亚硝酸盐氮、氧同位素组成的方法
CN113552258B (zh) 一种基于代谢组学技术挖掘工业大麻激素调控应答基因的方法
Kapoore Mass spectrometry based hyphenated techniques for microalgal and mammalian metabolomics.
Lengger et al. Determination of the δ2H values of high molecular weight lipids by high‐temperature gas chromatography coupled to isotope ratio mass spectrometry
CN112858559A (zh) 一种基于磷脂酰胆碱的牛羊乳掺伪鉴别方法
Zosso et al. Methylation procedures affect PLFA results more than selected extraction parameters
CN113720945B (zh) 一种基于QuEChRS方法的快速检验尿液中有机磷酸酯阻燃剂及其代谢物的检测方法
CN111402961B (zh) 一种多物种gc-ms内源性代谢物数据库及其建立方法
He et al. A gas chromatographic/mass spectrometric method for tracing the microbial conversion of glucose into amino sugars in soil
Jousse et al. Exploring metabolome with GC/MS
Fujisawa et al. Gas chromatography-mass spectrometry analysis of 4-O-methylpyridoxine (MPN) in the serum of patients with ginkgo seed poisoning
CN114047267B (zh) 一种衍生化-气相色谱-质谱方法分析烟草根系中烟酸的方法
CN111257447A (zh) 一种分析食品总糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值的方法
CN112557534B (zh) 一种空气环境内分泌干扰物检测方法
CN114019055A (zh) 评价细菌氨基糖苷类抗生素耐药效应的试剂盒及其应用
CN114577925B (zh) 一种水样中粪甾醇类物质快速检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant