CN107037144A - 一种超高效液相色谱串联质谱的检测方法 - Google Patents
一种超高效液相色谱串联质谱的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107037144A CN107037144A CN201611044433.2A CN201611044433A CN107037144A CN 107037144 A CN107037144 A CN 107037144A CN 201611044433 A CN201611044433 A CN 201611044433A CN 107037144 A CN107037144 A CN 107037144A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- blood plasma
- detection method
- detection
- mass spectrum
- liquid chromatography
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 52
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 64
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 11
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- GHCZAUBVMUEKKP-GYPHWSFCSA-N glycochenodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 GHCZAUBVMUEKKP-GYPHWSFCSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102100039215 Guanine nucleotide-binding protein G(t) subunit alpha-3 Human genes 0.000 claims description 2
- 101000888145 Homo sapiens Guanine nucleotide-binding protein G(t) subunit alpha-3 Proteins 0.000 claims description 2
- RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N chenodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N 0.000 claims description 2
- WVULKSPCQVQLCU-BUXLTGKBSA-N glycodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 WVULKSPCQVQLCU-BUXLTGKBSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 claims description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 claims description 2
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 abstract description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 abstract description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 4
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 abstract description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 abstract description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 abstract description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 16
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 7
- QGBSISYHAICWAH-UHFFFAOYSA-N dicyandiamide Chemical compound NC(N)=NC#N QGBSISYHAICWAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000013062 quality control Sample Substances 0.000 description 5
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010811 Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 4
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 4
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 3
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSGYTJNNHPZFKR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypropanenitrile Chemical compound OCCC#N WSGYTJNNHPZFKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 230000036651 mood Effects 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000131329 Carabidae Species 0.000 description 1
- KZBUYRJDOAKODT-UHFFFAOYSA-N Chlorine Chemical compound ClCl KZBUYRJDOAKODT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007445 Chromatographic isolation Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- VXJPCEOTZNHHOA-UHFFFAOYSA-N [K].OC Chemical compound [K].OC VXJPCEOTZNHHOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000001523 electrospinning Methods 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004129 fatty acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 1
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
- G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
- G01N30/724—Nebulising, aerosol formation or ionisation
- G01N30/7266—Nebulising, aerosol formation or ionisation by electric field, e.g. electrospray
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明涉及一种超高效液相色谱串联质谱的检测方法。本发明基于超高效液相色谱串联质谱的检测平台，首先利用靶标代谢物的标准品逐个优化其质谱检测参数和色谱分离条件；然后利用优化好的色谱质谱方法进一步摸索血浆中15种重点靶标代谢物(4个溶血卵磷脂、3个不饱和脂肪酸、8个胆汁酸)的提取方法；利用优化好的分析方法，考察了血浆和尿液中这些代谢物同时测定时的检测限、定量限、精密度、准确性、线性范围等。结果表明本发明的检测方法能快速、准确、特异、灵敏地定量体液中15种重要靶标代谢物的含量，为肝胆疾病非侵入式临床诊断标志物的筛选奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物分析与检测技术领域，具体地说，涉及一种超高效液相色谱串联质谱的检测方法。
背景技术
肝脏是内源性和外源性小分子代谢物在体内最重要的代谢器官。大量研究表明，随着肝病进程(正常肝—肝炎—肝硬化—肝癌)的不断加深，胆汁酸、溶血卵磷脂和不饱合脂肪酸代谢稳态会被破坏，而且不同肝脏损伤程度对应的这三类代谢物的代谢特征也不一样，因此，若能定量分析体液中这三类代谢物的含量，对于肝胆疾病的小分子诊断标志物的筛选具有重要意义。这三类代谢物中每一类代谢物单独的定量方法都有报道，但迄今尚未见三类代谢物同时快速定量的方法，这是由于这三类代谢物的分子极性以及在体内的丰度变化非常大，同时定量他们具有很大挑战性。
中国专利文献CN201210230311.8，公开日2012.11.07，公开了一种用于血清中总胆汁酸测定的组合试剂A和检测方法，组合试剂A包含由Tris-HCl缓冲液、3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSD)、辅酶(NAD+或NADH)构成的试剂I；和由心肌黄酶、2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)、Tris-HCl缓冲液构成的试剂II。通过辅酶循环不断地将蓝色的DCPIP还原为无色的产物，定量检测胆汁酸浓度。该发明还利用同轴共纺静电纺丝技术，将3α-HSD、心肌黄酶和辅酶原位包埋在中空的聚合物纳米纤维的腔室内，制备出一种固定化形态的组合试剂B。在待检测的含胆汁酸的血清样品中添加DCPIP，然后加入固定化组合试剂B，启动反应，进行胆汁酸的检测。
中国期刊《色谱》，2003年9月，Vol.5，No.5，刊出的论文《人静脉血浆中四种不饱和脂肪酸的气相色谱分析》，参考经氧化钾甲醇甲酯化和BF3甲醇甲酯化方法，进行了适当综合和改进，在甲酯化前加入苯溶解，酯化温度控制在55℃，使用氢氧化钾甲醇和BF3甲醇进行两步甲酯化，测定了正常人血浆中四种脂肪酸LA、AA、EPA和DHA的质量浓度。
然而，目前还未见体液中胆汁酸、溶血卵磷脂和不饱合脂肪酸同时快速定量且准确、特异、灵敏的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于同时快速检测体液中靶标代谢物含量的超高效液相色谱串联质谱的检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于同时快速检测体液中靶标代谢物含量的超高效液相色谱串联质谱的检测方法，
所述的体液为血浆、血清或尿液；
所述的靶标代谢物选自下列中的两种或两种以上：GCDA、TCDA、GCDCA、GDCA、DCA、GCA、TCA、CDCA、LPC16:0、LPC18:0、LPC18:1、LPC20:0、EPA、AA和DHA；
质谱条件为：
所用色谱柱为2.1×50mm2，1.7μm的C18柱。
优选地，质谱条件为：
优选地，所述的检测方法还选用了内标，所述的内标选自LPC17:0和GCA-C13。
优选地，所述的内标的质谱条件为：
更优选地，所述的内标的质谱条件为：
作为本发明的一种具体实施方式，所述的体液为血浆，所述的靶标代谢物的提取条件为有机溶剂:血浆＝(2～20):1，所述的有机溶剂选自甲醇、乙腈、氯仿、异丙醇及其任意两者的混合溶剂。
优选地，所述的靶标代谢物的提取条件为甲醇:乙腈:血浆＝2:1:1，v/v/v。
优选地，所述的体液为血浆或血清，前处理过程中用纯水稀释的比例为：血浆或血清:纯水＝1:(1～20)(v/v)。
更优选地，血浆:纯水＝1:9(v/v)。
本发明优点在于：
本发明基于超高效液相色谱串联质谱的检测平台，首先利用靶标代谢物的标准品逐个优化其质谱检测参数和色谱分离条件；然后利用优化好的色谱质谱方法进一步摸索血浆中15个重点靶标代谢物(4个溶血卵磷脂、3个不饱和脂肪酸、8个胆汁酸)的提取方法，发现甲醇:乙腈:血浆(2:1:1，v/v/v)体系是最优选择，其提取的回收率高、背景基质干扰少。利用优化好的分析方法，考察了血浆和尿液中这些代谢物同时测定时的检测限、定量限、精密度、准确性、线性范围等，分析结果表明所有的参数均满足定量分析的要求，并且取得了预料不到的技术效果。综上所述，本发明建立的超高效液相色谱串联三重四级杆质谱的检测方法能快速、准确、特异、灵敏地定量体液中15种重要靶标代谢物的含量，为肝胆疾病非侵入式临床诊断标志物的筛选奠定了基础。
附图说明
图1、图2、图3和图4.靶标代谢物的UPLC-MS/MS多反应监测总离子流图。(图1)100mm BEH C18柱，正离子模式；(图2)100mm BEH C18柱，负离子模式；(图3)50mm BEH C18柱，正离子模式；(图4)50mm BEH C18柱，负离子模式。
图5、图6、图7和图8.15个靶标代谢物和2个内标的UPLC-MS/MS提取离子流图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
1.材料和方法
1.1 试剂
Milli-Q纯水(Millipore，USA)，色谱纯的有机试剂(Aladdin，China)用于蛋白沉淀，质谱纯试剂(Merck，Germany)用于液相色谱质谱联用分析实验。8个胆汁酸标品、4个溶血卵磷脂标品、3个多不饱和脂肪酸标品和两个内标(见表1)均从Sigma-Aldrich公司购买。
表1.靶标代谢物和内标的详细信息
1.2 血浆、血清和尿液样本的收集
四个肝癌或胆管癌患者以及四个健康人的血液样本分别用抗凝管和促凝管收集，抗凝管收集的全血低温条件下离心(4℃，1000g)10分钟，分离上清血浆，分装后于-80℃冻存。促凝管收集的全血在4℃静置30分钟，低温条件下离心(4℃，1000g)10分钟，分离血清，分装后于-80℃冻存。尿液样本收集于15mL的离心管中，低温条件下离心(4℃，10000g)10分钟，上清尿液被分装后于-80℃冻存。
1.3 超高效液相色谱-串联质谱检测条件的优化
靶标代谢物的定量分析在超高效液相色谱仪上进行，分别使用两种不同规格的色谱柱来考察对靶标代谢物的分离效果，这两种色谱柱的规格分别是BEHC18柱(2.1×100mm2，1.7μm)和BEH C18柱(2.1×50mm2，1.7μm)。色谱分离均采用梯度洗脱，流动相A为水(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含0.1％甲酸)。BEH C18柱(2.1×50mm2，1.7μm)的洗脱程序为：0-0.2min：10-10％B，0.2-3.5min：10-55％B，3.5-6min：55-80％B，6-6.5min：80-100％B，6.5-8min：100-100％B，8-8.3min：100-10％B，8.3-10min：10-10％B。流速为0.4mL/min。BEH C18柱(2.1×100mm2，1.7μm)的洗脱程序为：0-3min：10-55％B，3-6min：55-80％B，6-8min：80-100％B，8-10min：100-100％B，10-10.5min：100-10％B，10.5-12min：10-10％B。流速为0.6mL/min。分析过程中样品室的温度控制在4℃。质谱数据的采集使用AB公司的三重四级杆6500质谱仪，配备电喷雾源可以快速进行正负离子切换扫描。质谱参数设置为：源温度：120℃；锥孔气流流速：40L/h；脱溶剂温度：400℃；脱溶剂载气流速：650L/h；毛细管电压：5500V；入口电压：10V；碰撞电压：10V。碰撞能量和去簇电压参数根据每个不同的代谢物具体优化。
1.4 靶标代谢物提取溶剂的优化
根据靶标代谢物的理化性质，我们选取了6种溶剂体系用于血浆中蛋白的沉淀以及靶标代谢物的提取，分别是A：甲醇:氯仿:血浆＝5:2:2(v/v/v)，B：甲醇:氯仿:血浆＝4:1:1(v/v/v)，C：甲醇:异丙醇:血浆＝5:2:2(v/v/v)，D：甲醇:异丙醇:血浆＝4:1:1(v/v/v)，E：甲醇:血浆＝3:1(v/v)和F：甲醇:乙腈:血浆＝2:1:1(v/v/v)。靶标代谢物的回收率以及基质干扰是评价6种溶剂体系的判断标准，最优的溶剂体系应该获得高回收率以及低的基质干扰效应。
1.5 储备液、质控样本以及标曲的制备
先用甲醇将标品配置成1.0mg/mL的单标储备液，然后将单标以不同的稀释比例混合，配置成不同浓度的混标储备液。空白血浆或空白尿液质控样本由健康人和患者的血浆或尿液分别混合制备而成。用甲醇-水(70:30，v/v)稀释混标储备液，可以得到一系列不同浓度的标准工作液，用于制备空白标准曲线；用空白质控样本稀释混合标准储备液，可以得到一系列不同加标浓度的标准工作液，用于制备加标标准曲线。标曲的制备至少设置6个浓度梯度，每个梯度三个平行。LPC17:0(分子量：509.35；C25H52NO7P)和GCA-C13(分子量：466.31；C27H43NO6)作为内标，其中，血浆样品中内标LPC17:0和GCA-C13的浓度分别是1.2μg/mL和12ng/mL；尿液样品中内标LPC17:0和GCA-C13的浓度分别是48ng/mL和12ng/mL。低、中、高三个浓度水平的血浆或尿液加标质控样本用于检测方法的准确性、精密度、重复性考察，每个浓度水平6个重复样。
1.6 样本的前处理
10μL的血清或血浆中加入90μL的纯水，然后再加入预冷的甲醇-乙腈混合溶液(2:1，v/v)(含1.6μg/mL LPC17:0和16ng/mL GCA-C13)，涡旋振荡1分钟，-20℃静置20分钟，低温离心10分钟(4℃，10000g)，150μL的上清液装入带内衬管的LC-MS进样小瓶中，用于分析。
50μL的尿液中加入150μL预冷的甲醇-乙腈混合溶液(2:1，v/v)(含64ng/mLLPC17:0和16ng/mL GCA-C13)后涡旋振荡1分钟，-20℃静置20分钟，低温离心10分钟(4℃，10000g)，150μL的上清液装入带内衬管的LC-MS进样小瓶中，用于分析。
1.7 方法学验证
靶向代谢物的超高效液相色谱串联质谱检测的方法学验证根据美国食品药品监督管理局(FDA)颁布的生物分析指南进行。最低检测限为3倍的信噪比；最低定量限为10倍的信噪比；标准曲线的最高浓度低于质谱检测器的饱和阈值。分析的准确度和精密度用三个不同加标水平的质控样本来评估。检测方法的日内精密度用同一天测的6个平行样来计算，日间精密度用三天测的3批(每批6个平行样)平行样来计算。准确度(％)＝计算浓度/加标浓度×100；精密度(％)＝标准偏差/平均值×100。
2 结果与讨论
2.1 UPLC-MS/MS条件的优化
通过手动直接质谱进样来优化每个靶标代谢物的母-子离子对以及关键的质谱源参数如：碰撞能量、毛细管电压等。每个靶标代谢物挑选两个母-子离子对，其中一对质谱响应最强，而另一对的质谱响应强度稍弱。靶标代谢物质谱响应最强的母-子离子对及其相关的质谱源参数见表2，靶标代谢物质谱响应较弱的母-子离子对及其相关的质谱源参数见表3。由于血液中磷脂的丰度远高于胆汁酸和不饱和脂肪酸，为了能同时使这类物质的质谱响应在合适定量的范围类，因此我们选取质谱响应较弱的母-子离子对用于溶血卵磷脂的定量分析，而选取质谱响应较强的离子对用于胆汁酸和不饱和脂肪酸的定量分析，三类化合物最优的检测条件见表4。质谱条件优化完成后，接下来优化色谱条件。分别挑选了50毫米和100毫米长度的BEH C18色谱柱以及配套色谱条件来考察其对靶标代谢物的分离效果，结果如图1、图2、图3和图4所示，50毫米的BEH C18色谱柱以及配套色谱条件能获得更好的分离效果以及更短的分离时间，因此在接下来的研究中我们选用了50毫米的BEH C18色谱柱来分析这些靶向代谢物。
表2.质谱响应最强的母-子离子对以及相应的质谱源参数
表3.质谱响应相对弱的母-子离子对以及相应的质谱源参数
表4.靶标代谢物同时检测时最优的母-子离子对以及相应的质谱源参数
2.2 提取条件的优化
6种溶剂体系用于血浆中蛋白的沉淀以及靶标代谢物的提取，分别是A：甲醇:氯仿:血浆＝5:2:2(v/v/v)，B：甲醇:氯仿:血浆＝4:1:1(v/v/v)，C：甲醇:异丙醇:血浆＝5:2:2(v/v/v)，D：甲醇:异丙醇:血浆＝4:1:1(v/v/v)，E：甲醇:血浆＝＝3:1(v/v)和F：甲醇:乙腈:血浆＝2:1:1(v/v/v)。结果研究表明，这6种溶剂体系都能高效地沉淀血浆蛋白，避免其对色谱柱和离子源的污染，但是溶剂体系F对靶标代谢物的提取效率最高，同时，背景干扰也最小，结果见表5。
表5.不同提取溶剂下靶标代谢物的提取效率比较
2.3 方法学验证
为了评价该方法的特异性、敏感性和准确性，我们采用血样或尿样加标的方式检测了标曲和线性范围、最低检测限、最低定量限、准确度、精密度。
2.3.1 特异性
15个靶向代谢物和2个内标的提取离子流图见图5、图6、图7和图8。图中我们可以看到分析物谱峰并未受到背景杂质的干扰，这表明该分析方法具有很好的特异性。
2.3.2 线性、最低检测限和最低定量限
不同基质(甲醇，血浆，尿液)中分析物的标准曲线和方程通过线性拟合得到。在甲醇基质中，以分析物浓度作为自变量X，以分析物峰面积/内标峰面积作为因变量Y进行线性回归，得到甲醇中分析物的标准曲线方程和相关系数；在血浆或尿液基质中，以分析物的加标浓度作为自变量X，以(加标样品中分析物峰面积/内标峰面积-空白样品中分析物峰面积/内标峰面积)作为因变量Y进行线性回归，得到血浆或尿液基质中分析物的标准曲线方程和相关系数。最低检出限的信噪比设为3，最低定量限的信噪比设为10。血浆和尿液中待测物的线性范围、标准方程、相关系数以及检出限和定量限的详细数据分别见表6和表7。由于血浆或尿液的加标标曲比空白甲醇基质的标曲更好地校正基质效应，因此接下来在该方法的精密度和准确性计算中我们使用血浆或尿液的加标标曲。
表6.血浆中待测物的线性范围、相关性系数、最低检测限和最低定量限
表7.尿液中待测物的线性范围、相关性系数、最低检测限和最低定量限
2.3.3 精密度和准确性
通过低、中、高三个加标浓度水平质控样本来考察该方法的日内和日间精密度和准确度，详细的数据见表8和表9。血浆基质中，各待测物的测量准确度为80.45％-118.99％，日内和日间精密度分别为：1.32％-12.79％和2.86％-19.83％。尿液基质中，各待测物的测量准确度为84.55％-112.66％，日内和日间精密度分别为：0.4％-11.89％和0.39％-14.93％。血浆基质和尿液基质中，该检测方法的准确度正负误差小于20％，而且日内和日间检测的相对标准偏差(RSD)均低于20％，满足定量分析的要求。
表8.血浆基质中15个待测物分析检测的精密度和准确度
表9.尿液基质中15个待测物分析检测的精密度和准确度
3 结论
在本发明中，我们建立了一种能同时检测体液样本(血清、血浆或尿液)中胆汁酸、溶血卵磷脂和不饱和脂肪酸的UPLC-MS/MS检测方法，该方法具有灵敏、准确、快捷、廉价等优点。我们的研究成果让定量检测肝脏核心代谢物的浓度水平成为可能，为肝胆疾病的非侵入式临床诊断、预后评价以及指导临床用药提供了新的视角。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种用于同时快速检测体液中靶标代谢物含量的超高效液相色谱串联质谱的检测方法，其特征在于，
所述的体液为血浆、血清或尿液；
所述的靶标代谢物选自下列中的两种或两种以上：GCDA、TCDA、GCDCA、GDCA、DCA、GCA、TCA、CDCA、LPC16:0、LPC18:0、LPC18:1、LPC20:0、EPA、AA和DHA；
质谱条件为：
所用色谱柱为2.1×50mm2，1.7μm的C18柱。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，质谱条件为：
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法还选用了内标，所述的内标选自LPC17:0和GCA-C13。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的内标的质谱条件为：
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的内标的质谱条件为：
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的体液为血浆，所述的靶标代谢物的提取条件为有机溶剂:血浆＝(2～20):1，所述的有机溶剂选自甲醇、乙腈、氯仿、异丙醇及其任意两者的混合溶剂。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的靶标代谢物的提取条件为甲醇:乙腈:血浆＝2:1:1，v/v/v。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的体液为血浆或血清，前处理过程中用纯水稀释的比例为：血浆或血清:纯水＝1:(1～20)(v/v)。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，血浆:纯水＝1:9(v/v)。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611044433.2A CN107037144B (zh) | 2016-11-22 | 2016-11-22 | 一种检测体液中靶标代谢物含量的超高效液相色谱串联质谱方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611044433.2A CN107037144B (zh) | 2016-11-22 | 2016-11-22 | 一种检测体液中靶标代谢物含量的超高效液相色谱串联质谱方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107037144A true CN107037144A (zh) | 2017-08-11 |
| CN107037144B CN107037144B (zh) | 2019-11-08 |
Family
ID=59530555
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611044433.2A Expired - Fee Related CN107037144B (zh) | 2016-11-22 | 2016-11-22 | 一种检测体液中靶标代谢物含量的超高效液相色谱串联质谱方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107037144B (zh) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108362804A (zh) * | 2018-02-27 | 2018-08-03 | 济南英盛生物技术有限公司 | 一种检测血液样品中dha含量的方法及试剂盒 |
| CN109164183A (zh) * | 2018-09-29 | 2019-01-08 | 中国检验检疫科学研究院 | 肝脏损伤相关差异性内源性标志物及其筛选方法和应用 |
| CN109781916A (zh) * | 2018-11-05 | 2019-05-21 | 苏州帕诺米克生物医药科技有限公司 | 靶向代谢组学定量自动分析方法和装置、电子设备 |
| CN110361495A (zh) * | 2019-08-21 | 2019-10-22 | 上海交通大学 | 一种生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法 |
| CN110531007A (zh) * | 2018-10-22 | 2019-12-03 | 嘉兴迈维代谢生物科技有限公司 | 一种类花生四烯酸类物质检测方法 |
| CN110596295A (zh) * | 2019-10-21 | 2019-12-20 | 上海百趣生物医学科技有限公司 | 一种检测胆汁酸的方法 |
| CN110850073A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-02-28 | 郑州大学第一附属医院 | 肝硬化阳离子标志物的筛选方法和应用 |
| CN110850074A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-02-28 | 郑州大学第一附属医院 | 肝硬化阴离子标志物的筛选方法和应用 |
| CN110850072A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-02-28 | 郑州大学第一附属医院 | 肝癌阴离子标志物的筛选方法和应用 |
| CN111610262A (zh) * | 2020-05-19 | 2020-09-01 | 上海鹿明生物科技有限公司 | 一种用于肝胆疾病诊断的代谢标志物 |
| CN117147735A (zh) * | 2023-10-26 | 2023-12-01 | 安徽医科大学 | 一种基于滤纸片干血斑检测人体血液中甘油三酯的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011087367A1 (en) * | 2010-01-18 | 2011-07-21 | Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno | Improved method for the detection of polyunsaturated fatty acids |
| CN102460160A (zh) * | 2009-06-02 | 2012-05-16 | 比奥克拉泰斯生命科学股份公司 | 用于评估肾脏疾病的新生物标记物 |
| EP2592420A1 (en) * | 2011-11-10 | 2013-05-15 | BIOCRATES Life Sciences AG | Method and use of metabolic compounds for diagnosing stroke |
| US20160305931A1 (en) * | 2015-04-17 | 2016-10-20 | Korea Institute Of Science And Technology | Multi-metabolites platform for diagnosis of acute coronary syndrome |
-
2016
- 2016-11-22 CN CN201611044433.2A patent/CN107037144B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102460160A (zh) * | 2009-06-02 | 2012-05-16 | 比奥克拉泰斯生命科学股份公司 | 用于评估肾脏疾病的新生物标记物 |
| WO2011087367A1 (en) * | 2010-01-18 | 2011-07-21 | Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno | Improved method for the detection of polyunsaturated fatty acids |
| EP2592420A1 (en) * | 2011-11-10 | 2013-05-15 | BIOCRATES Life Sciences AG | Method and use of metabolic compounds for diagnosing stroke |
| US20160305931A1 (en) * | 2015-04-17 | 2016-10-20 | Korea Institute Of Science And Technology | Multi-metabolites platform for diagnosis of acute coronary syndrome |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| EDANA CASSOL ET AL.: "Plasma metabolomics identifies lipid abnormalities linked to markers of inflammation, microbial translocation, and hepatic function in HIV patients receiving protease inhibitors", 《BMC INFECTIOUS DISEASES》 * |
| MAGALI H. SARAFIAN ET AL.: "Bile Acid Profiling and Quantification in Biofluids Using Ultra-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 * |
| XINJIE ZHAO ET AL.: "Metabonomic fingerprints of fasting plasma and spot urine reveal human pre-diabetic metabolic traits", 《METABOLOMICS》 * |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108362804A (zh) * | 2018-02-27 | 2018-08-03 | 济南英盛生物技术有限公司 | 一种检测血液样品中dha含量的方法及试剂盒 |
| CN108362804B (zh) * | 2018-02-27 | 2019-01-29 | 山东英盛生物技术有限公司 | 一种检测血液样品中dha含量的方法及试剂盒 |
| CN109164183A (zh) * | 2018-09-29 | 2019-01-08 | 中国检验检疫科学研究院 | 肝脏损伤相关差异性内源性标志物及其筛选方法和应用 |
| CN110531007A (zh) * | 2018-10-22 | 2019-12-03 | 嘉兴迈维代谢生物科技有限公司 | 一种类花生四烯酸类物质检测方法 |
| CN109781916A (zh) * | 2018-11-05 | 2019-05-21 | 苏州帕诺米克生物医药科技有限公司 | 靶向代谢组学定量自动分析方法和装置、电子设备 |
| CN110361495A (zh) * | 2019-08-21 | 2019-10-22 | 上海交通大学 | 一种生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法 |
| CN110596295A (zh) * | 2019-10-21 | 2019-12-20 | 上海百趣生物医学科技有限公司 | 一种检测胆汁酸的方法 |
| CN110850073A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-02-28 | 郑州大学第一附属医院 | 肝硬化阳离子标志物的筛选方法和应用 |
| CN110850074A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-02-28 | 郑州大学第一附属医院 | 肝硬化阴离子标志物的筛选方法和应用 |
| CN110850072A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-02-28 | 郑州大学第一附属医院 | 肝癌阴离子标志物的筛选方法和应用 |
| CN111610262A (zh) * | 2020-05-19 | 2020-09-01 | 上海鹿明生物科技有限公司 | 一种用于肝胆疾病诊断的代谢标志物 |
| CN113156018A (zh) * | 2020-05-19 | 2021-07-23 | 上海鹿明生物科技有限公司 | 一种肝胆疾病诊断模型的建立方法及诊断系统 |
| CN117147735A (zh) * | 2023-10-26 | 2023-12-01 | 安徽医科大学 | 一种基于滤纸片干血斑检测人体血液中甘油三酯的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107037144B (zh) | 2019-11-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107037144B (zh) | 一种检测体液中靶标代谢物含量的超高效液相色谱串联质谱方法 | |
| Ye et al. | High-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry for the analysis of bile acid profiles in serum of women with intrahepatic cholestasis of pregnancy | |
| CN108414660B (zh) | 一组与肺癌早期诊断相关的血浆代谢小分子标志物的应用 | |
| CN110361495A (zh) | 一种生物基质中的靶标代谢物含量的检测方法 | |
| Xia et al. | Simultaneous determination of ginsenoside Rg1, Re, Rd, Rb1 and ophiopogonin D in rat plasma by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometric method and its application to pharmacokinetic study of ‘SHENMAI’injection | |
| Yin et al. | Plasma metabolic profiling analysis of cyclophosphamide-induced cardiotoxicity using metabolomics coupled with UPLC/Q⿿ TOF⿿ MS and ROC curve | |
| CN113777209B (zh) | 尿液中挥发性污染物暴露与效应标志物同步检测及应用 | |
| Luo et al. | Derivatization method for sensitive determination of 3-hydroxybenzo [a] pyrene in human urine by liquid chromatography–electrospray tandem mass spectrometry | |
| Bouillaud et al. | Using benchtop NMR spectroscopy as an online non-invasive in vivo lipid sensor for microalgae cultivated in photobioreactors | |
| Yu et al. | Nanoconfinement effect based in-fiber extraction and derivatization method for ultrafast analysis of twenty amines in human urine by GC-MS: Application to cancer diagnosis biomarkers’ screening | |
| Liu et al. | Identification of a novel plasma metabolite panel as diagnostic biomarker for hepatocellular carcinoma | |
| CN106841452B (zh) | 一种hplc结合uplc-ms检测pqq对乳酸作用的方法 | |
| CN113406235A (zh) | 一种基于uplc-ms/ms检测色氨酸及其代谢物的试剂盒和方法 | |
| Zhu et al. | Comprehensive screening and separation of cyclooxygenase-2 inhibitors from Pterocephalus hookeri by affinity solid-phase extraction coupled with preparative high-performance liquid chromatography | |
| CN107462656A (zh) | 一种快速检测石蒜科植物中加兰他敏含量的方法 | |
| Sun et al. | Quantification of 2-NBDG, a probe for glucose uptake, in GLUT1 overexpression in HEK293T cells by LC–MS/MS | |
| CN110824081A (zh) | 一种血虚小鼠模型的脂质组学分析方法 | |
| Wang et al. | New analytical method for determination of epimer metabolites in rat plasma after oral administration of Paeoniflorin by UPLC-TOF-MS following picolinoyl derivatization | |
| Zhao et al. | A fast and sensitive HPLC–MS/MS analysis and preliminary pharmacokinetic characterization of ergone in rats | |
| Chen et al. | Plasma metabolomics profiling in maintenance hemodialysis patients based on liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry | |
| CN108680692A (zh) | 下壁心肌梗死和/或前壁心肌梗死的诊断标志物 | |
| US20130037709A1 (en) | Method for Clinically Monitoring Niacin and Niacin Metabolites in Serum or Plasma | |
| Zhu et al. | Fluorescence spectroscopic determination of dipyridamole binding on pancreas-1 tumor cell membrane | |
| Gupta et al. | Techniques for detection and extraction of metabolites | |
| CN112557568A (zh) | 一种雌二醇和雌酮的检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20191108 |