CN110320303A - 一种基于uplc-ms的土壤渗滤系统代谢组学分析方法 - Google Patents

一种基于uplc-ms的土壤渗滤系统代谢组学分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公布了一种基于UPLC‑MS的土壤渗滤系统代谢组学分析方法。包括以下工艺步骤：1)样品制备：采集土壤样本，经预处理后采用液相色谱‑电喷雾飞行时间质谱联用系统进行UPLC‑MS检测分析；2)通过UPLC‑MS检测技术获得样本数据，并对样本数据进行提取、滤噪、去卷积、对齐与归一化；3)对归一化处理之后的数据进行多元统计分析；4)差异性代谢产物筛选及鉴定分析；5)微生物代谢路径分析；6)代谢产物与环境因子的冗余(RDA)分析。本发明的分析方法简单易行，可以全面、综合地体现土壤微生物代谢产物的差异情况，模型设计合理可靠，为研究土壤系统微生物代谢组学提供一种快速、高效、精准的分析方法。

Description

一种基于UPLC-MS的土壤渗滤系统代谢组学分析方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及土壤渗滤系统微生物代谢的研究，提供一种微生物代谢机理研究的方法。
背景技术
土壤渗滤系统(soil infiltration system，SIS)是一种投资少、能耗低、运行成本低的污水生态处理技术。SIS中含有大量种类繁多的微生物，微生物作用是SIS除污的重要途径，微生物的代谢过程和产物特征是定性描述污染物脱除过程的重要依据。
微生物代谢组学是指在微生物细胞生长或生长循环某一特定时间点，以无偏、可重现的方式同时定性和定量分析细胞内、外存在的全部低分子量代谢产物，在寻找生物标志物、分析代谢途径等研究方面具有明显优势。不同于基因组学和蛋白组学反映生物体内的差异，代谢组学的研究领域也扩展到代谢产物与环境之间的相互影响和作用。
代谢组学分析方法主要包括：核磁共振波普(NMR)、质谱(MS)、色谱(GC或LC)、毛细管电泳、电化学检测等。目前，液相色谱-质谱、气相色谱-质谱分析范围较广泛，已成为代谢组学研究中重要的分析工具。UPLC－MS(超高效液相色谱-质谱联用)技术集液相色谱高效分离能力和质谱高灵敏性于一体，大大提高了色谱对复杂样品的高分离能力，具有分离度好，分析速度快，检测灵敏度高，应用范围广，前处理方法简单，无需样品衍生化处理等优点，液质联用在环境领域得到了广泛的应用。
然而目前，关于SIS中微生物生态特征的研究仍停留在传统的微生物分析方法，利用传统的分子生物学手段研究SIS时，当系统受到扰动时，其出水水质和生物菌群并不能马上做出调整。这种简单传统的微生物分析方法并不能准确反映SIS的完整生物学信息，据此直观的判定SIS是否健康可靠性不强。
发明内容
本发明的目的是设计一种合理可靠的模型，可以全面、综合地体现土壤微生物代谢产物的差异情况，为研究土壤系统微生物代谢组学提供一种快速、高效、精准的分析方法。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案为：
一种基于UPLC-MS的土壤渗滤系统代谢组学分析方法，包括以下步骤：
步骤1：样品制备：采集土壤样本，经预处理后采用液相色谱-电喷雾飞行时间质谱联用系统进行UPLC-MS检测分析；
步骤2：将预处理后的土壤样本利用UPLC-MS检测技术获得所述土壤样本的三维结构数据，并对所述三维结构数据进行提取、滤噪、去卷积、对齐与归一化，并将归一化处理之后的所有样本的三维结构数据进行平均中心化预处理，然后将平均中心化预处理后的三维结构数据通过Data Analysis软件转化为二维数据矩阵，所述的二维数据矩阵包括保留时间、峰面积、峰强度、信噪比、质荷比；
步骤3：对通过Data Analysis软件转化后的二维数据矩阵进行多元统计分析，所述的多元统计分析是指将所述的二维数据导入Simca-P软件分别进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)；
步骤4：差异性代谢产物筛选及鉴定分析，所述的差异性代谢产物筛选是指将经过主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)之后的二维数据按照PLS-DA中VIP值及t检验的p值进行筛选，筛选之后的二维数据所代表的化合物成为差异性代谢产物；
步骤5：微生物代谢路径分析，所述微生物代谢路径分析是指将所述鉴定化合物提交给KEGG途径数据库，通过对鉴定化合物名称的搜索得到相对应的编码，通过编码即可找到对应的代谢路径；
步骤6：代谢产物与环境因子的冗余(RDA)分析。
所述的步骤1中预处理方法为：
1)取被液氮灭活的土壤样本，分别用体积为5-10ml的纯甲醇提取液提取3次；
2)合并上述提取的3次提取液，真空旋干；
3)再用体积为1-2ml纯甲醇复溶一次；
4)将复溶后的样本溶液进行离心处理，离心速度设置为13000rpm，设置离心时间为5-10min；
5)离心处理之后，吸取上清，装入进样小瓶。
所述的步骤1中采用液相色谱-电喷雾飞行时间质谱联用系统进行UPLC-MS检测分析的系统参数设置如下：
1)色谱分离条件的参数设置：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18，反相柱的柱子填料的粒径为3.5um，反相柱的柱子长度为100mm，反相柱的柱子内径为2.1mm，流动相的参数设置为：流动相A为含0.1％甲酸的水，流动相B为乙腈，样品的流速设置为0.2-0.4mL/min，洗脱方式为梯度洗脱，样品的进样量设置为3-8μL，样品的柱温设置为25-30℃；
2)质谱条件的参数设置：质谱扫描采用的离子源为电喷雾(ESI)离子源，扫描模式设置为正离子扫描模式，毛细管电压为4.0-4.5KV，干燥气温度为150-200℃，干燥气流量为4-8L/min，辅助气压力为2.0Bar，采用甲酸钠标准溶液进行离线内标校正，质荷比采集范围为50～1800m/z。
所述的步骤2中提取、滤噪、去卷积、对齐与归一化处理具体步骤如下：
1)提取：对采用液相色谱-电喷雾飞行时间质谱联用系统进行UPLC-MS检测分析得到的色谱峰进行提取，提取时具体参数设置为：Peak Parameter为5个最少数据采集点，峰形参数Slope设定值为200，Sensitivity基线噪音值为20，Smoothing峰形平滑为2；
2)滤噪：将提取的色谱峰采用配滤噪技术进行色谱峰识别处理，噪比S/N设置为10；
3)去卷积、对齐：在Data Analysis软件中去卷积、对齐处理的具体参数设置为：(1)调整Data Analysis软件中Mass Spectra参数对选定蛋白或核酸的图谱进行去卷积计算；(2)Charge Deconvolution方法参数<Parameter>为：1)Maximum Charge:设置为15，将以带15个电荷的峰为基准，寻找带多电荷的系列峰，2)Min,peaks in comp.：在同一系列中，至少要有5个带多电荷的峰，3)Max number of comp.：对同一张多电荷系列峰图谱去卷积后，最多计算10个组分；(3)Charge State Ruler：选定图谱中某一系列的峰，快捷地通过一个多电荷峰，得到相应的分子量Mr，并为手动去卷积做准备；(4)Deconvolute withCharge State Ruler：根据Charge State Ruler所选定的峰质量列表，手动去卷积获得相应的分子质量Mr或M+1。设定好上述参数之后，通过Data Analysis软件中调整Recalibrate的参数对识别处理后的色谱峰进行保留时间校正和峰对齐处理；
4)归一化：将经过去卷积与对齐处理之后的每个样本的总积分面积归一化到1000。
所述的步骤4中差异性代谢产物鉴定分析是指将所述的差异性代谢产物与METLIN在线数据库(http://metlin.scripps.edu/)进行匹配，比较质谱的质荷比(m/z)以及精确分子质量(mass)，并与Pubchem数据库对比差异性代谢产物自身的性质，从而对筛选的差异性代谢产物进行鉴定分析，鉴定分析以后的差异性代谢产物称为鉴定化合物。
所述的步骤6中代谢产物与环境因子的冗余(RDA)分析是指将外部环境因子(NO3 -、ORP、NH4 +、COD、NO2 -)引入，分析环境因子以及差异性代谢产物之间的关系。
本发明的有益效果是：
本发明将微生物代谢组学方法引入土壤渗滤系统，形成了响应不同的土壤剖面的小分子代谢产物清单，建立了定量描述系统健康度的技术方法，其分析方法简单易行，可以全面、综合地体现土壤微生物代谢产物的差异情况，模型设计合理可靠，为土壤系统微生物代谢组学的研究提供了一种高效、严谨的技术方案。
附图说明
图1为本实施例中的基于UPLC-MS的土壤渗滤系统代谢组学分析方法流程图。
图2为本实施例中的三组样本的PCA得分图(ESI﹢)，其中ESI﹢表示进行UPLC-MS检测分析时采用的离子源为电喷雾(ESI)离子源，扫描模式设置为正离子扫描模式。
图3为本实施例中的三组样本的PLS-DA得分图(ESI﹢)，其中ESI﹢表示进行UPLC-MS检测分析时采用的离子源为电喷雾(ESI)离子源，扫描模式设置为正离子扫描模式。
图4为本实施例获得的已定性的部分代谢产物通路图。
图5为本实施例获得的代谢产物与环境因子的冗余(RDA)分析图。
具体实施方式
下面是结合附图对本发明的技术方案进行详细说明。
如图1基于UPLC-MS的土壤渗滤系统代谢组学分析方法流程图所示，一种基于UPLC-MS的土壤渗滤系统代谢组学分析方法的具体步骤如下：
步骤1：样品制备：采集土壤样本，经预处理后采用液相色谱-电喷雾飞行时间质谱联用系统进行UPLC-MS检测分析，本实施例中共采集土壤渗滤系统(SIS)中72个土壤样本，平均分为3组，分别为组A(有机负荷为250mg·L-1)、组B(有机负荷为400mg·L-1)、组C(有机负荷为500mg·L-1)，然后对上述采集的A、B、C三组样本进行预处理，预处理时用的试剂有：甲醇、甲酸均为购自德国Merck公司色谱级试剂，实验用水为超纯水，其具体步骤如下：
1)土壤样本先经过液氮灭活处理，液氮灭活处理时液氮的温度设置为-197℃，然后分别用体积为10ml的纯甲醇提取液提取3次；
2)合并上述提取的3次提取液，真空旋干；
3)再用体积为1ml纯甲醇复溶一次；
4)将复溶后的样本溶液进行离心处理，离心速度设置为13000rpm，设置离心时间为10min；
5)离心处理之后，吸取上清，装入1.5ml进样小瓶，待UPLC-MS检测分析用。
经预处理之后的样本进行UPLC-MS检测分析时用到的仪器分析平台为液相色谱-电喷雾飞行时间质谱联用系统，该系统中的色谱试验采用的是美国的Agilent快速夜相色谱，其系列为1200，质谱试验采用的是美国的BrukerDaltonicsInc MicrOTOF-Q II型电喷雾-四级杆-飞行时间质谱，试验时该系统的参数设置如下：
1)色谱分离条件的参数设置：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18，反相柱的柱子填料的粒径为3.5um，反相柱的柱子长度为100mm，反相柱的柱子内径为2.1mm，流动相的参数设置为：流动相A为含0.1％甲酸的水，流动相B为乙腈，样品的流速为0.2mL/min，洗脱方式为梯度洗脱，样品的进样量为5μL，样品的柱温为30℃。其中梯度洗脱的参数设置如表1所示。
2)质谱条件的参数设置：质谱扫描采用的离子源为电喷雾(ESI)离子源，扫描模式设置为正离子扫描模式，毛细管电压为4.5KV，干燥气温度为180℃，干燥气流量为6L/min，辅助气压力为2.0Bar，采用甲酸钠标准溶液进行离线内标校正，质荷比采集范围为50～1800m/z。
表1梯度洗脱参数设置表
步骤2：将预处理后的土壤样本利用UPLC-MS检测技术获得土壤样本的三维结构数据，并对三维结构数据进行提取、滤噪、去卷积、对齐与归一化，并将归一化处理之后的所有样本的三维结构数据进行平均中心化预处理，然后将平均中心化预处理后的三维结构数据通过Data Analysis软件转化为包括保留时间、峰面积、峰强度、信噪比、质荷比的二维数据矩阵，其中提取、滤噪、去卷积、对齐与归一化处理具体步骤如下：
1)提取：对采用液相色谱-电喷雾飞行时间质谱联用系统进行UPLC-MS检测分析得到的色谱峰进行提取，提取时具体参数设置为：Peak Parameter为5个最少数据采集点，峰形参数Slope设定值为200，Sensitivity基线噪音值为20，Smoothing峰形平滑为2；
2)滤噪：将提取的色谱峰采用配滤噪技术进行色谱峰识别处理，噪比S/N设置为10；
3)去卷积、对齐：在Data Analysis软件中去卷积、对齐处理的具体参数设置为：(1)调整Data Analysis软件中Mass Spectra参数对选定蛋白或核酸的图谱进行去卷积计算；(2)Charge Deconvolution方法参数<Parameter>为：1)Maximum Charge:设置为15，将以带15个电荷的峰为基准，寻找带多电荷的系列峰，2)Min,peaks in comp.：在同一系列中，至少要有5个带多电荷的峰，3)Max number of comp.：对同一张多电荷系列峰图谱去卷积后，最多计算10个组分；(3)Charge State Ruler：选定图谱中某一系列的峰，快捷地通过一个多电荷峰，得到相应的分子量Mr，并为手动去卷积做准备；(4)Deconvolute withCharge State Ruler：根据Charge State Ruler所选定的峰质量列表，手动去卷积获得相应的分子质量Mr或M+1。设定好上述参数之后，通过Data Analysis软件中调整Recalibrate的参数对识别处理后的色谱峰进行保留时间校正和峰对齐处理；
4)归一化：将经过去卷积与对齐处理之后的每个样本的总积分面积归一化到1000。
步骤3：对通过Data Analysis软件转化后的二维数据矩阵进行多元统计分析，即将所得到的二维数据导入Simca-P软件分别进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)。
主成分分析(PCA)：通过分析不同样品的组成可以反映样品间的差异和距离，PCA运用方差分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，坐标轴为能够最大程度反映方差的两个特征值。对所有样本进行PCA分析，累计总解释率(R2X)为0.462，说明当前建立的模型可靠，可以可视化观察A、B、C三组样本之间的代谢差异。PCA得分图如图2本实施例提供的三组样本的PCA得分图(ESI﹢)所示，其中ESI﹢表示进行UPLC-MS检测分析时采用的离子源为电喷雾(ESI)离子源，扫描模式设置为正离子扫描模式，从图2中可以看出，该模型下PCA得分图中大部分样本都在95％的置信区间，A、B、C三组样本之间代谢产物是存在差异的。
最小二乘判别分析(PLS-DA)：从PCA模型看出，三组土壤渗滤系统模拟柱微生物代谢产物之间虽存在差异，但不明显，模型只解释了45％的原始数据，需要采用更加适合的模型来表征代谢指纹。最小二乘法判别分析(PLS-DA)是以偏最小二乘法回归模型为基础，作为一种有监督的模式识别的方法，根据给定的样本分组信息，对群落结构进行判别分析。PLS-DA在PCA分析的基础上，使得组分之间的区分效果更明显，具有导向性。因此建立了PLS-DA模型，PLS-DA得分图如图3本实施例提供的三组样本的PLS-DA得分图(ESI﹢)所示，其中横坐标t[1]表示主成分，纵坐标t[2]表示正交成分。该模型质量参数为R2X(1)＝0.52，R2X(2)＝0.276，这说明模型的质量较好，从图3中可以看出A、B、C三组样本在分值图的第一主成分轴上(t[1])具有显著的分离效果。
从PCA图中可以看到样本的原始状态，而PLS-DA看到的是样本的分组效果，通过PLS-DA模型图找到造成组间差异的物质，为此，采用PLS-DA方法来区分A、B、C三组的模拟柱微生物代谢产物差异，筛选出潜在标志物。
步骤4：差异性代谢产物筛选及鉴定分析，其中差异性代谢产物筛选是指将经过主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)之后的二维数据按照PLS-DA中VIP值及t检验的p值进行筛选，筛选之后的二维数据所代表的化合物称为差异性代谢产物，然后需要对筛选之后的差异性代谢产物进行鉴定分析，即将差异性代谢产物与METLIN在线数据库(http://metlin.scripps.edu/)进行匹配，通过比较质谱的质荷比(m/z)以及精确分子质量(mass)，并与Pubchem数据库对比差异性代谢产物自身的性质，完成代谢产物的定性分析，其中经定性分析后差异性代谢产物数据如表2所示，从表2中可以看出SIS中微生物代谢产物主要为以酮、醇、酯类、糖苷、脂肪酸、氨基酸、色素、二萜类物质及某些多聚物为主。
差异性代谢产物筛选的原则包括：(1)当PLS-DA模型第一主成分的变量投影重要值(VIP)值大于1时，选取VIP＝1.5作为筛选的临界值来挑选具有代表性的差异性代谢产物；(2)当单维统计即t检验的P值小于0.05时，通过模拟柱不同有机负荷的PLS-DA模型分析。根据上述筛选原则，通过A、B、C三组样本的PLS-DA模型计算的VIP值可以得出：VIP值大于1的有500多个化合物，VIP大于1.5的化合物有230个，VIP值从0-2之间波动，VIP值大于2的潜在标志物约为8.4％，1.5<VIP<2的潜在标志物约为37.6％。
步骤5：差异性代谢产物代谢路径分析，即将得到的鉴定化合物提交给KEGG途径数据库，通过对鉴定化合物名称的搜索得到相对应的编码，通过编码即可找到对应的代谢路径。代谢路径图可以直观的展示产物代谢过程中的相互作用，可以表现受体结合的活动，蛋白质复合物，磷酸化反应，酶的活化等，将代谢路径与生物学注释连接在一起，使得产物的代谢路径更加清晰。
选取经定性后的部分差异性代谢产物进行代谢路径研究，本实施例中选取的研究对象为有机负荷波动下SIS生物代谢产物定性分析表中25号，通过代谢路径图分析其代谢路径如图4本实施例获得的已定性的部分代谢产物通路图所示，从图4中可以看出泛醌(UQ)和质体醌(PQ)分别是氧化磷酸化和光合作用中的电子载体，泛醌的醌核来自莽草酸途径；4-羟基苯甲酸酯直接由细菌中的分支酸形成，而酵母中可以由分支酸或酪氨酸形成。以下萜类化合物部分的生物合成涉及异戊烯化，脱羧和三个羟基化与三个甲基化交替的反应。这些反应的顺序在细菌和酵母之间有些不同。
步骤6：代谢产物与环境因子的冗余(RDA)分析，所述的冗余分析(redundancyanalysis,RDA)是基于对应分析发展而来的一种排序方法，属于线性模型。将外部环境因子(NO3 -、ORP、NH4 +、COD、NO2 -)引入，分析环境因子以及差异性代谢产物之间的关系，RDA分析使得样本之间的距离最大程度地反映出平面散点图内样本之间的关系，直观的看出样本分布和环境因子间的关系。
如表3代谢产物与环境因子的冗余(RDA)分析表所示，RDA分析结果中排序轴对差异性代谢产物的解释度逐渐减小，代谢产物与环境因子之间的相关系数都较高，横轴和纵轴的解释率共解释了总方差的97.16％，表明此排序结果能较好的反映差异性代谢产物与环境因子之间的关系，其中代谢产物与环境因子的RDA分析图如图5本实施例获得的代谢产物与环境因子的冗余(RDA)分析图所示，从图5可以看出：从代谢产物与环境因子之间的夹角可以看出，环境因子NO3 -、NH4 +、COD、NO2 -与大部分代谢产物呈显著正相关关系，ORP与大部分代谢产物呈负相关关系。从环境因子之间的夹角可以看出，NH4 +、COD、NO2 -两两之间呈正相关；ORP与NH4 +、COD都呈负相关关系。环境因子射线的长度表明：NH4 +、COD、NO2 -对代谢产物影响较大。
表2已定性差异性代谢产物数据表
表3代谢产物与环境因子的冗余(RDA)分析表

Claims (6)

1.一种基于UPLC-MS的土壤渗滤系统代谢组学分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：样品制备：采集土壤样本，经预处理后采用液相色谱-电喷雾飞行时间质谱联用系统进行UPLC-MS检测分析；
步骤2：将预处理后的土壤样本利用UPLC-MS检测技术获得所述土壤样本的三维结构数据，并对所述三维结构数据进行提取、滤噪、去卷积、对齐与归一化，并将归一化处理之后的所有样本的三维结构数据进行平均中心化预处理，然后将平均中心化预处理后的三维结构数据通过Data Analysis软件转化为二维数据矩阵，所述的二维数据矩阵包括保留时间、峰面积、峰强度、信噪比、质荷比；
步骤3：对通过Data Analysis软件转化后的二维数据矩阵进行多元统计分析，所述的多元统计分析是指将所述的二维数据导入Simca-P软件分别进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)；
步骤4：差异性代谢产物筛选及鉴定分析，所述的差异性代谢产物筛选是指将经过主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)之后的二维数据按照PLS-DA中VIP值及t检验的p值进行筛选，筛选之后的二维数据所代表的化合物称为差异性代谢产物；
步骤5：微生物代谢路径分析，所述微生物代谢路径分析是指将鉴定化合物提交给KEGG途径数据库，通过对鉴定化合物名称的搜索得到相对应的编码，通过编码即可找到对应的代谢路径；
步骤6：代谢产物与环境因子的冗余(RDA)分析。
2.根据权利要求1所述的一种基于UPLC-MS的土壤渗滤系统代谢组学分析方法，其特征在于，所述的步骤1中预处理方法为：
1)取被液氮灭活的土壤样本，分别用体积为5-10ml的纯甲醇提取液提取3次；
2)合并上述提取的3次提取液，真空旋干；
3)再用体积为1-2ml纯甲醇复溶一次；
4)将复溶后的样本溶液进行离心处理，离心速度设置为13000rpm，设置离心时间为5-10min；
5)离心处理之后，吸取上清，装入进样小瓶。
3.根据权利要求1所述的一种基于UPLC-MS的土壤渗滤系统代谢组学分析方法，其特征在于，所述的步骤1中采用液相色谱-电喷雾飞行时间质谱联用系统进行UPLC-MS检测分析的系统参数设置如下：
1)色谱分离条件的参数设置：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18，反相柱的柱子填料的粒径为3.5um，反相柱的柱子长度为100mm，反相柱的柱子内径为2.1mm，流动相的参数设置为：流动相A为含0.1％甲酸的水，流动相B为乙腈，样品的流速设置为0.2-0.4mL/min，洗脱方式为梯度洗脱，样品的进样量设置为3-8μL，样品的柱温设置为25-30℃；
2)质谱条件的参数设置：质谱扫描采用的离子源为电喷雾(ESI)离子源，扫描模式设置为正离子扫描模式，毛细管电压为4.0-4.5KV，干燥气温度为150-200℃，干燥气流量为4-8L/min，辅助气压力为2.0Bar，采用甲酸钠标准溶液进行离线内标校正，质荷比采集范围为50～1800m/z。
4.根据权利要求1所述的一种基于UPLC-MS的土壤渗滤系统代谢组学分析方法，其特征在于，所述的步骤2中提取、滤噪、去卷积、对齐与归一化处理具体步骤如下：
1)提取：对采用液相色谱-电喷雾飞行时间质谱联用系统进行UPLC-MS检测分析得到的色谱峰进行提取，提取时的信噪比设置为10；
2)滤噪：将提取的色谱峰采用配滤噪技术进行色谱峰识别处理；
3)去卷积、对齐：通过Data Analysis软件中调整Recalibrate的参数对识别处理后的色谱峰进行保留时间校正和峰对齐处理；
4)归一化：将经过去卷积与对齐处理之后的每个样本的总积分面积归一化到1000。
5.根据权利要求1所述的一种基于UPLC-MS的土壤渗滤系统代谢组学分析方法，其特征在于，所述的步骤4中差异性代谢产物鉴定分析是指将所述的差异性代谢产物与METLIN在线数据库(http://metlin.scripps.edu/)进行匹配，比较质谱的质荷比(m/z)以及精确分子质量(mass)，并与Pubchem数据库对比差异性代谢产物自身的性质，从而对筛选的差异性代谢产物进行鉴定分析，鉴定分析以后的差异性代谢产物称为鉴定化合物。
6.根据权利要求1所述的一种基于UPLC-MS的土壤渗滤系统代谢组学分析方法，其特征在于，所述的步骤6中代谢产物与环境因子的冗余(RDA)分析是指将外部环境因子(NO3 -、ORP、NH4 +、COD、NO2 -)引入，分析环境因子以及差异性代谢产物之间的关系。
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