CN117147735A - 一种基于滤纸片干血斑检测人体血液中甘油三酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种基于滤纸片干血斑检测人体血液中甘油三酯的方法，属于医学检测技术领域。针对目前对血液代谢物的检测样本保存、运输等不便的问题，本发明将干血斑技术引入对人体血液中40种甘油三酯的检测，通过制备滤纸片干血斑并加入TG16:0/18:0/16:0D5内标物，经萃取、净化后，取上层清液置于进样瓶中，通过内标法获得每种甘油三酯的定量数据。本发明以滤纸片干血斑采样技术的低创伤、采样方便、样品稳定等优势为思路，对人体血液中甘油三酯的检测给出了新方法，本发明的方法相较于传统的血液样品，使用的样品量低，成本低，且检测结果稳定可靠，在临床上对甘油三酯的检测具有重要的指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，特别涉及一种基于滤纸片干血斑检测人体血液中甘油三酯的方法。
背景技术
脂类组学是对整体脂质进行系统分析的一门新兴学科，通过比较不同生理状态下脂代谢网络的变化，从而了解其相互作用以及与其他生物分子之间的作用，通过脂质组学分析筛选，进而识别代谢调控中关键的脂质生物标志物，最终揭示脂质在各种生命活动中的作用机制。在脂质组学中，脂质被系统性地分成了8类，即脂肪酰类、甘油脂类、甘油磷脂类、鞘脂类、胆固醇类、多聚异戊二烯醇类、糖脂类、聚酮类。
甘油三酯（Triglyceride，缩写TG）是甘油脂类的重要组成部分，甘油三酯（TG）由3分子脂肪酸（FA）和1分子甘油组成，俗称为脂肪，它行使供能、储能、缓冲和保温等功能；甘油三酯是自然界中最丰富的脂质，随着物质生活的不断提高，人体若对甘油三酯摄入过剩，可导致高脂血症、肥胖、动脉粥样硬化、糖尿病等慢性非传染病风险的增加。
干血斑（Dried Blood Spot，DBS）技术是一种新型样本采集技术和样本形态，是将受试者的少量指尖血或足跟血滴于滤纸上，室温晾干后制成干血斑样本用于血液代谢物的检测，可搭载多种后端检测设备，现已应用于新生儿疾病筛查、HIV/HCV筛查、兴奋剂检测、精准医疗等领域；而且，干血斑样本的采集无需专业医护人员的参与，受试者可以在家采样，采样过程疼痛感低，病原体感染的风险也较静脉采血要低。
目前，临床检验及科学研究中，针对血液代谢物（如甘油三酯）的检测最常用的样本为冷冻保存的血清、血浆及全血。血液的采集需要专业医护人员进行静脉穿刺，且采集好的血液需要通过冷链运输至实验室待检，另外，样本检验前需将样本保存在-80℃超低温冰箱以最大程度上避免血液中目标代谢物的降解，会占用较大的空间。因此，提出一种基于滤纸片干血斑技术对人体血液中的甘油三酯进行检测的方法，对相关疾病的预防与筛查以及探索疾病的脂质生物标志物，有着重大意义。
发明内容
针对上述背景技术中存在的问题，本发明旨在提供一种基于滤纸片干血斑技术的检测人体血液中甘油三酯的方法，以解决背景技术中存在的问题。
本发明以滤纸片干血斑采样技术的低创伤、采样方便、样品稳定等优势为技术思路，将干血斑技术引至对人体血液中甘油三酯的检测中，能够对因甘油三酯过高引起的各类疾病的预防与筛查以及探索疾病的脂质生物标志物有着重要作用，本发明的方法相较于传统的血液样品，使用的样品量低，成本低，且检测结果稳定可靠。
本发明基于上述技术目的，所采用的技术方案如下：
一种基于滤纸片干血斑检测人体血液中甘油三酯的方法，包括以下步骤：
S1：制备滤纸片干血斑；
S2：对制备的滤纸片干血斑进行打孔，得到干血斑；
S3：将干血斑放入EP管中进行水孵育；
S4：向步骤S3中的EP管中加入TG16:0/18:0/16:0D5内标物；
S5：继续向步骤S4中的EP管中加入萃取液，萃取目标化合物；
S6：对步骤S5萃取后的目标化合物进行净化，取上层清液置于进样瓶中；
S7：采用液相色谱-串联质谱对步骤S6的上层清液中甘油三酯的含量进行定量分析。
基于上述技术方案，进一步地，甘油三酯包括TG14:0/16:0/18:1、TG14:0/16:0/18:2、TG14:0/16:1/18:1、TG14:0/16:1/18:2、TG14:0/17:0/18:1、TG14:0/18:0/18:1、TG14:0/18:2/18:2、TG14:1/16:0/18:1、TG14:1/16:1/18:0、TG14:1/18:0/18:2、TG14:1/18:1/18:1、TG15:0/16:0/18:1、TG15:0/18:1/18:1、TG16:0/16:0/16:0、TG16:0/16:0/18:0、TG16:0/16:0/18:1、TG16:0/16:0/18:2、TG16:0/16:1/17:0、TG16:0/16:1/18:1、TG16:0/17:0/18:1、TG16:0/17:0/18:2、TG16:0/18:0/18:1、TG16:0/18:1/18:1、TG16:0/18:1/18:2、TG16:0/18:2/18:2、TG16:1/16:1/16:1、TG16:1/16:1/18:1、TG16:1/17:0/18:1、TG16:1/18:1/18:1、TG16:1/18:1/18:2、TG17:0/18:1/18:1、TG18:0/18:0/18:1、TG18:0/18:1/18:1、TG18:0/18:2/18:2、TG18:1/18:1/18:1、TG18:1/18:1/18:2、TG18:1/18:1/20:4、TG18:1/18:2/18:2、TG18:2/18:2/18:2、TG18:2/18:2/20:4。
作为本发明的进一步优选方式，步骤S1具体包括以下步骤：
S101：将指尖血自然垂直滴在滤纸片上，使得血液在滤纸片上自然扩散，形成圆形的血斑；
S102：将滤纸片置于干净、阴暗、通风处干燥2小时后，装入含有干燥剂的密封袋，排出空气，置于-20℃进行保存。
作为本发明的进一步优选方式，在步骤S2中，选用直径为3mm的打孔器在滤纸片干血斑上两面完全浸润的位置处进行打孔，以获取直径为3mm的干血斑；
作为本发明的进一步优选方式，在步骤S3中，将直径为3mm的干血斑装入1.5mL的EP管中，加入20μL水，静置15min进行水孵育，用以浸泡干血斑。
作为本发明的进一步优选方式，步骤S4具体包括以下步骤：
S401：用甲醇将50μM的TG16:0/18:0/16:0 D5内标物稀释10倍，配制成5μM的TG16:0/18:0/16:0 D5内标物标准工作液；
S402：向孵育后的EP管中加入10μL的TG16:0/18:0/16:0 D5内标物标准工作液。
作为本发明的进一步优选方式，步骤S5具体包括以下步骤：
萃取液使用甲醇与异丙醇以1：1比例混合的混合溶液，向EP管中加入70μL的混合溶液，涡旋1-2min；
S502：再将EP管置于漂浮板上，超声处理40-60min，温度控制在10-20℃。
作为本发明的进一步优选方式，步骤S6具体包括以下步骤：
S601：将EP管置于15000rpm的高速离心机上，温度控制在15℃，离心处理10min；
S602：取离心处理后的上层清液70μL，装入进样瓶的内插管中，待进样。
作为本发明的进一步优选方式，在步骤S7中，
液相色谱-串联质谱采用的安捷伦InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 2.1×100mm 2.7-Micron HPLC色谱柱，进样量为5μL；
流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为含有5mmol/L甲酸铵的5:3:2水:乙腈:异丙醇溶液，流动相B为含有5mmol/L甲酸铵的1:9:90水:乙腈:异丙醇溶液；
洗脱梯度为0min 25%B，0.5min 49%B，8.2min 69%B，12min 100%B，15min 100%B，15.1min 25% B，19.5min 25%B流速为0.3mL/min，总进样时间为19.5min。
本发明通过采用上述方案，与现有技术相比，具有如下有益的技术效果：
1、本发明的检测方法相较于传统的静脉采血具有创伤小、侵入性小、采样过程疼痛感低，且在采样中使用的生物样品量少，可有效节省成本，同时，滤纸片干血斑的采集、运输及储存更为简便、快捷和安全，具有扩大筛查和医疗应用范围等优势。
2、本发明的方法能够获得人体血液中40种甘油三酯的准确浓度，且检测结果稳定可靠，同时随着脂质生物标志物的不断发现，基于滤纸片干血斑对人体甘油三酯的检测可以在疾病早期进行筛查，这是传统临床的检测方法不能做到的。
3、本发明的方法基于3mm的滤纸片干血斑中的含血量作为检测样本，获得每种甘油三酯的LC-MS/MS图谱，通过内标法可获得每种甘油三酯定量数据，同时，通过本发明的方法能够灵敏地对人体中40种甘油三酯在不同时间段的浓度变化进行监测，可作为检测40种甘油三酯浓度的定量方法，在临床上对甘油三酯的检测具有重要的指导意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明中干血斑样品中40种甘油三酯的液相色谱-串联质谱LC-MS/MS分析谱图；
图2为本发明中TG16:0/18:0/16:0 D5内标物在干血斑样品中的液相色谱-串联质谱LC-MS/MS分析谱图；
图3为本发明中TG14:0/16:0/18:1、TG14:0/16:0/18:2、TG14:0/16:1/18:1、TG14:0/16:1/18:2、TG14:0/17:0/18:1、TG14:0/18:0/18:1、TG14:0/18:2/18:2、TG14:1/16:0/18:1在干血斑样品中的液相色谱-串联质谱LC-MS/MS分析谱图；
图4为本发明中TG14:1/16:1/18:0、TG14:1/18:0/18:2、TG14:1/18:1/18:1、TG15:0/16:0/18:1、TG15:0/18:1/18:1、TG16:0/16:0/16:0、TG16:0/16:0/18:0、TG16:0/16:0/18:1在干血斑样品中的液相色谱-串联质谱LC-MS/MS分析谱图；
图5为本发明中TG16:0/16:0/18:2、TG16:0/16:1/17:0、TG16:0/16:1/18:1、TG16:0/17:0/18:1、TG16:0/17:0/18:2、TG16:0/18:0/18:1、TG16:0/18:1/18:1、TG16:0/18:1/18:2在干血斑样品中的液相色谱-串联质谱LC-MS/MS分析谱图；
图6为本发明中TG16:0/18:2/18:2、TG16:1/16:1/16:1、TG16:1/16:1/18:1、TG16:1/17:0/18:1、TG16:1/18:1/18:1、TG16:1/18:1/18:2、TG17:0/18:1/18:1、TG18:0/18:0/18:1在干血斑样品中的液相色谱-串联质谱LC-MS/MS分析谱图；
图7为本发明中TG18:0/18:1/18:1、TG18:0/18:2/18:2、TG18:1/18:1/18:1、TG18:1/18:1/18:2、TG18:1/18:1/20:4、TG18:1/18:2/18:2、TG18:2/18:2/18:2、TG18:2/18:2/20:4在干血斑样品中的液相色谱-串联质谱LC-MS/MS分析谱图；
图8为本发明中对6位受试者的第1至15种甘油三酯（以本发明给出的顺序）在各时点的浓度变化折线图；
图9为本发明中对6位受试者的第16至30种甘油三酯（以本发明给出的顺序）在各时点的浓度变化折线图；
图10为本发明中对6位受试者的第31至40种甘油三酯（以本发明给出的顺序）在各时点的浓度变化折线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
参考图1-10，本发明提供一种基于滤纸片干血斑检测人体血液中甘油三酯的方法，以本方法对人体血液中甘油三酯的浓度进行检测时，是以直径3mm的滤纸片干血斑中的含血量作为检测基准，因此在实施本发明对甘油三酯的检测之前，要获取直径3mm的滤纸片干血斑中含血量的定量数据，测得的含血量为2.63±0.0070μL，以此含血量为基准再对血液中的甘油三酯的浓度进行检测。具体包括以下步骤：
S1：滤纸片干血斑的制备；
S2：对制备的滤纸片干血斑进行打孔；
S3：将打孔取出的干血斑放入EP管中进行水孵育；
S4：向EP管中加入TG16:0/18:0/16:0D5内标物；
S5：继续向EP管中加入萃取液，萃取目标化合物；
S6：对目标化合物进行净化，取上层清液置于进样瓶中；
S7：采用液相色谱-串联质谱对上层清液中的甘油三酯的含量进行定量分析。
在本发明中，甘油三酯包括TG14:0/16:0/18:1、TG14:0/16:0/18:2、TG14:0/16:1/18:1、TG14:0/16:1/18:2、TG14:0/17:0/18:1、TG14:0/18:0/18:1、TG14:0/18:2/18:2、TG14:1/16:0/18:1、TG14:1/16:1/18:0、TG14:1/18:0/18:2、TG14:1/18:1/18:1、TG15:0/16:0/18:1、TG15:0/18:1/18:1、TG16:0/16:0/16:0、TG16:0/16:0/18:0、TG16:0/16:0/18:1、TG16:0/16:0/18:2、TG16:0/16:1/17:0、TG16:0/16:1/18:1、TG16:0/17:0/18:1、TG16:0/17:0/18:2、TG16:0/18:0/18:1、TG16:0/18:1/18:1、TG16:0/18:1/18:2、TG16:0/18:2/18:2、TG16:1/16:1/16:1、TG16:1/16:1/18:1、TG16:1/17:0/18:1、TG16:1/18:1/18:1、TG16:1/18:1/18:2、TG17:0/18:1/18:1、TG18:0/18:0/18:1、TG18:0/18:1/18:1、TG18:0/18:2/18:2、TG18:1/18:1/18:1、TG18:1/18:1/18:2、TG18:1/18:1/20:4、TG18:1/18:2/18:2、TG18:2/18:2/18:2、TG18:2/18:2/20:4。
进一步地，步骤S1具体包括以下步骤：
S101：将指尖血自然垂直滴在滤纸片上，使得血液在滤纸片上自然扩散，形成圆形的血斑；
S102：将滤纸片置于干净、阴暗、通风处干燥2小时后，装入含有干燥剂的密封袋，排出空气，置于-20℃进行保存。
进一步地，在步骤S2中，选用直径为3mm的打孔器在两面完全浸润的滤纸片干血斑的位置处进行打孔，以获取直径为3mm的干血斑；
进一步地，在步骤S3中，将直径为3mm的干血斑装入1.5mL的EP管中，加入20μL水，静置15min进行水孵育，以浸泡干血斑。
进一步地，步骤S4具体包括以下步骤：
S401：用甲醇将50μM的TG16:0/18:0/16:0 D5内标物稀释10倍，配制成5μM的TG16:0/18:0/16:0 D5内标物标准工作液；
S402：向孵育后的EP管中加入10μL的TG16:0/18:0/16:0 D5内标物标准工作液。
进一步地，步骤S5具体包括以下步骤：
S501：萃取液选用甲醇与异丙醇以1：1比例的混合溶液，向EP管中加入70μL的混合溶液，涡旋1-2min；
S502：再将EP管置于漂浮板上，超声处理40-60min，控制温度在10-20℃。
进一步地，步骤S6具体包括以下步骤：
S601：将EP管置于15000rpm的高速离心机上，温度控制在15℃，离心处理10min；
S602：取离心处理后的上层清液70μL，装入进样瓶的内插管中，待进样。
进一步地，在步骤S7中，
液相色谱-串联质谱采用的安捷伦InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 2.1×100mm 2.7-Micron HPLC色谱柱，进样量为5μL；
流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为含有5mmol/L甲酸铵的5:3:2水:乙腈:异丙醇溶液，流动相B为含有5mmol/L甲酸铵的1:9:90水:乙腈:异丙醇溶液；
洗脱梯度为0min 25%B，0.5min 49%B，8.2min 69%B，12min 100%B，15min 100%B，15.1min 25% B，19.5min 25%B流速为0.3mL/min，总进样时间为19.5min。
实施例
对6位受试者在餐前、餐后2小时、餐后6小时、餐后12小时以及餐后24小时进行滤纸片干血斑采血，期间饮食为全麦面包和矿泉水，避免脂质摄入（6位受试者均签署知情同意书，在受试的24小时内提供全麦面包和矿泉水，保持无（低）脂饮食状态）；以滤纸片干血斑为载体检测40种甘油三酯的浓度，通过绘制甘油三酯随时间变化的趋势图，评价滤纸片干血斑检测血液中甘油三酯的灵敏度。
具体的检测过程包括如下步骤：
S1：滤纸片干血斑的制备；
对上述6位受试者分别在餐前、餐后2小时、餐后6小时、餐后12小时和餐后24小时采集指尖血，使得血液在滤纸片上自然扩散，形成圆形的血斑，在干净、阴暗、通风处干燥2小时后，置于内有干燥剂的密封袋中，排出空气，放入-20℃冰箱保存待检测。
S2：对制备的滤纸片干血斑进行打孔；
用打孔器在两面浸透的滤纸片干血斑上打直径为3mm的圆形干血斑。
S3：将打孔取出的干血斑放入EP管中进行水孵育；
将取出的直径为3mm的干血斑放置于1.5mL的EP管中，每人每时点做三个平行样，并分别在EP管上进行编号，向干血斑表面滴加20μL的水，静置15min，用以浸泡干血斑进行孵育，此步骤可提高S5步骤中的萃取效率。
S4：向EP管中加入TG16:0/18:0/16:0D5内标物；
向孵育后的EP管中加入10μL的5μM TG16:0/18:0/16:0 D5作为标准工作液，涡旋20s。
S5：继续向EP管中加入萃取液，萃取目标化合物；
萃取液选用甲醇与异丙醇以1：1比例的混合溶液，向EP管中加入此混合溶液70μL，涡旋1-2min进行萃取；再将EP管置于漂浮板上，超声处理40-60min，控制温度在10-20℃。
S6：对目标化合物进行净化，取上层清液置于进样瓶中；
将EP管置于15000rpm的高速离心机上，温度控制在15℃，离心处理10min；取离心处理后的上层清液70μL，装入进样瓶的内插管中，待进样。
由于蛋白吸附于干血斑表面，高速离心可有效将萃取液中的纸屑和蛋白除去。
S7：采用液相色谱-串联质谱对上层清液中的甘油三酯的含量进行定量分析。
液相色谱-串联质谱采用的安捷伦InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 2.1×100mm 2.7-Micron HPLC色谱柱，进样量为5μL；
流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为含有5mmol/L甲酸铵的5:3:2水:乙腈:异丙醇溶液，流动相B为含有5mmol/L甲酸铵的1:9:90水:乙腈:异丙醇溶液；
洗脱梯度为0min 25%B，0.5min 49%B，8.2min 69%B，12min 100%B，15min 100%B，15.1min 25% B，19.5min 25%B流速为0.3mL/min，总进样时间为19.5min。
在本发明的方法中，用于检测的40种甘油三酯MS/MS目标化合物离子对参数如下表1所示：
表1 MS/MS目标化合物离子对参数
；
通过本发明的上述检测方法获得40种甘油三酯的色谱图，从图3-7中可以看出峰形良好，响应值较高，具有很好的参考价值。
进一步的，通过内标法对上述40种甘油三酯进行定量，以色谱图示样品为参照，分别计算40种甘油三酯的浓度，结果如下表2所示。
表2 40种甘油三脂定量浓度
；
从表2中的数据可知，本发明的40种甘油三酯TG14:0/16:0/18:1、TG14:0/16:0/18:2、TG14:0/16:1/18:1、TG14:0/16:1/18:2、TG14:0/17:0/18:1、TG14:0/18:0/18:1、TG14:0/18:2/18:2、TG14:1/16:0/18:1、TG14:1/16:1/18:0、TG14:1/18:0/18:2、TG14:1/18:1/18:1、TG15:0/16:0/18:1、TG15:0/18:1/18:1、TG16:0/16:0/16:0、TG16:0/16:0/18:0、TG16:0/16:0/18:1、TG16:0/16:0/18:2、TG16:0/16:1/17:0、TG16:0/16:1/18:1、TG16:0/17:0/18:1、TG16:0/17:0/18:2、TG16:0/18:0/18:1、TG16:0/18:1/18:1、TG16:0/18:1/18:2、TG16:0/18:2/18:2、TG16:1/16:1/16:1、TG16:1/16:1/18:1、TG16:1/17:0/18:1、TG16:1/18:1/18:1、TG16:1/18:1/18:2、TG17:0/18:1/18:1、TG18:0/18:0/18:1、TG18:0/18:1/18:1、TG18:0/18:2/18:2、TG18:1/18:1/18:1、TG18:1/18:1/18:2、TG18:1/18:1/20:4、TG18:1/18:2/18:2、TG18:2/18:2/18:2、TG18:2/18:2/20:4的浓度分别为1.76μM、1.07μM、0.62μM、0.18μM、0.93μM、0.00μM、0.23μM、0.11μM、0.61μM、0.07μM、1.64μM、0.52μM、0.50μM、4.28μM、2.02μM、5.12μM、14.42μM、0.80μM、3.94μM、0.36μM、1.85μM、4.94μM、22.86μM、20.08μM、26.60μM、0.04μM、2.34μM、3.79μM、3.32μM、5.50μM、0.18μM、0.66μM、2.27μM、2.42μM、5.70μM、2.81μM、1.37μM、6.47μM、3.55μM、0.34μM。
本发明通过对6位受试者在上述各时点的40种甘油三酯的检测，绘制出甘油三酯随时间变化的折线图，如图8-10所示，可知本发明的方法能够灵敏地检测到人体中40种甘油三酯在不同时间段的浓度变化，可作为检测40种甘油三酯浓度的定量方法，对临床上针对甘油三酯的检测具有重要的指导意义。
本发明中的检测方法对人体的创伤小于传统的静脉采血，可检测血液中40种甘油三酯的含量，目标物峰形良好，响应值较高，具有很好的参考价值，且本方法使用的生物样品量少，成本低，检测结果稳定可靠，同时能够灵敏地检测到40种甘油三酯浓度的变化，可作为检测40种甘油三酯浓度的方法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理及未付出创造性劳动的前提下，还可以作出若干改进、润饰和替换，这些改进、润饰和替换也包括在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种基于滤纸片干血斑检测人体血液中甘油三酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备滤纸片干血斑；
S2：对制备的滤纸片干血斑进行打孔，得到干血斑；
S3：将干血斑放入EP管中进行水孵育；
S4：向步骤S3中的EP管中加入TG16:0/18:0/16:0D5内标物；
S5：继续向步骤S4中的EP管中加入萃取液，萃取目标化合物；
S6：对步骤S5萃取后的目标化合物进行净化，取上层清液置于进样瓶中；
S7：采用液相色谱-串联质谱对步骤S6的上层清液中甘油三酯的含量进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的一种基于滤纸片干血斑检测人体血液中甘油三酯的方法，其特征在于，甘油三酯包括TG14:0/16:0/18:1、TG14:0/16:0/18:2、TG14:0/16:1/18:1、TG14:0/16:1/18:2、TG14:0/17:0/18:1、TG14:0/18:0/18:1、TG14:0/18:2/18:2、TG14:1/16:0/18:1、TG14:1/16:1/18:0、TG14:1/18:0/18:2、TG14:1/18:1/18:1、TG15:0/16:0/18:1、TG15:0/18:1/18:1、TG16:0/16:0/16:0、TG16:0/16:0/18:0、TG16:0/16:0/18:1、TG16:0/16:0/18:2、TG16:0/16:1/17:0、TG16:0/16:1/18:1、TG16:0/17:0/18:1、TG16:0/17:0/18:2、TG16:0/18:0/18:1、TG16:0/18:1/18:1、TG16:0/18:1/18:2、TG16:0/18:2/18:2、TG16:1/16:1/16:1、TG16:1/16:1/18:1、TG16:1/17:0/18:1、TG16:1/18:1/18:1、TG16:1/18:1/18:2、TG17:0/18:1/18:1、TG18:0/18:0/18:1、TG18:0/18:1/18:1、TG18:0/18:2/18:2、TG18:1/18:1/18:1、TG18:1/18:1/18:2、TG18:1/18:1/20:4、TG18:1/18:2/18:2、TG18:2/18:2/18:2、TG18:2/18:2/20:4。
3.根据权利要求2所述的一种基于滤纸片干血斑检测人体血液中甘油三酯的方法，其特征在于，步骤S1具体包括以下步骤：
S101：将指尖血自然垂直滴在滤纸片上，使得血液在滤纸片上自然扩散，形成圆形的血斑；
S102：将滤纸片置于干净、阴暗、通风处干燥2小时后，装入含有干燥剂的密封袋，排出空气，置于-20℃进行保存。
4.根据权利要求2所述的一种基于滤纸片干血斑检测人体血液中甘油三酯的方法，其特征在于，在步骤S2中，选用直径为3mm的打孔器在滤纸片干血斑上两面完全浸润的位置处打孔，获取直径为3mm的干血斑。
5.根据权利要求4所述的一种基于滤纸片干血斑检测人体血液中甘油三酯的方法，其特征在于，在步骤S3中，将直径为3mm的干血斑装入1.5mL的EP管中，加入20μL水，静置15min进行水孵育，用以浸泡干血斑。
6.根据权利要求5所述的一种基于滤纸片干血斑检测人体血液中甘油三酯的方法，其特征在于，步骤S4具体包括以下步骤：
S401：用甲醇将50μM的TG16:0/18:0/16:0 D5内标物稀释10倍，配制成5μM的TG16:0/18:0/16:0 D5内标物标准工作液；
S402：向孵育后的EP管中加入10μL的TG16:0/18:0/16:0 D5内标物标准工作液。
7.根据权利要求6所述的一种基于滤纸片干血斑检测人体血液中甘油三酯的方法，其特征在于，步骤S5具体包括以下步骤：
S501：萃取液使用甲醇与异丙醇体积比为1：1的混合溶液，向EP管中加入70μL的混合溶液，涡旋1-2min；
S502：再将EP管置于漂浮板上，超声处理40-60min，温度控制在10-20℃。
8.根据权利要求7所述的一种基于滤纸片干血斑检测人体血液中甘油三酯的方法，其特征在于，步骤S6具体包括以下步骤：
S601：将EP管置于15000rpm的高速离心机上，温度控制在15℃，离心处理10min；
S602：取离心处理后的上层清液70μL，装入进样瓶的内插管中，待进样。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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