CN115047084A - 血液脂质在奶制品摄入和疾病预测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及作为奶制品摄入生物标志物的脂质和/或其检测试剂在制备鉴定奶制品摄入、预测心血管疾病风险、鉴定心血管风险因素或其变化、研究奶制品与心血管健康关系的试剂盒中的用途。

Description

血液脂质在奶制品摄入和疾病预测中的应用
技术领域
本发明涉及疾病预测和诊断领域，更具体地涉及血液脂质在用作奶制品摄入的生物标志物、评估奶制品摄入、预测心血管疾病的发病风险中的应用。
背景技术
心血管疾病是全球首位的致死和致残因素，据《中国心血管健康与疾病报告2019》，我国心血管病患者高达3.3亿，给社会经济及公共健康造成了沉重的负担。其发生、发展是膳食等环境因素与遗传因素长期共同作用的结果，因此具有高度可防可控性。奶制品是健康膳食模式的一部分，含有丰富的优质乳清蛋白、脂质、维生素、矿物质等，极有可能成为一种经济有效预防管理心血管疾病的有利策略，明确奶制品暴露与心血管健康的关系及其潜在机制是预防、管理的关键。然而由于调查对象的主观回忆偏差、食品成分数据库覆盖范围有限等原因，人群研究中利用问卷获得的奶制品摄入数据准确性难以保证，其与心血管疾病的关系及潜在机理仍不清晰。
营养代谢组学是对血液、尿液或组织中小分子代谢物的定量测定，通过检测某一特定饮食或饮食模式的代谢组变化来捕捉反映食物内源暴露或代谢应答的标志物，因而更加准确无偏倚定义膳食与疾病的关系，同时为膳食-疾病二者的关联提供机理支撑。目前国外已有一些干预研究采用非靶向代谢组探讨了奶酪、牛奶、或乳清蛋白饮食餐后代谢组的变化，另有少量横断面的人群研究探索了血液代谢组与膳食频率问卷获取的奶制品摄入的关系。然而，由于非靶向代谢组检测平台、饮食快速变迁、及控制的协变量包括膳食因素等存在差异，尽管目前已发现一些代谢物如尿苷、泛酸盐、植物半乳糖与奶制品摄入高度相关，但大部分代谢物难以重复验证，且尚无证据报道上述代谢物特征对心血管健康的有益作用。
奶制品及牛奶含有丰富的脂质，其中新鲜牛乳中约含3％-5％脂肪，包含数千种脂质分子。动物及临床干预研究提示奶制品中极性脂质通过调控脂代谢紊乱、炎症、及肠道菌群，对心血管健康具有保护作用。然而，目前有关奶制品摄入与血液脂质组的人群研究十分匮乏，是否特定脂质特征能够反映膳食奶制品的摄入，且揭示奶制品与心血管疾病或其风险因素的关系亟需探索。
发明内容
本发明通过在两个独立的中国人群筛选350种血浆脂质，提供4种特定脂质用作奶制品摄入的生物标志物。
本发明第一方面提供作为奶制品摄入的生物标志物的脂质和/或其检测试剂在制备用于检测所述脂质以鉴定奶制品摄入、预测心血管疾病风险、鉴定心血管风险因素或其变化、研究奶制品与心血管健康关系的试剂盒中的用途，所述脂质包括鞘磷脂，所述鞘磷脂含有碳原子数≥12的偶数碳脂肪酸，例如碳原子数为12-22的偶数碳脂肪酸，较优地为14-20的偶数碳脂肪酸。
在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂选自SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂含有C14:0或C14:1酰基脂肪酸。
在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂包括SM(OH)C32:2、SM C32:1。在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂还包括SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2。
在一个或多个实施方案中，所述脂质还包括C18:1反式脂肪酸。
在一个或多个实施方案中，所述脂质是存在于哺乳动物(如人)血液或尿液中的脂质或在哺乳动物(如人)血液或尿液可检测的脂质。
在一个或多个实施方案中，所述的检测包括辅助检测和/或早期检测。
在一个或多个实施方案中，所述的检测为血液检测、血浆检测、血清检测、或尿液检测。
在一个或多个实施方案中，所述的检测针对的检测样品包括血液样品、血浆样品、血清样品、或尿液样品。
在一个或多个实施方案中，所述检测的方法选自以下的一种或多种：色谱、质谱、鸟枪法、核磁共振。优选地，所述检测的方法为靶向或非靶向液相色谱-质谱法、流动注射技术-质谱法、鸟枪法、核磁共振法。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂是检测样品中所述脂质含量的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂选自：丁醇、甲醇、异丙醇、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、氯仿、乙酸、1,2-双十二烷酰-sn-丙三氧基-3-磷酸胆碱、甲酸、乙腈、乙酸铵、甲醇。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂是所述脂质的色谱和/或质谱检测试剂。例如：用于脂质提取的甲醇、甲基叔丁基醚，用作内标的同位素标记的dSM(24:1)，用于溶解脂质的二氯甲烷、甲醇、乙酸铵，用于色谱的流动相(如乙酸铵、乙腈)，用于色谱的固定相(如全多孔型担体)。还例如：用于提取、溶解C18:1反式脂肪酸的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述检测是将来自对象的样品的鞘磷脂含量(A1)与正常人群的相应鞘磷脂含量(A0)相比较，若A1显著高于A0，则说明对象的奶制品摄入高、心血管疾病风险低、心血管风险因素改善。在一个或多个实施方案中，所述“显著高于”指A1/A0≥1.07，优选为A1/A0≥1.2，更优选为A1/A0≥1.5。
在一个或多个实施方案中，所述的正常人群的数量为至少100人，较佳地至少300人，更佳地至少500人，最佳地至少1000人。
在一个或多个实施方案中，所述检测是将来自对象的样品的鞘磷脂含量(A1)与该对象在先的相应鞘磷脂含量(A1’)相比较，若A1显著高于A1’，则说明对象的奶制品摄入增加、心血管疾病风险降低、心血管风险因素改善，优选地，所述“显著高于”指A1/A1’≥1.07，优选为A1/A1’≥1.2，更优选为A1/A1’≥1.5。
在一个或多个实施方案中，所述奶制品包括选自以下的一种或多种：鲜奶、酸奶、冰激凌、奶粉、奶片、奶酪、奶油、奶油蛋糕、炼乳、及其他奶制品。
在一个或多个实施方案中，所述心血管风险因素包括腰围、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、血压和血糖中的一个或多个，优选至少3个。
在一个或多个实施方案中，所述心血管风险因素变化是6年心血管风险因素变化。
在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂的含量与对象的心血管疾病风险和心血管风险因素或其变化呈负相关。
本发明第二方面提供一种用于鉴定奶制品摄入、检测心血管疾病风险、鉴定心血管风险因素或其变化、研究奶制品与心血管健康关系的试剂盒，包括：
(1)用于检测样品中作为奶制品摄入生物标志物的脂质含量的检测试剂，其中所述样品选自血液样品、血浆样品、血清样品、或尿液样品，并且所述脂质包括鞘磷脂，所述鞘磷脂含有碳原子数≥12的偶数碳脂肪酸，例如碳原子数为12-22的偶数碳脂肪酸；
(2)任选的鞘磷脂标准品；
(3)任选的使用说明书。
在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂选自SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂含有C14:0或C14:1酰基脂肪酸。
在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂包括SM(OH)C32:2、SM C32:1。在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂还包括SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2。
在一个或多个实施方案中，所述脂质还包括C18:1反式脂肪酸。
在一个或多个实施方案中，所述使用说明书中记载了本发明第三方面所述的方法。
在一个或多个实施方案中，项目(1)中所述的用于检测样品中脂质含量的检测试剂如本文第一方面中所述。
本发明的第三方面提供一种用于鉴定奶制品摄入、检测心血管疾病风险、鉴定心血管风险因素或其变化的方法，包括以下步骤：
(1)检测对象的样品中作为奶制品摄入生物标志物的脂质的含量，其中所述脂质包括鞘磷脂，所述鞘磷脂含有碳原子数≥12的偶数碳脂肪酸(例如碳原子数为12-22的偶数碳脂肪酸)，和
(2)根据所测脂质的含量确定总奶制品摄入、牛奶摄入、心血管疾病风险、心血管风险因素或其变化。
在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂选自SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂含有C14:0或C14:1酰基脂肪酸。
在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂包括SM(OH)C32:2、SM C32:1。在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂还包括SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2。
在一个或多个实施方案中，所述脂质还包括C18:1反式脂肪酸。
在一个或多个实施方案中，所述脂质的含量与对象的心血管疾病风险和心血管风险因素或其变化呈负相关。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)包括：
(2.1)将步骤(1)的鞘磷脂含量(A1)与正常人群样品的鞘磷脂含量(A0)相比，若A1显著高于A0，则说明对象的奶制品摄入高、心血管疾病风险低、心血管风险因素改善，优选地，所述“显著高于”指A1/A0≥1.07，优选为A1/A0≥1.2，更优选为A1/A0≥1.5；或
(2.2)将步骤(1)的鞘磷脂含量(A1)与该对象在先的相应鞘磷脂含量(A1’)相比较，若A1显著高于A1’，则说明对象的奶制品摄入增加、心血管疾病风险降低、心血管风险因素改善，优选地，所述“显著高于”指A1/A1’≥1.07，优选为A1/A1’≥1.2，更优选为A1/A1’≥1.5。
在一个或多个实施方案中，所述样品包括血液样品、血浆样品、血清样品、或尿液样品。
在一个或多个实施方案中，所述检测的方法选自以下的一种或多种：色谱、质谱、鸟枪法、核磁共振。优选地，所述检测的方法为靶向或非靶向液相色谱-质谱法、流动注射技术-质谱法、鸟枪法、核磁共振法。
在一个或多个实施方案中，所述奶制品包括选自以下的一种或多种：鲜奶、酸奶、冰激凌、奶粉、奶片、奶酪、奶油、奶油蛋糕、炼乳、及其他奶制品。
在一个或多个实施方案中，所述心血管风险因素包括腰围、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、血压和血糖中的一个或多个，优选至少3个。
在一个或多个实施方案中，所述心血管风险因素变化是6年心血管风险因素变化。
本发明还提供一种鉴定奶制品摄入、检测心血管疾病风险、鉴定心血管风险因素或其变化的装置，所述装置包括存储器、处理器以及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述程序时实现以下步骤：
(1)检测对象的样品中作为奶制品摄入生物标志物的脂质的含量，其中所述脂质包括鞘磷脂，所述鞘磷脂含有碳原子数≥12的偶数碳脂肪酸(例如碳原子数为12-22的偶数碳脂肪酸)，和
(2)根据所测脂质的含量确定奶制品摄入、心血管疾病风险、心血管风险因素或其变化。
在一个或多个实施方案中，所述装置的其他特征如本文第三方面的方法中的特征所述。
本发明还提供一种构建奶制品摄入预测模型的方法，包括：
(1)获取对象的奶制品摄入情况，例如每天的奶制品摄入量，
(2)获取奶制品摄入后对象的样品中脂质的含量，其中所述脂质包括鞘磷脂，所述鞘磷脂含有碳原子数≥12的偶数碳脂肪酸(例如碳原子数为12-22的偶数碳脂肪酸)，和
(3)根据(1)和(2)的数据利用数学方法构建总奶制品摄入或牛奶摄入预测模型。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括采用问卷方式获取对象的奶制品摄入情况。
在一个或多个实施方案中，所述数学方法选自广义线性回归、逻辑回归、随机森林或支持向量机。
在一个或多个实施方案中，所述奶制品包括选自以下的一种或多种：鲜奶、酸奶、冰激凌、奶粉、奶片、奶酪、奶油、奶油蛋糕、炼乳、及其他奶制品。
在一个或多个实施方案中，奶制品摄入量以份计，一份奶制品的重量如下：鲜奶，250克；酸奶，250克；含奶冰激凌，150克；奶粉，40克；奶片，40克；奶酪，30克；奶油，30克；奶油蛋糕，100克；炼乳，125克。
在一个或多个实施方案中，模型如式(I)或式(II)所示：
总奶制品摄入量(份/天)＝0.009×ln[SM(OH)C32:1]+0.361×ln[SM C32:1]+0.178×ln[SM(OH)C38:2]-0.199×ln[SM(2OH)C30:1]+0.461 (I)
牛奶摄入量(份/天)＝0.023×ln[SM(OH)C32:1]+0.240×ln[SM C32:1]+0.116×ln[SM(OH)C38:2]-0.131×ln[SM(2OH)C30:1]+0.323 (II)
本发明还提供脂质和/或奶制品在制备降低心血管疾病风险、改善心血管风险因素的试剂盒中的用途，所述脂质包括鞘磷脂，所述鞘磷脂含有碳原子数≥12的偶数碳脂肪酸，例如碳原子数为12-22的偶数碳脂肪酸。
在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂选自SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂含有C14:0或C14:1酰基脂肪酸。
在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂包括SM(OH)C32:2、SM C32:1。在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂还包括SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2。
在一个或多个实施方案中，所述脂质还包括C18:1反式脂肪酸。
在一个或多个实施方案中，所述奶制品包括选自以下的一种或多种：鲜奶、酸奶、冰激凌、奶粉、奶片、奶酪、奶油、奶油蛋糕、炼乳、及其他奶制品。
在一个或多个实施方案中，所述心血管风险因素包括腰围、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、血压和血糖中的一个或多个，优选至少3个。
在一个或多个实施方案中，所述心血管风险因素变化是6年心血管风险因素变化。
本发明还提供一种用于降低心血管疾病风险、改善心血管风险因素的药物组合物，包含脂质和/或奶制品和药学上可接受的辅料，所述脂质包括鞘磷脂，所述鞘磷脂含有碳原子数≥12的偶数碳脂肪酸，例如碳原子数为12-22的偶数碳脂肪酸；。
在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂选自SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂含有C14:0或C14:1酰基脂肪酸。
在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂包括SM(OH)C32:2、SM C32:1。在一个或多个实施方案中，所述鞘磷脂还包括SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2。
在一个或多个实施方案中，所述脂质还包括C18:1反式脂肪酸。
在一个或多个实施方案中，所述奶制品包括选自以下的一种或多种：鲜奶、酸奶、冰激凌、奶粉、奶片、奶酪、奶油、奶油蛋糕、炼乳、及其他奶制品。
在一个或多个实施方案中，所述心血管风险因素包括腰围、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、血压和血糖中的一个或多个，优选至少3个。
在一个或多个实施方案中，所述心血管风险因素变化是6年心血管风险因素变化。
本发明优点：
1、现有技术中检测鞘磷脂(SM)种类少，主要关注含有d18:1和饱和脂肪酸结构的鞘磷脂，如SM(d18:1/16:0)，而本文覆盖的鞘磷脂种类较多(46种)；
2、奶制品是一种广泛食用的健康食品，本发明的4种鞘磷脂能够无偏倚、客观反映人们奶制品的摄入量。本发明首次发现4种鞘磷脂可以作为敏感且稳定的反映奶制品摄入的生物标志物，准确反映奶制品的摄入，并作为其生物标志物研究与心血管风险因素的关系。
附图说明
图1，奶制品的脂质特征标志物与各种膳食摄入的Spearman相关系数。
模型：校正年龄、性别、地区、城乡、教育水平、吸烟、饮酒、体力活动、慢性疾病家族史、降脂药服用、膳食因素(红肉、蛋类、水产品、豆奶、蔬菜、水果、膳食纤维)以及BMI。**，Bonferroni多重校正显著。*，P<0.05。
图2，脂质特征标志物与奶制品摄入的接收者操作特征曲线。
A,总人群：反式脂肪酸18:1异构体AUC＝0.75(95％CI 0.74-0.77)，脂质特征组合AUC＝0.87(95％CI 0.86-0.88)，二者Delong检验P值<0.001。脂质特征组合结合反式脂肪酸18:1异构体AUC＝0.89(95％CI 0.88-0.90)；
B,北京地区：反式脂肪酸18:1异构体AUC＝0.69(95％CI 0.67-0.71)，脂质特征组合AUC＝0.81(95％CI 0.79-0.83)，二者Delong检验P值<0.001。脂质特征组合结合反式脂肪酸18:1异构体AUC＝0.82(95％CI 0.81-0.84)；
C,上海地区：反式脂肪酸18:1异构体AUC＝0.79(95％CI 0.77-0.81)，脂质特征组合AUC＝0.89(95％CI 0.88-0.91)，二者Delong检验P值<0.001。脂质特征组合结合反式脂肪酸18:1异构体AUC＝0.91(95％CI 0.90-0.92)。脂质特征组合由SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、及SM(OH)C38:2的浓度进行加权求和获得。
图3，奶制品及其脂质特征标志物与心血管风险因素6年变化关系。
模型1：校正年龄、性别、地区、城乡、教育水平、吸烟、饮酒、体力活动、慢性疾病家族史、降脂药服用、膳食因素(红肉、蛋类、水产品、豆奶、蔬菜、水果、膳食纤维)、各指标的基线水平；
模型2：模型1基础上进一步校正BMI、基线甘油三酯与低密度脂蛋白胆固醇水平。脂质特征组合由SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、及SM(OH)C38:2的浓度进行加权求和获得。***，P<0.001。**，P<0.01。*，P<0.05。
具体实施方式
发明人通过应用高通量靶向脂质组学定量检测血浆脂质，发现并验证4种鞘磷脂SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2及其组合与奶制品摄入和心血管疾病风险呈显著关联。
脂质和鞘磷脂
本文所述“脂质”是油、脂肪、类脂的总称。“鞘磷脂”(Sphingomyelin)由神经酰胺(Ceramide,Cer)和磷酰胆碱组成。鞘磷脂和神经酰胺均属于下式(I)所示的鞘脂：
Figure BDA0002968385430000081
对于神经酰胺，R1是C10-C30烷基或C10-C30烯基(例如C12-C26烷基或C12-C26烯基，或C16-C22烷基或C16-C22烯基)，R2是H，X是CH＝CH或CH2-CH2。饱和神经酰胺指R1是烷基的神经酰胺，例如Cer(d18:1/20:0)。不饱和神经酰胺指R1含有不饱和键的神经酰胺，例如Cer(d18:1/18:1)。如Cer(d18:a/b:c)所示的神经酰胺中，a表示X的不饱和度(双键数)，b表示R1的碳原子数，c表示R1的不饱和度。例如，Cer(d18:1/14:0)所示的神经酰胺中，R1是C14烷基，R2是H，X是CH＝CH；又如，Cer(d18:1/20:1)所示的神经酰胺中，R1是含一个双键的C20烯基，R2是H，X是CH＝CH；再如，Cer(d18:0/24:1)所示的神经酰胺中，R1是含一个双键的C24烯基，R2是H，X是CH2-CH2。
对于鞘磷脂，R1是烷基或烯基，R2是磷酰胆碱，X是亚烷基或亚烯基。饱和鞘磷脂指R1是烷基并且X是亚烷基的鞘磷脂，例如SM C34:0。不饱和鞘磷脂指R1和/或X含有不饱和键(例如双键)的鞘磷脂，例如SM C36:1。如SM Ca:b所示的鞘磷脂，a表示该鞘磷脂的总碳数，b表示该R1和X的总不饱和度(双键数)，所以R1和X的总碳数为a-16。例如，SM C34:0所示的鞘磷脂中，R1是烷基，R2是磷酰胆碱，X是亚烷基，R1和X的总碳数是18，R1和X的总不饱和度为0，即不含双键；又如，SM C36:1所示的鞘磷脂中，R2是磷酰胆碱，R1和X的总碳数是20，R1和X的总不饱和度为1，即R1和X共含有一个双键。此外，羟基鞘磷脂是指鞘磷脂的鞘氨醇骨架(X)或脂肪酸残基(R1)上额外增加一个(SM(OH))或两个羟基(SM(2OH))的衍生物，例如，SM(OH)C44:3、SM(2OH)C30:2。
预测方法和模型
发明人发现，检测以下脂质的血液水平可以用于鉴定总奶制品摄入/牛奶摄入：SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2。所述脂质还可包括C18:1反式脂肪酸。因此，这些脂质可以作为奶制品摄入的生物标志物。
发明人还发现，上述脂质的水平与心血管疾病风险之间相关性和奶制品摄入与心血管疾病风险之间的相关性类似。因此，检测这些脂质的血液水平还可以预测心血管疾病风险、鉴定心血管风险因素或其变化，在研究奶制品与心血管健康关系中发挥作用。本文所述奶制品可以是任何含奶的制品，包括但不限于鲜奶、酸奶、冰激凌、奶粉、奶片、奶酪、奶油、奶油蛋糕、炼乳、及其他奶制品。
本文所述“心血管疾病”一系列涉及循环系统的疾病，包括但不限于：冠心病、心绞痛、高血压、高血脂、高血糖、心肌梗死及其相关病症。
本文所述“心血管风险因素”包括腰围、甘油三酯、高密度脂蛋白、血压和血糖中的一个或多个。根据美国2005年修订的国家胆固醇教育计划成人治疗方案III(NCEP-ATPIII)中针对亚裔的标准，满足下列5个组分中的3项或以上的个体被定义为患有心血管风险因素≥3：向心性肥胖：男性腰围≥90cm，女性腰围≥80cm；高甘油三酯血症：甘油三酯≥1.7mmol/L；低高密度脂蛋白-胆固醇：男性高密度脂蛋白-胆固醇<1.03mmol/L，女性高密度脂蛋白-胆固醇<1.30mmol/L；血压升高：收缩压≥130mmHg或舒张压≥85mmHg或使用降压药；高血糖：空腹血糖≥5.6mmol/L或已经诊断为2型糖尿病或使用口服降糖药或胰岛素。
因此，本发明提供鉴定奶制品摄入、检测心血管疾病风险、鉴定心血管风险因素或其变化的方法，包括以下步骤：(1)检测对象的样品中作为奶制品摄入生物标志物的脂质的含量，其中所述脂质包括鞘磷脂，所述鞘磷脂含有碳原子数≥12的偶数碳脂肪酸(例如碳原子数为12-22的偶数碳脂肪酸)，和(2)根据所测脂质的含量确定奶制品摄入、心血管疾病风险、心血管风险因素或其变化。本文中，与奶制品摄入和心血管疾病风险相关的脂质包括选自SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2中的一种或多种鞘磷脂，和任选的C18:1反式脂肪酸。优选地，所述鞘磷脂包括含有C14:0或C14:1酰基脂肪酸的鞘磷脂。例如所述鞘磷脂包括SM(OH)C32:2，SM C32:1，和可选地包括SM(2OH)C30:2，SM(OH)C38:2。所述脂质的含量与心血管疾病风险和心血管风险因素或其变化呈负相关。
在与正常人群样品比较的实施方案中，步骤(2)包括：(2.1)将步骤(1)的鞘磷脂含量(A1)与正常人群样品的鞘磷脂含量(A0)相比，若A1显著高于A0，则说明对象的奶制品摄入高、心血管疾病风险低、心血管风险因素改善，优选地，所述“显著高于”指A1/A0≥1.07，优选为A1/A0≥1.2，更优选为A1/A0≥1.5。在与相同对象不同时间的样品比较的实施方案中，步骤(2)包括：(2.2)将步骤(1)的鞘磷脂含量(A1)与该对象在先的相应鞘磷脂含量(A1’)相比较，若A1显著高于A1’，则说明对象的奶制品摄入增加、心血管疾病风险降低、心血管风险因素改善，优选地，所述“显著高于”指A1/A1’≥1.07，优选为A1/A1’≥1.2，更优选为A1/A1’≥1.5。
或者，步骤(2)包括，根据式(I)或式(II)所示模型确定总奶制品摄入/牛奶摄入水平、心血管疾病风险和心血管风险因素水平：
总奶制品摄入量(份/天)＝0.009×ln[SM(OH)C32:1]+0.361×ln[SM C32:1]+0.178×ln[SM(OH)C38:2]-0.199×ln[SM(2OH)C30:1]+0.461 (I)
牛奶摄入量(份/天)＝0.023×ln[SM(OH)C32:1]+0.240×ln[SM C32:1]+0.116×ln[SM(OH)C38:2]-0.131×ln[SM(2OH)C30:1]+0.323 (II)。
上述模型是发明人根据所述脂质和奶制品的关系构建的模型。构建奶制品摄入预测模型的方法包括：(1)利用膳食频率问卷、24小时膳食回顾、或者食物记录等方式获取对象的奶制品摄入情况，例如每天的奶制品摄入重量，(2)获取奶制品摄入后对象的样品中脂质的含量，其中所述脂质包括鞘磷脂，所述鞘磷脂含有碳原子数≥12的偶数碳脂肪酸(例如碳原子数为12-22的偶数碳脂肪酸)，和(3)根据(1)和(2)的数据利用数学方法构建奶制品摄入预测模型。所述数学方法可以是本领域已知的任何方法，例如广义线性回归、逻辑回归、随机森林或支持向量机。
在示例性实施方案中，奶制品的摄入重量是每天的奶制品摄入量。在该实施方案中，奶制品食物共有5项，包括鲜奶、酸奶、冰激凌、奶粉、和其他奶制品。其中，鲜奶、酸奶、冰激凌用“份”记录，一份的重量依此为250克、250克、150克。奶粉、其他奶制品的摄入以“克”记录，一份的重量分别为：奶粉，40克；奶片，40克；奶酪，30克；奶油，30克；奶油蛋糕，100克；炼乳，125克。
此外，本发明还揭示了存储计算机程序的计算机可读存储介质，存储介质上所存储的计算机程序运行后执行本文所述的鉴定奶制品摄入、检测心血管疾病风险、鉴定心血管风险因素或其变化的方法。结合本文中公开的实施方案描述的方法或算法的步骤可直接在硬件中、在由处理器执行的软件模块中、或在这两者的组合中体现。如果在软件中实现为计算机程序产品，则各功能可以作为一条或更多条指令或代码存储在计算机可读介质上或藉其进行传送。计算机可读介质包括计算机存储介质和通信介质两者，其包括促成计算机程序从一地向另一地转移的任何介质。存储介质可以是能被计算机访问的任何可用介质。作为示例而非限定，这样的计算机可读介质可包括RAM、ROM、EEPROM、CD-ROM或其它光盘存储、磁盘存储或其它磁存储设备、或能被用来携带或存储指令或数据结构形式的合意程序代码且能被计算机访问的任何其它介质。示例性存储介质耦合到处理器以使得该处理器能从/向该存储介质读取和写入信息。在替换方案中，存储介质可以被整合到处理器。处理器和存储介质可驻留在ASIC中。ASIC可驻留在用户终端中。在替换方案中，处理器和存储介质可作为分立组件驻留在用户终端中。
检测试剂及检测方法
本发明涉及定量和定性检测人体血液脂质水平，检测脂质的血液水平可使用本领域已知的任何方法，例如高效靶向液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)。示例性的检测步骤包括：收集血浆，提取脂质(例如采用甲基叔丁基醚方法)，萃取，离心，干燥后溶解，高效液相色谱(例如ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱)分离，质谱检测(例如电喷雾电离、正负模式、多反应监测模式)。检测结果可使用常规数据分析方法(例如Analyst 1.6.3软件和MultiQuant3.0软件)进行定量计算。所有脂质均根据内标进行数据校正，例如使用同位素标记的dSM(24:1)标准品作为鞘磷脂的内标。此外，所述方法还可以是其他本领域常用的检测脂质的方法，例如流动注射技术-质谱法、鸟枪法、核磁共振法、基于抗原抗体反应的方法。
本文所述“试剂”是检测血液或尿液中本文所述一种或多种脂质的试剂。本文所述检测脂质的试剂包括脂质检测过程中所涉的任何试剂，例如用于从样品(例如血液)中提取脂质的试剂(例如甲基叔丁基醚方法中所用的试剂)；用于纯化脂质的试剂(例如色谱中的流动相、固定相、缓冲液等)；用于质谱检测脂质的试剂(例如电喷雾串联质谱所用的雾化气、辅助气、碰撞气等)。示例性地，所述试剂是使用液相色谱-质谱检测脂质所用的试剂。例如：氯仿、甲醇、丁醇、异丙醇、甲酸、乙酸、乙腈、乙酸乙酯、乙酸铵、甲基叔丁基醚、同位素标记的dSM(24:1)、用于色谱的流动相(如乙酸铵、乙腈)、用于色谱的固定相(如全多孔型担体)。此外，所述试剂还包括本领域常用的检测脂质的方法中所用试剂，例如用于脂质提取的丁醇/甲醇、异丙醇、甲基叔丁基醚/甲醇/异丙醇、异丙醇/乙酸乙酯、氯仿/甲醇/乙酸，用于脂质溶解的甲醇/异丙醇、氯仿/甲醇，用作流动相的甲酸/乙腈/异丙醇、乙酸铵/甲酸、甲醇/乙酸、乙酸铵/甲醇/乙酸。在一个或多个实施方案中，所述试剂是检测血液或尿液中所述脂质的试剂。例如：用于脂质提取的甲醇和/或甲基叔丁基醚，用作内标的同位素标记的dSM(24:1)，用于溶解脂质的50％二氯甲烷-甲醇/乙酸铵50％(v:v)，用于色谱的流动相(如10mM的乙酸铵/纯乙腈)，用于色谱的固定相(如全多孔型担体)。
试剂盒
本发明还提供了一种用于鉴定奶制品摄入、检测心血管疾病风险、鉴定心血管风险因素或其变化、研究奶制品与心血管健康关系的试剂盒，其中本文所述脂质作为奶制品摄入的生物标志物。可用于本发明的试剂盒通常包括如前所述的检测样品中脂质含量的试剂、脂质标准品和/或说明书。其中，所述脂质标准品是同位素标记的所述脂质。所述的说明书中记载了检测方法以及根据不同样品测定值A1判断个体心血管疾病风险的方法。所述脂质包括含有碳原子数≥12的偶数碳脂肪酸的鞘磷脂(例如SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2中的一种或多种)和任选的C18:1反式脂肪酸。
一种示例性的判断个体心血管疾病风险方法是本文上述鉴定奶制品摄入、检测心血管疾病风险、鉴定心血管风险因素或其变化的方法。一种典型的本发明的试剂盒可用于检测人血液样品、血浆样品、或尿液样品。其中，所述的血液或血浆样品可来自于外周血。
药物组合物
由于发明人发现SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2和SM(OH)C38:2或奶制品与心血管病存在一致的负相关关系，因此，本发明还提供本文所述脂质在制备用于降低心血管疾病风险、改善心血管风险因素的药物或试剂盒中的应用。
本发明的药物组合物包含上述脂质中任一和/或奶制品和药学上可接受的辅料。本发明中，“药学上可接受的辅料”是用于将本发明的脂质和/或奶制品传送给动物或人的药学上或食品上可接受的载体、溶剂、悬浮剂或赋形剂。本文中，药学上可接受的辅料在所采用的剂量和浓度对所述组合物的接受者是无毒的。可包括本领域周知的治疗中常用于递送康生物的各种类型的载体或赋形剂。示例性的辅料可以是液体或固体，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，碳水化合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂、防腐剂、载剂、助流剂、甜味剂、染料/着色剂、增味剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。在一些实施方案中，药学上可接受的辅料可以包括一种或多种非活性成分，包括但不限于：稳定剂、防腐剂、添加剂、佐剂、喷雾剂、压缩空气或其它适宜的气体，或其它适宜的与药效化合物合用的非活性成分。更具体而言，合适的辅料可以是本领域常用于转座系统或含有其的细胞给药的辅料。辅料的示例包括各种乳糖、甘露醇，油类如玉米油，缓冲剂如PiggyBacS、盐水、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇、二甲亚砜，酰胺如二甲基乙酰胺，蛋白质如白蛋白，和去污剂如吐温80，单糖和低聚多糖如葡萄糖、乳糖、环糊精和淀粉。
其它药物组合物将为本领域技术人员显而易见，包括在持续或控制释放递送配制物中包含本文所述脂质和/或奶制品的配制物。用于配制多种其它持续或可控传递方式的技术(诸如脂质体载剂、生物易蚀微粒或多孔珠粒和积存注射)也为本领域技术人员所知。
用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。在组合物冻干时，可在冻干和复水之前或之后使用此方法进行灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。肠胃外组合物通常放在具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液带或小瓶。
通常，组合物中含有治疗有效量的本文所述脂质和/或奶制品。治疗有效量是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解疾病或病症的剂量。实现这些效果可以通过插入具有相应功能的外源基因实现的，所述相应功能的外源基因具有相应于具体用途的功能，例如治疗功能或者诱导功能。可根据患者年龄、性别、所患病症及其严重程度、患者的其它身体状况等因素确定治疗有效量。治疗有效量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案在多个剂量中给药。本文中，受试者或患者通常指哺乳动物，尤其指人。示例性地，所述组合物含有按照重量比例为例如0.001-50％，优选0.01-30％，更优选0.05-10％的本文所述的脂质和/或奶制品。
本文所述组合物可与具有所述外源基因所实现功能相似或相应的功能的其他试剂联用。例如与治疗所述外源基因所治疗的疾病或病症的试剂联用。本领域技术人员可确定其他试剂的给药剂量。
本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物机体的剂型都是可以的，可以被制成单位剂型的形式。剂型比如可选自：凝胶剂、气雾剂、片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、悬浮液、注射剂、散剂、丸剂、控速释剂、输液剂、混悬剂等等。根据本文所述的脂质和/或奶制品所预防和治疗的疾病类型，本领域人员可以选择方便应用的剂型。从易于制备和储存的立场看，优选的组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。本文所述的脂质和/或奶制品或其组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。本文所述的脂质和/或奶制品或其组合物也可储存在适当的容器，并置于试剂盒或药盒中。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件进行，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例
一、研究方法
1.研究人群
建立奶制品摄入的生物标记物的样本来自两个独立的中国人群。发现人群基于一项人群设计的前瞻性流行病学调查，即“中国老龄人口营养与健康研究”，旨在研究环境、遗传因素及其交互作用在心血管代谢性疾病发生发展中的作用。在2005年，通过多级抽样方法招募了3289名调查对象，调查对象为北京和上海的50-70岁社区居民，对上述对象展开追踪研究。2011年，在3289名基线调查对象中有760名失访(23.1％)，其中554名无法联系上，206名拒绝参加。因此，总共有2529名调查对象参加了追踪调查。验证人群来源于一项随机化平行设计的营养干预研究，基线时招募了253名空腹血糖受损的超重或肥胖个体，项目方案在美国临床试验注册网(www.ClinicalTrials.gov)上注册(注册号为NCT03856762)。在两项研究基线时，采用面对面家访的形式收集人口学资料、生活方式和健康信息等。在血浆脂质组与奶制品摄入的关系研究中，符合以下情况之一的调查对象将被排除：日均能量摄入超出合理范围(男性为800到4000kcal，女性为500到3500kcal)、无完整膳食数据、无血液脂质组数据。经排除，最终发现与验证人群样本分别包含2140人、212人。
在分析奶制品及其脂质特征标志物与某种心血管风险因素的关系中，采用前瞻性设计，研究样本来自于“中国老龄人口营养与健康状况研究”，排除基线及追踪中服用降糖药、降压药、降脂药的人群后，最终纳入分析的人数为：血压1205人，血糖1829人，血脂1673人，腰围2135人，腹型肥胖1097人，及心血管风险因素≥3 1243人。
上述两组样本来源项目都通过了中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所伦理委员审查，所有调查对象均签署了书面知情同意书。
2.膳食数据评估
发现人群膳食数据用包含74种食物的食物频率问卷收集，该问卷在2002年全国营养调查用问卷的基础上进行调整。验证人群膳食信息采用三天膳食记录表格来收集，记录的是过去一周中2个工作日和周末中的1天食用的所有食物。奶制品食物共有5项，包括鲜奶、酸奶、冰激凌、奶粉、和其他奶制品。其中，奶类、酸奶、冰激凌用“份”记录，一份的重量依此为250克、250克、150克。奶粉、其他奶制品的摄入以“克”记录，一份的重量分别为：奶粉，40克；奶片，40克；奶酪，30克；奶油，30克；奶油蛋糕，100克；炼乳，125克。膳食营养素根据中国食物成分表进行估计，并采用残差法进行能量矫正。
3.脂质组检测
采用高效靶向液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)方法，对血浆脂质组进行定量检测。脂质提取运用经过改良后的甲基叔丁基醚(MTBE)方法，经过萃取、离心、干燥后，将脂质提取物溶解，加入内标(Sciex,Foster City,CA,USA，具体每种脂质的内标参见表1和表2)，样本待上机检测。脂质组学分析使用ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱进行色谱分离，使用Nexera X2 LC-30AD系统(Shimadzu Scientific Instruments,Marlborough,MA,USA)结合Sciex 5500QTRAP三重四极杆质谱仪(Applied Biosystems/Sciex)进行质谱检测。使用电喷雾电离以正负模式进行质谱分析，以多反应监测(MRM)模式获取数据。使用Analyst 1.6.3软件(Sciex,Foster City,CA,USA)用于特征对齐，信号检测和信号集成，使用MultiQuant3.0软件(Sciex,Foster City,CA,USA)进行定量计算。考虑到系统误差，每检测10个样本加入一个质控样本进行数据监测，所有脂质均应根据内标进行数据校正。排除代谢物数值缺失值超过20％或变异系数大于30％的脂质种类后，最终完成350种脂质的定量分析(见表1和表2)。
表1同位素内标检测血浆脂质组的动态MRM参数
Figure BDA0002968385430000161
Figure BDA0002968385430000171
Figure BDA0002968385430000181
Figure BDA0002968385430000191
Figure BDA0002968385430000201
Figure BDA0002968385430000211
Figure BDA0002968385430000221
注：Q1表示母离子分子质量；Q3表示次级离子分子质量。
表2同位素内标检测血浆甘油酯的动态MRM参数
Figure BDA0002968385430000222
Figure BDA0002968385430000231
Figure BDA0002968385430000241
Figure BDA0002968385430000251
Figure BDA0002968385430000261
Figure BDA0002968385430000271
Figure BDA0002968385430000281
Figure BDA0002968385430000291
Figure BDA0002968385430000301
注：Q1表示母离子分子质量；Q3表示次级离子分子质量。
4.心血管风险因素评估
体重、身高、腰臀围和血压采用标准化体检采集，体质指数(Body mass index,BMI)是通过体重(千克)除以身高(米)的平方来计算的。在基线及追踪研究中收集空腹静脉血，经离心后取上清，置于-80度保存。空腹血糖、血脂(总胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇、高密度脂蛋白-胆固醇、甘油三酯)用全自动生化分析仪(Hitachi7080,Tokyo,Japan)检测，试剂购自Wako Pure Chemical Industries(Osaka，Japan)公司。根据美国2005年修订的国家胆固醇教育计划成人治疗方案III(NCEP-ATPIII)中针对亚裔的标准，满足下列5个组分中的3项或以上的个体被定义为患有心血管风险因素≥3：向心性肥胖：男性腰围≥90cm，女性腰围≥80cm；高甘油三酯血症：甘油三酯≥1.7mmol/L；低高密度脂蛋白-胆固醇；男性高密度脂蛋白-胆固醇<1.03mmol/L，女性高密度脂蛋白-胆固醇<1.30mmol/L；血压升高：收缩压≥130mmHg或舒张压≥85mmHg或使用降压药；高血糖：空腹血糖≥5.6mmol/L或已经诊断为2型糖尿病或使用口服降糖药或胰岛素。
5.统计分析
部分脂质由于浓度太低采用1/2最小检测值进行填补，并进行自然对数转换及标准化处理。采用多重线性回归及Spearman秩相关分析脂质与奶制品摄入及其他膳食因素的关系，模型校正年龄、性别、地区、城乡、教育水平、吸烟、饮酒、体力活动、慢性疾病家族史、降脂药服用、膳食因素(红肉、蛋类、水产品、豆奶、蔬菜、水果、膳食纤维)以及BMI，用Bonferroni校正进行多重检验。脂质组合标记物采用脂质浓度的加权值，权重来自于脂质与奶制品摄入的β效应值。分别在发现人群及其亚人群(北京或上海)采用接收者操作特征曲线下面积(Area under the receiver operating characteristic curve，AUC)评估筛选的脂质标记物对奶制品摄入的预测效果，不摄入任何奶制品的标记为“0”，奶制品摄入量大于1份/天的标记为“1”，并与本研究组前期已发现的反式脂肪酸标记物进行对比。采用一般线性模型评估脂质生物标记物与6年心血管风险因素变化的关系，以年龄、性别、地区、城乡、教育水平、吸烟、饮酒、体力活动、慢性疾病家族史、降脂药服用、膳食因素(红肉、蛋类、水产品、豆奶、蔬菜、水果、膳食纤维)、各指标的基线水平、BMI、基线甘油三酯、低密度脂蛋白-胆固醇为协变量。
上述统计分析采用SAS V9.4和R V3.4.4软件。双侧P<0.05被认为具有统计学显著性。
二、研究结果
1.人群特征
表3展示了根据奶制品摄入量分为不摄入、0-0.5份/天、0.5-1份/天、>1份/天四组的人群特征。发现及验证样本集不摄入的人群占比分别为40.7％、5.7％，摄入量超过1份/天的人群占比分别为16.6％、29.2％。在两个样本集中，奶制品摄入量更高的人群其蛋类的摄入量也更高。与发现人群相比，验证人群年纪更轻、饮酒更多，有更高的教育水平及低体力活动。此外，该人群红肉、水产品及豆制品的摄入量也相对更高。
2.血浆脂质与奶制品摄入关联关系
如表4所示，在控制了年龄、性别、地区、城乡、教育水平、吸烟、饮酒、体力活动、慢性疾病家族史、降脂药服用、膳食因素、BMI及经过多重校正后，在发现人群中，筛选发现26种脂质与奶制品摄入显著相关，其中鞘磷脂(Sphingomyelin,SM)亚类与奶制品摄入的关系最强。在验证人群中，26种脂质中有4种脂质，即SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2，与奶制品摄入强相关(效应值范围：0.126-0.146；表4)。进一步探讨该4种脂质特征标志物与各种膳食摄入的关系时，该4种脂质特征与奶制品表现一致且较强的正关联(偏相关系数rs：0.21至0.28)，而与红肉(偏相关系数rs：-0.06至0.07)、蛋类(偏相关系数rs：-0.14至-0.05)、水产品(偏相关系数rs：0.01至0.12)、豆奶(偏相关系数rs：-0.15至-0.01)、蔬菜(偏相关系数rs：-0.08至0.02)、水果(偏相关系数rs：0至0.06)、膳食纤维(偏相关系数rs：-0.04至0.02)表现弱相关或者不相关(图1)。在敏感性分析中，当排除137名基线服用降脂药的个体后，这4种脂质特征标志物与奶制品的关系基本保持不变(效应值范围：0.128-0.149；参见表5)。同时，在分析奶类及除奶类之外其他奶制品摄入与血浆脂质的关系，其中3种脂质特征标志物[SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2]与奶类具有一致且较强的相关性，该结果提示上述4种脂质特征与奶制品摄入的关系可能主要与奶类相关(效应值范围：0.111-0.123；参见表6)。
3.奶制品摄入预测模型
同传统的反式脂肪酸标记物18:1相比，该4种鞘磷脂加入模型显著提升对奶制品摄入的预测效果，AUC值由0.75上升至0.89(图2)。同时，分别在两个亚人群即北京和上海中验证上述脂质特征标志物对奶制品摄入的预测效果，在北京人群：反式脂肪酸18:1标记物的AUC值为0.69，4种脂质特征标志物的AUC值范围为0.74-0.76，4种脂质特征标志物结合反式脂肪酸18:1标记物的AUC值为0.82。在上海人群：反式脂肪酸的AUC值为0.79,4种脂质标记物的AUC值范围为0.81-0.83，4种脂质特征标志物结合反式脂肪酸18:1标记物的AUC值为0.91。上述结果揭示新发现的脂质特征标志物及其组合对奶制品摄入具有较优的预测效果。
4.奶制品及其脂质特征标志物与心血管风险因素6年变化关系
在控制了年龄、性别、地区、城乡、教育水平、吸烟、饮酒、体力活动、慢性疾病家族史、降脂药服用、膳食因素、BMI、相应指标的基线值和基线甘油三酯、低密度脂蛋白-胆固醇后，奶制品摄入与多种心血管风险因素6年变化呈显著负相关关系：收缩压：-1.27(95％置信区间：-2.26,-0.29)，P值＝0.012；舒张压：-0.56(95％置信区间：-1.12,-0.01)，P值＝0.047；空腹血糖：-0.14(95％置信区间：-0.21,-0.07)，P值＝0.00001；腹型肥胖：0.84(95％置信区间：0.72,0.97)，P值＝0.020；及心血管风险因素≥3：0.90(95％置信区间：0.82,0.99)，P值＝0.031。一致地是，奶制品摄入相关的脂质特征标志物与上述风险因素呈现相同的关系：收缩压：-2.68(95％置信区间：-4.92,-0.44)，P值＝0.019；舒张压：-1.88(95％置信区间：-3.14,-0.62)，P值＝0.003；空腹血糖：-0.28(95％置信区间：-0.41,-0.08)，P值＝0.003；腹型肥胖：0.71(95％置信区间：0.53,0.94)，P值＝0.018；及心血管风险因素≥3：0.68(95％置信区间：0.56,0.83)，P值＝0.0002(图3)。
Figure BDA0002968385430000331
Figure BDA0002968385430000341
Figure BDA0002968385430000351
Figure BDA0002968385430000361
四、讨论
本发明发现并验证了4种SMs可以作为反映膳食奶制品摄入的脂质特征标志物。同奶制品一样，该4种奶制品相关的脂质特征标志物与多个心血管风险因素6年变化值包括收缩压、舒张压、空腹血糖、肥胖等均呈显著负相关关系。上述发现提示：特定鞘磷脂或其组合可以作为稳定反映奶制品摄入的生物标记物，且部分解释奶制品与心血管健康的关系。
奶制品是许多生物活性脂质的重要食物来源，应用高通量靶向组学精确定量350多种脂质，本发明首次揭示SM亚类与奶制品摄入的关系最强。由于奶制品的乳脂球膜中含有丰富的磷脂如SM，因而解释了本发明中SM与奶制品的关系。在发现的4种SMs中，含有14:0或14:1脂肪酸的2种SMs即SM(OH)C32:2、SM C32:1与奶制品的关系最强。其中SM(OH)C38:2与奶制品的关系在额外校正两种最强的脂质标记物后依然显著，提示该种脂质可以反映独立奶制品摄入。此前的牛乳的脂质组学分析提示，牛奶中含有丰富的含C20-C22酰基链的SM，部分解释了发现的SM(OH)C38:2与奶制品的关系。
前期人群研究发现奇数链脂肪酸(15:0、17:0、17:1)、反式脂肪酸(16:1n-7、18:1)、14:0和14:1与奶制品存在较强相关性，建立了血液脂肪酸与奶制品摄入的关联。但近来有证据显示，奇数链脂肪酸也可能来源于膳食鱼类、反刍动物肉类、蛋类，甚至经人体肠道菌群内源性发酵生成，因而缺乏足够的特异性。如在一项包含3000名欧洲人的研究中，Lankinen等发现对于鱼类摄入较高的人群，反式脂肪酸15:0及17:0与鱼类及二十二碳六烯酸的摄入强相关，而与奶制品不相关。有趣的是，本发明在发现人群中也发现含有奇数链的三酰甘油如TAG(49:2)、TAG(53:3)与奶制品摄入呈正相关关系。但是，该类关系在验证集中未发现。与之相比，SM可以作为更加稳定、特异的奶制品标记物，支持如下：(1)本发现人群包括了两个年龄跨度相差20-30年、膳食生活习惯不同的独立人群，在两个人群中SM与奶制品的相关系数几乎一致；(2)发现的4种SMs与其他膳食因素包括红肉、水产品、蛋类、豆奶、蔬菜、水果及膳食纤维不相关或呈较弱的关系，证实奶制品是这些SM的主要食物来源；(3)与本研究组前期已发现的反式脂肪酸标记物18:1相比，该4种SMs能够区分不摄入人群及奶制品高摄入人群效果更佳。
与以前的人群研究相一致，本发明也发现了奶制品对血压、血糖、肥胖等多个心血管风险因素的保护作用。值得注意地是，本研究发现与奶制品摄入相关的3种SMs即SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2与血压包括收缩压和舒张压及肥胖呈显著负相关关系，而SM(OH)C38:2与6年血糖变化显著负相关。越来越多的实验证据发现，奶类中极性脂质不仅仅是作为一种结构成分，越来越被认为是“功能成分”。SM的紊乱一方面将导致血管离子如钙离子、钠离子稳态的失衡，同时SM的活性代谢物如S-1-P能直接通过激活Rho激酶信号通路调节平滑肌张力，进而调控血压。对于肥胖，动物实验发现高脂小鼠连续饲喂含有25％SM的极性脂质能有效抵抗高脂饮食诱导的肥胖，可能解释是SM通过调节肠道厚壁菌与拟杆菌的比例增加肠道细菌的多样性。尽管目前有关SM与血糖调节的研究结论不一致，已有证据表明牛奶中含有较多的饱和的SM，是饱和的鞘氨醇的重要来源，而饱和鞘氨醇证实能促进胰高血糖素样肽-1的分泌，抑制胰岛素抵抗的发生。综合上述证据，本发明筛选的4种SMs或许能为奶制品与心血管健康提供了新的机理解释。
本研究是目前已知的最大且最全面评估脂质代谢物与膳食奶制品摄入的关系的研究，同时还具有以下优势：(1)样本量大，且研究人群来自于两个完全独立的人群，年龄相差20-30年，两个人群的膳食模式及生活习惯具有显著差异，侧面证实了发现的奶制品标记物是稳定可靠的；(2)采用高通量靶向脂质组学，全面且系统地评估了血液脂质分子与膳食奶制品摄入的关系；(3)大量收集且小心控制了各种协变量包括生活方式、疾病史、用药情况、及膳食因素的影响；(4)本研究采用了严格的Bonferroni多重校正方法，有效规避了假阳性代谢物的出现。
综上所述：本发明在两个独立的中国人群中建立了血液脂质组与膳食奶制品摄入的关系。在诸如心血管疾病等代谢异常频发且饮食结构复杂多样的中国人群中，所筛选的脂质组特征可供大规模流行病学调查研究奶制品与心血管健康的关系，更加精确评估奶制品暴露与疾病的关系。

Claims (10)

1.脂质和/或其检测试剂在制备用于检测所述脂质以鉴定奶制品摄入、预测心血管疾病风险、鉴定心血管风险因素或其变化、研究奶制品与心血管健康关系的试剂盒中的用途，其中，所述脂质包括鞘磷脂，所述鞘磷脂含有碳原子数≥12的偶数碳脂肪酸；
优选地，
所述鞘磷脂含有碳原子数为12-22的偶数碳脂肪酸，和/或
所述检测为血液检测、血浆检测、血清检测、或尿液检测，和/或
所述检测的方法选自以下的一种或多种：色谱、质谱、鸟枪法、核磁共振，和/或
所述检测包括辅助检测和/或早期检测，和/或
所述奶制品包括选自以下的一种或多种：鲜奶、酸奶、冰激凌、奶粉、奶片、奶酪、奶油、奶油蛋糕、炼乳、及其他奶制品，和/或
所述心血管风险因素包括腰围、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、血压和血糖中的一个或多个，和/或
所述试剂盒还包括鞘磷脂的标准品；
更优选地，
所述鞘磷脂选自SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2中的一种或多种，和/或
所述脂质还包括C18:1反式脂肪酸，和/或
所述检测试剂是所述脂质的色谱和/或质谱检测试剂，和/或
所述鞘磷脂的含量与对象的心血管疾病风险和心血管风险因素或其变化呈负相关。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，
所述检测是将来自对象的样品的鞘磷脂含量(A1)与正常人群的相应鞘磷脂含量(A0)相比较，若A1显著高于A0，则说明对象的奶制品摄入高、心血管疾病风险低、心血管风险因素改善；优选地，所述“显著高于”指A1/A0≥1.07，更优选为A1/A0≥1.2，更优选为A1/A0≥1.5；和/或
所述检测是将来自对象的样品的鞘磷脂含量(A1)与该对象在先的相应鞘磷脂含量(A1’)相比较，若A1显著高于A1’，则说明对象的奶制品摄入增加、心血管疾病风险降低、心血管风险因素改善；优选地，所述“显著高于”指A1/A1’≥1.07，更优选为A1/A1’≥1.2，更优选为A1/A1’≥1.5。
3.一种用于鉴定奶制品摄入、检测心血管疾病风险、鉴定心血管风险因素或其变化、研究奶制品与心血管健康关系的试剂盒，包括：
(1)用于检测样品中作为奶制品摄入生物标志物的脂质含量的检测试剂，所述脂质包括鞘磷脂，所述鞘磷脂含有碳原子数≥12的偶数碳脂肪酸；
(2)任选的鞘磷脂标准品；
(3)任选的使用说明书，
优选地，
所述鞘磷脂含有碳原子数为12-22的偶数碳脂肪酸，和/或
所述脂质还包括C18:1反式脂肪酸，和/或
所述检测的方法选自以下的一种或多种：色谱、质谱、鸟枪法、核磁共振，
所述样品选自血液样品、血浆样品、血清样品、或尿液样品；
更优选地，
所述鞘磷脂选自SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2中的一种或多种，和/或
所述检测试剂是所述脂质的色谱和/或质谱检测试剂。
4.一种用于鉴定奶制品摄入的方法，包括以下步骤：
(1)检测对象的样品中作为奶制品摄入生物标志物的脂质的含量，其中所述脂质包括鞘磷脂，所述鞘磷脂含有碳原子数≥12的偶数碳脂肪酸，和
(2)根据所测脂质的含量确定总奶制品摄入、牛奶摄入、心血管疾病风险、心血管风险因素或其变化，
优选地，
所述鞘磷脂含有碳原子数为12-22的偶数碳脂肪酸，和/或
所述样品包括血液样品、血浆样品、血清样品、或尿液样品，和/或
所述检测的方法选自以下的一种或多种：色谱、质谱、鸟枪法、核磁共振，和/或
所述奶制品包括选自以下的一种或多种：鲜奶、酸奶、冰激凌、奶粉、奶片、奶酪、奶油、奶油蛋糕、炼乳、及其他奶制品，和/或
所述心血管风险因素包括腰围、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、血压和血糖中的一个或多个，
更优选地，
所述鞘磷脂选自SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2中的一种或多种，和/或
所述脂质还包括C18:1反式脂肪酸，和/或
所述脂质的含量与对象的心血管疾病风险和心血管风险因素或其变化呈负相关。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：
(2.1)将步骤(1)的鞘磷脂含量(A1)与正常人群样品的鞘磷脂含量(A0)相比，若A1显著高于A0，则说明对象的奶制品摄入高、心血管疾病风险低、心血管风险因素改善；优选地，所述“显著高于”指A1/A0≥1.07，更优选为A1/A0≥1.2，最优选为A1/A0≥1.5；和/或
(2.2)将步骤(1)的鞘磷脂含量(A1)与该对象在先的相应鞘磷脂含量(A1’)相比较，若A1显著高于A1’，则说明对象的奶制品摄入增加、心血管疾病风险降低、心血管风险因素改善；优选地，所述“显著高于”指A1/A1’≥1.07，更优选为A1/A1’≥1.2，最优选为A1/A1’≥1.5。
6.一种鉴定奶制品摄入、检测心血管疾病风险、鉴定心血管风险因素或其变化的装置，所述装置包括存储器、处理器以及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其特征在于，所述处理器执行所述程序时实现以下步骤：
(1)检测对象的样品中作为奶制品摄入生物标志物的脂质的含量，其中所述脂质包括鞘磷脂，所述鞘磷脂含有碳原子数≥12的偶数碳脂肪酸，和
(2)根据所测脂质的含量确定总奶制品摄入、牛奶摄入、心血管疾病风险、心血管风险因素或其变化，
优选地，
所述鞘磷脂含有碳原子数为12-22的偶数碳脂肪酸，和/或
所述样品包括血液样品、血浆样品、血清样品、或尿液样品，和/或
所述检测的方法选自以下的一种或多种：色谱、质谱、鸟枪法、核磁共振，和/或
所述奶制品包括选自以下的一种或多种：鲜奶、酸奶、冰激凌、奶粉、奶片、奶酪、奶油、奶油蛋糕、炼乳、及其他奶制品，和/或
所述心血管风险因素包括腰围、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、血压和血糖中的一个或多个，
更优选地，
所述鞘磷脂选自SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2中的一种或多种，和/或
所述脂质还包括C18:1反式脂肪酸，和/或
所述脂质的含量与对象的心血管疾病风险和心血管风险因素或其变化呈负相关。
7.一种构建奶制品摄入预测模型的方法，包括：
(1)获取对象的奶制品摄入情况，
(2)获取奶制品摄入后对象的样品中脂质的含量，其中所述脂质包括鞘磷脂，所述鞘磷脂含有碳原子数≥12的偶数碳脂肪酸，和
(3)根据(1)和(2)的数据利用数学方法构建总奶制品摄入或牛奶摄入预测模型，
优选地，
步骤(1)包括采用问卷方式获取对象的奶制品摄入情况，
所述数学方法选自广义线性回归、逻辑回归、随机森林或支持向量机中的一种或多种，
所述奶制品包括选自以下的一种或多种：鲜奶、酸奶、冰激凌、奶粉、奶片、奶酪、奶油、奶油蛋糕、炼乳、及其他奶制品。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述模型如式(I)或式(II)所示：
总奶制品摄入量(份/天)＝0.009×ln[SM(OH)C32:1]+0.361×ln[SM C32:1]+0.178×ln[SM(OH)C38:2]-0.199×ln[SM(2OH)C30:1]+0.461 (I)
牛奶摄入量(份/天)＝0.023×ln[SM(OH)C32:1]+0.240×ln[SM C32:1]+0.116×ln[SM(OH)C38:2]-0.131×ln[SM(2OH)C30:1]+0.323 (II)
其中，奶制品摄入量以份计，一份奶制品的重量为：鲜奶，250克；酸奶，250克；含奶冰激凌，150克；奶粉，40克；奶片，40克；奶酪，30克；奶油，30克；奶油蛋糕，100克；炼乳，125克。
9.脂质和/或奶制品在制备降低心血管疾病风险、改善心血管风险因素的试剂盒中的用途，所述脂质包括鞘磷脂，所述鞘磷脂含有碳原子数≥12的偶数碳脂肪酸，
优选地，
所述鞘磷脂含有碳原子数为12-22的偶数碳脂肪酸，和/或
所述奶制品包括选自以下的一种或多种：鲜奶、酸奶、冰激凌、奶粉、奶片、奶酪、奶油、奶油蛋糕、炼乳、及其他奶制品，和/或
所述心血管风险因素包括腰围、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、血压和血糖中的一个或多个；
更优选地，
所述鞘磷脂选自SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2中的一种或多种，和/或
所述脂质还包括C18:1反式脂肪酸。
10.一种用于降低心血管疾病风险、改善心血管风险因素的药物组合物，包含脂质和/或奶制品和药学上可接受的辅料，所述脂质包括鞘磷脂，所述鞘磷脂含有碳原子数≥12的偶数碳脂肪酸，
优选地，
所述鞘磷脂含有碳原子数为12-22的偶数碳脂肪酸，和/或
所述奶制品包括选自以下的一种或多种：鲜奶、酸奶、冰激凌、奶粉、奶片、奶酪、奶油、奶油蛋糕、炼乳、及其他奶制品，和/或
所述心血管风险因素包括腰围、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、血压和血糖中的一个或多个；
更优选地，
所述鞘磷脂选自SM(OH)C32:2、SM C32:1、SM(2OH)C30:2、SM(OH)C38:2中的一种或多种，和/或
所述脂质还包括C18:1反式脂肪酸。
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