CN106979982A - 一种用于糖尿病风险预测、治疗评价的方法及试剂盒 - Google Patents
一种用于糖尿病风险预测、治疗评价的方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于预测患糖尿病风险或治疗糖尿病的效果的评价方法及检测试剂盒。所述用于糖尿病风险预测、治疗评价的方法,主要通过检测个体诊断标记组合物中生物标志物的浓度,其生物标志物主要为血浆或血清中氨基酸、脂肪酸、甘油三脂或甘氨猪去氧胆酸等,根据其浓度计算相关阈值,进行对比分析。本发明的方法和试剂盒能够简化实验步骤,提高检测效率,适合对糖尿病进行早期风险预测及治疗效果评价,为个体用药治疗提供指导。
Description
技术领域
本发明属于生物标志物和测定方法领域,具体涉及一种用于预测患糖尿病风险或治疗糖尿病的效果的评价方法及其应用。
背景技术
糖尿病是世界卫生组织(WHO)提出的四大非传染性疾病之一,糖尿病及其并发症已成为21世纪全球重大的公共卫生问题。根据国际糖尿病联盟统计,2011年全球范围内有3.66亿人患有糖尿病,2.8亿人属于高危人群。随着我国城市化进程的加快以及人们生活方式的改变,糖尿病的患病率持续升高,呈现流行的趋势。据中华医学会糖尿病学分会2008年5月完成的中国糖尿病和代谢疾病研究报告,我国20岁以上人群糖尿病患病率为9.7%,其中男性10.6%,女性8.8%,据此推算我国糖尿病患病总人数达9240万,位居世界第一。同时,糖尿病前期的患病率高达15.5%,估算人数为1.48亿。
肥胖是糖尿病重要的风险因素,根据最新的全国肥胖和代谢综合征调查结果显示:我国成人男性超重和肥胖的患病率分别为33.7%和13.7%,女性超重和肥胖的患病率分别为29.2%和10.7%。我国超重、肥胖人群中糖尿病的患病率分别为12.8%和18.5%。与健康人相比,健康超重人群的糖尿病患病风险增加2倍,而健康肥胖人群的患糖尿病风险增加4-12倍。目前,除了已经用于评估糖尿病,前期糖尿病或糖尿病前期状态风险的众多研究和算法如葡萄糖和HBA1c,Framingham scores研究,San Antonio heart Study以及基于芬兰人的糖尿病风险评分。鉴于实用性问题和风险计算所涉及的困难,一线医生极少采用这种方法。显然。仍需要用于评估未来发生糖尿病的风险的更加实用的方法。因此,寻找用于预测对象发生糖尿病的风险,或用于鉴定具有发生糖尿病的高风险的对象的生物标志物非常重要。这种方法可用于筛查大的群体,以鉴定具有糖尿病风险的人群,或用于测试单个个体,以确定该个体发生糖尿病的风险。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足,提供了一种用于预测对象发生糖尿病的风险,或用于鉴定具有发生糖尿病的高风险的对象,或用于评价糖尿病治疗对象的生物标记物组合测定方法及其应用。本发明还涉及计算此类风险的方法,将此类风险告知预测或治疗对象,其中所述对象属于糖尿病前期人群或处于糖尿病治疗过程当中的人群。
为了解决上述技术问题,本发明采用如下的技术方案:
测定了所述132例健康人,107例健康超重/肥胖以及73例超重/肥胖合并糖尿病患者以及一项研究中62例健康超重/肥胖10年随访样本空腹血清胆酸,游离脂肪酸和氨基酸的含量以及临床指标包括TG(甘油三酯),HBA1c(糖化血红蛋白),Glucose(葡萄糖),Insulin(胰岛素),HDL(高密度脂蛋白),LDL(低密度脂蛋白),并将该生物标志物的基线水平与10年随访期间的糖尿病发生率相关联。
使用色谱质谱联用技术检测血清或者血浆样本的代谢物,找到糖尿病风险预测以及糖尿病治疗评价的诊断标记物。具体包括:
收集健康人,健康超重/肥胖,超重/肥胖合并糖尿病患者以及一项研究中健康超重/肥胖10年随访基线的血浆/血清样本,处理后经色谱质谱检测分析:
血清样本的采集与制备:
本发明中的试验样本得到本地伦理委员会的批准并获得所有受试者的知情同意。
样本1
A.健康对照组:上海市糖尿病研究所正常人样本库中入选的代谢正常且BMI<23.0者132例,其中男性47例(35.6%),女性85例(64.4%)。
B.健康超重/肥胖组:上海市糖尿病研究所正常人样本库中入选的代谢正常但BMI>25者107例,其中男性39例(36.4%),女性68例(63.6%)。
C.超重/肥胖伴2型糖尿病:上海市糖尿病研究所患者样本库中选取的2型糖尿病且BMI>25的患者73例,其中男性37例(50.7%),女性36例(49.3%)。
受试者的临床表现被总结在表1中。
表1. 132例健康人、107例健康超重/肥胖以及73例超重/肥胖合并糖尿病患者特征
标注:浓度为平均值±标准差。p1表示健康人与健康超重/肥胖比,p2表示健康人与超重/肥胖合并糖尿病比,p3表示健康超重/肥胖与超重/肥胖合并糖尿病比。
样本2
一项研究中62例健康超重/肥胖10年随访样本。
受试者的临床表现被总结在表2中。
表2.一项研究中62例健康超重/肥胖10年随访样本特征
标注:浓度为平均值±标准差.FC值表示临床参数水平在10年后糖尿病患者与10年后非糖尿病患者的比值。
诊断标准:
1)肥胖的诊断标准
按照2000年国际肥胖工作组(IOTF)制定的亚洲成人分级建议,BMI 18.5~22.9kg/m2为正常体重,BMI 23.0~24.9kg/m2为超重,BMI≥25kg/m2为肥胖。
2)代谢正常肥胖(MHOB)的诊断标准
MHOB即肥胖但无代谢综合征(MS)者。MS诊断标标准按照中华医学会糖尿病学分会(CDS)建议标准。需同时符合以下4条标准:肥胖,即BMI≥25kg/m2;FPG≥6.1mmol/L,且既往无糖尿病史,未使用降糖药物;SBP/DBP<140/90mmHg,且既往无高血压史,未使用降压药物;空腹血TG<1.7mmol/L,及空腹血HDL-c≥0.9mmol/L(男)或≥1.0mmol/L(女),且既往无高血脂病史,未使用调脂药物。
3)非糖尿病超重或肥胖的定义
非糖尿病超重或肥胖即超重或肥胖但未达到2型糖尿病诊断标准者,即:体重指数:在23kg/m2≤BMI<25kg/m2(超重),或BMI≥25kg/m2(肥胖)且空腹血糖浓度<7.0mmol/L和餐后2h血糖浓度<11.1mmol/L。
4)2型糖尿病及相关诊断标准
2型糖尿病(T2DM)指空腹血糖浓度≥7.0mmol/L,和(或)餐后2h血糖浓度≥11.1mmol/L(美国糖尿病协会(ADA),1997)。正常糖耐量(normal glucose tolerance,NGT)指FPG<6.1且2h PG<7.8mmol/L。血糖调节受损(impaired glucose regulation,IGR)包括糖耐量减低(impaired glucose tolerance,IGT)和空腹血糖受损(impaired fastingglycaemia,IFG)。其中,IGT指FPG<7.0且2h PG≥7.8;IFG指6.1≤FPG<7.0mmol/L且2h PG<7.8mmol/L。
血清样本的采集:
采集空腹静脉血5mL置塑料离心管中。
血清制备:
(1)缓慢颠转血清制备管5次。
(2)在室温下(大约25摄氏度),将试管垂直置于试管架上1.5小时。
(3)将试管在2500rpm转速下离心10分钟(4摄氏度)。
(4)将上清(约2.5毫升)用移液器分装到塑料离心管(eppendorf,1.5ml离心管)中,每只冻存管0.5ml血清。
(5)在离心管上标好样品号码。
(6)迅速放入-80摄氏度冰箱。
血清样本的胆酸检测:
样本制备:取100μl血清于1.5mL的离心管中,加入150μL甲醇(含内标,50nM d4-CA(胆酸),d4-UDCA(熊去氧胆酸),d4-LCA(石胆酸))。漩涡震荡混匀10分钟,静置10分钟,然后4度13500转离心20分钟,取上清液进行UPLC-TQMS(超高效液相色谱-三重四级杆质谱)分析。
分析仪器测试:UPLC-TQMS:采用沃特斯超高效液相色谱系统(沃特斯公司,美国),配备二元溶剂控制器和样本控制室。采用沃特斯XEVO三重四级杆质谱仪(沃特斯公司,美国),配备双电喷雾离子源。
色谱条件:采用UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm);柱温45℃;流动相A:水(0.1%甲酸),B:乙腈(0.1%甲酸,);流速为0.4mL/min;进样量为5uL;梯度洗脱条件:0-1min(5%B),1-5min(5-25%B),5-15.5min(25-40%B),15.5-17.5min(40-95%B),17.5-19min(95%B),19-19.5min(95-5%B),19.6-21min(5%B)。
质谱条件:电喷雾离子源采用负离子扫描模式(ESI-),具体条件如下:毛细管电压1.2kV,锥孔电压55V,萃取锥孔电压4V,离子源温度150℃,脱溶剂气温度550℃,反向锥孔气流50L/h,脱溶剂气650L/h,低质量区分辨率4.7,高质量区分辨率15,多反应检测模式采集数据。
血清样本游离脂肪酸的检测:
样本制备:取血清30μL,加入异丙醇/正己烷/2M磷酸(40:10:1)500微升及同位素标记的C19:0-d37内标溶液(5ug/mL)10微升,涡旋2min,室温静置20min。加入正己烷400微升,水300微升,涡旋2min,12000rpm离心5min,取上清400微升;剩余液中加入正己烷400微升,涡旋2min,12000rpm离心5min,取上清400微升。合并上清,室温下真空干燥。在干燥后的离心管中加入80微升甲醇复溶后分析。
分析仪器测试:UPLC-TQMS:采用沃特斯超高效液相色谱系统(沃特斯公司,美国),配备二元溶剂控制器和样本控制室。采用沃特斯XEVO三重四级杆质谱仪(沃特斯公司,美国),配备双电喷雾离子源。
色谱条件:采用UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7um);柱温40℃;流动相A为水,流动相B为乙腈/异丙醇(体积比为8:2);流速为0.4mL/min;进样量为5uL;梯度洗脱条件:0-2min:70%B,2-5min:70%-75%B,5-10min:75%-80%B,10-13min:80%-90%B,13-16min:90%-100%B,16-21min:100%B,21-22.5min:100%-70%B,22.5-24min:70%B。总分析时间为24min。
质谱条件:电喷雾离子源采用负离子扫描模式(ESI-),具体条件如下:毛细管电压2.5kV,锥孔电压55V,萃取锥孔电压4V,离子源温度120℃,脱溶剂气温度450℃,反向锥孔气流50L/h,脱溶剂气650L/h,低质量区分辨率4.7,高质量区分辨率15,检测器电压2390V,扫描时间0.35s,扫描时间间隔0.02s,质荷比范围:m/z 50-1000。锁定质量数为554.2615。
血清样本的氨基酸检测:
样本制备:取血清40μL,加入500μL甲醇乙腈混合溶剂(1:9,v:v),涡旋振荡2min;置离心管于-20℃放置10min以促进蛋白沉淀,12000rpm4℃离心15min。取上清20μL,室温下真空干燥。在干燥后的离心管中加入100μL甲醇水混合溶剂(1:1,v:v,含1μg/mL二氯苯丙氨酸作为内标)复溶后分析。
分析仪器测试:UPLC-TQMS:采用沃特斯超高效液相色谱系统(沃特斯公司,美国),配备二元溶剂控制器和样本控制室。采用沃特斯XEVO三重四级杆质谱仪(沃特斯公司,美国),配备双电喷雾离子源。
色谱条件:采用UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm);柱温40℃;流动相A:水(0.1%甲酸),B:乙腈(0.1%甲酸,);流速为0.4mL/min;进样量为5uL;梯度洗脱条件:0-0.5min(1%B),0.5-9min(1-20%B),9-11min(20-75%B),11-16min(75-99%B),16-16.5min(99%B)。
质谱条件:电喷雾离子源采用负离子扫描模式(ESI-),具体条件如下:毛细管电压3.0,锥孔电压55V,萃取锥孔电压4V,离子源温度150℃,脱溶剂气温度450℃,反向锥孔气流50L/h,脱溶剂气800L/h,低质量区分辨率4.7,高质量区分辨率15,多反应检测模式采集数据。
血清样本甘油三酯的检测:血清甘油三酯的检测采用酶比色法测定。
待测诊断标志物浓度的确定:以待测诊断标志物的标准品溶液的浓度与对应的待测诊断标志物以及与待测诊断标志物一样的稳定同位素内标面积比绘制标准曲线,采用同位素内标定量测定。同时通过样品添加同位素内标对样品检测过程进行质量控制。
132例健康人、107例健康超重/肥胖以及73例超重/肥胖合并糖尿病患者的候选诊断标志物。
表3. 16个候选诊断标志物。
标注:浓度为平均值±标准差.氨基酸和游离脂肪酸浓度单位是μg/ml,胆酸浓度单位是ng/ml。
根据上述研究确定,本发明用于预测对象患糖尿病的风险或用于诊断对象中的糖尿病的方法中,所述的诊断标记物组合,为血浆或血清代谢物,包括Glycohyodeoxycholic acid(甘氨猪去氧胆酸)、hyocholic acid(猪胆酸)、Glycohyocholic acid(甘氨猪胆酸)、Taurodeoxycholic acid(牛磺去氧胆酸)、Taurohyocholic acid(牛磺猪胆酸)、Taurolithocholic acid(牛磺石胆酸)、Taurochenodeoxycholic acid(牛磺鹅去氧酸)、Palmitic acid(C16:0,棕榈酸)、Stearic acid(C18:0,硬脂酸)、Oleic acid(C18:1n9,油酸)、dihomo-γ-linolenic acid(C20:3 n6双高-γ-亚麻酸)、Arachidonic acid(C20:4 n6花生四烯酸)、C16:0/C18:0(棕榈酸/硬脂酸)、C18:1 n9/C18:0(油酸/硬脂酸)、C20:3n6/C20:4n6(双高-γ-亚麻酸/花生四烯酸)、Docosatetraenoic acid(C22:4 n-6,肾上腺酸)、Docosapentaenoic acid(C22:5 n-6二十二碳五烯酸)、Eicosenoic acid(C20:1 n-9二十碳烯酸)、Erucic acid(C22:1 n-9芥酸)、C22:4n-6/C22:5 n-6(肾上腺酸/二十二碳五烯酸)、C20:1 n-9/C22:1 n-9(二十碳烯酸/芥酸)、C18:1 n-9/C20:1 n-9(油酸/二十碳烯酸)、Valine(缬氨酸)、Leucine(亮氨酸)、Isoleucine(异亮氨酸)、Phenylalanine(苯丙氨酸)、Tyrosine(酪氨酸)、TG(甘油三酯)、HBA1c(糖化血红蛋白)、Glucose(葡萄糖)、Insulin(胰岛素)、HDL(高密度脂蛋白)或LDL(低密度脂蛋白)中的一种或多种的组合。
优选的,所述标记物为Glycohyodeoxycholate(GHDCA甘氨猪去氧胆酸)或者该胆汁酸在总胆酸中的比例(GHDCA/total Bile Acids)、Palmitic acid(C16:0棕榈酸)、Stearic acid(C18:0硬脂酸)、Oleic acid(C18:1n9油酸)、dihomo-γ-linolenicacid(C20:3 n6双高-γ-亚麻酸)、Arachidonic acid(C20:4 n6花生四烯酸)、C16:0/C18:0(棕榈酸/硬脂酸)、C18:1 n9/C18:0(油酸/硬脂酸)、C20:3 n6/C20:4 n6(双高-γ-亚麻酸/花生四烯酸)、Valine(缬氨酸)、Leucine(亮氨酸)、Isoleucine(异亮氨酸)、Phenylalanine(苯丙氨酸)、Tyrosine(酪氨酸)或TG(甘油三酯)中的一种或多种的组合。
更优选的,所述标记物为Glycohyodeoxycholate(甘氨猪去氧胆酸)、Palmitic acid(C16:0棕榈酸)、Stearic acid(C18:0硬脂酸)、Oleic acid(C18:1 n9油酸)、dihomo-γ-linolenic acid(C20:3 n6双高-γ-亚麻酸)、Arachidonic acid(C20:4 n6花生四烯酸)、Valine(缬氨酸)、Leucine(亮氨酸)、Isoleucine(异亮氨酸)、Phenylalanine(苯丙氨酸)、Tyrosine(酪氨酸)、TG(甘油三酯)中的一种或多种的组合。
利用10年随访样本验证上述诊断标志物对于糖尿病风险预测的能力:
表4. 10年随访样本中生物标志物表达情况和糖尿病预测能力
标注:浓度为平均值±标准差.氨基酸和游离脂肪酸浓度单位是μg/ml,胆酸浓素单位是ng/ml。
1)氨基酸预测糖尿病:
50例10年后发展为糖尿病的个体以及12例10年后仍健康的个体的基线血清氨基酸测定结果显示5个氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的水平在50例10年后发展为糖尿病的个体中显著高于12例10年后仍健康的个体。
逻辑回归模型分析表明,这5个氨基酸与糖尿病风险增加显著相关[风险比(OR)=2.53,95%置信区间(CI):1.68-3.81),p<0.05],且与年龄、性别、体质指数、胰岛素抵抗指数、胰岛β细胞功能指数、餐后空腹血糖及2小时餐后血糖无交互影响;ROC曲线下面积为0.82(如图1)。
2)脂肪酸预测糖尿病:
50例10年后发展为糖尿病的个体以及12例10年后仍健康的个体的基线血清游离脂肪酸测定结果显示5个游离脂肪酸包括Palmitic acid(C16:0棕榈酸)、Stearic acid(C18:0硬脂酸)、Oleic acid(C18:1 n9油酸)、dihomo-γ-linolenic acid(C20:3 n6双高-γ-亚麻酸)、Arachidonic acid(C20:4 n6花生四烯酸)的水平在50例10年后发展为糖尿病的个体中显著高于12例10年后仍健康的个体。
逻辑回归模型分析表明,这5个脂肪酸与糖尿病风险增加显著相关[风险比(OR)=8.78,95%置信区间(CI):1.92-40.17),p<0.01],且与年龄、性别、体质指数、胰岛素抵抗指数、胰岛β细胞功能指数、餐后空腹血糖及2小时餐后血糖无交互影响;ROC曲线下面积为0.83(如图2)。
3)胆酸预测糖尿病:
50例10年后发展为糖尿病的个体以及12例10年后仍健康的个体的基线血清胆酸测定结果显示甘氨猪胆酸的水平在50例10年后发展为糖尿病的个体中显著低于12例10年后仍健康的个体。
逻辑回归模型分析表明,胆酸与糖尿病风险增加显著相关[风险比(OR)=0.26,95%置信区间(CI):0.09-0.76),p<0.05],且与年龄、性别、体质指数、胰岛素抵抗指数、胰岛β细胞功能指数、餐后空腹血糖及2小时餐后血糖无交互影响;ROC曲线下面积为0.80(如图3)。
4)甘油三酯水平预测糖尿病:
50例10年后发展为糖尿病的个体以及12例10年后仍健康的个体的基线血清甘油三酯测定结果显示其水平在50例10年后发展为糖尿病的个体中显著高于12例10年后仍健康的个体。
逻辑回归模型分析表明,甘油三酯与糖尿病风险增加显著相关[风险比(OR)=2.53,95%置信区间(CI):1.68-3.81),p<0.001],且与年龄、性别、体质指数、胰岛素抵抗指数、胰岛β细胞功能指数、餐后空腹血糖及2小时餐后血糖无交互影响;ROC曲线下面积为0.82(如图4)。
优选的包含胆酸,游离脂肪酸,氨基酸以及甘油三酯诊断标志物预测糖尿病能力:
50例10年后发展为糖尿病的个体以及12例10年后仍健康的个体的基线血清胆酸,游离脂肪酸,氨基酸以及甘油三酯测定结果显示5个氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸,5个脂肪酸Palmitic acid(C16:0棕榈酸)、Stearic acid(C18:0硬脂酸)、Oleic acid(C18:1 n9油酸)、dihomo-γ-linolenic acid(C20:3 n6双高-γ-亚麻酸)、Arachidonic acid(C20:4 n6花生四烯酸)及甘油三酯的水平在50例10年后发展为糖尿病的个体中显著高于12例10年后仍健康的个体,Glycohyodeoxycholate(甘氨猪去氧胆酸)的水平在50例10年后发展为糖尿病的个体中显著低于于12例10年后仍健康的个体。
逻辑回归模型分析表明,优化的生物标志物与糖尿病风险增加显著相关[风险比(OR)=10.94,95%置信区间(CI):1.32-56.55),p<0.01],且与年龄、性别、体质指数、胰岛素抵抗指数、胰岛β细胞功能指数、餐后空腹血糖及2小时餐后血糖无交互影响;ROC曲线下面积为0.92(如图5)。
生物信息学方法告知个体糖尿病的风险:
本发明中提供一种糖尿病预测和诊断标记物组合的生物信息学方法计算此类风险以及将此类风险告知个体的方法。
单维和多维统计分析方法被用于评价和鉴定候选的生物标志物。单维统计方法包括Student t test和ANOVA以及Mann Whitney U test和Kruskal Wallis test。候选生物标志物预测糖尿病的能力采用Pearson或者Spearman系数,聚类,偏最小二乘法以及逻辑回归分析评价。利用逻辑回归模型进行验证,发现如表3中12个生物标志物(分别是Glycohyodeoxycholate(甘氨猪去氧胆酸)、Palmitic acid(C16:0棕榈酸)、Stearicacid(C18:0硬脂酸)、Oleic acid(C18:1 n9油酸)、dihomo-γ-linolenic acid(C20:3n6双高-γ-亚麻酸)、Arachidonic acid(C20:4 n6花生四烯酸)、Valine(缬氨酸)、Leucine(亮氨酸)、Isoleucine(异亮氨酸)、Phenylalanine(苯丙氨酸)、Tyrosine(酪氨酸)、TG(甘油三酯),将其中的一种或多种的组合作为预测糖尿病的风险的作用尤为重要,具有最佳的预测能力。
通过逻辑回归对挑选的指标进行组合,利用回归系数得到计算方程:
得分值=β1X1+β2X2+…+α
这里,Xj代表第j个指标的绝对浓度或标准化浓度(j为生物标志物的个数),βj表示各指标的回归系数,α是常规系数。
所述的常规系数α是通过逻辑回归数学模型计算得到,该回归分析是研究因变量,即疾病和正常组,与另一个(些)自变量(挑选的诊断标志物)的具体依赖关系的计算方法。
把每个测定对象的各种指标的浓度输入到该方程式,都将得到一个分值。通过采用临床诊断性能曲线(ROC曲线)分析10年随访样本,找到Youden指数对应的最佳阈值,该阈值表现为ROC模型区分真正患者和非患者的总能力。
采用生物信息学方法确定对象患糖尿病或用于诊断对象中的糖尿病的阈值。将所述生物标志物的水平与预测对象患糖尿病的风险相关联,其中水平升高预示患糖尿病的风险增加,或者水平升高与糖尿病的诊断相关,其中所述对象未患糖尿病或正在治疗中的糖尿病个体。
约登指数(Youden index):是评价筛查试验真实性的方法,假设其假阴性(漏诊率)和假阳性(误诊率)的危害性同等意义时,即可应用约登指数。约登指数是灵敏度与特异度之和减去1。表示筛检方法发现真正的患者与非患者的总能力。指数越大说明筛查实验的效果越好,真实性越大。
另一方面,提供了糖尿病预测和诊断标记物组合的应用,用于预测和诊断糖尿病的试剂盒。
诊断试剂盒包括所有诊断标记物的标准品或稳定同位素标记的与待测诊断标记物一样的化合物,此稳定同位素标记的化合物用于定量和校正待测诊断标记物。优选的诊断标记物的诊断样品是血浆或血清。
上述标准品来源于西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich),标准品浓度按照如下正常人体生理浓度范围:
TG(甘油三酯):0.5-1.7mmol/L
C16:0(棕榈酸):74-170μmol/L
C18:0(硬脂酸):31-470μmol/L
C18:1 n9(油酸):66-178μmol/L
C20:3 n6(双高-γ-亚麻酸):1.5-4.8μmol/L
C20:4 n6(花生四烯酸):2-28μmol/L
Valine(缬氨酸):7-42μmol/L
Leucine(亮氨酸):73-182μmol/L
Isoleucine(异亮氨酸):34-98μmol/L
Phenylalanine(苯丙氨酸):40-74μmol/L
Tyrosine(酪氨酸):38-96μmol/L
诊断试剂盒可以包含所有测试生物标志物的混合标准品,或者可以是所有需要测试的生物标志物的单一标准品。标准品可以是固体形式或者是配制好的溶液。如果标准品是固体形式,在测试前需要溶于合适的配制溶液。诊断试剂盒至少包含一种表3中列出的物质。
诊断试剂盒通常包括至少一个用于保存标准品的容器。这个容器可能是单格的也可能是多格的。例如,这个容器可以是一个多孔板(比如96孔板),或其他类似的容器。在一些诊断试剂盒中,这个容器也同样适合于生物标志物的测定时使用。在一些诊断试剂盒中,这个容器可以用于标准品检测或者待测样本中生物标志物的仪器分析,如色谱-质谱分析。比如可以是液相色谱-三种四级杆质谱分析。在其中的一些诊断试剂盒中,这个容器可以用于生物标志物其他方法的检测,如酶法,化学方法,比色法以及荧光标记法等。
诊断试剂盒也可以包括多个容器。例如诊断试剂盒含有一个或多个保存有标准品的容器,另外诊断试剂盒可以含有一个或多个标准品的容器,同时含有一个或多个用于未知样本测定的容器。
在一些诊断试剂盒中,需要测试的生物标志物标准品必须分布于一个或多个孔中。
诊断试剂盒容器通常设计用于液体样本的测定,例如生物体液或者是生物固体样本但已经经过处理得到的溶液提取物。
诊断试剂盒还包括用于标准品制备或者样本测试的溶剂。这些溶剂可能有几种,保存于不同的容器中。所述的溶剂包括但不限于水、乙腈或醇溶液或其中的一种或多种组合,醇溶液优选甲醇、乙醇或异丙醇。
一个用于示范的诊断试剂盒可能包含多个保存于不同溶剂中的标准品。这里这个容器可以是适用于液相色谱-质谱或者气相色谱-质谱测定的微孔板。这个微孔板必须包含足够多的孔容纳至少一个标准品和一个待测样本。这些标准品浓度已知,并且会配置成已知浓度的一系列的标准品溶液置于不同的微孔中。将标准品溶液置于微孔板后,同样将待测样本置于微孔板上。
诊断试剂盒可以采用本发明提供的诊断标志物的定量水平诊断或者预测受试对象患糖尿病的风险。例如,本发明的试剂盒可以用于预测未患糖尿病的受试对象患糖尿病的风险。本发明的试剂盒也可以用于判断正在进行治疗的糖尿病患者对于治疗是否有好的预后。同样,本发明的诊断试剂盒也可以用于观测受试对象判断是否患糖尿病。
本发明的试剂盒同样可以用于评价一个来源于糖尿病个体或疑似糖尿病个体的生物样本。诊断生物样本可以是血清或者血浆。在一些试剂盒的应用中,诊断生物样本可能不需要预处理或者需要进行事先的预处理。
临床上医师可以从受试对象获得样本,然后运送到临床实验室采用本发明的试剂盒进行检测与评价。或者,医生可以在临床实验室或者在可以进行检测的医疗设施内采集样本随后采用本发明的试剂盒进行检测与评价。
用本发明的试剂盒分析得到的是一个受试对象含有的诊断标志物的水平,这个水平可以与本发明确定的健康人的诊断标志物的量或者设定的阈值进行比较,从而得出个体患糖尿病的风险评价或者糖尿病治疗效果评价。
提供了糖尿病预测和诊断标记物组合的测定方法,包括以下步骤:
1、取测试对象(未患糖尿个体或糖尿病治疗过程中的患者)临床血浆或者血清样本;
2、通过色谱质谱联用代谢组学分析方法分析测定非糖尿病病人临床血浆/血清样本;
3、通过上述分析方法对诊断标记物的阈值及相应指标数值进行计算,根据结果进行患糖尿病风险或糖尿病治疗效果的分析和判断。
其中所述的色谱包括液相色谱或气相色谱;质谱包括飞行时间,离子肼,四级杆,磁扇区,离子回旋共振,静电扇形或他们的任意组合;
TG(甘油三酯)的测定也可以按常规的酶法(试剂盒)、化学法、或色谱法,结果再跟其他标记物一起进行生物信息学建模分析。
在具体的实施方案中,诊断标志物的水平是用高效液相色谱-三重四级杆质谱来测定的。更具体的,是在负离子模式下测定的。
附图说明
图1是10年随访血清样本中5种氨基酸的ROC曲线图(Valine(缬氨酸)、Leucine(亮氨酸)、Isoleucine(异亮氨酸)、Phenylalanine(苯丙氨酸)、Tyrosine(酪氨酸));
图2是10年随访血清样本中5种脂肪酸的ROC曲线图(Palmitic acid(C16:0棕榈酸)、Stearic acid(C18:0硬脂酸)、Oleic acid(C18:1 n9油酸)、dihomo-γ-linolenic acid(C20:3n6双高-γ-亚麻酸)、Arachidonic acid(C20:4 n6花生四烯酸));
图3是10年随访血清样本中胆酸的ROC曲线图(GHDCA(甘氨猪去氧胆酸));
图4是10年随访血清样本中甘油三脂的ROC曲线图(TG(甘油三酯));
图5是10年随访血清样本中12种生物标志物的ROC曲线图(Glycohyodeoxycholate(甘氨猪去氧胆酸)、Palmitic acid(C16:0棕榈酸)、Stearic acid(C18:0硬脂酸)、Oleic acid(C18:1 n9油酸)、dihomo-γ-linolenic acid(C20:3 n6双高-γ-亚麻酸)、Arachidonic acid(C20:4n6花生四烯酸)、Valine(缬氨酸)、Leucine(亮氨酸)、Isoleucine(异亮氨酸)、Phenylalanine(苯丙氨酸)、Tyrosine(酪氨酸)、TG(甘油三酯))
图6是10年随访血清样本中棕榈酸/硬脂酸比值的ROC曲线图(C16:0/C18:0(棕榈酸/硬脂酸)比值)
图7是10年随访血清样本中棕榈酸/硬脂酸比值及甘油三脂的ROC曲线图(C16:0/C18:0(棕榈酸/硬脂酸)比值和TG(甘油三酯))
图8是10年随访血清样本的中棕榈酸/硬脂酸比值、双高-γ-亚麻酸/花生四烯酸及甘油三脂的ROC曲线图(C16:0/C18:0(棕榈酸/硬脂酸)比值、C20:3 n6/C20:4(双高-γ-亚麻酸/花生四烯酸)比值及TG(甘油三酯))
具体实施方式
除非另有定义,本发明使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的含义相同。通常,本发明使用的命名及下述实验方法都是本领域公知的或常用的。为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本发明作进一步的说明。需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1:多生物标志物检测
选择生物标志物为:甘氨猪去氧胆酸、棕榈酸/硬脂酸比值、油酸/硬脂酸比值、双高-γ-亚麻酸/花生四烯酸比值、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甘油三酯
通过逻辑回归对挑选的指标进行组合,利用回归系数得到计算方程:
得分值=β1X1+β2X2+…+α
这里,Xj代表第j个指标的绝对浓度或标准化浓度(j为生物标志物的个数),βj表示各指标的回归系数,α是常规系数。
其中Xj代表的绝对浓度或标准化浓度来源于表3;βj表示的各指标的回归系数是通过逻辑回归数学模型计算得到,该回归分析是研究因变量,即疾病和正常组,与另一个(些)自变量(挑选的诊断标志物)的具体依赖关系的计算方法。
计算如下:
得分值=-50.48*(甘氨猪去氧胆酸)-8.8*(棕榈酸/硬脂酸比值)+15.09*(油酸/硬脂酸比值)+12.5*(双高-γ-亚麻酸/花生四烯酸比值)+247.1*(亮氨酸)-57.67*(异亮氨酸)+306.71*(苯丙氨酸)+165.88*(酪氨酸)-10.7*(缬氨酸)+3.35*(甘油三酯)-1.9
随后应用临床诊断性能曲线(ROC曲线)对标记物对10年随访受试者基线血清样本进行评价。结果曲线下面积为0.92,95%置信区间(CIs):0.840-1.000(图5)。并且根据ROC模型得到的Yuden指数(灵敏度与特异度之和最大值减去1),最佳的模型得分阈值为7.08,如所述对象测定标志物的得分阈值大于7.08时,预示患糖尿病的风险大大增加。
通过测定个体的上述相关生物标志物的水平,将这些测定值输入上述模型公式得到得分。如果个体的得分大于7.08,表明此个体具有较高的患糖尿病风险或其糖尿病治疗效果较差;如果个体的得分小于7.08,表明此个体具有较低的患糖尿病风险或其糖尿病治疗效果较好。
实施例2:棕榈酸/硬脂酸比值作为诊断标志物
如说明书中所述62例健康超重/肥胖个体,10年后重新测定临床代谢指标发现50例发展为糖尿病,12例仍保持健康。将棕榈酸/硬脂酸比值被选为诊断标志物,受试者工作特征分析用于评价棕榈酸/硬脂酸比值区别50例发展为糖尿病个体与12例仍保持健康个体的能力。产生的受试者工作特征曲线下面积是0.76(95%置信区间0.60-0.91)(如图6)。根据受试者工作特征曲线得到的Yuden指数(灵敏度与特异度之和最大值减去1),最佳的棕榈酸/硬脂酸比值阈值为1.15,此阈值可以作为比较值。因此,当健康超重/肥胖个体的棕榈酸/硬脂酸比值阈值大于1.15时,这些个体未来可能会有较高的糖尿病风险。
实施例3:榈酸/硬脂酸比值以及甘油三酯作为诊断标志物
如说明书中所述62例健康超重/肥胖个体,10年后重新测定临床代谢指标发现50例发展为糖尿病,12例仍保持健康。
将棕榈酸/硬脂酸比值以及甘油三酯被选为诊断标志物。采用逻辑回归方法,选择的标志物合并为一个组合并且根据如下公式建立模型:
得分值=β1X1+β2X2+…+α
这里,Xj代表第j个指标的绝对浓度或标准化浓度(j为生物标志物的个数),βj表示各指标的回归系数,α是常规系数。
其中Xj代表的绝对浓度或标准化浓度来源于表3;βj表示的各指标的回归系数是通过逻辑回归数学模型计算得到,该回归分析是研究因变量,即疾病和正常组,与另一个(些)自变量(挑选的诊断标志物)的具体依赖关系的计算方法。
得分值=1.79*(甘油三酯)+3.67*(棕榈酸/硬脂酸比值)-4.57
通过受试者工作特征分析用于评价棕榈酸/硬脂酸比值以及甘油三酯区别50例发展为糖尿病个体与12例仍保持健康个体的能力。产生的受试者工作特征曲线下面积是0.78(95%置信区间0.62-0.94)(如图7)。根据受试者工作特征曲线得到的Yuden指数(灵敏度与特异度之和最大值减去1),最佳的模型得分阈值为1.58。当健康超重/肥胖个体的得分阈值大于1.58时,这些个体未来可能会有较高的糖尿病风险。
通过测定个体的棕榈酸/硬脂酸比值以及甘油三酯的水平,将这些测定值输入上述模型公式得到得分。如果个体的得分大于1.58,表明此个体具有糖尿病高风险。
实施例4:棕榈酸/硬脂酸比值、油酸/硬脂酸比值以及双高-γ-亚麻酸/花生四烯酸比值作为诊断标志物
如说明书中所述62例健康超重/肥胖个体,10年后重新测定临床代谢指标发现50例发展为糖尿病,12例仍保持健康。选择棕榈酸/硬脂酸比值,油酸/硬脂酸比值以及双高-γ-亚麻酸/花生四烯酸比值作为诊断标志物。采用逻辑回归方法,选择的标志物合并为一个组合并且根据如下公式建立模型:
得分值=β1X1+β2X2+…+α
这里,Xj代表第j个指标的绝对浓度或标准化浓度(j为生物标志物的个数),βj表示各指标的回归系数,α是常规系数。
其中Xj代表的绝对浓度或标准化浓度来源于表3;βj表示的各指标的回归系数是通过逻辑回归数学模型计算得到,该回归分析是研究因变量,即疾病和正常组,与另一个(些)自变量(挑选的诊断标志物)的具体依赖关系的计算方法。
得分值=0.50*(棕榈酸/硬脂酸比值)+5.28*(油酸/硬脂酸比值)+11.87*(双高-γ-亚麻酸/花生四烯酸)-4.37.
通过受试者工作特征分析用于评价棕榈酸/硬脂酸比值以及甘油三酯区别50例发展为糖尿病个体与12例仍保持健康个体的能力。产生的受试者工作特征曲线下面积是0.82(95%置信区间0.67-0.97)(如图8)。根据受试者工作特征曲线得到的Yuden指数(灵敏度与特异度之和最大值减去1),最佳的棕榈酸/硬脂酸比值阈值为1.19。当健康超重/肥胖个体的棕榈酸/硬脂酸比值阈值大于1.19时,这些个体未来可能会有较高的糖尿病风险。
通过测定个体的棕榈酸/硬脂酸比值,油酸/硬脂酸比值以及双高-γ-亚麻酸/花生四烯酸比值,将这些测定比值输入上述模型公式得到分值。如果个体的分值大于1.19,表明此个体具有糖尿病高风险。
应当说明的是,虽然本发明以较佳实施例揭露如上,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,然其并非用以限定本发明,任何熟习此项技艺者,在不脱离本发明的精神和范围内,所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于糖尿病风险预测、治疗评价的方法,其特征在于通过检测个体血浆或血清中生物标志物的浓度,根据其浓度计算相关阈值,对比分析个体患糖尿病风险或治疗评价。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于生物标志物为氨基酸、脂肪酸、甘油三脂、甘氨猪去氧胆酸、糖化血红蛋白、葡萄糖、胰岛素、HDL、或LDL中的一种或多种的组合,计算方法中阈值为相应生物标志物指标的绝对浓度或标准化浓度与各指标的回归系数之积和常规系数α相加的结果值,所述常规系数α为回归方程的误差项,通过逻辑回归数学模型计算得到。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于生物标志物为Glycohyodeoxycholate(GHDCA甘氨猪去氧胆酸)或者该胆汁酸在总胆酸中的比例(GHDCA/total Bile Acids)、Palmitic acid(C16:0棕榈酸)、Stearic acid(C18:0硬脂酸)、Oleic acid(C18:1n9油酸)、dihomo-γ-linolenic acid(C20:3n6双高-γ-亚麻酸)、Arachidonicacid(C20:4n6花生四烯酸)、C16:0/C18:0(棕榈酸/硬脂酸)、C18:1n9/C18:0(油酸/硬脂酸)、C20:3n6/C20:4n6(双高-γ-亚麻酸/花生四烯酸)、Valine(缬氨酸)、Leucine(亮氨酸)、Isoleucine(异亮氨酸)、Phenylalanine(苯丙氨酸)、Tyrosine(酪氨酸)或TG(甘油三酯)中的一种或多种的组合。
4.如权利要求2所述的方法,其特征在于生物标志物为Glycohyodeoxycholate(甘氨猪去氧胆酸)、Palmitic acid(C16:0棕榈酸)、Stearic acid(C18:0硬脂酸)、Oleic acid(C18:1n9油酸)、dihomo-γ-linolenic acid(C20:3n6双高-γ-亚麻酸)、Arachidonic acid(C20:4n6花生四烯酸)、Valine(缬氨酸)、Leucine(亮氨酸)、Isoleucine(异亮氨酸)、Phenylalanine(苯丙氨酸)、Tyrosine(酪氨酸)、TG(甘油三酯)中的一种或多种的组合。
5.如权利要求1-4所述的用于糖尿病风险预测、治疗评价的试剂盒,其特征在于试剂盒包括诊断标记物的标准品或稳定同位素标记的与待测诊断标记物一样的化合物,此稳定同位素标记的化合物用于定量和校正待测诊断标记物。
6.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于所述的诊断标记物的诊断样品为血浆或血清。
7.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于所述的诊断试剂盒为包含所有测试生物标志物的混合标准品,或所有需要测试的生物标志物的单一标准品,标准品为固体形式或者是配制好的溶液。
8.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于所述的诊断试剂盒通常包括至少一个用于保存标准品的容器,为单格或者是多格的。
9.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于所述的诊断试剂盒还包括用于标准品制备或者样本测试的溶剂,所述的溶剂为水、乙腈、甲醇、乙醇或异丙醇。
10.使用如权利要求5所述的试剂盒方法,包括以下步骤:取测试个体的血浆或者血清样本;通过色谱质谱联用代谢组学分析方法分析测试个体血浆或血清样本中生物标志物的浓度,其中所述的色谱包括液相色谱或气相色谱;质谱包括飞行时间,离子肼,四级杆,磁扇区,离子回旋共振,静电扇形或他们的任意组合。
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