CN109390036B - 一种挖掘甄选微藻油脂合成代谢标志物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种挖掘甄选微藻油脂合成代谢标志物的方法。本发明以氮缺乏诱导条件下的淡水小球藻、海水微拟球藻、极地胶球藻三种近缘极差藻株为受试对象，基于细胞组学、代谢组学及生物信息学手段挖掘甄选三种近缘极差藻株细胞油脂合成积累同种代谢标志物，利用不用藻株以及不同组学间的互补分析，可有效避免仅以单一藻株和单一分析手段造成的结果片面性，从而大大增加微藻油脂合成积累关键代谢标志物的甄选鉴定率及相应精确度，为进一步提高微藻油脂产率及揭示微藻油脂合成代谢共性机制问题提供理论依据。

Description

一种挖掘甄选微藻油脂合成代谢标志物的方法

技术领域

本发明属于生物分析化学领域，具体涉及一种挖掘甄选微藻油脂合成代谢标志物的方法。

背景技术

近年来，能源匮乏与环境污染问题日益突出，在一定程度上限制了全球经济发展，开发环境友好的可再生能源迫在眉睫。微藻因其光合效率高、生长速率快、不占用耕地、油脂含量高、环境适应能力强等优势，被认为是开发生物柴油最具潜力的原料之一。然而，诸多能源微藻单位体积藻细胞密度与油脂含量呈负相关性，导致藻细胞本身产油效率并不理想，微藻生物柴油面临规模与成本双重瓶颈。如何提高微藻油脂产率是实现微藻生物柴油低成本产业化的关键技术之一。

通过改变微藻生长环境诱导细胞积累油脂是微藻能源领域的热点方向。国内外研究者对极端环境下藻细胞油脂积累特性开展了大量研究，证实低温、高光、营养限制、高盐、重金属离子等极端环境条件均可刺激诱导藻细胞积累油脂，有些藻种属油脂含量甚至高达80％以上，暗示此类非生物逆境在油脂积累过程中起正调控作用。其中，氮饥饿模式因其易控性和多藻适用性，受到研究者的广泛关注。然而，非生物逆境诱导利于胞内油脂含量提高的同时也限制细胞生长，影响整体油脂产率。因此，一些研究者提出以“分段培养模式”来增强细胞脂质生产力。如四川大学曹毅教授等以“多因素分段优化”二步法策略使得绿球藻细胞甘油三酯产率提高至51.58mg/L/d；华东理工大学李元广教授等发展了“异养–稀释–光诱导”多段串联培养模型，促使小球藻油脂产率增至89.89mg/L/d。尽管极端环境条件耦合的分段培养模式可整体上优化藻细胞油脂产率，但与微藻细胞油脂产率最大理论值相比，尚存在较大差距。其主要原因在于对微藻油脂合成积累的内在调控机制认知不足，无法根本有效地提高藻细胞油脂产率。

随着生物技术(如基因组学、转录组学、蛋白组学等)在微藻研究领域的不断渗透，一些与油脂合成积累相关的关键调控酶基因获得相关阐述，为理解油脂代谢调控机制提供了理论基础，但当前获得的微藻油脂积累路径关键调控酶基因并不能精确地阐释油脂合成调控机制。而代谢组学技术处于基因调控和蛋白质作用下游，提供的是生物学的终端信息，直接揭示(核酸、蛋白质等)大分子的功能性变化，因而能更准确地反映微藻的生理生化状态。Renberg等运用代谢组学发现在二氧化碳浓度限制条件下莱茵衣藻胞内丝氨酸、谷氨酸等代谢物显著下调，而脯氨酸、甘氨酸、络氨酸、苏氨酸等代谢物显著上调，证实氨基酸代谢物是莱茵衣藻油脂合成积累的关键代谢标志物；杨等研究了营养胁迫条件下的微藻油脂合成有关的代谢物，并证实下调α-亚麻酸、乙酸、丙酸以及上调甘油、二十碳五烯酸、磷酸等代谢能显著提高藻细胞油脂积累；Popko等运用代谢组学手段分析氮饥饿条件下与三角褐指藻甘油三酯形成有关的代谢物发现，来源于TCA循环的代谢物景天庚酮糖的显著性上调有效地刺激了甘油三酯的合成；Mariusz等通过对氮饥饿条件下海洋硅藻的代谢物分析发现，在鉴定的代谢物中，蛋氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸、络氨酸等的显著性下调和二甲基磺基内酯的显著性上调共同促进了油脂的合成积累。通过这些研究结果总结可以发现，当前甄选出的与油脂合成积累相关的代谢物因藻种属差异而不具普适性，这一不足将导致开发高产油脂工程微藻缺乏一定的理论指导。

挖掘甄选不同藻株细胞中油脂合成积累同种或关键代谢标志物，不仅利于揭示微藻细胞脂质合成积累共性机制问题，且可从根本上增强藻细胞产油效率。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种挖掘甄选微藻油脂合成代谢标志物的方法，以氮缺乏诱导条件下的淡水小球藻、海水微拟球藻、极地胶球藻三种近缘极差藻株为受试对象，基于细胞组学、代谢组学及生物信息学手段挖掘甄选三种近缘极差藻株细胞油脂合成积累同种代谢标志物，利用不用藻株以及不同组学间的互补分析，有效避免仅以单一藻株和单一分析手段造成的结果片面性，从而大大增加微藻油脂合成积累关键代谢标志物的甄选鉴定率及相应精确度，为进一步提高微藻油脂产率及揭示微藻油脂合成代谢共性机制问题提供理论依据。

本发明的技术方案为：

一种挖掘甄选微藻油脂合成代谢标志物的方法，包括如下步骤：

(1)以氮缺乏条件诱导培养淡水藻、海水藻、极地藻三种近缘极差藻株细胞，用细胞组学手段定性定量三种藻株细胞积累油脂；

(2)用非靶向比较代谢组学分析三种积脂藻株细胞的代谢物；

(3)用生物信息学方法挖掘甄选三种藻株细胞油脂合成积累共有代谢标志物。

进一步地，所述淡水藻为基因组序列已知的淡水生长微藻株；所述海水藻为基因组序列已知的海水生长微藻株；所述极地藻为基因组序列已知的极地生长微藻株。

进一步地，所述的以氮缺乏条件诱导培养淡水藻、海水藻、极地藻三种近缘极差藻株细胞，用细胞组学手段定性定量三种藻株细胞积累油脂具体为：经灭菌、冷却后，向均以硝酸钠氮素为氮源的Basal基础培养基、人工模拟的海水基础培养基、改进Basal基础培养基中，按培养基体积的1-5％分别接入淡水藻、海水藻、极地藻细胞种子液，在25-28℃条件下培养5-10天，离心收集藻细胞，并分别将藻细胞泥转入新鲜的无氮Basal基础培养基、无氮人工模拟的海水基础培养基以及无氮改进Basal基础培养基中继续培养2-72小时，同步收集2～72小时氮缺乏条件诱导培养的三种藻株细胞液，离心弃上清，以磷酸盐缓冲溶液洗涤藻细胞2～3次，将洗涤藻细胞在黑暗条件下采用多聚甲醛固定、尼罗红染色后，置于激光共聚焦显微镜下扫描，设置扫描信号采集为560-615nm，选取藻细胞内信号最强的断层拍照，用软件LASAF Lite进行定量计算其平均荧光强度，获得藻细胞总脂含量；同步应用流式细胞仪对尼罗红染色藻细胞进行分析，激发光为汞灯488nm二极管激光，采集FL1通道530nm和FL2通道575nm荧光信号，每次10⁴个细胞，定量分析计算FL1和FL2通道荧光信号强度，获得藻细胞中性脂含量；同步取尼罗红染色藻细胞加入96孔荧光板中，立即放入全波长多功能酶标仪内测定荧光强度，设置激发波长为488nm，检测540nm中性脂荧光强度，以及590nm极性脂荧光强，获得藻细胞中性脂和极性脂含量。

进一步地，氮缺乏条件诱导培养的三种藻株细胞，即实验组，均以前后均含氮素的培养基得到的藻细胞为对照组，具体为：经灭菌、冷却后，分别向均以硝酸钠氮素为氮源的Basal基础培养基、人工模拟的海水基础培养基、改进Basal基础培养基中，按培养基体积的1-5％分别接入淡水藻、海水藻、极地藻细胞种子液，在25-28℃条件下培养5-10天，离心收集藻细胞，并分别将藻细胞泥转入新鲜的Basal基础培养基、人工模拟的海水基础培养基以及改进Basal基础培养基中继续培养2-72小时，同步收集经2～72小时培养的三种藻株细胞液，离心弃上清，以磷酸盐缓冲溶液洗涤藻细胞2～3次，将洗涤藻细胞在黑暗条件下采用多聚甲醛固定、尼罗红染色后，置于激光共聚焦显微镜下扫描，设置扫描信号采集为560-615nm，选取藻细胞内信号最强的断层拍照，用软件LAS AF Lite进行定量计算其平均荧光强度，获得对照组藻细胞总脂含量；同步应用流式细胞仪对尼罗红染色藻细胞进行分析，激发光为汞灯488nm二极管激光，采集FL1通道530nm和FL2通道575nm荧光信号，每次10⁴个细胞，定量分析计算FL1和FL2通道荧光信号强度，获得对照组藻细胞中性脂含量；同步取尼罗红染色藻细胞加入96孔荧光板中，立即放入全波长多功能酶标仪内测定荧光强度，设置激发波长为488nm，检测540nm中性脂荧光强度，以及590nm极性脂荧光强，获得对照组藻细胞中性脂和极性脂含量。

进一步地，所述的Basal基础培养基具体为：按质量份数计，Glucose 10份、NaNO₃1.5份、KH₂PO₄ 1.25份、MgSO₄·7H₂O 1份、CaCl₂ 0.0835份、H₃BO₃ 0.1142份、FeSO₄·7H₂O0.0498份、ZnSO₄·7H₂O 0.0882份、MnCl₂·4H₂O 0.0144份、MoO₃ 0.0071份、CuSO₄·5H₂O0.0157份、Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0049份、Na₂EDTA 0.5份、蒸馏水1000份，培养基pH 6.1，115℃灭菌20min，无氮Basal基础培养基中NaNO₃ 0份，其余组分同Basal基础培养基；所述的人工模拟的海水基础培养基具体为：Glucose 8份、NaCl 30份、MgSO₄·7H₂O 2.44份、KCl 0.6份、NaNO₃ 1份、CaCl₂·2H₂O 0.3份、KH₂PO₄ 0.05份、Tricine 1份、NH₄Cl 0.027份、Na₂EDTA·2H₂O 0.00075份、FeCl₃·6H₂O 0.000097份、MnCl₂·4H₂O 0.000041份、ZnCl₂ 0.000005份、CoCl₂·6H₂O 0.000002份、Na₂MoO₄·2H₂O 0.000004份、Vitamin B12 0.000135份、Thiamine0.000335份、Biotin 0.000025份、Soilwater 30份、蒸馏水1000份，培养基8.0，115℃灭菌20min，无氮人工模拟的海水基础培养基NaNO₃ 0份，其余组分同人工模拟的海水基础培养基；所述的改进Basal基础培养基具体为：Glucose 10份、NaNO₃ 1.25份、KH₂PO₄ 1.25份、MgSO₄·7H₂O 1份、CaCl₂ 0.111份、H₃BO₃ 0.1142份、FeSO₄·7H₂O 0.0498份、ZnSO₄·7H₂O0.0882份、MnCl₂·4H₂O 0.0142份、MoO₃ 0.0119份、CuSO₄·5H₂O 0.0157份、Co(NO₃)₂·6H₂O0.0049份、Na₂EDTA 0.5份、蒸馏水1000份，培养基pH 6.1，115℃灭菌20min，无氮改进Basal基础培养基NaNO₃ 0份，其余组分同改进Basal基础培养基。

进一步地，所述的用非靶向比较代谢组学分析三种积脂藻株细胞的代谢物，具体为：1)三种藻株对照组和实验组细胞内代谢物的提取、纯化与定量：离心收集培养藻株细胞，再经冻干、碎冰保护超声破碎后，滤膜过滤提取超声上清液；2)液相色谱质谱分析：采用沃特世ACQUITY UPLC超高效液相串联AB Sciex Triple TOF 5600高分辨质谱仪组成的液质联用系统分析超声上清液所含的代谢物；色谱条件为：色谱柱ACQUITY UPLC BEH C8，尺寸为100mm×2.1mm,1.7um和ACQUITY UPLC HSS T3，尺寸为100mm×2.1mm，1.8um，正离子模式流动相为质量分数为0.1％的甲酸水溶液A及质量分数为0.1％的甲酸的乙腈混合液B，负离子模式流动相为6.5mmol/L碳酸氢铵的水溶液A₁及6.5mmol/L碳酸氢铵-95％甲醇水溶液B₁，流速均为0.35-0.4mL/min，正负离子模式进样体积为5～10μL；正离子(BEH C8)梯度洗脱程序为：0～1min，95％A和5％B；1～28min，95％A降至0％A，5％B升至100％B；28.1～30min，0％A升到95％A，100％B降至5％B；负离子(HSS T3)梯度洗脱程序为：0～1min，95％A₁和5％B₁；1～28min，95％A₁降至0％A₁，5％B₁升至100％B₁；28.1～30min，0％A₁升到95％A₁，100％B₁降至5％B₁。质谱条件：三种藻株细胞对照组和实验组代谢物样品质谱信号采集采用正、负离子扫描模式，具体参数为电喷雾离子源ESI，离子源温度550℃，正、负离子模式下雾化气压强均为275.8KPa，毛细管电压2800V，锥孔电压40-60V，电喷雾器温度为340～360℃，干燥气温度500℃，电喷雾器流量为580～620L/h，锥孔气流量为58～62L/h，碰撞池能量10V，质谱数据采集采用全扫描模式，数据采集范围为70～1000m/z；另外，以所有样本的提取液等体积混合制备质控样本QC并进行液质联用分析，以考察整个分析过程的重复性；3)数据分析：对所有藻细胞样本的基峰色谱图(包括信号、峰容量、保留时间等参数)进行可视化检查确保其良好的重现性，利用MSconventer将原始数据转换为mzML格式进行数据预处理，通过XCMS软件(1.50.1)提取峰，至少在任意一组50％的样品中检测到变量被提取出，变量包括质荷比m/z与精确分子量，并对每个样本收集到的峰信号强度即峰面积进行归一化处理，最终形成包含代谢物ID、质荷比m/z、精确分子量、保留时间RT、检测模式Ion mode、样本名称编号和代谢物相对表达量即峰面积归一化结果的三维数据矩阵，将同位素峰、内标峰从矩阵数据中删除；将正负离子数据合并的数据矩阵导入SIMCA软件包(version 14.0)进行模式识别，采用无监督的主成分分析PCA来观察各三种藻株细胞样本之间的总体分布及分析过程的稳定性，采用偏最小二乘方-判别分析PLS-DA来解释和预测各藻株细胞对照组和实验组样本之间的差异，然后采用有监督的正交偏最小二乘法分析OPLS-DA来区分各藻株样品间代谢轮廓的总体差异，找到各藻株细胞对照组和实验组间的差异代谢物；为精确筛选差异性变量，在OPLS-DA分析中，将一般变量权重值VIP大于1同时单维t检验p值<0.05的变量认定为差异变量，并且为防止OPLS-DA模型过度拟合，以七次循环交互验证和200次响应排序检验考察模型的质量。

进一步地，所述的用生物信息学方法挖掘甄选三种藻株细胞油脂合成积累共有代谢标志物，具体为：首先采用多维分析和单维分析相结合方法筛选各藻株对照组和实验组间的差异代谢物，筛选标准以OPLS-DA模型第一主成分变量权重值VIP>1，t检验p值<0.05定义为潜在的差异代谢物，采用代谢组学小分子化合物快速鉴定分析软件系统OSI/SMMS定性差异代谢物，其依据为中国科学院大连化学物理研究所与大连达硕信息技术有限公司建立的标准物质数据库即http://www.chemdatasolution.com、HMDB即http://www.hmdb.ca/和METLIN即https://metlin.scripps.edu/，并进入MBRole数据库确认差异代谢物；基于筛选的三种藻株细胞对照组和实验组间差异代谢物，以代谢物名称、ID等参数比对分析筛选出三种藻株细胞中共有的代谢物，并将获得的共有代谢物进行生物信息分析即KEGG代谢通路分析，登录http://www.genome.jp/KEGG/pathway.html即KEGG数据库，输入所要映射物种的拉丁名称的缩写、所要查询物种拉丁名缩写，将共有差异代谢物ID号匹配到KEGG数据库ID，挖掘共有代谢物在KEGG数据库中的生物学信息，将有收录信息的共有代谢物进行KEGGpathway分析，并导出共有代谢物参与的与油脂合成积累相关的路径图，进而甄选出与微藻油脂合成积累相关的共有代谢标志物。

本发明的有益效果在于：

本发明以氮缺乏诱导条件下的淡水藻、海水藻、极地藻三种近缘极差藻株为受试对象，基于细胞组学、代谢组学及生物信息学手段挖掘甄选三种近缘极差藻株细胞油脂合成积累同种代谢标志物，利用不用藻株以及不同组学间的互补分析，可有效避免仅以单一藻株和单一分析手段造成的结果片面性，从而显著提升微藻油脂合成积累关键代谢标志物的甄选鉴定率及相应精确度，为进一步提高微藻油脂产率及揭示微藻油脂合成代谢共性机制问题提供理论依据。

附图说明

图1为质控样本的总离子流图。

图2为多元统计得分图及响应排序检验图(胶球藻细胞)。

图3为三藻株细胞差异代谢物数量及表达变化。

图4为三藻株细胞挖掘甄选的共有代谢标志物代谢通路图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不仅限于此。

实施例

1.氮缺乏条件诱导培养淡水小球藻、海水微拟球藻、极地胶球藻细胞积累油脂

挑取平面保存的淡水小球藻、海水微拟球藻、极地胶球藻藻种接入30mL如下所述(A-1)、(B-1)、(C-1)培养基中，分别在28℃(小球藻)、25℃(微拟球藻)、27℃(胶球藻)条件下黑暗光照交替(12小时:12小时)培养120小时，获得活化藻种种子液，移取5mL活化种子液接入100mL新鲜的如下所述的(A-1)、(B-1)、(C-1)培养基中，在25～28℃条件下培养(光照周期比为12小时:12小时)5～10天。离心收集培养藻液，并立即转入如下所述的新鲜的无氮Basal基础培养基(A-2)、无氮人工模拟的海水基础培养基(B-2)以及无氮改进Basal基础培养基(C-2)中继续培养2～72小时。

收集2～72小时氮缺乏条件诱导培养的三种藻株细胞液，离心弃上清，以磷酸盐缓冲溶液洗涤藻细胞2～3次，将洗涤藻细胞在黑暗条件下采用多聚甲醛固定、尼罗红染色后，置于激光共聚焦显微镜下，设置扫描信号采集为560-615nm，选取藻细胞内信号最强的断层拍照，用软件LAS AF Lite进行定量计算其平均荧光强度，获得藻细胞总脂含量；同步应用流式细胞仪对尼罗红染色藻细胞进行分析，激发光为汞灯488nm二极管激光，采集FL1通道530nm和FL2通道575nm荧光信号，每次10⁴个细胞，定量分析计算FL1和FL2通道荧光信号强度，获得藻细胞中性脂含量；同步取尼罗红染色藻细胞加入96孔荧光板中，立即放入全波长多功能酶标仪内测定荧光强度，设置激发波长为488nm，检测540nm中性脂荧光强度，以及590nm极性脂荧光强，获得藻细胞中性脂和极性脂含量。

上述氮缺乏条件诱导培养淡水小球藻、海水微拟球藻、极地胶球藻细胞，称为实验组，以如下条件培养的藻细胞作为对照组，具体为：

挑取平面保存的淡水小球藻、海水微拟球藻、极地胶球藻藻种接入30mL如下所述(A-1)、(B-1)、(C-1)培养基中，分别在28℃(小球藻)、25℃(微拟球藻)、27℃(胶球藻)条件下黑暗光照交替(12小时:12小时)培养120小时，获得活化藻种种子液，移取5mL活化种子液接入100mL新鲜的如下所述的(A-1)、(B-1)、(C-1)培养基中，在25～28℃条件下培养(光照周期比为12小时:12小时)5～10天。离心收集培养藻液，并立即转入如下所述的新鲜的Basal基础培养基(A-1)、人工模拟的海水基础培养基(B-1)以及改进Basal基础培养基(C-1)中继续培养2～72小时，培养完毕，离心收集藻细胞备用，其基于细胞组学手段定性定量分析总脂和中性脂含量步骤同实验组细胞。

(A-1)淡水小球藻Basal基础培养基组成(g/L)：

Glucose 10g、NaNO₃ 1.5g、KH₂PO₄ 1.25g、MgSO₄·7H₂O 1g、CaCl₂ 83.5mg、H₃BO₃114.2mg、FeSO₄·7H₂O 49.8mg、ZnSO₄·7H₂O 88.2mg、MnCl₂·4H₂O 14.4mg、MoO₃ 7.1mg、CuSO₄·5H₂O 15.7mg、Co(NO₃)₂·6H₂O 4.9mg、Na₂EDTA 0.5g、蒸馏水1000mL，培养基pH 6.1，115℃灭菌20min。

(A-2)淡水小球藻无氮Basal基础培养基组成(g/L)：

无氮Basal基础培养基中NaNO₃ 0g，其余组分同Basal基础培养基，培养基pH 6.1，115℃灭菌20min。

(B-1)海水微拟球藻人工模拟海水基础培养基组成(g/L)：

Glucose 8g、NaCl 30g、MgSO₄·7H₂O 2.44g、KCl 0.6g、NaNO₃ 1g、CaCl₂·2H₂O0.3g、KH₂PO₄ 50mg、Tricine 1g、NH₄Cl 27mg、Na₂EDTA·2H₂O 0.75mg、FeCl₃·6H₂O0.097mg、MnCl₂·4H₂O 0.041mg、ZnCl₂ 0.005mg、CoCl₂·6H₂O 0.002mg、Na₂MoO₄·2H₂O0.004mg、Vitamin B12 0.135mg、Thiamine 0.335mg、Biotin 0.025mg、Soilwater 30mL、蒸馏水1000mL，培养基pH 8.0，115℃灭菌20min。

(B-2)海水微拟球藻无氮人工模拟海水基础培养基组成(g/L)：

无氮人工模拟的海水基础培养基NaNO₃ 0g，其余组分同人工模拟的海水基础培养基，培养基pH 8.0，115℃灭菌20min。

(C-1)极地胶球藻改进Basal基础培养基组成(g/L)：

Glucose 10g、NaNO₃ 1.25g、KH₂PO₄ 1.25g、MgSO4·7H₂O 1g、CaCl₂ 0.111g、H₃BO₃0.1142g、FeSO₄·7H₂O 49.8mg、ZnSO₄·7H₂O 88.2mg、MnCl₂·4H₂O 14.2mg、MoO₃ 11.9mg、CuSO₄·5H₂O 15.7mg、Co(NO₃)₂·6H₂O 4.9mg、Na₂EDTA0.5g、蒸馏水1000mL，培养基pH 6.1，115℃灭菌20min。

(C-2)极地胶球藻无氮改进Basal基础培养基组成(g/L)：

无氮改进Basal基础培养基NaNO₃ 0g，其余组分同改进Basal基础培养基，培养基pH 6.1，115℃灭菌20min。

2.三种藻株细胞非靶向比较代谢组学分析

三种藻株对照组和实验组细胞内代谢物提取、纯化与定量：分别精密称取第一阶段、两段法培养的三种藻株细胞冻干样本30mg，置于离心管中，依次加入20μL内标(0.3mg/mLL-2-氯苯丙氨酸，甲醇配置)，以预冷的甲醇:水(4:1＝V:V)补充至1mL，并用移液枪加入200μL氯仿吹散藻细胞团，后置于细胞破碎仪中冰浴超声破碎20min(500W，6s开，4s关)，将全部破碎液体转移至离心管中离心15min(13000rpm，4℃)，用注射器吸取200μL离心上清液，以0.22μm有机相针孔过滤器过滤后，转移至进样小瓶进行色谱-质谱分析。质控样本由所有样本提取液等体积混合制得，体积与上样样本相同(备注：所有提取试剂使用前均在-20℃进行预冷)。

藻细胞内提取物的液相色谱-质谱分析：量取经纯化的三种藻株对照组和实验组细胞提取上清液各5μL置于进样小瓶中，采用沃特世ACQUITY UPLC超高效液相串联ABSciex Triple TOF 5600高分辨质谱仪组成的液质联用系统分析胞内提取物。色谱条件为：色谱柱ACQUITY UPLC BEH C8，尺寸为100mm×2.1mm,1.7um和ACQUITY UPLC HSS T3，尺寸为100mm×2.1mm，1.8um，正离子模式流动相为质量分数为0.1％的甲酸水溶液A及质量分数为0.1％的甲酸的乙腈混合液B，负离子模式流动相为6.5mmol/L碳酸氢铵的水溶液A₁及6.5mmol/L碳酸氢铵-95％甲醇水溶液B₁，流速均为0.35mL/min，正负离子模式进样体积为5μL。正离子(BEH C8)梯度洗脱程序为：0～1min，95％A和5％B；1～28min，95％A降至0％A，5％B升至100％B；28.1～30min，0％A升到95％A，100％B降至5％B；负离子(HSS T3)梯度洗脱程序为：0～1min，95％A₁和5％B₁；1～28min，95％A₁降至0％A₁，5％B₁升至100％B₁；28.1～30min，0％A₁升到95％A₁，100％B₁降至5％B₁。质谱条件：三种藻株细胞对照组和实验组代谢物样品质谱信号采集采用正、负离子扫描模式，具体参数为电喷雾离子源ESI，离子源温度550℃，正、负离子模式下雾化气压强均为275.8KPa，毛细管电压2800V，锥孔电压40-60V，电喷雾器温度为340～360℃，干燥气温度500℃，电喷雾器流量为580～620L/h，锥孔气流量为58～62L/h，碰撞池能量10V，质谱数据采集采用全扫描模式，数据采集范围为70～1000m/z；所有分析样本插入一个质控样本进行色谱-质谱分析。代谢组数据分析：1)谱图检查：对所有藻细胞提取物样本(对照组和实验组)的基峰色谱图(包括信号、峰容量、保留时间等参数)进行可视化检查，图1中A(+)和B(―)分别为质控样本正、负离子模式下的总离子流图，其信号强、峰容量大且保留时间重现性好；2)谱图数据预处理：采用MSconventer将三种藻株细胞对照组和实验组原始谱图数据转换为mzML格式，采用XCMS软件(1.50.1)提取峰，至少在任意一组50％的样品中检测到变量(m/z，精确分子量)被提取出，同时将同位素峰、内标峰数据删除，并对每个样本收集到的峰信号强度(峰面积)进行归一化处理获得三种藻株细胞中每种代谢物的相对表达量，最终形成包含代谢物ID、质荷比(m/z)、精确分子量、保留时间(RT)、检测模式(Ion mode)、三种藻株对照组和实验组编号和代谢物相对表达量(峰面积归一化的结果)的三维数据矩阵；3)多元统计分析：将正负离子数据合并的数据矩阵导入SIMCA软件包(version 14.0)，采用无监督的主成分分析(PCA)来观察小球藻、胶球藻、海水微拟球藻细胞对照组和实验组样本之间的总体分布及分析过程的稳定性，采用偏最小二乘方-判别分析(PLS-DA)来解释和预测各藻株细胞对照组和实验组样本之间的差异，然后采用有监督的(正交)偏最小二乘法分析(OPLS-DA)来区分各藻株样品间代谢轮廓的总体差异，找到三藻株细胞对照组和实验组间的差异代谢物。样本多元统计对比分析以极地胶球藻对照组(第一阶段培养胶球藻细胞)与实验组(两段法培养胶球藻细胞)对比为例进行具体说明：将对照组和实验组胶球藻细胞代谢物分别进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘方-判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘方-判别分析(OPLS-DA)，得分如图2(a)-2(c)所示，OPLS-DA模型的200次响应排序检验如图2(d)所示。由图2(a)可知，模型累积解释率R2X、预测率Q2较高，当前PCA模型能较为可靠地用于解释对照组和实验组样本之间的代谢物差异，且PCA得分图中两组样本分离程度显著，反映了两组样本之间的代谢差异较大。由图2(b)可知，胶球藻对照组和实验组样本在PLS-DA得分图上具有显著性差异(谱分离)，模型解释率R2Y和预测率Q2都较高，当前PLS-DA模型能很好地解释和预测两组样本之间的差异。由图2(c)可知，两组样本在OPLS-DA得分图上具有显著的差异(谱分离)，消除了胶球藻细胞对照组和处理不相关的噪音信息，同时获得导致两组样本之间显著差异的更加可靠的代谢物信息。由OPLS-DA模型200次响应排序检验图2(d)可知，将获得随机模型R2和Q2值与原模型的R2Y、Q2Y进行线性回归后，证实此OPLS-DA模型质量较高，无过拟合现象。

3.三种藻株细胞油脂合成积累共有代谢标志物的挖掘甄选首先采用多维分析和单维分析相结合办法筛选三藻株细胞对照组和实验组间差异代谢物，具体筛选标准以多元统计OPLS-DA模型第一主成分变量权重值VIP>1，同时满足t检验p值<0.05标准定义为潜在的差异代谢物，将差异代谢物输入代谢组学小分子化合物快速鉴定分析软件系统(OSI/SMMS)，依据中国科学院大连化学物理研究所与大连达硕信息技术有限公司建立的标准物质数据库(http://www.chemdatasolution.com)以及HMDB(http://www.hmdb.ca/)和METLIN(https://metlin.scripps.edu/)定性差异代谢物。差异代谢物变化倍数为代谢物在三藻株对照组和实验组两组中的平均含量的比值。图3为筛选鉴定的三藻株细胞组间差异代谢物数量及表达变化情况。

基于筛选的三藻株细胞对照组和实验组间差异代谢物，以代谢物名称、ID等参数比对分析筛选出三藻株细胞中共有代谢物，并将获得的共有差异代谢物进行生物信息分析(KEGG代谢通路分析)，登录http://www.genome.jp/KEGG/pathway.html数据库，输入所要映射物种的拉丁名称的缩写、所要查询物种拉丁名缩写，将共有差异代谢物ID号匹配到KEGG数据库ID，挖掘共有代谢物在KEGG数据库中的生物学信息，将有收录信息的共有代谢物进行KEGG pathway分析，依据导出的共有代谢物路径图，进一步甄选出与微藻油脂合成积累直接相关的共有代谢物。表1为三藻株细胞挖掘甄选的与微藻油脂合成代谢相关的共有标志物，图4为三藻株细胞挖掘甄选的共有代谢标志物代谢通路图。

表1三藻株细胞挖掘甄选的与微藻油脂合成代谢相关的共有代谢标志物

Claims (4)

1.一种挖掘甄选微藻油脂合成代谢标志物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以氮缺乏条件诱导培养淡水藻、海水藻、极地藻三种近缘极差藻株细胞，用细胞组学手段定性定量三种藻株细胞积累油脂；

（2）用非靶向比较代谢组学分析三种积脂藻株细胞的代谢物；

（3）用生物信息学方法挖掘甄选三种藻株细胞油脂合成积累共有代谢标志物；

所述的用非靶向比较代谢组学分析三种积脂藻株细胞的代谢物，具体为：1)三种藻株对照组和实验组细胞内代谢物的提取、纯化与定量：离心收集培养藻株细胞，再经冻干、碎冰保护超声破碎后，滤膜过滤提取超声上清液；2)液相色谱质谱分析：采用沃特世ACQUITYUPLC超高效液相串联AB Sciex Triple TOF 5600高分辨质谱仪组成的液质联用系统分析超声上清液所含的代谢物；色谱条件为：色谱柱ACQUITY UPLC BEH C8，尺寸为100 mm×2.1mm, 1.7 um和ACQUITY UPLC HSS T3，尺寸为100 mm×2.1 mm，1.8 um，正离子模式流动相为质量分数为0.1%的甲酸水溶液A及质量分数为0.1%的甲酸的乙腈混合液B，负离子模式流动相为6.5 mmol/L碳酸氢铵的水溶液A₁及6.5 mmol/L碳酸氢铵-95%甲醇水溶液B₁，流速均为0.35-0.4 mL/min，正负离子模式进样体积为5~10 μL，正离子即BEH C8梯度洗脱程序为：0~1 min，95%A和5%B；1~28 min，95% A降至0 %A，5% B升至100%B；28.1~30 min，0%A升到95%A，100%B降至5% B；负离子即HSS T3梯度洗脱程序为：0~1 min，95% A₁和5% B₁；1~28 min，95% A₁降至0 % A₁，5% B₁升至100% B₁；28.1~30 min，0% A₁升到95% A₁，100% B₁降至5% B₁，质谱条件：三种藻株细胞对照组和实验组代谢物样品质谱信号采集采用正、负离子扫描模式，具体参数为电喷雾离子源ESI，离子源温度550℃，正、负离子模式下雾化气压强均为275. 8 KPa，毛细管电压2800V，锥孔电压40-60V，电喷雾器温度为340~360℃，干燥气温度500℃，电喷雾器流量为580~620 L/h，锥孔气流量为58~62 L/h，碰撞池能量10 V，质谱数据采集采用全扫描模式，数据采集范围为70~1000m/z；另外，以所有样本的提取液等体积混合制备质控样本QC并进行液质联用分析，以考察整个分析过程的重复性；3)数据分析：对所有藻细胞样本的基峰色谱图进行可视化检查确保其良好的重现性，利用MSconventer将原始数据转换为mzML格式进行数据预处理，通过XCMS软件提取峰，至少在任意一组50%的样品中检测到变量被提取出，变量包括质荷比m/z与精确分子量，并对每个样本收集到的峰信号强度即峰面积进行归一化处理，最终形成包含代谢物ID、质荷比m/z、精确分子量、保留时间RT、检测模式Ion mode、样本名称编号和代谢物相对表达量即峰面积归一化结果的三维数据矩阵，将同位素峰、内标峰从矩阵数据中删除；将正负离子数据合并的数据矩阵导入SIMCA软件包进行模式识别，采用无监督的主成分分析PCA来观察各三种藻株细胞样本之间的总体分布及分析过程的稳定性，采用偏最小二乘-判别分析PLS-DA来解释和预测各藻株细胞对照组和实验组样本之间的差异，然后采用有监督的正交偏最小二乘-判别分析OPLS-DA来区分各藻株样品间代谢轮廓的总体差异，找到各藻株细胞对照组和实验组间的差异代谢物；为精确筛选差异性变量，在OPLS-DA分析中，将一般变量权重值VIP大于1同时单维t检验p值<0.05的变量认定为差异变量，并且为防止OPLS-DA模型过度拟合，以七次循环交互验证和200次响应排序检验考察模型的质量；

所述的用生物信息学方法挖掘甄选三种藻株细胞油脂合成积累共有代谢标志物，具体为：首先采用多维分析和单维分析相结合方法筛选各藻株对照组和实验组间的差异代谢物，筛选标准以OPLS-DA模型第一主成分变量权重值VIP >1，t检验p值<0.05定义为潜在的差异代谢物，采用代谢组学小分子化合物快速鉴定分析软件系统OSI/SMMS定性差异代谢物，其依据为中国科学院大连化学物理研究所与大连达硕信息技术有限公司建立的标准物质数据库即http://www.chemdatasolution.com、HMDB即http://www.hmdb.ca/ 和METLIN即https://metlin.scripps.edu/，并进入MBRole数据库确认差异代谢物；基于筛选的三种藻株细胞对照组和实验组间差异代谢物，以代谢物名称、ID比对分析筛选出三种藻株细胞中共有的代谢物，并将获得的共有代谢物进行生物信息分析即KEGG代谢通路分析，登录http://www.genome.jp/KEGG/pathway.html即KEGG数据库，输入所要映射物种的拉丁名称的缩写、所要查询物种拉丁名缩写，将共有差异代谢物ID号匹配到KEGG数据库ID，挖掘共有代谢物在KEGG数据库中的生物学信息，将有收录信息的共有代谢物进行KEGG pathway分析，并导出共有代谢物参与的与油脂合成积累相关的路径图，进而甄选出与微藻油脂合成积累相关的共有代谢标志物。

2.根据权利要求1所述的挖掘甄选微藻油脂合成代谢标志物的方法，其特征在于，所述淡水藻为基因组序列已知的淡水生长微藻株；所述海水藻为基因组序列已知的海水生长微藻株；所述极地藻为基因组序列已知的极地生长微藻株。

3.根据权利要求1所述的挖掘甄选微藻油脂合成代谢标志物的方法，其特征在于，所述的以氮缺乏条件诱导培养淡水藻、海水藻、极地藻三种近缘极差藻株细胞，用细胞组学手段定性定量三种藻株细胞积累油脂具体为：经灭菌、冷却后，向均以硝酸钠氮素为氮源的Basal基础培养基、人工模拟的海水基础培养基、改进Basal基础培养基中，按培养基体积的1-5%分别接入淡水藻、海水藻、极地藻细胞种子液，在25-28℃条件下培养5-10天，离心收集藻细胞，并分别将藻细胞泥转入新鲜的无氮Basal基础培养基、无氮人工模拟的海水基础培养基以及无氮改进Basal基础培养基中继续培养2-72小时；同步收集氮缺乏诱导培养2-72小时的藻株细胞，黑暗条件下经多聚甲醛固定、尼罗红染色后，采用基于荧光分子探针的激光共聚焦、流式细胞仪、全波长多功能酶标仪细胞组学手段定性定量藻株细胞中的总脂和中性脂；氮缺乏条件诱导培养的三种藻株细胞，以下称为实验组，以前后均含氮素的培养基培养得到的藻细胞为对照组。

4.根据权利要求3所述的挖掘甄选微藻油脂合成代谢标志物的方法，其特征在于，所述的Basal基础培养基具体为： 按质量份数计，Glucose 10份、NaNO₃ 1.5份、KH₂PO₄ 1.25份、MgSO₄•7H₂O 1份、CaCl₂ 0.0835份、H₃BO₃ 0.1142份、FeSO₄•7H₂O 0.0498份、ZnSO₄•7H₂O0.0882份、MnCl₂•4H₂O 0.0144份、MoO₃ 0.0071份、CuSO₄•5H₂O 0.0157份、Co(NO₃)₂•6H₂O0.0049份、Na₂EDTA 0.5份、蒸馏水1000份，培养基pH 6.1，115℃灭菌 20 min，无氮Basal基础培养基中NaNO₃ 0份，其余组分同Basal基础培养基；所述的人工模拟的海水基础培养基具体为：Glucose 8份、NaCl 30份、MgSO₄•7H₂O 2.44份、KCl 0.6份、NaNO₃ 1份、CaCl₂•2H₂O0.3份、KH₂PO₄ 0.05份、Tricine 1份、NH₄Cl 0.027份、Na₂EDTA•2H₂O 0.00075份、FeCl₃•6H₂O0.000097份、MnCl₂•4H₂O 0.000041份、ZnCl₂ 0.000005份、CoCl₂•6H₂O 0.000002份、Na₂MoO₄•2H₂O 0.000004份、Vitamin B12 0.000135份、Thiamine 0.000335份、Biotin0.000025份、Soilwater 30份、蒸馏水1000份，培养基8.0，115℃灭菌 20 min，无氮人工模拟的海水基础培养基NaNO₃ 0份，其余组分同人工模拟的海水基础培养基；所述的改进Basal基础培养基具体为：Glucose 10份、NaNO₃ 1.25份、KH₂PO₄ 1.25份、MgSO₄•7H₂O 1份、CaCl₂ 0.111份、H₃BO₃ 0.1142份、FeSO₄•7H₂O 0.0498份、ZnSO₄•7H₂O 0.0882份、MnCl₂•4H₂O0.0142份、MoO₃ 0.0119份、CuSO₄•5H₂O 0.0157份、Co(NO₃)₂•6H₂O 0.0049份、Na₂EDTA 0.5份、蒸馏水1000份，培养基pH 6.1，115℃灭菌 20 min，无氮改进Basal基础培养基NaNO₃ 0份，其余组分同改进Basal基础培养基。

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